CN111996114A - 一种用于神经细胞轴突分离培养的多室型微流控装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微流控装置。所述微流控装置包括多个胞体室和多个轴突室，多个所述胞体室和多个所述轴突室交替间隔设置，相邻的所述胞体室与所述轴突室之间通过微流道连通。本发明的微流控装置可以收集得到大量且纯度较高的轴突组织材料，在用于神经细胞轴突的培养等研究时可高效收集轴突RNA以进行定量分析或分离，为轴突的后续研究提供了可能，具有远大的科研和应用意义。

Description

一种用于神经细胞轴突分离培养的多室型微流控装置

技术领域

本发明涉及生物技术/生物医学工程领域，特别是涉及一种微流控装置。

背景技术

微流控芯片又称为芯片实验室(Lab-on-a-Chip)，是一种以在微米尺度空间对流体操控为主要特征的技术，它以微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，可以实现常规化学或生物实验室的各种功能，具有微型化、自动化、集成化、高通量以及可以在接近生理环境下运行等特点。

然而，传统的微流控装置所收集的神经轴突组织材料的量远远不能满足后续对轴突进行神经发育、突触传输以及神经性疾病在亚细胞、细胞及网络水平的分析要求。因此极需开发新的微流控装置以满足轴突相关性研究的要求。

发明内容

基于此，有必要提供一种可显著提高轴突组织收集量的微流控装置。

一种微流控装置，包括多个胞体室和多个轴突室，多个所述胞体室和多个所述轴突室交替间隔设置，相邻的所述胞体室与所述轴突室之间通过微流道连通。

在其中一个实施例中，所述轴突室的相对的两端分别具有轴突室入口和轴突室出口，所述轴突室入口或所述轴突室出口设置在所述腔室串的同一侧。

在其中一个实施例中，所述胞体室的相对的两端分别具有胞体室入口和胞体室出口，所述胞体室入口或所述胞体室出口设置在所述腔室串的同一侧。

在其中一个实施例中，所述轴突室入口和所述轴突室出口分别为圆形且直径相等，所述胞体室入口和所述胞体室出口分别为圆形且直径相等，所述轴突室入口的直径与所述胞体室入口的直径不相等。

在其中一个实施例中，所述胞体室和所述轴突室交替间隔设置形成腔室串，所述腔室串的两端均为所述轴突室。

在其中一个实施例中，所述胞体室的数量为2～50个，所述轴突室的数量为3～51个。

在其中一个实施例中，相邻的所述胞体室和所述轴突室之间的距离为0.2mm～30mm。

在其中一个实施例中，所述轴突室的宽度与所述胞体室的宽度的比为(1～10)：1。

在其中一个实施例中，所述轴突室呈腰形，所述轴突室的宽度为1mm～5mm，长度为5mm～10mm；。

在其中一个实施例中，所述胞体室呈矩形，所述胞体室的宽度为1mm～10mm，长度为5mm～15mm。

在其中一个实施例中，所述微流道具有与所述胞体室连通的第一开口和与所述轴突室连通的第二开口，所述第一开口的宽度大于所述第二开口的宽度。

在其中一个实施例中，相邻的所述胞体室和所述轴突室之间通过多个所述微流道连通，相邻两个所述微流道之间的距离为0.5mm～35mm。

上述微流控装置具有多个胞体室和多个轴突室，接种在胞体室内的神经细胞轴突可通过微流道向多个轴突室延伸生长，从而在每个轴突室都可以收集得到大量且纯度较高的轴突组织材料，在用于神经细胞轴突的培养等研究时可高效收集轴突RNA以进行定量分析或分离，为轴突的后续研究提供了可能，具有远大的科研和应用意义。

附图说明

图1为一实施方式的微流控装置的结构示意图；

图2为实施例1中，胚胎期E13.5的小鼠胚胎背根神经节细胞(DRG)在微流控装置中生长第六天的显微镜图片。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

需要说明的是，当元件被称为“固定于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

一实施方式的微流控装置，请参阅图1，该微流控装置包括多个胞体室110和多个轴突室120，多个胞体室110和多个轴突室120交替间隔设置，相邻的胞体室110与轴突室120之间通过微流道130连通。

胞体室110用于接种神经细胞。一个胞体室110和其左右相邻的两个轴突室120可以构成一个基本单元，采用微流控装置进行神经细胞轴突的培养时，接种在胞体室110内的神经细胞轴突可通过微流道130向其左右相邻的轴突室120延伸生长，最终能够在多个轴突室120中收集得到大量轴突组织材料。

多个胞体室110和轴突室120可以在一平面上沿一方向交替间隔设置且各自的中心大致在一直线上，在图1中，胞体室110和轴突室120沿图面由左至右的方向交替间隔设置，以便于轴突的延伸生长。进一步地，胞体室110和轴突室120交替间隔设置形成腔室串，腔室串的两端均为轴突室120。也即，多个胞体室110和多个轴突室120形成的腔室串中，确保每个胞体室110的两侧均设置有一个轴突室120，使得神经细胞轴突可按照其生长规律进行生长延伸，有利于提升轴突组织材料的收集量。

在与轴突室120和胞体室110的交替设置方向相垂直的方向上(即图1中的上下方向)，轴突室120的相对的两端分别具有轴突室入口121和轴突室出口122。轴突室入口121用于加入细胞培养基或生物试剂，轴突室出口122用于收集轴突。多个轴突室120的轴突室入口121或轴突室出口122优选设置在多个轴突室120的相同一端，即多个轴突室120的轴突室入口121或轴突室出口122设置在腔室串的同一侧。例如在图1中，多个轴突室120的上端均连接轴突室入口121，下端均连接轴突室出口122。进一步地，轴突室入口121和轴突室出口122可以分别为圆形且直径相等。具体地，轴突室入口121的直径可以为1mm～8mm，轴突室出口122的直径可以为1mm～8mm。

在与轴突室120和胞体室110的交替设置方向相垂直的方向上(即图1中的上下方向)，胞体室110的相对的两端分别具有胞体室入口111和胞体室出口112。胞体室入口111用于加入细胞培养基，胞体室出口112用于更换细胞培养基。多个胞体室110的胞体室入口111或胞体室出口112优选设置在多个胞体室110的相同一端，即多个胞体室110的胞体室入口111或胞体室出口112设置在腔室串的同一侧。例如在图1中，多个胞体室110的上端均连接胞体室入口111，下端均连接胞体室出口112。进一步地，胞体室入口111和胞体室出口112可以分别为圆形且直径相等。具体地，胞体室入口111的直径可以为1mm～8mm，胞体室出口112的直径可以为1mm～8mm。

为了与胞体室入口111和胞体室出口112进行区分，轴突室入口121的直径优选与胞体室入口111的直径不相等，也即轴突室出口122的直径与胞体室出口112的直径不相等。进一步地，轴突室入口121的直径小于胞体室入口111的直径，也即轴突室出口122的直径小于胞体室出口112的直径。

胞体室110和轴突室120的数量可以根据需要进行调整，例如可以根据由与微流控装置封装的玻璃盖板的大小进行调整。进一步地，胞体室110的数量可以为2～50个；轴突室120的数量可以为3～51个。

相邻的胞体室110和轴突室120之间的距离对于轴突的延伸生长具有一定影响。在一个实施例中，相邻的胞体室110和轴突室120之间的距离可以为0.2mm～30mm。上述距离范围较为适宜，既有利于轴突由胞体室110向轴突室120延伸生长，也避免多余的胞体或其他组织材料进入轴突室120。

由于轴突的长短与胞体的大小存在相关性，为了提供适宜轴突生长的空间，轴突室120的宽度与胞体室110的宽度的比可以为(1～10)：1。其中，轴突室120和胞体室110的宽度是指，轴突室120和胞体室110在其交替设置方向(即图1中的左右方向)上的尺寸。轴突室120和胞体室110的宽度符合上述比例范围时，轴突在轴突室120内的生长情况较好，从而可最终收集得到更多的轴突组织材料。

在一个实施例中，轴突室120可以呈如图1中所示的腰形。这样的形状更适合轴突的生长，有利于收集得到最大量的轴突组织材料。进一步地，轴突室120的宽度可以为1mm～5mm，长度可以为5mm～10mm。其中轴突室120的长度是指其在上下方向上的最大尺寸。在其他实施例中，轴突室120也可以为其他形状，如矩形、椭圆形等。多个轴突室120的形状和大小可以相同，也可以不同，优选情况下，多个轴突室120具有相同的形状和大小。轴突室120的高度可以为50μm～150μm，其中轴突室120的高度是指其在垂直于图1的图面方向上的尺寸。

在一个实施例中，胞体室110可以呈矩形。进一步地，胞体室110的宽度可以为1mm～10mm，长度可以为5mm～15mm。。其中胞体室110的长度是指其在上下方向上的尺寸。多个胞体室110的长度和宽度可以相同，也可以不同，可以根据实际需要进行设计，在图1所示的实施例中，多个胞体室110的长度即不完全相同。胞体室110的高度可以为50μm～150μm，其中胞体室110的高度是指其在垂直于图1的图面方向上的尺寸。

通过合理地设计胞体室110和轴突室120的数量、形状、大小及二者的间隔距离，有利于在有限的空间内尽可能多地收集得到最大量的轴突组织材料。

相邻的胞体室110和轴突室120之间可以通过多个微流道130连通，从而使神经细胞轴突的生长更接近生理环境下的运行。多个微流道130均匀间隔排列，相邻两个微流道130之间的距离可以为10μm～20μm。其中，相邻两个微流道130之间的距离是指相邻两个微流道130与胞体室110连通的开口或者与轴突室120连通的开口之间的距离。相邻的胞体室110和轴突室120之间的微流道130的数量可以根据胞体室110和轴突室120的长度进行调整，例如，相邻的胞体室110和轴突室120之间的微流道130的数量可以为500～1000个。微流道130的高度可以为1μm～3μm，其中微流道130的高度是指其在垂直于图1的图面方向上的尺寸。

进一步地，微流道130具有与胞体室110连通的第一开口和与轴突室120连通的第二开口，第一开口的宽度大于第二开口的宽度。如此设置的好处是，一方面，仅胞体室110中的神经细胞轴突可经由微流道130延伸生长进入轴突室120，而胞体或其他组织难以进入微流道130内；另一方面，还可以避免进入轴突室120中的轴突再延伸生长进入到临近的胞体室110，从而确保了在轴突室120内可收集得到大量且纯度较高的轴突组织材料。具体地，第一开口的宽度可以为5μm～10μm，第二开口的宽度可以为3μm～6μm。

制备微流控装置100的材料可以为聚二甲基硅氧烷(PDMS)，其具有良好的透气性和透光性，利于神经细胞的生长，且价格低廉。

微流控装置100的制备可以采用本领域的常规方法。例如，首先，按照设计，将胞体室110和轴突室120制作为菲林掩膜版，微流道130制作为铬版掩膜版，微流道130的长度可稍长于胞体室110和轴突室120的间隔距离，以确保微流道130能够连接胞体室110和轴突室120；然后，通过软光刻的方法制作相应的负性光刻胶模板；再在负性光刻胶模板上沉积聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料，PDMS固化剥离后与玻璃基板封接，得到微流控装置100。

上述微流控装置100可用于神经细胞轴突的培养，并能高效收集轴突RNA以进行定量分析或分离，为轴突的后续研究提供了可能，在例如轴突的生长及导向、轴突信号传导、反向信号传导、轴突中蛋白质的局部合成、树突-细胞核信号等研究领域具有远大的科研和应用意义。

以下通过具体实施例进一步说明本发明，但不用于限制本发明。

实施例1

本实施例的微流控装置在AutoCAD软件中完成设计，结构如图1所示，包括交替间隔设置的9个轴突室120和8个胞体室110，相邻的轴突室120和胞体室110之间通过微流道阵列130连通，微流控装置的尺寸为5.6cm×2.4cm。每个轴突室120的形状为腰形，宽度为3mm，长度为9mm，高度为100μm，上端连接一个直径2mm的圆形的轴突室入口121，下端连接一个直径2mm的圆形的轴突室出口122。每个胞体室110的形状为矩形，宽度为1mm，长度为12mm或15mm，高度为100μm，上端连接一个直径3mm的圆形的胞体室入口111，下端连接一个直径3mm的圆形的胞体室出口112。相邻的轴突室120和胞体室110之间的距离为1mm。相邻的轴突室120和胞体室110之间的微流道130的个数为650个(图中未完全示出)，连通胞体室110的第一开口的宽度为6μm，间隔的距离为6μm，连通轴突室120的第二开口的宽度为4.5μm，间隔的距离为7.5μm，微流道130的长度为2.3mm，高度为2.5μm。

一、制作曝光掩膜版

按照如图1所示的结构设计，将胞体室110和轴突室120制作为菲林掩膜版，微流道130制作为铬版掩膜版，并制作相应的负性光刻胶SU-8模板。

二、制作负性光刻胶SU-8模板

利用电子束蒸镀在清洗干净的3英寸硅片上镀上一层50nm厚的铬；在硅片上匀上一层1μm厚的正性光刻胶rzj-304(苏州瑞红)、前烘、紫外光刻、显影后得到对准标志的图形；使用铬刻蚀液进行湿法刻蚀，去掉正性光刻胶之后得到只保留了对准标志图形的铬；在已有对准标志的硅片上匀上一层2.5μm厚的负性光刻胶SU-8 2005(MicroChem)前烘、紫外光刻(需要使用对准标志)、后烘、显影后得到微流道阵列图形；5、在已完成微流道阵列结构的硅片上再匀上一层100μm厚的负性光刻胶SU-8 2075(MicroChem)前烘、紫外光刻(需要使用对准标志)、后烘、显影后得到胞体室和轴突室的结构；将模板置于150℃的烘胶台上坚膜10分钟，使光刻胶和硅片的粘附性更加强，提高装置耐用性。

三、采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料和玻璃基板制成微流控装置100

将PDMS的A液与B液按按质量10:1比例搅拌混匀；将模板进行硅烷化处理，即将模板和少量三氯硅烷(trichlorosilane)置于真空干燥器中15分钟左右，用异丙醇冲洗模板去除残余的三氯硅烷，然后氮气吹干；将硅烷化处理后的SU-8模板固定在平底培养皿上，倒入约2mm～3mm厚的PDMS溶液，真空除气泡后放入80℃烘箱烘烤1个小时；将固化的PDMS从SU-8模板上剥离并在所有腔室的入口和出口处打孔；打好孔后的PDMS芯片和玻璃基板同时放入等离子清洗机中处理1min，对准封接后得到微流控装置100。

四、将微流控装置100进行神经细胞培养和轴突定量分析

对微流控装置100进行预处理：在微流控装置100的各腔室入口处加入多聚赖氨酸(PDL)，置于二氧化碳细胞培养箱过夜，用细胞培养级别的去离子水冲洗三次，空气中晾干之后加入含有3.3μg/mL黏连蛋白的培养基置于二氧化碳细胞培养箱中孵育2h，接种细胞之前吸干此培养基。

背根神经节细胞(DRG)的获取：取出胚胎期E13.5的小鼠胚胎放入含有青链霉素的L-15培养基中，置于冰上，分离出其背部脊柱后，用精细镊夹取脊柱上面的背根神经节细胞(DRG)，用玻璃吸管吸进15mL离心管中，置于冰上。待收集完成后用离心机在800rpm/min下离心3min。弃去L-15培养基后加入2mL TrypLE，在37℃水浴消化15min(每隔2min轻摇几下)，然后在800rpm/min下离心5min。弃去TrypLE，加入2mL含有10％FBS的NeurobasalMedium，用润湿过的玻璃管吹打细胞至云雾状，然后在800rpm/min下离心5min。弃去含有10％FBS的Neurobasal Medium，加入适量完全培养基(Neurobasal Medium+B-27+GlutaMAX^TM-I+Pen-Strep+NGF+5-Fluoro-2’-deoxyuridine)吹散细胞。吸取少量细胞接种到微流控装置100中的胞体室110，等待30min细胞完全贴到盖玻片上后补充完全培养基。每隔两天更换一半完全培养基。

RNA的提取：培养至第六天，用磷酸缓冲液(PBS)冲洗两次，首先吸掉轴突室的PBS后从入口加入50uL TRIzol试剂，从轴突室出口吸取。轴突收集后采用TRIzol法提取轴突的RNA。图2为胚胎期E13.5的小鼠胚胎背根神经节细胞(DRG)在微流控装置100中生长第六天的显微镜图片，在轴突室120中可见大量生长状态良好的轴突组织。

RNA的定量检测：取1uL轴突RNA使用RNA 6000 Pico Kit&Reagents在Agilent2100 Bioanalyzer机器上进行分析，得到最终的RNA浓度为12960pg/uL。

对比例1

本对比例1的微流控芯片为购自美国Xona Microfluidics公司，型号为XC-T500的微流控芯片。该微流控芯片具有一个胞体室，一个中间室和一个轴突室，微流控芯片的尺寸为3.5cm×2.4cm。

按照实施例1中的轴突定量分析过程进行神经细胞的培养和分析，检测得到最终的RNA浓度为336.67pg/uL。

由实施例1和对比例1的对比可以发现，与传统微流控芯片相比，本发明的微流控装置在轴突室单位面积内收集得到的胚胎期E13.5的小鼠胚胎背根神经节细胞(DRG)轴突的RNA量大大提升，可达传统微流控芯片的11.8倍。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种微流控装置，其特征在于，包括多个胞体室和多个轴突室，多个所述胞体室和多个所述轴突室交替间隔设置，相邻的所述胞体室与所述轴突室之间通过微流道连通。

2.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于，所述胞体室和所述轴突室交替间隔设置形成腔室串，所述腔室串的两端均为所述轴突室。

3.根据权利要求2所述的微流控装置，其特征在于，所述轴突室的相对的两端分别具有轴突室入口和轴突室出口，所述轴突室入口或所述轴突室出口设置在所述腔室串的同一侧；

所述胞体室的相对的两端分别具有胞体室入口和胞体室出口，所述胞体室入口或所述胞体室出口设置在所述腔室串的同一侧。

4.根据权利要求3所述的微流控装置，其特征在于，所述轴突室入口和所述轴突室出口分别为圆形且直径相等，所述胞体室入口和所述胞体室出口分别为圆形且直径相等，所述轴突室入口的直径与所述胞体室入口的直径不相等。

5.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于，所述胞体室的数量为2～50个，所述轴突室的数量为3～51个。

6.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于，相邻的所述胞体室和所述轴突室之间的距离为0.2mm～30mm。

7.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于，所述轴突室的宽度与所述胞体室的宽度的比为(1～10)：1。

8.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于，所述轴突室呈腰形，所述轴突室的宽度为1mm～5mm，长度为5mm～10mm；及/或，

所述胞体室呈矩形，所述胞体室的宽度为1mm～10mm，长度为5mm～15mm。

9.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于，所述微流道具有与所述胞体室连通的第一开口和与所述轴突室连通的第二开口，所述第一开口的宽度大于所述第二开口的宽度。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的微流控装置，其特征在于，相邻的所述胞体室和所述轴突室之间通过多个所述微流道连通，相邻两个所述微流道之间的距离为0.5mm～35mm。

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