CN111979296A - 一种多核苷酸激酶检测方法、胞内监测体系及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种多核苷酸激酶检测方法，包括以下步骤：S1，设计合成两个DNA片段DNA1和DNA2，DNA1的序列如SEQ ID：01所示，DNA2的序列如SEQ ID：02所示；根据沃森‑克里克碱基互补配对原则设计合成RNA‑DNA模板链，RNA‑DNA模板链的序列如SEQ ID：03所示；设计合成DNAzyme的底物MB，MB的序列如SEQ ID：04所示；MB的5’端连接荧光基团FAM，MB的3’端连接淬灭基团BHQ1；S2，将DNA1，DNA2，RNA‑DNA模板链混合杂交形成复合探针；复合探针与MB，ATP，T4DNA连接酶和RNase H混合成检测溶液；S3，取检测溶液和待测样品，混合均匀，36‑38℃反应40‑50min后测定荧光强度，根据荧光强度定性或定量多核苷酸激酶。该检测方法背景信号低，灵敏度高。

Description

一种多核苷酸激酶检测方法、胞内监测体系及应用
技术领域
本发明涉及一种多核苷酸激酶检测方法、胞内监测体系及应用，属于生化分析与诊断技术领域。
背景技术
多核苷酸激酶(PNK)可以将ATP分子上的γ-磷酸基团转运到核苷酸上从而磷酸化核苷酸分子。该过程在DNA复制，核酸代谢和DNA重组中发挥重要作用。有证据显示磷酸化是DNA连接酶修复损伤DNA的前提条件，多核苷酸激酶功能受阻会导致布鲁姆综合症、罗斯蒙-汤姆逊综合症、沃纳综合症、神经退行性疾病等疾病。另一方面，多核苷酸激酶的过度表达会引起活性氧的产生，导致慢性炎症。因此准确的监测多核苷酸激酶的意义重大。
传统的检测PNK活性的方法有放射性32P标记法，聚丙烯酰胺凝胶电泳法以及放射自显影法。上述传统方法存在很多缺点：对环境和人体有害，需要专业的操作人员。近年来有很多新的方法出现，但是这些方法普遍存在背景信号较高，重复性欠佳等问题。
发明内容
本发明提供了一种多核苷酸激酶检测方法、胞内监测体系及应用，可以有效解决上述问题。
本发明是这样实现的：
一种多核苷酸激酶检测方法，包括以下步骤：
S1，设计合成两个DNA片段DNA1和DNA2，DNA1的序列如SEQ ID：01所示，DNA2的序列如SEQ ID：02所示；根据沃森-克里克碱基互补配对原则设计合成RNA-DNA模板链，RNA-DNA模板链的序列如SEQ ID：03所示；设计合成DNAzyme的底物MB，MB的序列如SEQ ID：04所示；MB的5’端连接荧光基团FAM，MB的3’端连接淬灭基团BHQ1；
S2，将DNA1，DNA2，RNA-DNA模板链混合杂交形成复合探针；复合探针与MB，ATP，T4DNA连接酶和RNase H混合成检测溶液；
S3，取检测溶液和待测样品，混合均匀，36-38℃反应40-50min后测定荧光强度，根据荧光强度定性或定量多核苷酸激酶。
作为进一步改进的，所述DNA1、DNA2、ATP、T4 DNA连接酶、RNase H和MB在所述检测溶液中的终浓度为90～110nM、90～110nM、0.45～0.55mM、2.0～2.2U/μL、0.02～0.04U/μL和180～220nM。
作为进一步改进的，所述测定荧光强度的Ex/Em＝450/521，扫描范围495～580nm，狭缝宽度10nm。
一种多核苷酸激酶胞内成像监测体系的制备方法，包括以下步骤：
A1，设计合成两个DNA片段DNA1和DNA2，DNA1的序列如SEQ ID：01所示，DNA2的序列如SEQ ID：02所示；根据沃森-克里克碱基互补配对原则设计合成RNA-DNA模板链，RNA-DNA模板链的序列如SEQ ID：03所示；设计合成DNAzyme的底物MB，MB的序列如SEQ ID：04所示；MB的5’端连接荧光基团FAM，MB的3’端连接淬灭基团BHQ1；
A2，将DNA1，DNA2，RNA-DNA模板链、MB、ATP，T4 DNA连接酶、RNase H和脂质体混合均匀，室温下孵育25～35min后采用含1％胎牛血清的高糖培养基DMEM稀释，得到所述多核苷酸激酶胞内成像监测体系。
作为进一步改进的，所述DNA1、DNA2、ATP、T4 DNA连接酶、RNase H和MB在所述多核苷酸激酶胞内成像监测体系中的终浓度为90～110nM、90～110nM、0.45～0.55mM、2.0～2.2U/μL、0.02～0.04U/μL和180～220nM。
作为进一步改进的，所述DNA1、DNA2、ATP、T4 DNA连接酶、RNase H和MB的总质量与所述脂质体的质量比为1：2.5～3.5。
作为进一步改进的，所述脂质体根据薄膜分散法制备，其中胆固醇：卵磷脂的质量比为1：2。
一种多核苷酸激酶胞内成像监测体系，根据上述方法制备。
一种上述的多核苷酸激酶胞内成像监测体系的应用方法，将所述多核苷酸激酶胞内成像监测体系加入到待测细胞中，36～38℃共孵育3.5～4.5h，再用进行细胞核染色，在多维活细胞成像显微镜下观察拍摄。
作为进一步改进的，所述细胞核染色为采用Hoechst 33342染色液染色25～35min。作为进一步改进的，。
本发明的有益效果是：
本发明的多核酸监测体系将将DNAzyme分成两个片段之后借助模板辅助链RNA-DNA和T4 DNA连接酶的功能将片段连接成完整的DNAzyme，然后用RNase H消化模板链，使得DNAzyme释放出来，这样的设计减少DNAzyme与底物MB的非特异性结合后引起的信号释放，同时由于DNA 5’-OH磷酸化是DNA连接酶修复的前提条件，从而使得所述多核苷酸激酶监测体系特异性强，背景信号低。与传统的多核苷酸激酶监测方法比如放射性32P标记，聚丙烯酰胺凝胶电泳以及放射自显影相比，所述多核苷酸激酶监测体系环保绿色，对人体无害，不需要专业技术人员即可操作。
本发明所述脂质体辅助的多核苷酸激酶胞内成像监测体系，在脂质体辅助转染作用下，使得多核苷酸监测体系可以高效进入胞内，可以在几小时内观察到胞内多核苷酸激酶的变化，且操作简单，方便快捷。
本发明采用RNA-DNA的探针设计，借助T4 DNA连接酶和RNase H两者的特性，实现目标酶促发酶链反应，形成完整DNAzyme之后从模板链上释放出来执行切割功能，控制较低本底信号的同时荧光信号释放明显，使得DNAzyme释放出来，信背比(信号与背景比值)达67倍，极大的提高了检测的灵敏度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是本发明实施例1至4提供的多核苷酸激酶检测图。
图2是本发明实施例5提供的多核苷酸激酶检测特异性分析图。
图3是本发明实施例6提供的脂质体辅助的多核苷酸激酶监测体系胞内成像图。
图4为是本发明实施例7提供的脂质体辅助的多核苷酸激酶监测体系胞内成像的时间依赖性图。
图5是MB发夹结构图。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
所用核酸链的设计与合成
设计合成DNAzyme的两个片段DNA1和DNA2，根据沃森-克里克碱基互补配对原则设计合成辅助RNA-DNA模板链，设计合成DNAzyme底物MB，另合成对照模板链RNA和对照模板链DNA3。其序列如表1所示。
表1(表中碱基序列前面标注为r，代表是RNA)
Figure BDA0002658437050000061
实施例1
为了证明DNAzyme对MB的切割作用，我们将实验分成两组，一组为100μL体系中加入终浓度为200nM的MB，另一组为100μL体系中加入终浓度为200nM的MB和100nM的DNAzyme，两组均在37℃反应3.5h，测定荧光强度(Ex/Em＝450/521，扫描范围495～580nm，狭缝宽度10nm)。
实验结果如图1A所示。可以看出，在没有DNAzyme的情况下，没有明显的荧光信号(1A，MB)。而将DNAzyme引入反应缓冲液后，出现了明显的荧光响应(1A，DNAzyme+MB)。上述结果表明，DNAzyme能裂解MB，荧光信号明显增加。
实施例2
为了证明RNase H从模板连上释放DNAzyme的功能，我们将实验分成以下6组：
第一组：100μL体系中加入终浓度为100nM的DNAzyme，100nM的模板DNA3 37℃互补配对45min后，接着37℃反应60min。加入终浓度为200nM的MB继续37℃反应45min，测定荧光强度(Ex/Em＝450/521，扫描范围495～580nm，狭缝宽度10nm)。
第二组：100μL体系中加入终浓度为100nM的DNAzyme，100nM的模板RNA37℃互补配对45min后，37℃反应60min后加入终浓度为200nM的MB继续37℃反应45min，测定荧光强度(Ex/Em＝450/521，扫描范围495～580nm，狭缝宽度10nm)。
第三组：100μL体系中加入终浓度为100nM的DNAzyme，100nM的模板RNA-DNA37℃互补配对45min,37℃反应60min后加入终浓度为200nM的MB继续37℃反应45min，测定荧光强度(Ex/Em＝450/521，扫描范围495～580nm，狭缝宽度10nm)。
第四组：100μL体系中加入终浓度为100nM的DNAzyme，100nM的模板DNA3,37℃互补配对45min后加入终浓度为0.03U/μL的RNase H37℃反应60min。后加入终浓度为200nM的MB继续37℃反应45min，测定荧光强度(Ex/Em＝450/521，扫描范围495～580nm，狭缝宽度10nm)。
第五组：100μL体系中加入终浓度为100nM的DNAzyme，100nM的模板RNA,37℃互补配对45min后加入终浓度为0.03U/μL的RNase H37℃反应60min。后加入终浓度为200nM的MB继续37℃反应45min，测定荧光强度(Ex/Em＝450/521，扫描范围495～580nm，狭缝宽度10nm)。
第六组：100μL体系中加入终浓度为100nM的DNAzyme，100nM的模板RNA-DNA,37℃互补配对45min后加入终浓度为0.03U/μL的RNase H 37℃反应60min。后加入终浓度为200nM的MB继续37℃反应45min，测定荧光强度(Ex/Em＝450/521，扫描范围495～580nm，狭缝宽度10nm)。
实验结果如图1B所示。可以观察到，在没有RNase H的情况下，没有明显的荧光信号(1B，DNA,RNA,RNA-DNA)。同时，即使将RNase H引入DNA模板系统(1B,DNA+RNase H)也没有荧光信号释放。然而，当RNase H加入到RNA模板系统和RNA-DNA模板系统，体系中存在明显的荧光信号，说明RNase H切割模板链释放出DNAzyme(1B,RNA+RNase H，RNA-DNA+RNaseH)，从而DNAzyme可以对MB执行切割功能。以上结果表明RNase H可以切割含有RNA或RNA-DNA模板链的双链，我们选择RNA或RNA-DNA模板作为DNAzyme的互补模板进行后续实验。
实施例3
为了证明T4 DNA连接酶的连接酶修复功能，我们将实验分成4组，分别如下：
第一组：100μL体系中加入终浓度为100nM的p-DNA1，100nM的DNA2，100nM的模板RNA 37℃互补配对45min，后加入终浓度为0.03U/μL的RNase H 37℃反应60min，最后加入终浓度为200nM的MB，37℃反应45min，测定荧光强度(Ex/Em＝450/521，扫描范围495～580nm，狭缝宽度10nm)。
第二组：100μL体系中加入终浓度为100nM的p-DNA1，100nM的DNA2，100nM的模板RNA-DNA 37℃互补配对45min，后加入终浓度为0.03U/μL的RNase H 37℃反应60min，最后加入终浓度为200nM的MB，37℃反应45min，测定荧光强度(Ex/Em＝450/521，扫描范围495～580nm，狭缝宽度10nm)。。
第三组：100μL体系中加入终浓度为100nM的p-DNA1，100nM的DNA2，100nM的模板RNA 37℃互补配对45min后，加入终浓度为2.1U/μL的T4 DNA连接酶37℃反应60min，后加入终浓度为0.03U/μL的RNase H37℃反应60min，最后加入终浓度为200nM的MB，37℃反应45min，测定荧光强度(Ex/Em＝450/521，扫描范围495～580nm，狭缝宽度10nm)。
第四组：100μL体系中加入终浓度为100nM的p-DNA1(人工合成的磷酸化的DNA1)，100nM的DNA2，100nM的模板RNA-DNA,37℃互补配对45min形成复合探针后，加入终浓度为2.1U/μL的T4 DNA连接酶37℃反应60min，后加入终浓度为0.03U/μL的RNase H 37℃反应60min，最后加入终浓度为200nM的MB，37℃反应45min，测定荧光强度(Ex/Em＝450/521，扫描范围495～580nm，狭缝宽度10nm)。
实验结果如图1C所示。可以观察到，在没有T4 DNA连接酶的情况下，无明显的荧光信号(1C，RNA，RNA-DNA)。相同的荧光反应也出现在将T4 DNA连接酶加入到RNA模板系统中(1C,RNA+T4 DNA ligase)，说明RNA模板系统不能辅助T4 DNA连接酶修复p-DNA1和DNA2之间的缺口形成完成的DNAzyme来执行对MB的切割功能。然而，当T4 DNA连接酶引进RNA-DNA系统中，明显的荧光信号说明当RNA-DNA作为模板的时候，T4 DNA连接酶可以修复p-DNA1和DNA2之间的缺口，生成完整的DNAzyme执行对MB的切割功能(1C,RNA-DNA+T4 DNA ligase)。因此，我们选择RNA-DNA模板进行后续实验。
实施例4
如图1D，构建了一种基于DNA连接酶修复和RNase H切割释放的DNAzyme循环放大信号的多核苷酸激酶监测体系，实验分为三组：
第一组：100μL体系中加入终浓度为100nM的DNA1，0.5mM的ATP，100nM的DNA2，100nM的模板RNA-DNA，2.1U/μL的T4 DNA连接酶，0.03U/μL的RNase H，200nM的MB，37℃反应3.5h，测定荧光强度(Ex/Em＝450/521，扫描范围495～580nm，狭缝宽度10nm)。
第二组：100μL体系中加入终浓度为100nM的DNA1，0.5mM的ATP，0.05U/μL的PNK，100nM的DNA2，100nM的模板RNA-DNA，2.1U/μL的T4 DNA连接酶，0.03U/μL的RNase H，200nM的MB，37℃反应3.5h，测定荧光强度(Ex/Em＝450/521，扫描范围495～580nm，狭缝宽度10nm)。
第三组：100μL体系中加入终浓度为100nM的p-DNA1(人工合成)，0.5mM的ATP，100nM的DNA2，100nM的RNA-DNA，2.1U/μL的T4 DNA连接酶，0.03U/μL的RNase H，200nM的MB，37℃反应3.5h，测定荧光强度(Ex/Em＝450/521，扫描范围495～580nm，狭缝宽度10nm)。
所述监测体系在没有多核苷酸激酶(PNK)存在的条件下，基本没有信号释放(DNA1，荧光值为103.7a.u)；而在PNK存在的条件下，所述监测体系有很明显的荧光信号释放(PNK+DNA1，荧光值为6951a.u.)，且PNK磷酸化DNA1导致的信号释放和合成的p-DNA1引起的荧光信号释放相比，没有明显差异(p-DNA1,荧光值为7108a.u.)。信背比达到6951/103.7＝67倍，荧光信号的明显变化说明多核苷酸激酶检测方法成功，背景信号低。荧光强度高，说明检测灵敏度高。
本发明的多核苷酸激酶检测的原理如下：首先小片段DNA1、DNA2与辅助模板链RNA-DNA互补配对形成可修补的缺口，在多核苷酸激酶将ATP的γ位磷酸(γ-p)转移到DNA15’端羟基(5’-OH)后形成5’端磷酸(5’-p)，T4 DNA连接酶修补DNA1与DNA2之间的切口将两个小片段DNA连接成一条完整的DNAzyme。然后利用RNase H切割RNA杂合链的功能将完整的DNAzyme从RNA-DNA上释放出来。释放出来的DNAzyme从而可以在Mg2+辅助作用下和MB的环部互补配对，切割MB环部的RNA，使得发夹结构的MB分裂成两段，淬灭基团BHQ1与FAM荧光基团分开从而释放出荧光信号。根据荧光信号的强度可以对多核苷酸激酶进行定性或定量。
实施例5
100μL体系中加入终浓度为100nM的DNA1，0.5mM的ATP，0.05U/μL的PNK，100nM的DNA2，100nM的RNA-DNA，2.1U/μL的T4 DNA连接酶，0.03U/μL的RNase H，200nM的MB，37℃反应3.5h，测定荧光强度(Ex/Em＝450/521，扫描范围495～580nm，狭缝宽度10nm)。
另设置多个对照组，对照组是将多核苷酸激酶(PNK)换成碱性磷酸酶(ALP)、尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)、DNA修复酶(APE1)、脱氧核糖核酸酶I(DNase1)、MB核酸酶(MBNuclease)，其他操作相同。实验结果如图2所示，只有PNK引起明显的信号变化，其他的酶基本不引起荧光信号变化，说明本实施例中多核苷酸激酶检测方法的特异性良好。
实施例6
(1)脂质体合成
按照胆固醇：卵磷脂＝1：2的比例合成出10mg/ml的脂质体。
(2)细胞准备
RAW264.7细胞接种爬片到12孔板上，100ng/ml LPS处理24h。
(3)脂质体包裹
算出DNA1，DNA2，RNA-DNA、MB、ATP、T4 DNA连接酶、RNase H等的分子质量。在100μL体系中加入终浓度为100nM的DNA1，0.5mM的ATP，0.05U/μL的PNK，100nM的DNA2，100nM的RNA-DNA，2.1U/μL的T4 DNA连接酶，0.03U/μL的RNase H，200nM的MB，混合成小分子体系，按照1：3(Liposome)的质量比例将上述小分子自组装成脂质体纳米平台，具体操作如下：上述小分子和脂质体按照相应的比例混合之后，室温下共孵育30min，后加入含1％FBS的DMEM至200μL。
(4)脂质体辅助进行胞内多核苷酸激酶活性监测
用恢复至室温的PBS清洗爬片两次之后，上述混合物加入到细胞中37℃共孵育4h；
(5)实时成像
孵育结束之后，Hoechst 33342进行细胞核染色30min,后用游离的PBS清洗游离的Hoechst 33342后在多维活细胞成像显微镜下观察拍摄。
Hoechst 33342进行细胞核染色对细胞进行定位，染色为蓝色，切割MB环部的RNA，使得发夹结构的MB分裂成两段，淬灭基团BHQ1与FAM荧光基团分开从而释放出荧光信号为绿色，两者不重合，不相互干扰，两者结合可以很好的对细胞内的多核苷酸激酶进行检测。
另外设置4个对照组，对照组1为阴性对照组(CON)，为脂质体只包覆MB，对照组2为阳性对照组，为DNAzyme在胞内的切割MB释放信号，对照组3为使用模板链DNA3，对照组4为使用模板链RNA。
实验结果如图3所示，和单纯的MB(CON)相比，阳性对照DNAzyme在胞内的切割MB释放信号，脂质体辅助的多核苷酸激酶监测体系(RNA-DNA)呈现出的荧光信号和阳性对照相比无明显差异，但是两者相比于CON组，DNA3模板组和RNA模板组相对差异性明显，说明脂质体辅助的多核苷酸激酶监测体系可以实时监测胞内的多核苷酸激酶活性。
实施例7
混合物加入到细胞中37℃共孵育时间设为2h、4h、6h，其他同实施例6。实验结果如图4所示，脂质体辅助的多核苷酸激酶胞内监测体系对胞内多核苷酸激酶活性的监测呈现出时间依赖性，监测体系与细胞共孵育4h，荧光信号较共孵育2h强，同时4h和6h相比没有明显差异。
以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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<110> 湖南艾科瑞生物工程有限公司
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
catctcttct ccgagccggt cgaaatagtt ggt 33
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
accaactatt tcgaccggct cggagaagag atg 33
<210> 7
<211> 33
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 7
accaacuauu ucgaccggcu cggagaagag aug 33

Claims (10)

1.一种多核苷酸激酶检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，设计合成两个DNA片段DNA1和DNA2，DNA1的序列如SEQ ID：01所示，DNA2的序列如SEQ ID：02所示；根据沃森-克里克碱基互补配对原则设计合成RNA-DNA模板链，RNA-DNA模板链的序列如SEQ ID：03所示；设计合成DNAzyme的底物MB，MB的序列如SEQ ID：04所示；MB的5’端连接荧光基团FAM，MB的3’端连接淬灭基团BHQ1；
S2，将DNA1，DNA2，RNA-DNA模板链混合杂交形成复合探针；复合探针与MB，ATP，T4 DNA连接酶和RNase H混合成检测溶液；
S3，取检测溶液和待测样品，混合均匀，36-38℃反应40-50min后测定荧光强度，根据荧光强度定性或定量多核苷酸激酶。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸激酶检测方法，其特征在于，所述DNA1、DNA2、ATP、T4DNA连接酶、RNase H和MB在所述检测溶液中的终浓度为90～110nM、90～110nM、0.45～0.55mM、2.0～2.2U/μL、0.02～0.04U/μL和180～220nM。
3.根据权利要求1所述的多核苷酸激酶检测方法，其特征在于，所述测定荧光强度的Ex/Em＝450/521，扫描范围495～580nm，狭缝宽度10nm。
4.一种多核苷酸激酶胞内成像监测体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A1，设计合成两个DNA片段DNA1和DNA2，DNA1的序列如SEQ ID：01所示，DNA2的序列如SEQ ID：02所示；根据沃森-克里克碱基互补配对原则设计合成RNA-DNA模板链，RNA-DNA模板链的序列如SEQ ID：03所示；设计合成DNAzyme的底物MB，MB的序列如SEQ ID：04所示；MB的5’端连接荧光基团FAM，MB的3’端连接淬灭基团BHQ1；
A2，将DNA1，DNA2，RNA-DNA模板链、MB、ATP，T4 DNA连接酶、RNase H和脂质体混合均匀，室温下孵育25～35min后采用含1％胎牛血清的高糖培养基DMEM稀释，得到所述多核苷酸激酶胞内成像监测体系。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸激酶胞内成像监测体系的制备方法，其特征在于，所述DNA1、DNA2、ATP、T4 DNA连接酶、RNase H和MB在所述多核苷酸激酶胞内成像监测体系中的终浓度为90～110nM、90～110nM、0.45～0.55mM、2.0～2.2U/μL、0.02～0.04U/μL和180～220nM。
6.根据权利要求5所述的多核苷酸激酶胞内成像监测体系的制备方法，其特征在于，所述DNA1、DNA2、ATP、T4 DNA连接酶、RNase H和MB的总质量与所述脂质体的质量比为1：2.5～3.5。
7.根据权利要求4所述的多核苷酸激酶胞内成像监测体系的制备方法，其特征在于，所述脂质体根据薄膜分散法制备，其中胆固醇：卵磷脂的质量比为1：2。
8.一种多核苷酸激酶胞内成像监测体系，其特征在于，根据权利要求4至7任一项所述方法制备。
9.一种根据权利要求8所述的多核苷酸激酶胞内成像监测体系的应用方法，其特征在于，将所述多核苷酸激酶胞内成像监测体系加入到待测细胞中，36～38℃共孵育3.5～4.5h，再用进行细胞核染色，在多维活细胞成像显微镜下观察拍摄。
10.根据权利要求9所述的应用方法，其特征在于，所述细胞核染色为采用Hoechst33342染色液染色25～35min。
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