CN111989402A - 肌酐脱亚氨酶及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明广泛地涉及肌酐测定领域。特别地，本发明提供了新颖的肌酐脱亚氨酶，其特征在于新颖的核酸和氨基酸序列以及优异的酶促活性。本发明还提供了这种肌酐脱亚氨酶的用途，包括确定样品中肌酐含量的方法。这些尤其可以用于检测肾脏疾病。
Description
技术领域
本发明广泛地涉及肌酐测定领域。特别地，本发明提供了新颖的肌酐脱亚氨酶，其特征在于新颖的核酸和氨基酸序列以及优异的酶促活性。本发明还提供了这种肌酐脱亚氨酶的用途，包括确定样品中肌酐含量的方法。这些尤其可以用于检测肾脏疾病。
背景技术
肌酐脱亚氨酶也称为肌酐酰胺水解酶(EC 3.5.4.21)，催化肌酐水解为N-甲基乙内酰脲，从而释放氨。它参与细菌代谢中肌酐的降解，并且对于尿液和血清中肌酐的诊断测定具有重要意义。肌酐脱亚氨酶是一种金属蛋白，而Zn2+和Fe2+对其活化有效。相关酶，即胞嘧啶脱氨酶的3D结构表明，Zn2+和Fe2+离子作为此类酶中的催化金属离子存在于活性位点。基于该结构，还可能生成来自肌酐泰氏菌(Tissierella creatinini)的肌酐脱亚氨酶的3D结构模型，其蛋白质序列在EP1325958A1中描述为SEQ ID NO：1。在该结构模型中，Zn2+原子位于活性位点(Nishiya，Int J Anal Bio-Sci，1：55-59，2013)。
已知来自肌酐泰氏菌的肌酐脱亚氨酶对于肌酐诊断分析中的应用具有优越的性能。EP1325958A1描述了该酶的分子克隆和重组表达。然而，到目前为止，就发明人所知，科学或专利文献中没有关于EP1325958A1的重组酶的重组生产或使用的报道。
发明人试图根据EP1325958A1中描述的序列信息和表达设置建立肌酐脱亚氨酶的重组生产方法。然而，所有尝试均以失败告终，因为EP1325958A1的教导导致了无酶促活性的肌酐脱亚氨酶蛋白。然后发明人发现肌酐脱亚氨酶的核苷酸和氨基酸序列不同于EP1325958A1中教导的那些，产生了活性蛋白。特别地，发明人在表达和活性分析实验中发现未翻译的区域能够或促进活性肌酐泰氏菌肌酐脱亚氨酶的表达。足够高的表达水平对于酶应用的商业化至关重要。
此外，发明人发现使用Mn2+作为催化金属离子增加了肌酐脱亚氨酶的活性和稳定性。与可商购获得的肌酐脱亚氨酶相比，在Mn2+负载下，该酶表现出优异的性能。
发明内容
在第一方面，本发明涉及一种经分离的肌酐脱亚氨酶多肽，其包含根据SEQ IDNO：4的氨基酸序列或其至少80％序列同一性变体，其中经分离的肌酐脱亚氨酶多肽具有肌酐脱亚氨酶活性。
在第二方面，本发明涉及编码如第一方面所定义的肌酐脱亚氨酶多肽的经分离的核酸。
在第三方面，本发明涉及包含第二方面的核酸的载体。
在第四方面，本发明涉及一种细胞，其包含第一方面的多肽、第二方面的核酸或第三方面的载体。
在第五方面，本发明涉及制备第一方面中所定义的肌酐脱亚氨酶多肽的方法，其包括以下步骤：
(i)在第四方面所定义的细胞中表达第二方面所定义的核酸，和
(ii)分离肌酐脱亚氨酶多肽。
在第六方面，本发明涉及用第五方面所定义的方法制备的肌酐脱亚氨酶多肽。
在第七方面，本发明涉及在第一方面或第六方面中定义的肌酐脱亚氨酶多肽在确定样品中肌酐含量中的用途。
在第八方面，本发明涉及一种适合于确定样品中肌酐含量的试剂盒，其包含第一方面或第六方面中所定义的肌酐脱亚氨酶多肽。
在第九方面，本发明涉及一种适合于确定样品中肌酐含量的组合物，其包含第一方面或第六方面中所定义的肌酐脱亚氨酶多肽。
在第十方面，本发明涉及一种用于检测对象的肾脏疾病的体外方法，其包括第七方面所定义的确定来自对象的样品中的肌酐含量，其中肌酐的量大于正常值表示对象患有肾脏疾病。
附图说明
图1：用于表达肌酐脱亚氨酶的克隆策略(解释参见实施例2)。A：策略1；B：策略2。
图2：表达克隆全细胞裂解物的SDS Page分析。可以清楚地看到，与衍生自基因组DNA的克隆的蛋白相比，衍生自合成DNA的克隆的蛋白迁移速度更快。策略2的所有克隆均未表达可见量的肌酐脱亚氨酶蛋白。
| 泳道 | 克隆编号 | 温度 | 构建体 |
| 1 | 1 | 28℃ | 基因组(seq ID 3)，策略1，方向1 |
| 2 | 1 | 25℃ | 基因组(seq ID 3)，策略1，方向1 |
| 3 | 2 | 28℃ | 基因组(seq ID 3)，策略1，方向2 |
| 4 | 2 | 25℃ | 基因组(seq ID 3)，策略1，方向2 |
| 5 | 8 | 28℃ | 合成(seq ID 2)，策略1，方向1 |
| 6 | 8 | 25℃ | 合成(seq ID 2)，策略1，方向1 |
| 7 | 9 | 28℃ | 合成(seq ID 2)，策略1，方向2 |
| 8 | 9 | 25℃ | 合成(seq ID 2)，策略1，方向2 |
| 9 | 17 | 28℃ | 合成(seq ID 2)，策略2，C端His标签 |
| 10 | 17 | 25℃ | 合成(seq ID 2)，策略2，C端His标签 |
| 11 | EVC | 28℃ | 空载体对照(pMS470) |
| 12 | 标准 | 5ul page ruler尺寸标准 | |
| 13 | 21 | 28℃ | 合成(seq ID 2)，策略2，N端His标签 |
| 14 | 21 | 25℃ | 合成(seq ID 2)，策略2，N端His标签 |
| 15 | 13 | 28℃ | 合成(seq ID 2)，策略2，无标签 |
图3：通过离心分级分离获得的蛋白级分的SDS Page分析。
图4：克隆的活性分析。a：克隆1，16000g上清液，b：ctHis无肌酐，c：经纯化的ctHis1∶10，d：克隆1，无肌酐，e：ctHis 16000g上清液，f：克隆8，16000g上清液。克隆1：基因片段，策略1，方向1；克隆8：合成片段，策略1，方向1；ctHis：基因片段，策略1，方向1，C末端插入His标签(见图1)。经纯化的ctHis：通过镍螯合物色谱法纯化的蛋白质。
图5：带有Hs标签的变体的沉淀和上清液级分的SDS PAGE分析。将无标签的变体克隆1和克隆8作为参考。通过NADH消耗的斜率半定量地估计了裂解物的活性。有关构建体，请参见图1(克隆1和8)和图6(克隆3h、4H、6h和11h)；n.d.：不确定
图6：来自克隆1h的Ni螯合物层析纯化的裂解物和洗脱级分的SDS PAGE。将无标签的克隆8和1的沉淀和上清液级分作为参考。
| 泳道 | |
| 1 | 克隆8 16000g沉淀 |
| 2 | 克隆1 16000g上清液 |
| 3 | 粗裂解物(超声处理) |
| 4 | 16000g沉淀 |
| 5 | 16000g上清液 |
| 6 | 16000g上清液，无菌过滤 |
| 7 | 穿流 |
| 8 | 冲洗 |
| 9 | 洗脱级分1 |
| 10 | 洗脱级分2 |
| 11 | 洗脱级分3 |
| 12 | 洗脱级分4 |
| 13 | 洗脱级分5 |
| 14 | 标准 |
| 15 | 选取洗脱级分F1-F3脱盐 |
图7：肌酐脱亚氨酶蛋白制剂的SDS Page。根据确定的蛋白浓度，每种蛋白上样了0.7μg的蛋白(将克隆1和11用作参考)。将克隆1(泳道2)作为16000 x g上清液制剂使用，将克隆1h和11h作为Ni螯合物纯化的蛋白制剂使用。由于尚不清楚在Toyobo酶制剂中有什么作为稳定剂，因此制备溶液的酶量被称重。
| 泳道 | 酶 | 构建体 | 凝胶上样的蛋白质，μg |
| 2 | 克隆1 | 基因组，无标签 | 0.7μg |
| 3 | 标准 | 0.7μg | |
| 4 | 克隆11h | 基因组，N-长，5′和3′ | 0.7μg |
| 5 | Toyobo | 购买的制剂 | 0.7μg |
| 6 | 克隆1h | 基因组，C-长，5′和3′ | 0.7μg |
图8：从来自肌酐泰氏菌的肌酐脱亚氨酶和可商购获得的Toyobo制剂的活性分析得出的反应曲线。详细信息参见实施例5。A：1μg肌酐脱亚氨酶蛋白。B：1μg肌酐脱亚氨酶蛋白。a：空白，b：Toyobo，c：克隆1h，d：克隆11h。
图9：来自稳定性测试的样品的SDS PAGE分析。将每种样品20μg的蛋白上样到凝胶上。
| 泳道 | 样品 |
| 1 | 20℃下储存，融解(0天) |
| 2 | 4℃下储存，25天 |
| 3 | 23℃下储存，25天 |
| 4 | 37℃下储存，25天 |
图10：用来自肌酐泰氏菌的肌酐脱亚氨酶测定肌酐。来自2个独立测定值的ΔE值取自10分钟(三角形和正方形)和20分钟(点和十字)的反应时间。
图11：裂解物和纯化蛋白的SDS凝胶分析。泳道1和5；尺寸标准(Page Ruler预染蛋白梯)；泳道2：细胞裂解物；泳道3：2μg纯化蛋白；泳道4：5μg纯化蛋白。
图12：金属负载蛋白制剂(Cdi-金属交换)的比活性。WT：未经处理的蛋白(在培养基中添加了Mn2+而制备的)；Mn、Mn+Fe、Mn+Zn、F+Zn和Mn+Fe+Zn：分别用金属2+离子处理的Apo蛋白(WT的金属提取制剂)。
具体实施方式
在下面详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于本文描述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求书来限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。
优选地，本文所用术语的定义如“A multilingual glossary ofbiotechnological terms：(IUPAC Recommendations)”，Leuenberger，H.G.W，Nagel，B.and
H.eds.(1995)，Helvetica Chimica Acta，CH-4010 Basel，Switzerland中所述。
在本说明书的全文中引用了一些文件。本文所引用的每个文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明等)，无论是上文还是下文，均通过引用整体并入本文。本文中的任何内容均不应解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于这些公开。
在下文中，将描述本发明的要素。这些要素与特定实施方案一起列出，但是，应该理解，它们可以以任何方式和任何数量组合以创建其他实施方案。各种描述的实施例和优选实施方案不应被解释为将本发明限制为仅明确描述的实施方案。说明书应被理解为支持并包含将明确描述的实施方案与任何数量的公开和/或优选要素相结合的实施方案。此外，除非上下文另外指出，否则应认为本申请的说明书中公开了本申请中所有所描述要素的任何排列和组合。
在整个本说明书和随后的权利要求中，除非上下文另有要求，词语“包括”及其变体，例如“包含”和“含有”，应理解为暗示包括所述整数或步骤或一组整数或步骤，但不排除任何其他整数或步骤或其他组整数或步骤。如本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非内容另外明确指出，不使用数量词包括复数个指示物。
本发明的各方面及其特定实施方案
在第一方面，本发明涉及一种经分离的肌酐脱亚氨酶多肽，其包含根据SEQ IDNO：4的氨基酸序列或其至少80％序列同一性变体，其中所述经分离的肌酐脱亚氨酶多肽具有肌酐脱亚氨酶活性。
本文中提及的经分离的肌酐脱亚氨酶多肽包括包含根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列的多肽及其变体。
根据第一方面，经分离的肌酐脱亚氨酶多肽具有酶活性。包含根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列的肌酐脱亚氨酶多肽的活性在0.002mg/ml至0.02mg/ml(例如0.005mg/ml)的肌酐脱亚氨酶多肽的浓度下优选为至少10U/mg，更优选为至少15U/mg，或在0.002mg/ml的肌酐脱亚氨酶多肽的浓度下至少20U/mg，更优选至少24U/mg。变体具有经分离的肌酐脱亚氨酶多肽的酶活性的至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，至少80％，至少90％或至少95％，最优选活性相同(理想情况，100％)。
经分离的肌酐脱亚氨酶多肽优选是可溶的。
在一个优选的实施方案中，不管序列同一性的最低水平如何，变体的序列都保留以下一个或多于一个：
-SEQ ID NO：4的第364位氨基酸，
-SEQ ID NO：4的371氨基酸，
-SEQ ID NO：4的394氨基酸，和/或
-SEQ ID NO：4的第410至419位氨基酸残基中的一个或多于一个，优选全部。
在另一个优选的实施方案中，经分离的肌酐脱亚氨酶多肽结合或能够结合至少一种金属双正离子，所述金属双正离子例如选自Zn2+、Fe2+、Ni2+和Mn2+，优选Mn2+。在一个实施方案中，它与Mn2+结合，还任选地与Zn2+或Fe2+结合。任选的Zn2+或Fe2+中，Zn2+是优选的。
如下面的第五方面和第六方面所暗示的，本发明还涉及多个第一方面的肌酐脱亚氨酶多肽。在一个特定的实施方案中，多个肌酐脱亚氨酶多肽中Mn2+与肌酐脱亚氨酶多肽的摩尔比至少为0.05或0.10(金属：蛋白亚基)，优选至少0.15(例如至少0.17、0.18、0.21或0.23)，更优选至少0.25。根据本发明的Mn2+的理论上限为2(金属双正离子可结合至两个蛋白亚基的每一个)，其可以与上述各下限组合。在一个优选的实施方案中，Mn2+的上限为1，其也可以与上述各下限组合。在另一个优选的实施方案中，Mn2+的上限为0.5，其也可以与上述各下限组合。
优选地，在这个特定实施方案中，多个肌酐脱亚氨酶多肽中Zn2+与肌酐脱亚氨酶多肽的摩尔比至少为0.05或0.15(金属：蛋白亚基)，优选至少0.25(例如至少0.3、0.4或0.5)，最优选至少0.52。根据本发明的Zn2+的理论上限为2减去选择的Mn2+的最小比，例如如果Mn2+的最小比为0.05，则为1.95，或者，如果还包含Fe2+(参见下文)，则为2减去选择的Mn2+的最小比并减去选择的Fe2+的最小比。其可以与上述每个Zn2+下限组合。在一个优选的实施方案中，Zn2+的上限为1.6，其也可以与上述各下限组合。在另一个优选的实施方案中，Zn2+的上限为1.3，其也可以与上述各下限组合。
在这个特定实施方案中，还设想了多个肌酐脱亚氨酶多肽中Fe2+与肌酐脱亚氨酶多肽的摩尔比至少为0.05或0.10(金属：蛋白亚基)，优选至少0.15(例如至少0.2、0.25或0.3)，最优选至少0.42。根据本发明的Fe2+的理论上限为2减去选择的Mn2+的最小比，例如如果Mn2+的最小比为0.05，则为1.95，或者，如果还包含Zn2+(参见下文)，则为2减去选择的Mn2+的最小比并减去选择的Zn2+的最小比。其可以与上述每个Fe2+下限组合。在一个优选的实施方案中，Fe2+的上限为1.2，其也可以与上述各下限组合。在另一个优选的实施方案中，Fe2+的上限为0.7，其也可以与上述各下限组合。
在不同的优选实施方案中，多个肌酐脱亚氨酶多肽中与肌酐脱亚氨酶多肽的摩尔比如下(金属：蛋白亚基；在每个实施方案中，摩尔比的上限对于Mn2+优选为1，对于Zn2+为1.5)：
Mn2+：至少0.05和上述任意比的Zn2+(和任选地不大于1的Fe2+)；
Mn2+：至少0.10和上述任意比的Zn2+(和任选地不大于1的Fe2+)；
Mn2+：至少0.15和上述任意比的Zn2+(和任选地不大于1的Fe2+)；
Mn2+：至少0.17和上述任意比的Zn2+(和任选地不大于1的Fe2+)；
Mn2+：至少0.19和上述任意比的Zn2+(和任选地不大于1的Fe2+)；
Mn2+：至少0.21和上述任意比的Zn2+(和任选地不大于1的Fe2+)；
Mn2+：至少0.23和上述任意比的Zn2+(和任选地不大于1的Fe2+)；
Mn2+：至少0.25和上述任意比的Zn2+(和任选地不大于1的Fe2+)。
应当理解，Mn2+、Zn2+和/或Fe2+的任意组合的总金属：蛋白亚基之比最多为2。由于不一定所有活性位点都被金属占据，因此它也可以低于2，例如至多为1.9、1.7或1.5。在一个优选的实施方案中，Mn2+、Zn2+和/或Fe2+的总和：蛋白亚基的比率为1至2，优选为1.3至2，更优选为1.5(或1.6)至1.9，最优选为1.7至1.85。
在另一个优选的实施方案中，多个肌酐脱亚氨酶多肽中的肌酐脱亚氨酶多肽的至少1％、至少2％或至少3％，优选至少5％，更优选至少7％，最优选至少10％(例如至少15％或至少19％)包含结合Mn2+的活性位点。
经分离的肌酐脱亚氨酶多肽可包含C末端或N末端标签，优选His标签。
此外，经分离的肌酐脱亚氨酶多肽可在标签和根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列或其变体之间包含肽接头。接头的长度优选为2个至20个氨基酸，更优选3个至15个或4个至10个氨基酸，例如5个氨基酸。肽接头优选是可切割的，例如由于包含蛋白酶切割位点，即被蛋白酶识别和切割的切割位点而可切割。蛋白酶优选对切割位点的序列具有特异性，即，它仅在切割位点才识别和切割分离的肌酐脱亚氨酶多肽。序列特异性蛋白酶是众所周知的。优选地，蛋白酶是肠肽酶。示例性的切割位点是凝血酶切割位点(SEQ ID NO：9的第4至9位残基)。
在第二方面，本发明涉及编码如第一方面所定义的肌酐脱亚氨酶多肽的经分离的核酸。该经分离的核酸优选包含根据SEQ ID NO：3的核苷酸的第115至1374位核苷酸序列或其至少80％序列同一性变体。SEQ ID NO：3的第1372至1374位核苷酸表示终止密码子TAA，其可以交换为不同的终止密码子TAG或TGA。特别优选的是，无论序列同一性的最低水平如何，变体的序列都保留SEQ ID NO：3的第1204、1205、1225、1295和/或1314位核苷酸中的一个或多于一个。
在一个优选的实施方案中，第二方面的经分离的核酸包含肌酐泰氏菌肌酐脱亚氨酶5′UTR。优选地，5′UTR包含SEQ ID NO：3的至少第105至114位核苷酸(范围1)、至少第95至114位核苷酸(范围2)、至少第75至114位核苷酸(范围3)、至少第65至114位核苷酸(范围4)、至少第55至114位核苷酸(范围5)、至少第45至114位核苷酸(范围6)、至少第35至114位核苷酸(范围7)、至少第25至114位核苷酸(范围8)、至少第15至114位核苷酸(范围9)、至少第5至114位核苷酸(范围10)或至少第1至114位核苷酸(范围11)(每个范围都比前一个优选)，或其至少80％序列同一性变体。5′UTR的特征优选在于其改善或确定核酸编码的肌酐脱亚氨酶多肽的表达和/或肌酐脱亚氨酶活性。改善或确定表达可指可溶形式的总表达水平和/或表达的多肽的量，例如占包括不可溶多肽在内的总量的比例。
此外，优选地，特别是除上述5′UTR之外，第二方面的经分离的核酸特别还包含肌酐泰氏菌肌酐脱亚氨酶3′UTR。优选地，3′UTR包含SEQ ID NO：3的至少第1375至1394位氨基酸(范围1)、至少第1375至1414位氨基酸(范围2)、至少第1375至1434位氨基酸(范围3)、至少第1375至1454位氨基酸(范围4)、至少第1375至1474位氨基酸(范围5)、至少第1375至1494位氨基酸(范围6)、至少第1375至1514位氨基酸(范围7)、至少第1375至1524位氨基酸(范围8)、至少第1375至1544位氨基酸(范围9)、至少第1375至1564位氨基酸(范围10)或至少第1375至1594位氨基酸(范围11)(每个范围都比前一个优选)，或其至少80％序列同一性变体。特别优选的是，无论序列同一性的最低水平如何，该变体的序列都保留SEQ ID NO：3的核苷酸1524。3′UTR的特征优选在于其改善核酸编码的肌酐脱亚氨酶多肽的表达和/或肌酐脱亚氨酶活性。改善的表达具有上述定义。
在第二方面的经分离的核酸包含5′UTR和3′UTR两者的实施方案中，每个前述5′UTR范围可以与每个前述3′UTR范围组合。但是，优选将相应的范围1相互组合，或者将相应的范围1与范围2、3、4、5、6、7、8、9、10或11组合(每种组合都比前一种更优选)。
在一个优选的实施方案中，第二方面的经分离的核酸包含SEQ ID NO：3的至少第1至1374位核苷酸或其至少80％序列同一性变体。在一个更优选的实施方案中，它包含SEQID NO：3的第1至1594位核苷酸或其至少80％序列同一性变体。
任选地，对于上述任意序列，经分离的核酸可包含编码如上所述的标签的核酸序列，其插入根据SEQ ID NO：3的第115至1374位核苷酸或其变体的核苷酸序列的3′或5′端。该核酸还可以包含编码如上所述的肽接头的核酸序列，其插入编码标签的核酸序列和根据SEQ ID NO：3的第115至1374位核苷酸或其变体的核苷酸序列之间。
在第三方面，本发明涉及包含第二方面的核酸的载体。载体优选还包含与第二方面的核酸可操作连接的启动子。启动子可以是诱导型或组成型的。
在第四方面，本发明涉及一种细胞，其包含第一方面的多肽、第二方面的核酸或第三方面的载体。尽管细胞可以是真核细胞，但其优选是原核细胞，更优选是细菌细胞。细菌细胞的优选实例是大肠杆菌细胞。细胞不为肌酐泰氏菌细胞。
在第五方面，本发明涉及制备第一方面中所定义的经分离的肌酐脱亚氨酶多肽的方法，其包括以下步骤：
(i)在第四方面所定义的细胞中表达第二方面所定义的核酸，和
(ii)分离肌酐脱亚氨酶多肽。
优选地，经分离的肌酐脱亚氨酶多肽是可溶的。
在一个优选的实施方案中，该方法是制备如第一方面所定义的肌酐脱亚氨酶多肽的方法，其中在步骤(ii)中，分离肌酐脱亚氨酶多肽。
优选地，第五方面中所述方法的步骤(i)包括在包含一种或多于一种金属双正离子的培养基中培养细胞。在一个实施方案中，一种或多于一种金属双正离子选自Zn2+、Fe2+和Mn2+。例如，培养基可以包含Zn2+和/或Fe2+。然而，优选地，其包含Mn2+，并且任选地还包含Zn2+和/或Fe2+。任选的Zn2+和/或Fe2+中，Zn2+是优选的。设想培养基中每种金属双正离子，特别是Mn2+的浓度至少与步骤(i)中表达的肌酐脱亚氨酶多肽的浓度等摩尔。培养基中每种金属双正离子，特别是Mn2+的优选浓度为至少0.05mM，优选至少0.1mM，或为0.05mM至0.2mM，优选约0.1mM。
当添加到如第四方面所定义的细胞中时，培养基可以包含一种或多于一种金属双正离子，或者可以在步骤(i)中，优选在诱导核酸表达时或之前立即将一种或多于一种金属双正离子，特别是Fe2+、Zn2+和/或Mn2+，优选Mn2+(更优选Mn2+以及Zn2+和/或Fe2+，其中Zn2+是优选的)添加到培养基中。当添加到如第四方面所定义的细胞中时，培养基还可包含一种或多于一种金属双正离子，特别是Fe2+、Zn2+和/或Mn2+，优选Fe2+和/或Zn2+，尤其可以在步骤(i)中，优选在诱导核酸表达时或在诱导核酸之前立即，向培养基中进一步补充已经包含在培养基中的一种或多于一种金属双正离子(特别是Fe2+、Zn2+和/或Mn2+，优选Fe2+和/或Zn2 +)。在诱导核酸之前立即可以是之前最多60分钟，优选最多30分钟，更优选最多5分钟。在一个实施方案中，如上所述，将Mn2+添加到包含Fe2+和/或Zn2+的培养基中，并且如上所述，任选地还向该培养基补充Fe2+和/或Zn2+。发明人出乎意料的发现，Mn2+的添加对产生具有酶促活性的肌酐脱亚氨酶多肽具有显著的积极作用。
在一个优选的实施方案中，第五方面中所述方法的步骤(ii)包括裂解和离心细胞并保留上清液。然后从上清液中分离出肌酐脱亚氨酶多肽。
用于蛋白质分离的方法是本领域已知的，并且包括例如色谱法(包括但不限于IMAC，例如Ni螯合物色谱法和离子交换色谱法)。
还优选地，第五方面中所述方法的步骤(ii)包括减少，优选消除消耗NADH的酶的量。这样的酶可以包含在步骤(i)的细胞中。
在第六方面，本发明涉及用第五方面所定义的方法制备的肌酐脱亚氨酶多肽。它还涉及一种分离物，其包含用第五方面中定义的方法制备的肌酐脱亚氨酶多肽。
优选地，肌酐脱亚氨酶多肽是可溶的。
以这种方式产生的肌酐脱亚氨酶多肽优选包含结合一种或多于一种选自Zn2+、Fe2 +、Ni2+和Mn2+的金属双正离子的活性位点。优选的是，一种或多于一种金属双正离子中的至少一种是Mn2+。如在第五方面中所定义的方法所暗示，所述分离物包含多个肌酐脱亚氨酶多肽。在一个特定的实施方案中，在分离物中，特别是在包含多个肌酐脱亚氨酶多肽的分离物中，Mn2+与肌酐脱亚氨酶多肽的摩尔比至少为0.05或0.10(金属：蛋白亚基)，优选至少0.15(例如至少0.17、0.19、0.21或0.23)，更优选至少0.25。根据本发明的Mn2+的理论上限为2(金属双正离子可结合至两个蛋白亚基的每一个)，其可以与上述各下限组合。在一个优选的实施方案中，Mn2+的上限为1，其也可以与上述各下限组合。在另一个优选的实施方案中，Mn2+的上限为0.5，其也可以与上述各下限组合。
优选地，在这个特定实施方案中，在分离物中，特别是在包含多个肌酐脱亚氨酶多肽的分离物中，Zn2+与肌酐脱亚氨酶多肽的摩尔比至少为0.05或0.15(金属：蛋白亚基)，优选至少0.25(例如至少0.3、0.4或0.5)，最优选至少0.52。根据本发明的Zn2+的理论上限为2减去选择的Mn2+的最小比，例如如果Mn2+的最小比为0.05，则为1.95，或者，如果还包含Fe2+(参见下文)，则为2减去选择的Mn2+的最小比并减去选择的Fe2+的最小比。其可以与上述每个Zn2+下限组合。在一个优选的实施方案中，Zn2+的上限为1.6，其也可以与上述各下限组合。在另一个优选的实施方案中，Zn2+的上限为1.3，其也可以与上述各下限组合。
在这个特定实施方案中，还设想了在分离物中，特别是在包含多个肌酐脱亚氨酶多肽的分离物中，Fe2+与肌酐脱亚氨酶多肽的摩尔比至少为0.05或0.10(金属：蛋白亚基)，优选至少0.15(例如至少0.2、0.25或0.3)，最优选至少0.42。根据本发明的Fe2+的理论上限为2减去选择的Mn2+的最小比，例如如果Mn2+的最小比为0.05，则为1.95，或者，如果还包含Zn2+(参见下文)，则为2减去选择的Mn2+的最小比并减去选择的Zn2+的最小比。其可以与上述每个Fe2+下限组合。在一个优选的实施方案中，Fe2+的上限为1.2，其也可以与上述各下限组合。在另一个优选的实施方案中，Fe2+的上限为0.7，其也可以与上述各下限组合。
在不同的优选实施方案中，多个肌酐脱亚氨酶多肽中与肌酐脱亚氨酶多肽的摩尔比如下(金属：蛋白亚基；在每个实施方案中，摩尔比的上限对于Mn2+优选为1，对于Zn2+为1.5)：
Mn2+：至少0.05和上述任意比的Zn2+(和任选地不大于1的Fe2+)；
Mn2+：至少0.10和上述任意比的Zn2+(和任选地不大于1的Fe2+)；
Mn2+：至少0.15和上述任意比的Zn2+(和任选地不大于1的Fe2+)；
Mn2+：至少0.17和上述任意比的Zn2+(和任选地不大于1的Fe2+)；
Mn2+：至少0.19和上述任意比的Zn2+(和任选地不大于1的Fe2+)；
Mn2+：至少0.21和上述任意比的Zn2+(和任选地不大于1的Fe2+)；
Mn2+：至少0.23和上述任意比的Zn2+(和任选地不大于1的Fe2+)；
Mn2+：至少0.25和上述任意比的Zn2+(和任选地不大于1的Fe2+)。
应当理解，Mn2+、Zn2+和/或Fe2+的任意组合的总金属：蛋白亚基之比最多为2。由于不一定所有活性位点都被金属占据，因此它也可以低于2，例如至多为1.9、1.7或1.5。在一个优选的实施方案中，Mn2+、Zn2+和/或Fe2+的总和：蛋白亚基的比率为1至2，优选为1.3至2，更优选为1.5(或1.6)至1.9，最优选为1.7至1.85。还应理解，当称为分离物时，如果在分离过程中未除去不与肌酐脱亚氨酶多肽结合的金属离子，则该分离物可包含这些其他金属离子。
在另一个优选的实施方案中，多个肌酐脱亚氨酶多肽中的肌酐脱亚氨酶多肽的至少1％、至少2％或至少3％，优选至少5％，更优选至少7％，最优选至少10％(例如至少15％或至少19％)包含结合Mn2+的活性位点。
在第七方面，本发明涉及第一方面或第六方面中定义的肌酐脱亚氨酶多肽或第六方面的分离物在确定样品中肌酐含量中的用途。特别地，本发明涉及一种确定样品中肌酐含量的方法，包括以下步骤：
(a)使样品与第一方面或第六方面中所定义的肌酐脱亚氨酶多肽或第六方面中所定义的分离物接触，以将样品中的肌酐转化为N-甲基乙内酰脲和NH3/4 +，和
(b)对步骤(a)的转化进行量化。
转化量，例如转化前体的减少或转化产物的增加表明肌酐的量。为此，可以使用已知的肌酐量作为参考转化值。
在步骤(a)的接触之后，产生NH3/4 +。NH3/4 +在本文中是指NH3或NH4 +，或两种化合物的混合物(即产生了NH3或NH4 +两者)。在水溶液中，NH3和NH4 +处于平衡状态。平衡状态的平衡取决于pH，NH3的pKa值为9.25。在pH值小于9.25时，转化产生的NH4 +比NH3多；在pH值大于9.25时，转化产生的NH3比NH4 +多。在9.25的pH值下产生基本上相同量的NH3和NH4 +。
样品通常是但不一定是来自对象的样品，优选是体液样品。优选的体液样品是血液、血清、血浆和尿液。
所述对象优选选自实验室动物(例如小鼠或大鼠)、家畜(包括豚鼠、兔子、马、驴、牛、绵羊、山羊、猪、鸡、骆驼、猫、狗、鳖、乌龟、蛇或蜥蜴)或灵长类动物，包括黑猩猩、倭黑猩猩、大猩猩和人类。特别优选是人类。
在一个优选的实施方案中，该方法的步骤(b)包括确定步骤(a)中产生的NH3/4 +或N-甲基乙内酰脲的量。例如，这可以在一个实施方案中实现，其中步骤(a)还包括使样品与NADPH(或NADH)、α-酮戊二酸和谷氨酸脱氢酶接触以将NH3/4 +(优选NH4 +)、α-酮戊二酸和NADPH(或NADH)转化为谷氨酸和NADP+(或NAD+，分别地)，并且步骤(b)包括定量NADPH(或NADH，分别地)的消耗。这种进一步的接触可以在样品与肌酐脱亚氨酶多肽或分离物接触之前、同时或之后发生。合适的测定法是本领域已知的，例如来自Tanganelli，Clin.Chem.28/7，1461-1484(1982)。优选地，添加的NADPH(或NADH)的浓度为0.01mM至0.2mM，更优选为0.05mM至0.15mM，最优选为0.01mM。发明人发现，在该范围内，消耗的线性范围更宽。另外，除了此NADPH(或NADH)浓度之外，或独立于该NADPH(或NADH)浓度，添加的肌酐脱亚氨酶多肽的浓度为10mg/ml或低于10mg/ml，5mg/ml或低于5mg/ml，1mg/ml或低于1mg/ml，优选0.05mg/ml至0.01mg/ml(或约0.02mg/ml)，更优选0.01mg/ml至0.003mg/ml(或约0.005mg/ml)，最优选0.003mg/ml至0.001mg/ml(或约0.002mg/ml)。发明人发现在这些浓度下，酶活性是特别有利的。
在一个特别优选的实施方案中，肌酐脱亚氨酶多肽是步骤(a)中与样品接触的最后一种物质。换句话说，向转化反应中添加肌酐脱亚氨酶多肽启动了转化。
NADPH(或NADH)的消耗量可以通过光学方法测定，更具体地说，例如通过光度测定或荧光测定。光度测定包括测量反应混合物中NADPH(或NADH)光吸收的消失或消失速率，优选在340nm或其附近(例如+/-15nm)测量，参见例如Tanganelli，Clin.Chem.28/7，1461-1484(1982)。荧光测定包括测量NADPH(或NADH)荧光的消失或消失速率，优选在460nm或其附近(例如+/-15nm)测量，并且激发波长优选在340nm或其附近(例如+/-15nm)，参见例如Chen at al.，Clin.Chem.Acta，100(1980)21。
NH3/4 +的产生可以通过光学传感器确定，例如通过比色干片来确定。合适的比色干片是本领域已知的，参见例如Tofaletti等人，Clin.Chem.29/4，684-687，1983。在这种传感器中，肌酐脱亚氨酶多肽被嵌入干膜中。样品中由肌酐脱亚氨酶多肽催化的转化产生的NH3/4 +扩散过膜，优选半透膜，并通过其与pH敏感染料反应产生的颜色进行测量。术语“半透膜”是指可渗透NH3/4 +但不能渗透肌酐脱亚氨酶多肽的膜。这是通过合适的膜孔径实现的。合适的膜是本领域已知的，例如来自Tofaletti等人，Clin.Chem.29/4，684-687，1983。在优选的实施方案中，孔径小于10nm，优选小于1nm。
在步骤(a)中开始的转化也可以通过电化学方法确定，例如通过一个或多于一个电极在步骤(b)中测量转化的产物，包括例如氢离子(例如pH的变化)或铵离子。优选地，肌酐脱亚氨酶多肽直接固定在一个或多于一个电极的表面上，例如以层的形式(例如作为层或在层内)。如本领域中一样，合适的电极也可以被描述为传感器或生物传感器，参见例如Guilbault and Coulet，Anal.Letters 13(B18)1607-1624；Guilbault and Coulet，Anal.Chim.Acta，152，223-228，1983；Cou et al.，IEEE Sensors J，9，665-672，2009；Zinchenko等人，Biosens Bioelectr 35，466-469，2012。
在第八方面，本发明涉及一种适于确定样品中肌酐含量的试剂盒(或简单试剂盒)，优选地如第七方面所定义，该试剂盒包含如第一方面或第六方面所定义的肌酐脱亚氨酶多肽或第六方面所定义的分离物。在一个优选的实施方案中，试剂盒在单独的容器中还包含一种或多于一种选自适合于第七方面的用途或方法的缓冲剂(优选pH缓冲剂)、第二酶和/或其底物(例如谷氨酸脱氢酶和/或α-酮戊二酸)和NADPH(或NADH)的组分。在一个优选的实施方案中，试剂盒包含谷氨酸脱氢酶、α-酮戊二酸、以及NADPH或NADH之一。优选地，其还包含缓冲剂。
在第九方面，本发明涉及一种组合物，优选适合于确定样品中肌酐含量的传感器组合物，优选如第七方面所定义的组合物，其包含第一方面或第六方面中所定义的肌酐脱亚氨酶多肽。组合物还包含其上固定了肌酐脱亚氨酶多肽的传感器，优选电极或光学传感器(包括干片，优选比色干片)。换句话说，当组合物描述为传感器组合物时，传感器优选其上固定了肌酐脱亚氨酶多肽的电极或光学传感器(包括干片，优选比色干片)。优选地，组合物是电极组合物，即，其包括其上固定有肌酐脱亚氨酶多肽的电极，优选由其上固定有肌酐脱亚氨酶多肽的电极组成。术语传感器是指可以检测并优选地定量在第七方面所述方法的步骤(a)中开始的一个或多于一个转化产物的装置。旨在包括但不限于生物传感器、化学传感器和电传感器。本文中的“固定”是指固定在传感器上(例如，在其表面上)或在传感器中，优选以层的形式，例如作为层或在层内。“作为层”是指肌酐脱亚氨酶多肽构成该层，“在层内”是指另一种物质构成该层，并且肌酐脱亚氨酶多肽层嵌入该层内。
在第十方面，本发明涉及一种用于检测，优选诊断对象的肾脏疾病的体外方法，其包括第七方面所定义的确定来自对象的样品中的肌酐含量，其中肌酐的量大于正常值表示对象患有肾脏疾病。正常值可以是本领域已知的，或者可以从一个或多于一个对照对象样品中确定。对照对象是没有肾脏疾病的对象。正常值是本领域已知的，男性血清中示例性正常值为58μmol/L至110μmol/L，女性为46μmol/L至92μmol/L，或男性尿液中为8840μmol/天至17680μmol/天，女性为7072μmol/天至15912μmol/天。优选针对对象的年龄、种族、性别和体重中的一种或多于一种调节正常值。
在一个实施方案中，肾脏疾病的特征是肾单位功能下降。在一个优选的实施方案中，肾脏疾病是III期肾脏疾病(肾小球滤过率，GFR为30-59)、IV期肾脏疾病(GFR为15-29)或V期肾脏疾病(GFR低于15)。
在一个特定优选的实施方案中，该方法还包括确定样品中白蛋白的量，其中白蛋白与肌酐的比(ACR)为30或高于30，优选为300或高于300表明该对象患有肾脏疾病。
第十方面的方法还可以包括治疗肾脏疾病的步骤。还设想了一种治疗肾脏疾病的方法，其中已经根据第十方面的方法诊断了该对象。治疗可以包括，例如，施用一种或多于一种选自以下的药物：降低血压的药物、降低胆固醇水平的药物、治疗贫血的药物和缓解肿胀的药物。治疗还可以包括透析和/或肾脏移植。
以下描述的定义和实施方案，特别是在标题“本发明的定义和其他实施方案”下，适用于本发明的所有上述方面。而且，就任何上述方面而言，给出的定义和描述的实施方案在适用的范围内也适用于所有其他方面。
本发明的定义和其他实施方案
本规范使用各种术语和短语，它们具有如下定义的某些含义。优选的含义应被解释为本文所述的本发明各方面的优选实施方案。这样，它们以及下面描述的其他实施方案可以与本发明方面的任何实施方案，特别是与上述本发明方面的任何优选实施方案相结合。
如本文所用，术语“经分离的”是指基本上不含与其天然缔合的其他分子的分子。具体地，经分离的表示该分子不在动物体内或动物体内样品中。因此，经分离的分子不含在动物中会遇到或接触的其他分子。“经分离的”不表示与本文所述相关的其他组分分离，例如不与分子所包含的组合物的其他组分分离，也不与分子所包含的载体或细胞分离。
如本文所用，术语“肌酐脱亚氨酶”(EC编号3.5.4.21)，也称为肌酐脱氨基酶、肌酸酐脱氨酶或脱亚氨酶、肌酐亚氨基水解酶或肌酐水解酶，是指催化肌酐与L-甲基乙内酰脲和NH3/4 +反应的酶。
关于多肽，术语“变体”通常是指多肽的修饰形式，例如突变，因此可以缺失、插入、修饰和/或取代多肽的一个或多于一个氨基酸。本文定义了更具体的功能，并且优先于一般定义。“突变”或“氨基酸突变”可以是氨基酸取代、缺失和/或插入(如果存在多种突变，则可以适用“和”)。优选地，它是取代(即保守或非保守氨基酸取代)，更优选是保守氨基酸取代。在一些实施方案中，取代还包括将天然存在的氨基酸与非天然存在的氨基酸交换。保守取代包括用化学性质类似于被取代氨基酸的另一种氨基酸取代氨基酸。优选地，保守取代是选自以下的取代：
(i)用另一个不同的碱性氨基酸取代碱性氨基酸；
(ii)用另一个不同的酸性氨基酸取代酸性氨基酸；
(iii)用另一个不同的芳香族氨基酸取代芳香族氨基酸；
(iv)用另一个不同的非极性脂肪族氨基酸取代非极性脂肪族氨基酸；和
(v)用另一个不同的极性不带电荷的氨基酸取代极性不带电荷的氨基酸。
碱性氨基酸优选选自精氨酸、组氨酸和赖氨酸。酸性氨基酸优选为天冬氨酸或谷氨酸。芳香族氨基酸优选选自苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。非极性脂肪族氨基酸优选选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸。极性不带电荷的氨基酸优选选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。与保守氨基酸取代相反，非保守氨基酸取代是一个氨基酸与不属于上述保守取代(i)至(v)的任何氨基酸的交换。
下面描述确定序列同一性的方法。
蛋白质的氨基酸也可以被修饰，例如化学修饰。例如，可以通过糖基化、酰胺化、磷酸化、泛素化等修饰蛋白质或多肽的氨基酸的侧链或游离氨基或羧基末端。如本领域众所周知的，化学修饰也可以在体内，例如在宿主细胞中进行。例如，合适的化学修饰基序，例如蛋白质的氨基酸序列中存在的糖基化序列基序将使蛋白质被糖基化。除非修饰导致修饰的氨基酸的同一性改变(例如，取代或缺失)，否则修饰的多肽在关于某些SEQ ID NO所提及的多肽的范围内，即其不是本文定义的变体。
关于多核苷酸，术语“变体”通常是指多核苷酸的修饰形式，例如突变，因此可以缺失、插入、修饰和/或取代多核苷酸的一个或多于一个核苷酸。本文定义了更具体的功能，并且优先于一般定义。“突变”可以是核苷酸取代、缺失和/或插入(如果存在多种突变，则可以适用“和”)。优选地，它是取代，更优选它引起氨基酸取代，最优选保守氨基酸取代。
在多核苷酸、多肽或蛋白质序列的上下文中，术语“同一性”或“相同”是指针对最大对应比对时两个序列中的相同残基数量。具体而言，无论是核酸序列还是氨基酸序列，两个序列的序列同一性百分比是两个比对序列之间的精确匹配数除以较短序列的长度再乘以100。可以用来比对两个序列的比对工具是本领域技术人员众所周知的，并且可以例如在万维网上获得，例如，Clustal Omega(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)用于多肽比对，或MUSCLE(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)或MAFFT(http：// www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/)用于多核苷酸比对，或WATER(http：//www.ebi.ac.uk/ Tools/psa/emboss_water/)用于多核苷酸和多肽比对。可以使用默认参数设置来执行两个序列之间的比对，例如对于MAFFT优选：MATRIX：Blosum62，空位开放1.53，空位扩展0.123，对于WATER多核苷酸优选MATRIX：DNAFULL，空位开放：10.0，空位扩展0.5，对于WATER多肽优选MATRIX：BLOSUM62，空位开放：10.0，空位扩展：0.5。本领域技术人员理解，可能有必要以任一顺序引入空位以产生令人满意的比对。“最佳序列比对”定义为具有最小数目的空位时产生最大比对的相同残基的比对。优选地，它是全局比对，其包括比对中每个序列中的每个残基。
术语“多核苷酸”指核酸，即由多个核苷酸组成的生物分子。它包括DNA、RNA和合成类似物，例如PNA。DNA是优选的。
上面的描述通常是指“至少80％的序列同一性变体”。在其优选的实施方案中，所述变体是至少83％、至少85％、至少90％，更优选至少95％、96％、97％、98％或最优选至少99％的序列同一性变体，全部针对各自的SEQ ID NO或其所指部分。
术语“肌酐脱亚氨酶活性”是指酶催化肌酐+H2O
N-甲基乙内酰脲+NH3反应的能力。活性通常以U/ml表示，并且可以在体积活性测定法中确定，例如在实施例中根据以下等式确定：
其中：
ΔE：光密度差
ε：在所用波长下NADH的比吸收系数(6.22ml μmol-1cm-1)
dil：稀释度
d：吸收池中光束的路径长度
V总：总体积
V样品：样品体积
除非另有说明，否则本文所用的术语“可溶”是指在水溶液(例如水)中具有至少约40％、包括50％至100％、还包括60％至90％、优选90％至100％的蛋白质溶解度的那些蛋白质，例如根据以下方法测定：(1)以5.00克每100克悬浮液，将蛋白质悬浮在纯净水中；(2)将悬浮液的pH调节至所需的pH(例如7)；(3)在室温(例如20℃至22℃)下轻轻搅拌60分钟；(4)通过任何合适的技术(例如HPLC)测量悬浮液中的总蛋白质；(5)将悬浮液的等分试样在例如16000×g和4℃下离心30分钟；(6)通过步骤(4)中所述的所选技术测量蛋白质的上清液；和(7)将蛋白质溶解度计算为上清蛋白质占总蛋白质的百分比。在一个优选的实施方案中，这意味着在4℃下以16000g离心30分钟的大肠杆菌细胞裂解液后，在大肠杆菌中表达的蛋白质中的至少40％，包括50％至100％，还包括60％至90％，优选90％至100％包含在水性上清液中，而不是在沉淀物中。
术语“UTR”(“非翻译区”)是指未翻译成多肽序列的mRNA或被转录成mRNA的DNA的核苷酸序列。
术语“确定肌酐脱亚氨酶活性”是指肌酐脱亚氨酶活性所需的特征。术语“改善肌酐脱亚氨酶活性”是指将肌酐脱亚氨酶活性提高至少10％、至少25％、至少50％或至少100％的特征。本文公开了用于测试肌酐脱亚氨酶活性的方法，包括特征是否确定或改善了肌酐脱亚氨酶活性。
术语“标签”是指重组连接至多肽的异源多肽序列。优选的是适合于纯化和/或定量的标签。标签可以例如包含亲和标签、色谱标签、表位标签或荧光标签。将亲和标签附加到蛋白质上，以便可以使用亲和技术从生物学来源中纯化它们。这些包括壳多糖结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)和谷胱甘肽S-转移酶(GST)。多聚组氨酸(poly(His))标签是与金属基质结合的广泛使用的蛋白质标签。色谱标签用于改变蛋白质的色谱特性，以在特定的分离技术中提供不同的分辨率。通常，它们由聚阴离子氨基酸组成，例如FLAG标签。表位标签是短肽序列，其选择是因为可以在许多不同物种中可靠地产生高亲和力抗体。这些通常来自病毒基因，这解释了它们的高免疫反应性。表位标签包括V5标签、Myc标签和HA标签。这些标签对于蛋白质印迹、免疫荧光和免疫沉淀实验特别有用，尽管它们也可用于抗体纯化。荧光标签用于视觉读取蛋白质。GFP及其变体(例如，具有不同荧光光谱的突变GFP)和RFP及其变体(例如，具有不同荧光光谱的突变RFP)是最常用的荧光标签。GFP/RFP的更高级应用包括将其用作折叠报告基因(折叠后为荧光，否则为无色)。荧光团的其他实例包括荧光素、罗丹明和磺基吲哚菁染料Cy5。标签的优选实例包括但不限于AviTag、钙调蛋白标签、聚谷氨酸标签、E标签、FLAG标签、HA标签、His标签(优选5个至10个，例如被镍或钴螯合物结合的6个组氨酸)、Myc标签、S标签、SBP标签、Softag 1、Softag 3、链球菌标签、TC标签、V5标签、VSV标签、Xpress标签、Isopeptag、SpyTag、BCCP、谷胱甘肽S-转移酶标签、绿色荧光蛋白标签、麦芽糖结合蛋白标签、Nus标签、硫氧还蛋白标签、Fc标签或Ty标签。优选His标签。
如本文所用，术语“载体”是指能够被引入或将其中包含的多核苷酸引入细胞中并且任选地在细胞中表达多核苷酸的蛋白质或核酸或其混合物。在本发明的上下文中，优选的是，第二方面的核酸在引入载体后在细胞内表达。合适的载体是本领域已知的，并且包括例如质粒、黏粒、人工染色体(例如细菌、酵母或人)、噬菌体、病毒载体(例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒或杆状病毒)或纳米工程物质(例如有机改性硅酸盐(ormosils))。所需的载体技术是本领域众所周知的(参见例如Lodish等人，MolecularCell Biology，W.H.Freeman；6th edition，June 15，2007；或Green and Sambrook，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，2012 Cold Spring Harbor LaboratoryPress)。该术语包括克隆载体，特别是表达载体。
如本文所用，术语“启动子”是指指导基因转录的DNA序列。启动子可以是“诱导型的”，响应于启动子激活剂而启动转录，或者可以是“组成型的”，由此转录的调节独立于这种试剂。优选的是细菌或病毒来源的启动子。合适的启动子是本领域已知的。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指核酸序列中通过操作能力而非物理位置连接的元件或结构。元件或结构能够或通过完成所需的操作来表征。本领域普通技术人员认识到，核酸序列中的元件或结构不需要以串联或相邻顺序可操作地连接。
上述细胞可以是任何原核或真核细胞。原核细胞可以是适用于重组DNA技术例如克隆或蛋白质表达的任何种类的细菌或古微生物，包括革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物。合适的细菌可以选自例如埃希氏菌(Escherichia)(特别是最优选的是大肠杆菌)、鱼腥藻(Anabaena)、柄杆菌(Caulobacter)、葡糖杆菌(Gluconobacter)、红杆菌(Rhodobacter)、假单胞菌(Pseudomonas)、副球菌(Paracoccus)、芽孢杆菌(Bacillus)、短杆菌(Brevibacterium)、贪铜菌(Cupriavidus)、棒状杆菌(Corynebacterium)、根瘤菌(Rhizobium)(中华根瘤菌(Sinorhizobium))、黄杆菌(Flavobacterium)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、肠杆菌(Enterobacter)、乳杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、甲基杆菌(Methylobacterium)、丙酸杆菌(Propionibacterium)、葡萄球菌(Staphylococcus)或链霉菌(Streptomyces)。
真核细胞特别是真菌或动物细胞。从广义上讲，真菌细胞可以是真菌生物体的任何细胞，例如来自乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维氏酵母变种(Kluyveromyces marxianus var.marxianus)、耐高温马克斯克鲁维氏酵母(Kluyveromyces thermotolerans)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、白色假丝酵母(Candida albicans)、解脂假丝酵母(Candidalipolytica)和耐盐性假丝酵母(Candida versatilis)、毕赤氏酵母属(Pichia)如具柄毕赤氏酵母(Pichia stipidis)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)和毕赤氏酵母(Pichia sorbitophila)、隐球酵母(Cryptococcus)、德巴利氏酵母(Debaromyces)、汉逊酵母(Hansenula)、复膜抱酵母(Saccharomycecopsis)、类糖酵母(Saccharomycodes)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、威克酵母(Wickerhamia)、德巴利氏酵母(Debayomyces)、有孢汉逊酵母(Hanseniaspora)、克勒克酵母(Kloeckera)、接合酵母(Zygosaccharomyces)、Ogataea、Kuraishia、Komagataella、梅奇酵母(Metschnikowia)、拟威尔酵母(Williopsis)、Nakazawaea、隐球酵母(Cryptococcus)、孢圆酵母(Torulaspora)、布勒弹孢酵母(Bullera)、红酵母(Rhodotorula)、拟威尔酵母(Willopsis)或掷孢酵母(Sporobolomyces)的细胞。然而，优选地，真菌细胞是酵母(Saccharomyces)或毕赤氏酵母细胞，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德毕赤氏酵母细胞。
动物细胞可以是灵长类动物、小鼠、大鼠、兔、狗、猫、仓鼠、牛、昆虫(例如Sf9或Sf21)等的细胞，优选人类的细胞。
术语“细胞培养”是指细胞在其自然环境之外在细胞培养基中或之上在受控条件下生长的过程。术语“细胞培养基”是指用于支持细胞，特别是如上所述的细胞的存活或生长的液体或凝胶。此类培养基包含支持此类细胞存活或生长所需的所有营养素。细胞培养基组合物可以是干粉组合物、液体组合物或固体(例如凝胶或琼脂)组合物。合适的细胞培养和培养技术是本领域众所周知的，参见例如Peterson等人，Comp Immunol MicrobiolInfect Dis.1988；11(2)：93-8。
关于将金属双正离子添加到培养基中的表述“添加到培养基”包括其中相同的金属双正离子可能已经包含或可能尚未包含在培养基中的实施方案。优选地，它尚未包含在培养基中。关于向培养基中添加金属双正离子的表述“补充”是指增加了培养基中金属双正离子(已经包含在培养基中)的量。在这方面，“尚不包含”包括痕量，并且“包含”是指大于痕量。如本文所用，术语“痕量”是指飞摩尔水平(fM)或更小的量。具体地，“痕量”可以指500fM以下，更具体地100fM以下，最具体地50fM以下的量。
表述“样品中肌酐的量”包括绝对量，例如以摩尔计的量或以克为单位的质量，以及相对量(即浓度)，例如以摩尔计的量或以克为单位的质量。
术语“转化”是指借助酶促反应的一种或多于一种试剂的化学转化。
术语“基本上相同量的NH3或NH4 +”是指NH3或NH4 +中的一种以彼此相同的量±10％(优选地为±5％，更优选地为±1％)存在。
术语“NAD(P)H”是指“NADPH或NADH”，术语“NAD(P)+”是指“NADP+或NAD+”。
术语“干片”是指层状、经涂覆的干膜，其通过添加水性流体(例如本文所述的样品)而被水合。涂层优选是肌酐脱亚氨酶(如本文所述)涂层。
本申请中涉及的SEQ ID
本申请涉及SEQ ID NO：1-4。以下是这些SED ID的概述：
SEQ ID NO：1表示EP1325958A1的肌酐脱亚氨酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2表示EP1325958A1的肌酐脱亚氨酶的核酸序列。
SEQ ID NO：3表示本发明肌酐脱亚氨酶的核酸序列(编码区的起始和终止密码子用下划线标出，与SEQ ID NO：1不同的核苷酸以灰色突出显示的粗体字母表示)：
SEQ ID NO：4表示本发明肌酐脱亚氨酶的氨基酸序列(与SEQ ID NO：2不同的氨基酸以灰色突出显示的粗体字母表示)：
SEQ ID NO：5表示示例性接头的氨基酸序列。SEQ ID NO：6表示根据SEQ ID NO：5的接头的示例性核苷酸序列。SEQ ID NO：7表示包括凝血酶切割位点的示例性氨基酸序列。SEQ ID NO：8表示根据SEQ ID NO：7的氨基酸序列的示例性核苷酸序列。有关更多详细信息，请参见表1的图例。
***
通过以下实施例描述本发明，这些实施例应被解释为仅仅是说明性的，而不是对本发明范围的限制。
实施例1：从肌酐泰氏菌的基因组DNA中分离出编码肌酐脱亚氨酶的DNA片段。
从DSMZ菌株保藏处[https：//www.dsmz.de/]以编号DSM 9508(类型菌株)保藏的肌酐泰氏菌菌株中分离的基因组DNA购自DSMZ。使用正向和反向引物将该DNA用作模板以扩增如EP1325958A1所述的相应的DNA片段，所述正向和反向引物具有已公开的DNA序列(SEQID NO：2)的各个末端的相同序列，并且在5′末端还包含HindIII限制性位点。Q5R High-Fidelity DNA聚合酶和相应的缓冲液购自New England BioLabs。PCR条件如下：
温度程序参数是在98℃变性10分钟，35个循环(98℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 2分钟)和在72℃最终延伸4分钟。
通过琼脂糖凝胶电泳分析获得预期大小的DNA片段。使用凝胶提取试剂盒(GeneJET Gel Extraction Kit，ThermoFisher)从琼脂糖凝胶中提取5个反应的片段。将得到的DNA连接到质粒pBluescript II KS+中，并通过限制性分析来分析得到的克隆。对一个所选择的合适克隆的插入片段进行测序。所得的DNA序列示于SEQ ID NO：3。对SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3中的序列进行比较和分析表明，基因组DNA除4个碱基取代外，在编码区内还具有另一个碱基(C，SEQ ID NO：3中的核苷酸第1314位)。如SEQ ID NO：4所示，这导致C末端部分的氨基酸序列有显著差异(与SEQ ID NO：1，EP1325958A1肌酐脱亚氨酶的氨基酸序列相比)。
实施例2：肌酐脱亚氨酶的重组表达-基本结构
购买了SEQ ID NO：2中定义的合成DNA片段(Life Technologies-Thermo FisherInc.)。如EP1325958A1中所述，该片段由肌酐脱亚氨酶的编码区和5′上游和3′下游区域组成。为了克隆到载体pBluescript II KS+中，在3′和5′末端添加了HindIII限制性核酸内切酶的限制性核酸内切酶识别序列(在上面的SEQ ID NO：2的图中标有下划线)。克隆、培养、DNA和蛋白质分析是根据如Current Protocols in Molecular Biology，Wiley，PrintISSN：1934-3639中所述的标准方法进行的。在策略1中，包括5′和3′非编码区的整个片段都通过HindIII克隆到了pBluescript II KS+中。大肠埃希氏菌菌株XL1(Stratagene)被用作宿主生物进行所有克隆和表达。对从包含100mg/L氨苄青霉素的选择性LB-琼脂平板分离的一组10个转化体进行限制性分析后，选择了图1中所示方向的一个克隆(此处也称为方向1)。为了对照目的，检查相反方向的克隆的表达能力(在本文中也称为方向2)。使用相同的克隆策略将如SEQ ID NO：3中所定义的源自肌酐泰氏菌的基因组DNA的相应片段克隆到pBluescript II KS+中。根据策略1构建了另一个克隆。在这里，3′非编码区被一个经由PCR引入的His标签所取代，该标签使用了包含与肌酐脱亚氨酶C末端融合的His6编码区的相应引物(长版，参见实施例3的示意图，克隆4h)。
此外，按照策略2，仅将编码区克隆到基于tac启动子的大肠杆菌表达载体pMS470Δ8中，并以其他两种形式克隆为N末端和C末端带有His标签的(His6)蛋白。因此，在标准条件下，使用适合于编码区N端或C端部分并含有6个His密码子的引物，对编码区进行PCR扩增。使用分别根据SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的合成或基因组DNA片段作为模板。
从所有策略中，根据限制性分析选择一个合适的克隆，并通过测序验证所有表达克隆的正确性。通过这些克隆策略获得的所得构建体的示意图如图1所示。
将所有构建的表达菌株在补充有100mg/L氨苄青霉素的2x TY肉汤(50mL于500mL锥形瓶中)中培养。用过夜培养物(相同培养基)进行接种，并使细胞在37℃下生长至OD为0.2至1.4。然后通过加入0.1mM的IPTG进行诱导，并且在诱导下，还将MnCl2(终浓度0.1mM)加入培养物中。然后将培养物在25℃或28℃下再孵育10小时，并通过离心收集细胞。将沉淀直接悬浮在pH 7.5(PPB)的50mM磷酸钾缓冲液中，或在-20℃冷冻，解冻后重新悬浮。通过超声处理破坏细胞，并通过2步离心进一步分离裂解物的可溶性和沉淀级分。在第一步中，不溶物以3000 x g沉淀，在第二步中，来自剩余的上清液中的不溶物以16000 x g沉淀。将不溶性沉淀级分重悬于PPB中，并通过SDS PAGE分析所有级分的表达蛋白。含有无插入载体的克隆也以与对照相同的方式处理。SDS PAGE分析表明，预期大小的蛋白质是从策略1的克隆中产生的(红色箭头)。使用方向相反的策略1的克隆(对照，方向2)和策略2的克隆，均未见明显的预期大小的蛋白带(图2)。
当分析表达重组肌酐脱亚氨酶蛋白的克隆的可溶性和沉淀级分时(策略1)，已经认识到，衍生自基于基因组DNA(SEQ ID NO：3)的克隆1的蛋白质主要存在于上清液级分中，表明该蛋白质具有良好的可溶性。相反，衍生自基于根据SEQ ID NO：2的DNA的克隆的蛋白质几乎全部存在于3000×g沉淀级分中，表明蛋白质完全不溶(图3)。
还使用基于NADH的酶偶联测定法测试了可溶性级分的酶活性。原理概述如下：
在此测定肌酐脱亚氨酶活性的方法中，NADH的消耗量在340nm处用分光光度法测量。G1DH(来自牛肝)获自Sigma(产品代码G2626)。使用了以下反应设置(按此顺序添加)：
0.75ml肌酐溶液(50mM K-磷酸盐缓冲液中的50mM，pH 7.5)
0.1ml α-酮戊二酸溶液(10mM K-磷酸盐缓冲液中的50mM，pH 7.5)
8μL GlDH(约1U/μL)
设为空白
新鲜配制的0.1mL NADH(3mM)
0.05mL肌酐脱亚氨酶制剂(如果需要，在pH 7.5的50mM磷酸钾缓冲液中稀释)
该测定在37℃下进行。在添加NADH之前进行空白设置，通过添加肌酐脱亚氨酶制剂开始反应。活性分析的结果(图4)清楚地表明，来自克隆8(基于SEQ ID NO：2的DNA)的裂解物未显示出活性，只能看到裂解物存在的非特异性背景(参见对照，线d)。用克隆1的裂解物(基于根据SEQ ID NO：3的DNA)可以清楚地看到强活性。尽管在SDS PAGE上看不到肌酐脱亚氨酶大小范围内明显的较强条带，但衍生自基因组DNA的C端带有His标签的蛋白也可见弱活性(数据未显示，但与合成DNA的带有His标签的变体相当，图2)。使用镍螯合物色谱法，该带有His标签的克隆的纯化蛋白易于获得并显示出良好的活性。活性结果与SDS-PAGE结果一致，该结果表明，来自克隆1的表达蛋白(衍生自根据SEQ ID NO：3的DNA)具有良好的可溶性，因此处于活性状态，而来自克隆8的蛋白质(衍生自根据SEQ ID NO：2的DNA)则完全不溶，因此处于未充分折叠的失活状态。C末端缺失的氨基酸在酶催化机理中也可能起重要作用。
实施例3：基于含有肌酐脱亚氨酶的位于5′和3′上下游的未翻译基因组区域的克隆的带有His标签的肌酐脱亚氨酶的表达。
从实施例2的结果可以看出，肌酐脱亚氨酶的位于5′和3′上下游的未翻译基因组区域对于在大肠杆菌中有效重组表达该酶是重要的。带有His标签的蛋白质可以通过Ni螯合物色谱法进行有效纯化。因此，使用重叠延伸PCR策略和包含用于编码His标签氨基酸的相应序列的引物构建了表达带有His标签的变体的表达克隆，该克隆包含肌酐脱亚氨酶的位于5′和3′上下游的未翻译基因组区域。为每个N-末端标签和C-末端标签构建了两个变体。一组仅在N或C末端添加了6个组氨酸。第二组包含肽接头，并且在N末端C标签包含凝血酶切割位点的情况下，可以在纯化后去除标签。将表1中概述的所有构建体以可被诱导型lac启动子驱动转录的方向克隆到载体pBluescript II KS+中。
表1：构建的带有His标签的肌酐脱亚氨酶变体的总结。所有构建体均基于肌酐泰氏菌的基因组DNA，并如SEQ ID NO：3所示取5′上游和3′下游区域。简短版本在Met启动密码子(N末端His标签)之后包含6个His密码子(CAC或CAT)，在终止密码子之前(C末端His标签)包含6个His密码子(CAC或CAT)。C端接头具有序列Ala Ala Ala Leu Glu(SEQ ID NO：5，核苷酸序列GCGGCCGCACTCGAG，SEQ ID NO：6)，并且插入在肌酐脱亚氨酶编码区和C末端His标签之间。N末端接头具有序列Gly Ser Ser(核苷酸GGCAGCAGC)，并插入在肌酐脱亚氨酶5′上游UTR和N末端6His密码子之间，其后是包含凝血酶切割位点的肽序列Ser Ser Gly LeuVal Pro Arg Gly Ser His(SEQ ID NO：7；核苷酸序列CACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCAT，SEQ ID NO：8)，并在其C末端(His)与肌酐脱亚氨酶编码区融合。
所构建的克隆在摇瓶培养物中培养，以与实施例2中所述相同的方式进行处理并分析肌酐脱亚氨酶活性。SDS PAGE分析(图5)显示与不包含两个区域的变体相比，同时包含5′上游和3′下游区域的带有His标签的变体(克隆1h、6h和11h)以更好的方式表达了肌酐脱亚氨酶蛋白(可溶性肌酐脱亚氨酶蛋白的量更大)。不包含3′下游区域的两个C末端标签的变体表达效率较低，并且在16000 xg上清液(克隆3h和4h)中只能观察到少量的可溶性肌酐脱亚氨酶蛋白，这些克隆的可溶性级分显示出活性。含有5′和3′上下游区域的带有His标签的变体(克隆1h、6h和11h)产生了大量的可溶性蛋白，可溶性级分显示出良好的酶促活性，但与克隆1相比水平较低，这与裂解物中存在的可溶性蛋白质量较少有关。这些结果还证实了来自肌酐泰氏菌的肌酐脱亚氨酶作为C-或N-末端带有His标签的变体具有良好的活性。
实施例4：肌酐脱亚氨酶的带有His标签的变体的纯化和比活性的测定
按照以下方案纯化带有His标签的肌酐脱亚氨酶：将50ml培养物的发酵沉淀重悬于30ml裂解缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液，pH 7.5；10mM咪唑1mM DTT)中，并通过超声处理破坏。在新填充的色谱柱(Ni-NTA-Sepharose TM，GE-Healthcare)中装入无菌过滤的(0.2μm)裂解物(16000 x g上清液)，然后用洗涤缓冲液(50mM K-磷酸缓冲液，pH 7.5；20mM咪唑；1mM DTT)洗涤。然后用洗脱缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液，pH 7.5；250mM咪唑；1mM DTT)洗脱蛋白质。使用GE Healthcare 52-1308-00 BB PD-10脱盐柱对洗脱的蛋白质进行脱盐。根据制造商的操作规程，用pH7.5的50mM K-磷酸盐缓冲液、1mMDTT从该柱上洗脱蛋白质。用Nanodrop分光光度法测量最终级分中的蛋白质浓度。用ProtPram软件确定比消光系数。在图6中，以克隆1h的纯化为例。
通过实施例2中描述的活性测定法进行比活性的测定。这两个变体克隆1h。根据以下等式计算样品的体积活性：
ε：在所用波长下NADH的比吸收系数(6.22ml μmol-1cm-1)
dil：稀释度
d：吸收池中光束的路径长度
V总：总体积
V样品：样品体积
当每个测定使用0.5μg蛋白质时，这两种变体的比活性值均高达40U/mg蛋白质。活性值取决于制剂，并且带有His标签的纯化的蛋白为20U/mg至40U/mg。
实施例5：肌酐泰氏菌肌酐脱亚氨酶活性与可商购获得的酶的比较。
购买了来自未指明的微生物(Toyobo，产品代码CNI-311)的肌酐脱亚氨酶。根据专利文献(Toyobo，例如Toyobo JPS61219383A和JP1985000062900的专利)和有关酶的数据，似乎该酶源自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，因此与源自肌酐泰氏菌的酶具有不同的来源。说明书数据报告酶制剂包含30％的未指定稳定剂。购买的批次声称具有13.4U/mg的比活性。据报道，由Toyobo提供的酶活性值以与实施例4中所述类似的方式测定，不同之处在于与Toyobo酶一起使用了NADPH依赖性GlDH。
为了有可比的情况，使用源自克隆1h的高度纯化的带有His标签的肌酐脱亚氨酶，通过考马斯蓝染色的SDS PAGE凝胶的条带强度比较纯酶的蛋白质浓度，其中蛋白质浓度通过分光光度计(Nanodrop)或考马斯亮蓝法(Bradford)方法分光光度法测定(使用高度纯化的蛋白质可获得相同的结果)。用于该比较的SDS PAGE如图7所示。
从图7可以看出，Toyobo酶的强度较低，并且与仅70％(存在30％的稳定剂)的含量很好地对应。因此，为了比较比活性，用该因子校正了Toyobo酶的获得值。
使用不同浓度的酶，对来自克隆1h和克隆11h的Toyobo和肌酐泰氏菌的两种酶来源进行了活性测定。由于反应在整个范围内不是完全线性的，并且在较低的NADH浓度下会稍稍减慢，因此从较长时间内斜率保持恒定的区域确定了活性值(参见图8)。获得的数据如表2所示。为了确定与胞嘧啶的潜在交叉反应性，在平行测定中用相同浓度的胞嘧啶代替了肌酐。结果是两种酶的反应行为与背景对照相同(未添加酶)。
表2肌酐脱亚氨酶制剂的比活性测定。在该实验中，使用了使用0.1mM NADH代替0.3mM NADH的标准检测方法。在这些条件下，线性范围更宽。有关肌酐泰氏菌衍生制剂的描述和蛋白质含量平衡的更多详细信息，参见图7。校正后的活性值是基于对Toyobo酶制剂中实际酶含量(70％)的估算(见上文)。
从表2可以看出，本发明的酶的活性是Toyobo酶的两倍。另一个有意思的点是，本发明的酶在较低的酶浓度下似乎更具活性，并且在N-和C-末端标签的变体的活性水平上没有显著差异。
在图8中，图中显示了活性测定的反应曲线，从中可以看出，较高的蛋白质浓度会导致反应早期的反应延迟。在较低的蛋白质浓度下，也观察到较大范围的线性反应速度。
实施例6：二价正离子对酶活性和保真度的影响
如实施例2所述，培养并编码SEQ ID NO：4的肌酐脱亚氨酶的克隆1(参见实施例2)，并诱导重组蛋白的产生。使用补充或不补充0.1mM Mn++的TB(极品肉汤(TerrificBroth))培养基进行一组培养。收获细胞并通过超声处理破坏，并分析16000×g上清液的肌酐脱亚氨酶活性。获得的结果如表3所示。
表3向生长培养基中添加Mn++(在培养基中添加0.1％Mn++)对来自肌酐泰氏菌的肌酐脱亚氨酶比活性的影响。Cdi：来自克隆1的酶在-20℃下储存大约1年(用作参考酶)。T+Mn：在具有0.1mM Mn++的极品肉汤中培养。TB-Mn：在不具有Mn++的极品肉汤中培养。
从表3可以看出，添加Mn++对肌酐脱亚氨酶的比活性具有明显的积极作用。
在第二组中，将克隆1h(带有His标签的蛋白)在以葡萄糖(10g/L)为碳源的特定矿物盐培养基(标准M9，补充有适当的氨基酸和硫胺素)中培养。从主种批次中接种该培养基的预培养物，并用于主要培养物的接种。通过在OD＝1附近添加0.1mM IPTG来诱导肌酐脱亚氨酶的表达。在诱导时用以下金属离子(0.1mM)补充培养物：Fe++、Mn++、Zn++及其组合。收获细胞并破坏，通过Ni螯合物层析从16000×g上清液中纯化肌酐脱亚氨酶蛋白。检查纯化的肌酐脱亚氨酶蛋白的活性。作为一般趋势，可以看出添加Mn++和Fe++会产生活性蛋白，而添加Zn++则具有负面影响(基于体积活性比较)。
实施例7：肌酐脱亚氨酶蛋白的金属分析
如实施例2所述的，使用TB培养基并在诱导时添加0.1mM Mn++从标准发酵中获得克隆1h的肌酐脱亚氨酶(带有His标签)。Fe和Zn以足够的量存在于使用的复合TB培养基中，没有进行补充。Mn在培养基中并非大量存在，因此被添加。如实施例4中所述通过Ni螯合物色谱法纯化蛋白质。通过原子吸收光谱法对蛋白质含量为13mg/ml的纯化制剂进行金属含量分析(在格拉茨工业大学，分析化学研究所进行)。结果如表4所示。
表4：纯化的带有His标签的肌酐脱亚氨酶的金属分析。在运行1和2中，分析了相同的蛋白质制剂，在4℃下储存4天后进行了运行2。仅显示与酶的催化活性有关的金属。
实施例8：来自肌酐泰氏菌的肌酐脱亚氨酶的稳定性
在-20℃冷冻保存用pH 7.5的50mM K-磷酸盐缓冲液洗脱的如实施例7所述的纯化的克隆1h的蛋白(来自在TB培养基中的培养物，并在诱导时补充0.1mM Mn)。将样品在冰上缓慢融化，稀释至0.1μg/μL，然后在4℃下保存7天。然后将样品等分，将等分试样分别储存在4℃、23℃和37℃下。以时间间隔测量活性。结果是在4℃下超过25天。在所有条件下均未观察到活性的显著变化。还通过SDS PAGE分析了来自第25天的样品(图9)。通过该分析，也未观察到蛋白质含量的降解或衰减的迹象。
实施例9：肌酐的定量测定。
将如实施例7中所述的根据SEQ ID NO：4的纯化的带有His标签的肌酐脱亚氨酶(克隆1h)(来自在TB培养基中的培养物并在诱导时补充有0.1mM Mn)用于肌酐的定量测定。使用以下测定条件：
所有溶液：在pH 7.5的50mM磷酸钾缓冲液中，
按以下顺序进行测定设置：
750μL肌酐溶液(不同浓度)
100μL α-酮戊二酸(10mM)
10μL GlDH
设为空白
50μL NADH(5mM)
100μL酶溶液(3.6μg/μL；启动反应)
用分光光度法在340nm下测量反应，然后观察20分钟。
结果显示在图10中，其中显示了直到20mg/L的肌酐，NADH衰减对肌酐浓度保持了良好线性相关性。反应在10分钟时完成，与20分钟时测得的ΔE值无明显差异。
实施例10：向介质中添加Mn2+以及包括Mn2+的二价金属组合的影响。
酶制剂
如实施例2中所述进行携带表达质粒的重组大肠杆菌W3110菌株的培养，所述表达质粒包含肌酐脱亚氨酶基因的无标签野生型，并制备无细胞裂解物。细胞裂解物用于通过使用QFF阴离子交换树脂柱和
色谱系统的离子交换色谱法纯化蛋白质。最后将纯化的蛋白质置于含有1mM DDT的50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)中。通过SDS凝胶电泳分析所获得的蛋白制剂(18.7mg/mL)(图11)，并且估计肌酐脱亚氨酶的含量最小约75％。
该制剂的金属含量通过具有电感耦合等离子体的光学原子发射光谱法(ICP-OES)测定。因此，通过稀释将蛋白质样品的浓度设定为约9mg/mL。结果总结在表5中。
表5：金属分析的结果。摩尔比基于被测制剂中的47.5kDa的肌酐脱亚氨酶的分子量和75％的肌酐脱亚氨酶蛋白质的含量，并以每个蛋白质亚基给出(该蛋白质包含两个亚基)。
获得的蛋白制剂用于后续的金属交换研究：
去除蛋白质中的金属
将2mL的蛋白制剂与2mL PDCA透析缓冲液(10mM 2.6吡啶羧酸，66mM乙酸钠，20mMNaCl，pH 5.5)混合。将溶液填充到透析管(Zellutrans/Roth 6.0)中，并在250mL PCDA透析缓冲液中透析3次，持续1.5h。最后的透析步骤在1.25L 50mM pH 7.5K-磷酸盐缓冲液中进行过夜，然后通过0.2μm膜滤器过滤。最终的蛋白质溶液(Apo蛋白质)的浓度为8.65mg/mL(4mL体积)。
金属交换
用含有1mM DDT的50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)将Apo蛋白制剂稀释至最终体积13.3mL。这导致蛋白质摩尔浓度约为0.05mM(肌酐脱亚氨酶的MW为47124Da)。然后使用以下金属离子在水中的100mM储备溶液，如图12所示，将1.9mL的馏分添加到0.1mM的金属离子中(每个离子，摩尔过量约2倍)：Mn(II)Cl2.4xH2O；Fe(II)SO4.7xH2O；Zn(II)Cl2。
将蛋白质-金属混合物在4℃孵育2.5小时(用手摇晃试管轻微混合几次)，然后在台式离心机(12000rpm)中离心以除去可能的沉淀物(未观察到)。然后将上清液(各1.9mL)加载到PD-10凝胶过滤柱上，该柱用含1mM DDT的50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)预先平衡。然后，将柱子用0.6mL相同的缓冲液溢出，最后用3mL相同的缓冲液洗脱蛋白质。在这些溶液中确定所有制剂的比活性。结果总结在图12中，清楚地表明了Mn2+单独或与Zn2+、Fe2+或两者组合对酶活性的积极作用。
Claims (15)
1.一种经分离的肌酐脱亚氨酶多肽，其包含根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列或其至少80％序列同一性变体，其中所述经分离的肌酐脱亚氨酶多肽具有肌酐脱亚氨酶活性。
2.根据权利要求1所述的经分离的肌酐脱亚氨酶多肽，其中变体的序列保留以下一个或多于一个：
-SEQ ID NO：4的第364位氨基酸，
-SEQ ID NO：4的第371位氨基酸，
-SEQ ID NO：4的第394位氨基酸，和/或
-SEQ ID NO：4的第410至419位氨基酸残基中的一个或多于一个，优选全部。
3.根据权利要求1或2所述的经分离的肌酐脱亚氨酶多肽，其中所述经分离的肌酐脱亚氨酶多肽与Mn2+结合。
4.一种经分离的核酸，其编码根据权利要求1至3中任一项所述的肌酐脱亚氨酶多肽。
5.根据权利要求4所述的经分离的核酸，其还包含肌酐泰氏菌肌酐脱亚氨酶5′UTR。
6.根据权利要求4或5所述的经分离的核酸，其还包含肌酐泰氏菌肌酐脱亚氨酶3′UTR。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的经分离的核酸，其包含SEQ ID NO：3的至少第1至1374位核苷酸或其至少80％序列同一性变体，优选包含SEQ ID NO：3的第1至1594位核苷酸或其至少80％序列同一性变体。
8.一种载体，其包含根据权利要求4至7中任一项所述的核酸。
9.一种细胞，其包含根据权利要求4至7中任一项所述的核酸或根据权利要求8所述的载体，其中所述细胞不是肌酐泰氏菌细胞，并且优选是大肠杆菌细胞。
10.一种制备根据权利要求1至3中任一项所述的经分离的肌酐脱亚氨酶多肽的方法，其包括以下步骤：
(i)在根据权利要求9所述的细胞中表达根据权利要求4至7中任一项所述的核酸，和
(ii)分离肌酐脱亚氨酶多肽。
11.根据权利要求1至3中任一项所述的肌酐脱亚氨酶多肽在确定样品中肌酐含量中的用途。
12.一种确定样品中肌酐含量的方法，其包括以下步骤：
(a)使所述样品与根据权利要求1至3中任一项所述的肌酐脱亚氨酶多肽接触，以将所述样品中的肌酐转化为N-甲基乙内酰脲和NH3/4 +，和
(b)对步骤(a)的转化进行定量。
13.根据权利要求12所述的方法，其中步骤(b)包括确定步骤(a)中产生的NH3/4 +的含量，其中步骤(a)还包括使所述样品与NADPH或NADH、α-酮戊二酸和谷氨酸脱氢酶接触以将NH3/4 +、α-酮戊二酸和NADPH或NADH分别转化为谷氨酸和NADP+或NAD+，并且步骤(b)包括分别对NADPH或NADH的消耗进行定量。
14.一种适合于根据权利要求12或13所述的方法确定样品中的肌酐含量的试剂盒，其包含根据权利要求1至3中任一项所述的肌酐脱亚氨酶多肽、NADPH或NADH、α-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶和任选的pH缓冲剂。
15.一种适合于确定样品中肌酐含量的传感器，其包含固定在所述传感器中或所述传感器上的根据权利要求1至3中任一项所述的肌酐脱亚氨酶多肽。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20201124 |
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