CN111972351B - 基于pit标记的龟类产卵量及受精率的定量方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物育种技术领域，尤其涉及基于PIT标记的龟类产卵量及受精率的定量方法及应用。本发明使用PIT标记经由背甲和腹甲之间容纳后肢的间隙部位注射进入腹腔，以实现对龟类的标记。运用挂签法，即将上述的PIT编号用记号笔登记在制作好的圆形纸质标签上，并用尼龙绳系在竹签末端，在龟类产卵结束，即将完成卵的掩埋工作时，将竹签插在雌龟产卵点旁，次日早晨收集龟卵。将PIT标记和挂签法相结合，即可解决个体产卵量和受精率不明的难题。
Description
技术领域
本发明属于生物育种技术领域，尤其涉及基于PIT标记的龟类产卵量及受精率的定量方法及应用。
背景技术
PIT(passive integrated transponder)标记，又称被动集成应答器，是一种基于无线射频识别的标记对动物进行跟踪识别的方法，近年来广泛应用于动物的行为、生长和资源监测等研究。PIT标记在鱼类中应用较为广泛，而在其他水生动物中的应用有限，尤其是在背有厚而坚硬的外骨骼等龟类中报道较少。
龟类属于夜晚产卵类动物，且产卵结束后不具有护卵行为，因此，养殖条件下，现有的标记技术很难将龟类的筑巢点与产卵母本准确对应。在无法确定亲本产卵能力的基础上，以产卵能力作为目标性状的选育工作因技术受限而一直迟滞不前。
目前，对于水产养殖龟类尚无有效的标记方法。本申请发明人之前有使用在龟甲上刻字或者在龟甲边缘打孔等方法，但是由于龟甲也会自然脱落，而且龟类日常活动，比如相互爬跨，打斗等都会造成龟甲边缘的磨损，因此，该方法尽管短期内可以分辨个体，但是短则半年，长则一年，刻字或者边缘打孔均无法对个体进行有效标记。
黄喉拟水龟是我国重要的具有经济，药用和观赏价值的淡水龟类之一，是新兴的水产养殖品种之一。黄喉拟水龟一般4-5年性成熟，每年4-8月筑巢、产卵，个体间产卵量差异显著。随着黄喉拟水龟人工养殖规模持续扩大，苗种获得量少成为困扰该产业发展的一个问题。目前，在人工孵化技术比较成熟的情况下，苗种获得量往往由产卵量和受精率决定，如何筛选到一批产卵能力强、受精率高的母本作为后备亲本进行强化培育，最终应用于良种选育是获得大量苗种的有效可行途径之一。而且，产卵量高的母体其受精率到底如何？与产卵量低的个体相比，是高还是低？两者有没有显著差异？这都是需要阐明的问题。所以，构建一套能够比较准确地将筑巢点与产卵雌龟相关联的标记方法，并在此基础上评估个体的产卵量和受精率，对于后续推进高繁殖力品系的选育具有重要的应用价值。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于PIT标记的龟类产卵量及受精率的定量方法及应用。利用本发明提供的技术方法确定养殖条件下黄喉拟水龟产卵个体的筑巢点，再分别结合PIT标记和标签编号确定个体每次产卵的窝卵数，接着利用铅笔对龟卵进行编号，48小时后通过观察卵的受精情况确定个体在繁殖季节的产卵量和受精率。本发明可准确鉴定并筛选产卵能力强、受精率高的黄喉拟水龟母本用于构建基础群体进行后续的良种选育工作。
本发明是这样实现的，一种基于PIT标记的龟类产卵量及受精率的定量方法，包括以下步骤：
利用PIT电子标签对雌龟进行标记：在繁殖期前，利用PIT电子标签对雌龟进行标记；所述雌龟为黄喉拟水龟；
登记产卵个体编号，标记筑巢点：在雌龟产卵即将完成时，利用手持式扫码机从雌龟后部读取筑巢个体的电子标签编号，将编号用记号笔登记在制作好的圆形纸质标签上，并用尼龙绳系在竹签末端，插在雌龟产卵点旁；
龟卵收集及编号：用铅笔对收集到的龟卵进行编号，随后在卵的上面铺设一层沙子，放在聚乙烯盆中，待后续检查受精情况；
统计受精率和产卵量：卵收集后48-72小时左右，轻轻拨开沙子，记录卵的受精情况；受精卵的标志是：在卵的中央周围出现一个白色的受精斑，且随着时间推移，白色受精斑逐渐环绕整个龟卵；否则，则定为非受精卵；
待繁殖期结束后，统计整个繁殖期黄喉拟水龟卵的受精率和产卵量。
进一步地，在利用PIT电子标签对雌龟进行标记步骤中，在繁殖期前，天气晴朗，温度适宜的情况下，将PIT电子标签沿着雌龟背甲和腹甲之间容纳后肢的间隙部位注射进入雌龟腹腔；注射前用高锰酸钾对电子标签进行消毒，接着用75％酒精棉球对入针处的腹膜进行消毒，注射时针管和腹甲与背甲连接处外沿角度≤30度，入针深度约2.5-3cm；注射完成后，用棉签蘸取红霉素软膏对入针处均匀涂抹，以防止伤口发炎；最后用手持式扫码机读取电子标签号，验证并登记标签编号；标记后的雌龟，隔日后放入产卵水池。
进一步地，在登记产卵个体编号，标记筑巢点步骤中，在养殖条件下，整个产卵池分为两部分：产卵场地和活动场地；产卵场地略高于活动场地，两者之间用挡板隔开；产卵期间，在每天17点-22点之间，移开挡板，每隔半小时巡查雌龟筑巢情况；在雌龟产卵即将完成时，即用后肢掘取沙子掩盖卵期间，利用手持式扫码机从雌龟后部轻轻贴近背甲近尾端处，读取筑巢个体的电子标签编号；将编号用记号笔登记在制作好的圆形纸质标签上，并用尼龙绳系在竹签末端，插在雌龟产卵点旁，以便次日早晨收集龟卵。
进一步地，在龟卵收集及编号步骤中，用毛刷清除卵表面的沙子，用铅笔按照“标签号”+“产卵日期”+“卵称重顺序”的格式对收集到的龟卵进行编号；在卵的中上部和中下部对编号进行两次记录，随后用电子天平按顺序记录卵的重量；随后在卵的上面铺设一层沙子，放在聚乙烯盆中，待后续检查受精情况。
如上述的基于PIT标记的龟类产卵量及受精率的定量方法在水产养殖龟类产卵能力检测中的应用。
如上述的基于PIT标记的龟类产卵量及受精率的定量方法在水产养殖龟类优良品种育种中的应用。
本发明使用PIT标记经由背甲和腹甲之间容纳后肢的间隙部位注射进入腹腔，以实现对龟类的标记。运用挂签法，即将上述的PIT编号用记号笔登记在制作好的圆形纸质标签上，并用尼龙绳系在竹签末端，在龟类产卵结束，即将完成卵的掩埋工作时，将竹签插在雌龟产卵点旁，次日早晨收集龟卵。将PIT标记和挂签法相结合，即可解决个体产卵量和受精率不明的难题。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
(1)对雌龟伤害小，注射PIT标记时留下的微创经消毒和涂抹红霉素眼膏后，会在2-3天内愈合，不会给雌龟带来负面影响，之前有使用在龟甲上刻字或者在龟甲边缘打孔等方法，此法对背甲有一定程度的损伤，尤其是影响观赏龟类的外观。而本发明中的方法可以避免这一缺陷，且不影响雌龟筑巢、产卵。
(2)通过“挂签法”将PIT标记和雌龟产卵点一一对应，解决了雌龟夜间产卵且不具有护卵行为而导致的产卵量不明的问题。
(3)该方法中使用废弃纸箱作为圆形标签的制作材料之一，废弃物回收利用率高。圆形标签可重复使用，节能环保。
(4)确定了繁殖期雌龟个体的产卵量和受精率，为后续筛选、构建产卵能力强的群体奠定基础。
本发明可以确定个体产卵量和受精率，在此基础上，淘汰那些产卵量低或者受精率低的个体，减少人力物力和财力，从而优化养殖成本。基于上述结果，后续即可通过筛选建立高产卵量和低产卵量群体，研究产卵量存在差异的机制，具有较高的科研价值和科学意义。
附图说明
图1是本发明的流程图；
图2是腹腔注射PIT标记图；
图3是竹签标记筑巢产卵点图(即将完成卵的掩埋)；
图4是已编号的卵；
图5是应用例1的数据统计图；
图6是应用例2的数据统计图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
实施例1
本发明首先披露了一种基于PIT标记的龟类产卵量及受精率的定量方法，方法流程图见图1所示。具体方法如下：
(1)利用PIT电子标签对雌龟进行标记。
在繁殖期前(3月底到4月初)天气晴朗，温度适宜的情况下，将PIT电子标签沿着雌龟背甲和腹甲之间容纳后肢的间隙部位注射进入雌龟腹腔(如图2所示)。注射前用高锰酸钾对电子标签进行消毒，接着用75％酒精棉球对入针处的腹膜进行消毒，注射时针管和腹甲与背甲连接处外沿角度≤30度，入针深度约2.5-3cm。注射完成后，用棉签蘸取红霉素软膏对入针处均匀涂抹，以防止伤口发炎。最后用手持式扫码机读取电子标签号，验证并登记标签编号。标记后的雌龟，隔日后放入产卵水池。
(2)登记产卵个体编号，标记筑巢点
在养殖条件下，整个产卵池分为两部分：产卵场地和活动场地。产卵场地略高于活动场地，两者之间用挡板隔开。产卵期间，在每天17点-22点之间，移开挡板，每隔半小时巡查雌龟筑巢情况。在雌龟产卵即将完成时(用后肢掘取沙子掩盖卵期间)，利用手持式扫码机从雌龟后部轻轻贴近背甲近尾端处，读取筑巢个体的电子标签编号。将编号用记号笔登记在制作好的圆形纸质标签上，并用尼龙绳系在竹签末端(称之为“挂签法”)，插在雌龟产卵点旁，以便次日早晨收集龟卵(如图3所示)。
(3)龟卵收集及编号
用毛刷清除卵表面的沙子，用铅笔按照“标签号”+“产卵日期”+“卵称重顺序”的格式对收集到的龟卵进行编号，比如电子标签号为12067的雌龟在05月20日晚产了3枚卵(一窝)，其编号为“120670520-1，120670520-2和120670520-3”(图4)。在卵的中上部和中下部对编号进行两次记录，随后用电子天平按顺序记录卵的重量。随后在卵的上面铺设一层沙子，放在聚乙烯盆中，待后续检查受精情况。
(4)统计受精率和产卵量
卵收集后48-72小时左右，轻轻拨开沙子，检查卵的受精情况。受精卵的标志是：在卵的中央周围出现一个白色的受精斑，且随着时间推移，白色受精斑逐渐环绕整个龟卵。否则，则定为非受精卵。按此方法依次核对每个个体每窝卵的受精情况。
待繁殖期结束后(一般为8月中旬)，统计整个繁殖期黄喉拟水龟卵的受精率和产卵量。
本发明还披露了上述基于PIT标记的龟类产卵量及受精率的定量方法的应用。
应用例1
利用该方法统计的部分雌龟(32只)在整个繁殖期的产卵量，如图5所示。
经统计分析，32只雌龟在繁殖期产卵量存在个体差异，产卵量2-14不等，平均产卵量8.62枚。产卵量在10枚及以上的个体有13只，占产卵群体的41％。表明该部分雌龟母体的繁殖性能仍然有较大的提升空间。
应用例2
利用该方法统计的该部分雌龟(32只)的受精率，结果如图6所。
经统计分析，在繁殖期32只雌龟卵受精率存在个体差异，受精率70％-100％不等，平均受精率达到96.85％。产的卵全部受精的个体有25只，占产卵群体的78％。表明该部分雌龟母体的繁殖性能较好。
总之，本发明中涉及到技术方法适用于黄喉拟水龟产卵能力强的群体的筛选，可为促进黄喉拟水龟产业发展奠定基础。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.基于PIT标记的龟类产卵量及受精率的定量方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用PIT电子标签对雌龟进行标记：在繁殖期前，利用PIT电子标签对雌龟进行标记；所述雌龟为黄喉拟水龟；
在利用PIT电子标签对雌龟进行标记步骤中，在繁殖期前，天气晴朗，温度适宜的情况下，将PIT电子标签沿着雌龟背甲和腹甲之间容纳后肢的间隙部位注射进入雌龟腹腔；注射前用高锰酸钾对电子标签进行消毒，接着用75%酒精棉球对入针处的腹膜进行消毒，注射时针管和腹甲与背甲连接处外沿角度≤30度，入针深度2.5-3cm；注射完成后，用棉签蘸取红霉素软膏对入针处均匀涂抹，以防止伤口发炎；最后用手持式扫码机读取电子标签号，验证并登记标签编号；标记后的雌龟，隔日后放入产卵水池；
登记产卵个体编号，标记筑巢点：在雌龟产卵即将完成时，利用手持式扫码机从雌龟后部读取筑巢个体的电子标签编号，将编号用记号笔登记在制作好的圆形纸质标签上，并用尼龙绳系在竹签末端，插在雌龟产卵点旁；
在登记产卵个体编号，标记筑巢点步骤中，在养殖条件下，整个产卵池分为两部分：产卵场地和活动场地；产卵场地略高于活动场地，两者之间用挡板隔开；产卵期间，在每天17点-22点之间，移开挡板，每隔半小时巡查雌龟筑巢情况；在雌龟产卵即将完成时，即用后肢掘取沙子掩盖卵期间，利用手持式扫码机从雌龟后部轻轻贴近背甲近尾端处，读取筑巢个体的电子标签编号；将编号用记号笔登记在制作好的圆形纸质标签上，并用尼龙绳系在竹签末端，插在雌龟产卵点旁，以便次日早晨收集龟卵；
龟卵收集及编号：用铅笔对收集到的龟卵进行编号，随后在卵的上面铺设一层沙子，放在聚乙烯盆中，待后续检查受精情况；
在龟卵收集及编号步骤中，用毛刷清除卵表面的沙子，用铅笔按照“标签号”+“产卵日期”+“卵称重顺序”的格式对收集到的龟卵进行编号；在卵的中上部和中下部对编号进行两次记录，随后用电子天平按顺序记录卵的重量；随后在卵的上面铺设一层沙子，放在聚乙烯盆中，待后续检查受精情况；
统计受精率和产卵量：卵收集后48-72小时，轻轻拨开沙子，记录卵的受精情况；受精卵的标志是：在卵的中央周围出现一个白色的受精斑，且随着时间推移，白色受精斑逐渐环绕整个龟卵；否则，则定为非受精卵；
待繁殖期结束后，统计整个繁殖期黄喉拟水龟卵的受精率和产卵量。
2.如权利要求1所述的基于PIT标记的龟类产卵量及受精率的定量方法在水产养殖龟类产卵能力检测中的应用。
3.如权利要求1所述的基于PIT标记的龟类产卵量及受精率的定量方法在水产养殖龟类优良品种育种中的应用。
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