CN111991430B - 虫草菌丝免疫调节及治疗脓毒症的新用途 - Google Patents

虫草菌丝免疫调节及治疗脓毒症的新用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供虫草菌丝或虫草菌丝提取物或虫草菌丝糖蛋白在制备具有免疫调节作用的药物或保健品中的应用。虫草菌丝或虫草菌丝提取物或虫草菌丝糖蛋白能够明显改善腹腔持续置管引流脓毒症动物模型的生存率、髓系细胞迁移至感染部位、髓系细胞的吞噬功能，具有确切的治疗脓毒症的作用。

Description

虫草菌丝免疫调节及治疗脓毒症的新用途
技术领域
本发明涉及虫草菌丝的新用途，具体涉及虫草菌丝在免疫调节以及治疗脓毒症方面的新用途，属于医药保健领域。
背景技术
脓毒症指由感染引起的全身炎症反应综合征，常见于肺炎、腹膜炎、胆管炎、泌尿系统感染、蜂窝织炎、脑膜炎、脓肿等感染，其病原微生物包括细菌、真菌、病毒及寄生虫等，是各种严重创伤、烧伤、缺氧、再灌注损伤及外科大手术后常见的并发症，也是糖尿病、慢性阻塞性支气管炎、白血病、再生障碍型贫血和尿路结石等慢性疾病的并发症。脓毒症是宿主对感染的全身反应，与菌血症的密切相关，后期表现为失控的炎性反应、免疫功能紊乱、高代谢状态及多器官功能损害。
目前，脓毒症早期治疗主要依靠抗菌药物，这其中包括众多中药组方或提取物，其作用靶点是抑菌和杀菌。脓毒症的病原物微生物种类多样，从调节天然免疫细胞吞噬功能的角度开发新药或保健品将是治疗脓毒症的突破口。因此，从祖国传统医药资源中开发抗细菌性脓毒症的免疫调节药物或功能性保健品具有广阔前景。
冬虫夏草(Cordyceps sinensis)，又名中华虫草，是由肉座菌目麦角菌科虫草属的冬虫夏草菌寄生于高山草甸土中的蝠蛾幼虫，使幼虫僵化，在适宜条件下，夏季由僵虫头端抽生出长棒状的子座而形成(即冬虫夏草菌的子实体与僵虫菌核(幼虫尸体)构成的复合体)。野生冬虫夏草来源稀少且采集不易，使虫草身价昂贵，利用生物分离技术从天然冬虫夏草提取有效菌株，经过人工接种、培养，得到的虫草菌丝体。虫草菌丝具有与天然冬虫夏草基本相同的功效。
虫草菌丝糖蛋白是中药材虫草菌丝提取物中的主要活性成分，由多糖和蛋白通过糖肽键结合构成的。1克虫草菌丝提取得到135毫克虫草菌丝糖蛋白，其中多糖和蛋白比例为19:2。虫草菌丝糖蛋白具有抗纤维化、抗肿瘤、降血糖等多方面的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供虫草菌丝、虫草菌丝提取物、虫草菌丝糖蛋白在免疫调节以及治疗脓毒症方面的新用途。
作为本发明的一个方面，本发明提供虫草菌丝糖蛋白或虫草菌丝提取物或虫草菌丝在制备具有免疫调节作用的药物或保健品中的应用。
进一步，本发明提供虫草菌丝糖蛋白或虫草菌丝提取物或虫草菌丝在制备促进髓系细胞吞噬功能的药物或保健品中的应用。其中，所述髓系细胞包括粒细胞、单核细胞和巨噬细胞中的一种或多种。
进一步，本发明提供虫草菌丝糖蛋白或虫草菌丝提取物或虫草菌丝在制备治疗脓毒症的药物或保健品中的应用。
作为本发明的另一个方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括虫草菌丝糖蛋白和/或虫草菌丝提取物和/或虫草菌丝以及药学上可接受的载体。本发明所述药物组合物包括但不限于片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂等口服剂型以及注射剂、冻干剂等非口服剂型。
本发明所述虫草菌丝糖蛋白为虫草(即子实体与僵虫菌核构成的复合体)或虫草子实体或虫草菌丝采用水提醇沉法制备得到，醇沉浓度为70％-90％。优选醇沉浓度为72％-88％；进一步优选的，醇沉浓度为75％-86％；更进一步优选的，醇沉浓度为78％-84％；最优选的，醇沉浓度为80％-82％。
本发明所述虫草菌丝提取物为虫草菌丝以常规提取溶剂、按常规提取方法提取得到的提取物。所述常规提取溶剂包括水或乙醇；所述常规提取方法包括煎煮提取、回流提取、浸渍提取、超声提取、渗漉提取、微波提取等。优选为虫草菌丝的水提取物。
本发明所述虫草菌丝提取物或虫草菌丝中虫草菌丝糖蛋白的含量不低于13.5％。
本发明所述虫草菌丝糖蛋白或虫草菌丝提取物或虫草菌丝还可与其他中药进行配伍，如生黄芪，白术，升麻，黄连，赤芍等。
本发明所述水提醇沉法(水醇法)系指在水提液中，加入乙醇使达一定含醇量(即醇沉浓度)，某些药物成分在醇溶液中溶解度降低析出沉淀，固液分离后使水提液得以精制的方法。
本发明所述脓毒症的致病菌包括：大肠杆菌、拟杆菌、绿脓假单胞菌、变形杆菌，克雷伯菌、肠杆菌等革兰阴性杆菌；金黄葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肠球菌等革兰染色阳性球菌；拟杆菌、梭状杆菌、厌氧葡萄球菌、厌氧链球菌等无芽胞厌氧菌；以及白念珠菌、曲霉菌、毛霉菌和新型隐球菌等条件致病真菌。
1、本发明所述保健品除活性成分外，还可以添加常见配料，包括但不限于营养素、维他命、矿物质、香料、着色剂、增粘剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂等。所述保健品可以单独食用，也可以与现有的药物或保健品配合使用。所述药学上可接受的载体包括：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等。
本发明通过腹腔持续置管引流(colon ascending stent peritonitis,CASP)的动物模型实验发现：虫草菌丝糖蛋白以及包含虫草菌丝糖蛋白的虫草菌丝提取物或虫草菌丝对腹腔持续置管引流造成的脓毒症具有保护作用，能够明显改善腹腔持续置管引流脓毒症动物模型的生存率、髓系细胞迁移至感染部位、髓系细胞的吞噬功能，说明其具有确切的治疗脓毒症作用，可以用来制备治疗或缓解细菌性脓毒症症状的药物。本发明还发现：虫草菌丝糖蛋白或包含虫草菌丝糖蛋白虫草菌丝提取物或虫草菌丝的药物组合物对多种细菌感染具有明显的吞噬、杀菌作用，可以用来治疗或改善多种感染引起的炎症。
附图说明
图1为实施例6的虫草菌丝干预CASP脓毒症模型小鼠生存率图表。
图2为实施例7的虫草菌丝干预二次打击(CLP 7天+鼻饲绿脓杆菌)脓毒症模型小鼠生存率图表。
图3为实施例8的虫草菌丝糖蛋白干预CASP脓毒症模型小鼠生存率图表。
图4为实施例9的虫草菌丝多糖和虫草菌丝蛋白干预CASP脓毒症模型小鼠生存率图表。
图5为实施例10的虫草菌丝多糖干预CASP脓毒症模型小鼠生存率图表。
图6为实施例11的虫草菌丝蛋白和虫草菌丝糖蛋白干预CASP脓毒症模型小鼠生存率图表。
图7为实施例15SDS-PAGE电泳鉴定虫草菌丝糖蛋白以及酶法和Sevage法制备的虫草菌丝多糖和虫草菌丝蛋白；
其中：1为Protein Maker；2为BSA；3为酶解BSA；4和6为虫草菌丝糖蛋白；5和7为酶解制备虫草菌丝多糖；8和9为Sevage法制备的虫草菌丝多糖；10为Sevage法制备的虫草菌丝蛋白。
图8为实施例15SDS-PAGE电泳鉴定虫草菌丝糖蛋白以及酶法制备的虫草菌丝蛋白；
其中：1为Protein Maker；2、3和5为虫草菌丝糖蛋白；4和6为酶解制备的虫草菌丝蛋白。
具体实施方式
实施例1虫草菌丝混悬液的制备
虫草菌丝购自北京同仁堂药店，经药材学鉴定，粉碎成粉末，以蒸馏水稀释至所需浓度(85mg/ml)灌胃。给予临床等效剂量的虫草菌丝灌胃(成人每日用药临床常用剂量：虫草菌丝5g/60kg/d)，虫草菌丝(850mg/kg/d)配成85mg/ml，每只小鼠(约20g)0.2ml灌胃。
实施例2虫草菌丝糖蛋白的制备
虫草菌丝粉：水(1:7)100℃水浴2小时，冷却后3000rpm离心15分钟，取上清依次通过5μm→1μm→0.45μm→0.22μm滤膜过滤，过滤后的虫草菌丝水提取液，用5倍95％乙醇(约81％乙醇沉淀)-20℃沉淀过夜，3000rpm离心15分钟，过0.45μm Whatman滤膜得到的沉淀物即为虫草菌丝糖蛋白，真空干燥，得到虫草菌丝糖蛋白。测定虫草菌丝糖蛋白和蛋白质含量。-20℃保存。使用时用无菌蒸馏水溶解，按实验要求进一步稀释至所需浓度。
实施例3 Sevage法提取制备虫草菌丝多糖和虫草菌丝蛋白
虫草菌丝糖蛋白粉末溶于相当于原液的水中，加入等量的氯仿：正丁醇(4:1)充分混匀，静置，4000rpm，20分钟。分三层：下层水相—多糖，中间层—蛋白质，有机相(氯仿：正丁醇)—小分子物质。分别吸出水相和有机相，余下为蛋白层。吸出水相，再抽提两次，水相负压吸干，即为虫草菌丝多糖，使用时用无菌蒸馏水溶解至所需浓度。蛋白层加入3倍体积的丙酮沉淀过夜，8000rpm，15分钟，移去上清，沉淀即为虫草菌丝蛋白，风干，用无菌蒸馏水溶解至所需浓度。
实施例4虫草菌丝多糖的酶法制备
虫草菌丝糖蛋白粉末溶于相当于原液的水中，虫草菌丝糖蛋白含量相当于85mg/ml生药，蛋白含量1.1mg/ml。取455ul CCDT(1.1ug/ul×455ul＝500ug)加535ul水(455+535＝990ul)，然后加入2ug Asp-N酶(购自Promega公司)管中37°消化2h，80°热失活10min。恢复至常温后加入10mg/ml蛋白酶K(购自Promega公司)储存液10ul 65℃消化2h，80℃热失活10min。虫草菌丝糖蛋白的蛋白部分被消化，得到虫草菌丝多糖，相当于37.4mg/ml生药，用于小鼠给药。
实施例5虫草菌丝蛋白的酶法制备
采用Sigma-Aldrich公司Native Protein Deglycosylation Kit按protocol进行虫草菌丝蛋白制备。虫草菌丝糖蛋白粉末溶于相当于10倍原液的水中，虫草菌丝糖蛋白含量相当于850mg/ml生药，蛋白含量11mg/ml。取9ulCCDT(11ug/ulx9ul＝99ug)加31ul水(9+31＝40ul)，按非变性反应条件去糖基化酶消化。加入5ul的10X G7反应缓冲液；加入5ul去糖基化酶混合液，温和混匀，37℃温育4h。虫草菌丝糖蛋白的多糖部分被消化，得到虫草菌丝蛋白，相当于153mg/ml生药，使用时用无菌蒸馏水稀释成相当于85mg/ml生药，用于小鼠给药。
实施例6虫草菌丝干预对脓毒症小鼠CASP模型生存率的影响
实验材料：一次性使用静脉留置针18G，购自BD公司；8/0和6/0聚丙烯缝线，购自COVIDIEN公司。
实验动物：C57/BL6小鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
实验药物：实施例1制备的虫草菌丝混悬液(浓度：85mg/ml)
分组：C57/BL6小鼠68只，雄性，18-20g，适应性饲养1天后，随机分为2组，每组34只：CASP模型组和虫草菌丝组。
模型制备和给药处理：小鼠于麻醉前15～20分钟，模型组用200μL用无菌蒸馏水，虫草菌丝组给予200μL虫草菌丝混悬液(浓度：85mg/ml)给小鼠灌胃，剂量为850mg/kg，制备脓毒症模型动物。小鼠戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射行麻醉，消毒，腹正中切口，暴露升结肠，在距离回盲部约1cm的升结肠处插入静脉置留针(18G)，待穿透肠壁后退出针芯，8/0聚丙烯缝线固定置留管，挤出少许肠内容物以保持置留管开放，升结肠还纳腹腔，关腹。术毕皮下补液。造模后，观察动物术后96小时死亡率。
结果：如图1所示，CASP术后18小时后小鼠开始死亡，48小时内死亡较集中，之后死亡率下降，72-96小时趋于稳定。CASP模型组的生存率是26.5％，药物处理后小鼠生存率升高，虫草菌丝组的生存率为61.8％(与模型组相比，**，p<0.01)。生存率经Kaplan-Meier统计学分析，虫草菌丝处理组与模型组相比均有显著差异。该结果表明，虫草菌丝能提高CASP脓毒症模型小鼠的生存率。
实施例7虫草菌丝干预脓毒症小鼠二次打击模型生存率的影响。
实验材料：LPS购自Sigma公司，18G注射器购自BD公司；绿脓杆菌(Pseudomanasaeruginosa,PA)购自武汉淼灵生物科技有限公司。
实验动物：C57/BL6小鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
实验药物：实施例1制备的虫草菌丝混悬液(浓度：85mg/ml)
分组：C57/BL6小鼠100只，雄性，18-20g，适应性饲养1天后，行鼠类盲肠结扎穿孔(CLP)手术。7天后存活57只，随机分为2组，模型组25只：虫草菌丝组32只。
(1)CLP模型制备：小鼠戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射行麻醉，消毒，腹正中切口，暴露盲肠，在距离回盲部约50％的盲肠结扎，在结扎游离的盲肠末端插入10ml注射器针头(18G)，待穿透肠壁后退出针芯，挤出少许肠内容物，盲肠还纳腹腔，关腹。术毕皮下补液。造模7天后存活57只。
(2)绿脓杆菌制备：用一次性接种环将复苏好的单菌落挑至新鲜LB培养基(200ml体系)，置摇床上37℃，220rpm摇菌过夜。菌液呈粉红色，表明绿脓杆菌状态良好。取1ml菌液3000rpm，离心7分钟，去上清，生理盐水洗一遍，重悬，生理盐水稀释，测吸光值600nm OD值，计算出菌数：(测得菌液OD值÷0.965)×1.65×109。用NS重悬调成5x 1010/ml。
(3)模型制备和给药处理：模型组200μL生理盐水灌胃，虫草菌丝组200μL虫草菌丝混悬液(浓度：85mg/ml)灌胃，剂量为850mg/kg。每只小鼠鼻饲绿脓菌液40ul(大约为2x109/小鼠)。造模后，观察动物96小时死亡率。
结果：如图2所示，鼻饲绿脓杆菌5小时后小鼠开始死亡，24小时内死亡较集中，之后死亡率下降，48-96小时趋于稳定。CLP模型组的生存率是28％，药物处理后小鼠生存率升高，虫草菌丝组的生存率为59.4％(与模型组相比，*p<0.05)。生存率经Kaplan-Meier统计学分析，虫草菌丝处理组与模型组相比均有显著差异。该结果表明，虫草菌丝能提高二次打击(CLP 7天+鼻饲绿脓杆菌)脓毒症模型小鼠的生存率。
实施例8虫草菌丝糖蛋白干预对脓毒症小鼠CASP模型生存率的影响
实验材料：一次性使用静脉留置针18G，购自BD公司；8/0和6/0聚丙烯缝线，购自COVIDIEN公司。
实验动物：C57/BL6小鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
实验药物：实施例2制备的虫草菌丝糖蛋白。
模型制备和给药处理：与实施例6相同，虫草菌丝糖蛋白按虫草菌丝生药的含量给药。
结果：如图3所示，CASP术后18小时后小鼠开始死亡，48小时内死亡较集中，之后死亡率下降，72-96小时趋于稳定。CASP模型组的生存率是50％，药物处理后小鼠生存率升高，虫草菌丝糖蛋白组的生存率为80％(与模型组相比，*p<0.05)。生存率经Kaplan-Meier统计学分析，虫草菌丝糖蛋白处理组与模型组相比均有显著差异。该结果表明，虫草菌丝糖蛋白能提高CASP脓毒症模型小鼠的生存率。
实施例9化学法制备的虫草菌丝多糖和虫草菌丝蛋白干预对脓毒症小鼠CASP模型生存率的影响
实验材料：一次性使用静脉留置针18G，购自BD公司；8/0和6/0聚丙烯缝线，购自COVIDIEN公司。
实验动物：C57/BL6小鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
实验药物：实施例3制备的虫草菌丝多糖和虫草菌丝蛋白。
模型制备和给药处理：与实施例6相同，虫草菌丝多糖和虫草菌丝蛋白是按虫草菌丝生药的含量给药。
结果：如图4所示，CASP术后18小时后小鼠开始死亡，48小时内死亡较集中，之后死亡率下降。CASP模型组的生存率是63.3％，药物处理后小鼠生存率下降，虫草菌丝多糖组的生存率为43.3％，虫草菌丝多糖组的生存率为40％(与模型组相比，p>0.05)。生存率经Kaplan-Meier统计学分析，虫草菌丝多糖和虫草菌丝蛋白处理组与模型组相比均没有显著差异。该结果表明，虫草菌丝多糖和虫草菌丝蛋白不能改善CASP脓毒症模型小鼠的生存率。
实验例10酶法制备的虫草菌丝多糖干预对脓毒症小鼠CASP模型生存率的影响
实验材料：一次性使用静脉留置针18G，购自BD公司；8/0和6/0聚丙烯缝线，购自COVIDIEN公司。
实验动物：C57/BL6小鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
实验药物：实施例4制备的虫草菌丝多糖。
模型制备和给药处理：与实施例6相同，虫草菌丝多糖是按虫草菌丝生药的含量给药。
结果：如图5所示，CASP术后18小时后小鼠开始死亡，48小时内死亡较集中，之后死亡率下降，72-96小时趋于稳定。CASP模型组的生存率是52.4％，药物处理后小鼠生存率没有明显改善，虫草菌丝多糖组的生存率为55％(p>0.05)。生存率经Kaplan-Meier统计学分析，虫草菌丝多糖处理组与模型组相比没有显著差异。该结果表明，虫草菌丝多糖不能提高CASP脓毒症模型小鼠的生存率。
实施例11酶法制备的虫草菌丝蛋白和虫草菌丝糖蛋白干预对脓毒症小鼠CASP模型生存率的影响
实验材料：一次性使用静脉留置针18G，购自BD公司；8/0和6/0聚丙烯缝线，购自COVIDIEN公司。
实验动物：C57/BL6小鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
实验药物：实施例5制备的虫草菌丝蛋白和实施例2制备的虫草菌丝糖蛋白。
模型制备和给药处理：与实施例6相同，虫草菌丝蛋白和虫草菌丝糖蛋白是按虫草菌丝生药的含量给药。
结果：如图6所示，CASP术后18小时后小鼠开始死亡，48小时内死亡较集中，之后死亡率下降。CASP模型组的生存率是40.9％，药物处理后小鼠生存率改善，虫草菌丝糖蛋白组的生存率为66.7％(与模型组相比，*p<0.05)，虫草菌丝蛋白组的生存率为53.3％(与模型组相比，p>0.05)。生存率经Kaplan-Meier统计学分析，虫草菌丝蛋白处理组与模型组相比没有显著差异，而未经过去多糖的处理的虫草菌丝糖蛋白组与模型组相比有显著差异。该结果表明，虫草菌丝糖蛋白能提高CASP脓毒症模型小鼠的生存率，而虫草菌丝蛋白不能改善CASP脓毒症模型小鼠的生存率。
实施例12虫草菌丝对脓毒症小鼠CASP模型吞噬作用的影响
实验材料、动物以及实验药物与实施例6相同。
分组：C57BL/6小鼠，雄性，18-20g，适应性饲养1天后，随机分为3组：正常对照组，CASP模型组和虫草菌丝组。
模型制备和给药处理：除正常对照组外，模型组和虫草菌丝组行CASP手术。虫草菌丝组给药剂量与实施例6。手术后18小时，取各组小鼠腹腔灌洗液进行检测。
(1)检测虫草菌丝对CASP模型小鼠腹腔髓系细胞的影响。每组5只，分别在CASP术后18小时麻醉处死，取腹腔灌洗液，流式细胞仪检测腹腔髓系细胞比例；
(2)检测虫草菌丝对CASP模型小鼠腹腔髓系细胞表面吞噬受体表达的影响。每组5只，分别在CASP术后18小时麻醉处死，取腹腔灌洗液，分离获取腹腔细胞，加入混合抗体(APC-Cy7-CD45，APC-CD64，BV650-Gr-1，BV510-CD16/32，PE-Cy7-CD48，PE-Cy5-F4/80，PE-CF594-CD11b)进行流式染色，流式细胞仪检测腹腔髓系细胞表面吞噬受体CD16/32和CD64表达程度。
(3)检测虫草菌丝对CASP模型小鼠腹腔髓系细胞吞噬功能的影响。每组5只，分别在CASP术后18小时麻醉处死，取腹腔灌洗液，分离获取腹腔细胞，以5×105/200μl/孔接种于96孔板中，加入终浓度100ng/ml LPS刺激，同时加入1:10稀释的Yellow-green标记0.25μl/200μl的Latex beads(Carboxylate-modified,Yellow-green,1.0μm,Cat.No L4655,Sigma)，孵育3小时后，加入2ml00ul Lysing Buffer(BD Lysing)或Fixation buffer(4％多聚甲醛)终止吞噬，10min后PBS洗两遍；加入混合抗体(APC-Cy7-CD45，APC-CD64，BV650-Gr-1，BV510-CD16/32，PE-Cy7-CD48，PE-Cy5-F4/80，PE-CF594-CD11b)进行流式染色，流式细胞仪检测腹腔髓系细胞中Beads+细胞的比例，明确腹腔髓系细胞的吞噬功能。
结果(1)：虫草菌丝对CASP模型小鼠腹腔髓系细胞比例的影响。见表1。
表1腹腔髓系细胞比例变化(x±s,％)
粒细胞 单核细胞 巨噬细胞
对照组 0.13±0.03<sup>▲▲</sup> 85.05±2.33<sup>▲▲</sup> 10.47±3.08
模型组 89.33±2.04** 7.60±1.05** 9.03±3.75
虫草菌丝组 87.33±3.88** 10.71±2.63** 21.30±9.03<sup>▲</sup>
注：与对照组相比，*p<0.05，**p<0.001；与CASP模型组相比，▲p<0.05，▲▲p<0.001。
结果表明，CASP脓毒症模型小鼠与正常组相比，腹腔粒细胞比例显著升高、单核细胞比例显著下降(**，p<0.001)；虫草菌丝干预后巨噬细胞比例显著升高(▲，p<0.05)。说明虫草菌丝能促进巨噬细胞分化。
结果(2)：虫草菌丝对CASP模型小鼠腹腔髓系细胞表面吞噬受体表达的影响。见表2。
表2腹腔髓系细胞吞噬功能(x±s,MFI)
Figure GDA0003487097020000111
注：与对照组相比，*p<0.05；与CASP模型组相比，▲p<0.05。
CD16/32和CD64是髓系细胞表面吞噬受体。结果表明，CASP脓毒症模型小鼠与正常组相比，单核细胞表面CD16/32和CD64受体表达显著下降(*，p<0.05)；虫草菌丝干预后巨噬细胞表面CD16/32和CD64受体表达显著升高(▲，p<0.05)。说明虫草菌丝能促进巨噬细胞吞噬。
结果(3)：虫草菌丝对CASP模型小鼠腹腔髓系细胞吞噬功能的影响。见表3。
表3腹腔髓系细胞吞噬功能(x±s,％)
Figure GDA0003487097020000121
注：与对照组相比，*p<0.05；与CASP模型组相比，▲p<0.05。
结果表明，加荧光磁珠刺激，CASP模型小鼠腹腔粒细胞体外吞噬磁珠比例显著增多(*，p<0.05)；虫草菌丝干预后腹腔巨噬细胞体外吞噬磁珠比例显著增多(*，p<0.05)。同时加内毒素LPS和荧光磁珠，增加刺激强度，CASP模型小鼠腹腔粒细胞和巨噬细胞体外吞噬磁珠比例显著增多(*，p<0.05)；虫草菌丝干预后腹腔粒细胞、单核细胞和巨噬细胞体外吞噬磁珠比例没有显著增多。
综上所述，虫草菌丝能明显提高CASP和二次打击脓毒症小鼠模型的生存率，增加腹腔巨噬细胞比例，增加腹腔髓系细胞吞噬功能，具有显著的吞噬杀菌作用，可用作脓毒症治疗的药物。
实施例13虫草菌丝对脓毒症小鼠GFP-Ecoli模型吞噬作用的影响
试验材料：GFP-Ecoli购自武汉淼灵生物科技有限公司。
动物：C57BL/6小鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
实验药物：实施例1制备的虫草菌丝混悬液(浓度：85mg/ml)
分组：C57BL/6小鼠，雄性，18-20g，适应性饲养1天后，随机分为2组，每组5只：GFP-Ecoli模型组和CCJS组。
模型制备和给药处理：GFP-E.coli 200ul接种LB培养皿，37度培养24小时，挑选1单一菌落接种LB培养基，37度培养过夜。测OD值，计算细菌数量。每组6只，C57BL/6小鼠分别给予250μL双蒸水和虫草菌丝混悬液灌胃，剂量为850mg/kg。在灌胃1.5小时后，开始给菌。按1X108 GFP-E.coli剂量单次腹腔注射小鼠，每只间隔5分钟，于注射后0.5小时取材。将小鼠颈椎脱臼处死，对照组腹腔注射5ml生理盐水，轻揉小鼠腹部2-3分钟，静置5分钟后，剪开小鼠腹部皮肤，用注射器抽取腹腔灌洗液。
(1)腹腔灌洗液显微镜下细胞计数；
(2)腹腔灌洗液1:100至1:10000，涂片LB培养基，37度培养24-48小时，菌落计数；
(3)腹腔灌洗液离心1200rpm，5min，分离获取腹腔细胞，细胞中加入1％多聚甲醛固定，加入混合抗体(Percp-Cy5.5-CD11b，APC-Gr-1，PE-F4/80)进行流式染色后，流式细胞仪检测腹腔髓系细胞及其吞噬GFP-Ecoli的平均荧光强度。同时，取正常小鼠腹腔灌洗液和骨髓，调补偿。
结果：
结果(1)，如表4显示，与正常对照组相比，注射GFP-E.coli模型小鼠腹腔白细胞数量显著增加(#，p<0.05)；与GFP-E.coli模型组相比，虫草菌丝干预进一步增加腹腔白细胞数量(▲，p<0.05)。说明虫草菌丝能促进白细胞进入腹腔。
表4腹腔白细胞数量变化(x±s)
白细胞
对照组 1203667±630041<sup>▲</sup>
模型组 3185000±1877514*
虫草菌丝组 12936000±6523940**<sup>▲</sup>
注：与对照组相比，*p<0.05，**p<0.001；与GFP-Ecoli模型组相比，▲p<0.05。
结果(2)，如表5显示，与GFP-E.coli模型组相比，虫草菌丝干预显著减少腹腔内细菌数量(▲，p<0.05)。
表5腹腔GFP-Ecoli数量变化(x±s)
GFP-E coli
模型组 212576000±184211096
虫草菌丝组 35354666±16411981<sup>▲</sup>
注：与GFP-Ecoli模型组相比，▲p<0.05。
结果(3)，如表6显示，与GFP-E.coli模型组相比，虫草菌丝干预增加腹腔内吞噬细菌的髓系细胞数量，其中巨噬细胞数量显著增加(▲，p<0.05)。
表6腹腔吞噬GFP-E coli的髓系细胞数量(x±s)
粒细胞 单核细胞 巨噬细胞
模型组 9223±9126 138047±110297 28879±28200
虫草菌丝组 48769±60142 286218±233003 140992±84786<sup>▲</sup>
注：与GFP-Ecoli模型组相比，▲p<0.05。
结果(4)如表7显示，与GFP-E.coli模型组相比，虫草菌丝干预显著增加腹腔内粒细胞吞噬GFP-E.coli细菌的量(▲，p<0.05)。
表7腹腔髓系细胞吞噬的GFP-E coli(x±s,MFI)
粒细胞 单核细胞 巨噬细胞
模型组 1129.83±383.66 1664.33±524.33 835.33±206.30
虫草菌丝组 1947.17±664.54<sup>▲</sup> 1786.17±775.40 797.00±110.76
注：与GFP-Ecoli模型组相比，▲p<0.05。
综上所述，虫草菌丝能促进髓系细胞进入腹腔，并且增强髓系细胞吞噬、杀菌功能。虫草菌丝可用作细菌性脓毒症治疗的药物。
实验例14虫草菌丝对脓毒症小鼠Beads、LPS±Beads模型的吞噬作用的影响
试验材料：LPS,Latex beads购自Sigma公司；
实验药物：实施例1制备的虫草菌丝混悬液(浓度：85mg/ml)
动物：C57BL/6小鼠，雄性，18-20g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司适应性饲养1天后，随机分为4组，每组5只：磁珠组，虫草菌丝+磁珠组，内毒素+磁珠组和虫草菌丝+内毒素+磁珠组。
模型制备和给药处理：制备LPS储液为10mg/ml，使用浓度为LPS(10mg/kg)，即10mg/kg LPS/0.2ml/只；制备beads悬液：1ml含beads颗粒为4.56×1011，每只小鼠需要beads为5×107，即5×107/0.2ml/只；制备LPS-beads悬液；每组6只，C57BL/6小鼠分别给予250μL双蒸水和虫草菌丝混悬液灌胃，剂量为850mg/kg。在灌胃1.5小时后，开始小鼠腹腔分别单次注射beads悬液和LPS-beads悬液，每只间隔5分钟，于注射后3小时取材。将小鼠颈椎脱臼处死，对照组腹腔注射5ml生理盐水，轻揉小鼠腹部2-3分钟，静置5分钟后，剪开小鼠腹部皮肤，用注射器抽取腹腔灌洗液。
(1)腹腔灌洗液显微镜下细胞计数；
(2)1200rpm，离心5分钟，分离获取腹腔细胞，细胞中加入1％多聚甲醛固定，加入混合抗体(Percp-Cy5.5-CD11b，APC-Gr-1，PE-F4/80)进行流式染色后，流式细胞仪检测腹腔细胞及吞噬beads的髓系细胞。同时，取正常小鼠腹腔灌洗液和骨髓，调补偿。
结果：结果(1)如表8显示，与单注射磁珠组相比，虫草菌丝干预显著增加腹腔白细胞数量(*，p<0.05)；与注射内毒素+磁珠组相比，虫草菌丝干预显著增加腹腔白细胞数量(▲，p<0.05)。说明虫草菌丝能促进白细胞进入腹腔。
表8腹腔白细胞数量变化(x±s)
白细胞
磁珠组 6490000±1809834
虫草菌丝+磁珠组 13750000±5429180*
内毒素+磁珠组 3955000±1891791
虫草菌丝+内毒素+磁珠组 14055000±7953122<sup>▲</sup>
注：与磁珠组相比，*p<0.05；与内毒素+磁珠组相比，▲p<0.05。
结果(2)如表9显示，与单注射磁珠组相比，虫草菌丝干预显著增加腹腔吞噬磁珠的单核细胞和巨噬细胞数量(*，p<0.05)；与注射内毒素+磁珠组相比，虫草菌丝干预显著增加腹腔吞噬磁珠的粒细胞、单核细胞和巨噬细胞数量(▲，p<0.05)。说明虫草菌丝能髓系细胞吞噬功能。
表9腹腔吞噬磁珠的髓系细胞数量(x±s)
Figure GDA0003487097020000161
注：与磁珠组相比，*p<0.05；与内毒素+磁珠组相比，▲p<0.05。
综合以上结果，虫草菌丝能促进天然免疫细胞即粒细胞、单核细胞和巨噬细胞迁移至感染部位，增强髓系细胞吞噬和杀菌功能，具有广泛的免疫调节作用。因此，虫草菌丝糖肽或包含虫草菌丝糖肽中药提取物的药物组合物、或者包含虫草菌丝的中药组合物等具有明显的促进髓系细胞吞噬作用，可用作制备免疫调节药物或功能性保健品。除非特别限定，本发明所用术语均为本领域技术人员通常理解的含义。
实施例15虫草菌丝糖蛋白、虫草菌丝蛋白、虫草菌丝多糖的鉴定
采用SDS-PAGE电泳进行鉴定。配制15％分离胶液，5％的浓缩胶液，灌制凝胶，待凝胶凝聚后，加样(实施例2制备的虫草菌丝糖蛋白、实施例3制备的虫草菌丝多糖和虫草菌丝蛋白、实施例4制备的虫草菌丝多糖和实施例5制备的虫草菌丝蛋白)进行SDS-PAGE电泳。程序设定为开始电压为50V，样品走出浓缩胶后改为110V。电泳结束后取出分离胶，固定4h以上，放入考马斯亮蓝染色液中染色1小时，转入10％乙酸中脱色，脱至凝胶考马思亮蓝背景消失。结果见图7、8。

Claims (1)

1.虫草菌丝糖蛋白在制备治疗脓毒症的药物中的应用，其特征在于，所述虫草菌丝糖蛋白按如下方法制备：
虫草菌丝粉：水按1:7的比例100℃水浴2小时，冷却后3000 rpm离心15分钟，取上清依次通过5μm→1μm→0.45μm→0.22μm滤膜过滤，过滤后的虫草菌丝水提取液，用5倍95%乙醇调整至乙醇浓度为81%，-20℃沉淀过夜，3000 rpm离心15分钟，过0.45μm的Whatman滤膜得到的沉淀物即为虫草菌丝糖蛋白，真空干燥，得到虫草菌丝糖蛋白。
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