CN111965351B - 一种十种呼吸道病原体联合检测试纸及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种十种呼吸道病原体联合检测试纸及其制备方法。包括从上至下依次叠加设置的第一硝酸纤维素层、防水双面胶带、第二硝酸纤维素层和PVC底板，本发明可以在一张纸上同时实现10种病原体的快速检测；通过两个样品滴加口，就可以实现10条检测线的同时检测，避免了频繁操作造成的污染以及大大降低了样品的消耗量，提高了检测结果的准确性；通过调整试纸包被的抗体，一张试纸可以实现同时检测多种类型病原体或多平行检测同种病原体；检测线和质控线位于同一横轴/纵轴上，方便对检测结果进行比较。与其他试纸相比，更加高效且精准，可为病原体的现场快速检测提供技术支持。

Description

一种十种呼吸道病原体联合检测试纸及其制备方法
技术领域
本发明涉及病原体检测领域，尤其是涉及一种十种呼吸道病原体联合检测试纸及其制备方法。
背景技术
免疫学检测技术和核酸检测技术是目前大规模检测新型冠状病毒（2019-nCoV）、呼吸道疾病的重要手段。其中，核酸检测技术中的实时荧光定量PCR技术（QuantitativeReal-time PCR，RT-PCR）是目前临床检测主要采用的方法。该技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，由于荧光基团会与DNA结合从而使体系的荧光强度发生变化。因此在反应过程中对荧光信号进行实时采集，就可以实现对样品的检测。该方法灵敏度好、特异性强。但也具有一些局限性，比如（1）对仪器和设备（RT-PCR仪）的要求较高（2）操作复杂、操作时间长（3）对引物的要求较高，易出现非特异性条带（4）感染性材料或活病毒需要灭活后进行核酸检测，易出现假阴性。
胶体金免疫层析（Immune colloidal gold technique）是近年来应用最为广泛的一项免疫学检测技术。该技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的检测法。胶体金可聚合成特定大小的金纳米颗粒，并由于静电作用形成一种稳定的胶体状态，它可以与抗体表面巯基特异性结合或产生静电吸附作用。样品中若存在相应抗体，那么会形成红色的金标复合物（抗体+金纳米颗粒）。该复合物通过检测线时会被抗原蛋白捕获，从而胶体金颗粒不断聚集而使检测线显红色。该方法具有（1）方便快速、无需专业人员、设备，便于基层、现场使用和大规模筛查（2）成本低（3）标记物稳定，存放时间长等优点，目前已经广泛应用于禽流感、艾滋病和新型冠状病毒的检测筛查中。
微流控技术是涉及化学、流体物理、生物学、材料学的新型交叉技术，它具有微型化、集成化、自动化的特点，能够比传统方法在更短时间内处理和分析多个/多量的样品。目前，微流控芯片已用于化学、物理、生物学、医学、农业、食品和环境监测等领域，尤其在生物医学研究相关领域应用最为广泛和透彻。其中，纸基微流控技术不仅具备上述的诸多优点，而且成本低廉、易于制作，已成为该领域研究的重点。
本发明将纸基微流控、胶体金免疫层析两种技术相结合，研发了一种用于检测十种呼吸道病原体的联合检测试纸，包括新型冠状病毒(2019-nCoV)、嗜肺军团菌(LP)、肺炎支原体(MP)、Q热立克次体(COX)、肺炎衣原体(CP)、腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、甲型流感病毒(IFA)、乙型流感病毒(IFB)和副流感病毒 (PIVS)，实现了反应、检测一体化，提高了检测结果的准确度和灵敏度，大幅降低了样品消耗，并且更加小型化、易于携带，便于大规模筛查和快速诊断。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种十种呼吸道病原体联合检测试纸及其制备方法，解决对于仅检测单一抗原/抗体的检测试纸来说，虽然能满足该物质的检测需求，但对于需要同时检测数种物质的场合下，不仅需要准备不同类型的检测试纸，而且需要来回滴加样品液，这不仅增加了检测成本，而且操作费时费力、样品消耗量大；对于组合试纸，往往具有多个样品滴加口，需要反复滴加样品液，操作繁琐； 由于这种试纸往往是将数个单一试纸拼接在一起，所以检测试纸的面积较大，利用率低；此外，检测线和质控线往往处于不同的位置，不利于对检测结果进行观察和比较，对于同一张纸上具有多个检测线的试纸，由于样品垫的大小是固定的，它所含有的胶体金标记的蛋白量也是一定的。检测的病原体种类越多，检测线也越多，每条检测线上所能结合的金标复合物的量就越少，会造成灵敏度低、显示的颜色结果不准确（变浅），影响结果的判断等。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
一种十种呼吸道病原体联合检测试纸，包括从上至下依次叠加设置的第一硝酸纤维素层、防水双面胶带、第二硝酸纤维素层和PVC底板，
第一硝酸纤维素层上设置有五条竖向设置的第一检测通道，第一检测通道的其中一端设置有第一试剂加入口，第一检测通道靠近第一试剂加入口处覆盖有结合垫，第一检测通道远离第一试剂加入口的一端上设置有第一质控线和第一检测线，第一质控线和第一检测线配合形成第一检测结果显示区，试剂从第一试剂加入口在自动虹吸作用下通过结合垫后流向第一质控线和第一检测线并显示检测结果，第一硝酸纤维素层其中一侧边缘与最外侧的第一检测通道之间设置有第二试剂加入口，第一硝酸纤维素层远离第二试剂加入口一侧边缘与最外侧的第一检测通道之间设置有第二检测结果显示区，第二检测结果显示区包括五条与第一检测通道相互垂直的五条辅助通道，五条辅助通道靠近第一检测通道的一端上均设置有第一渗透带，五条辅助通道远离第一检测通道的一端上均设置有第二质控线和第二检测线，
第二硝酸纤维素层上设置有五条横向分布的第二检测通道，第二硝酸纤维素层上靠近第二检测通道的其中一端处设置有渗透试剂加入口，五条第二检测通道均与渗透试剂加入口导通，第二检测通道靠近渗透试剂加入口的一端上覆盖有结合垫，每个第二检测通道远离渗透试剂加入口的一端上设置有第二渗透带，
贯穿防水双面胶带层上开设有一个试剂渗透通孔和五个渗透带通孔，试剂渗透通孔内填充有第一亲水材料，每个渗透带通孔内填充有第二亲水材料，渗透试剂加入口位于第二试剂加入口正下方并通过试剂渗透通孔内填充的第一亲水材料导通，第二渗透带位于第一渗透带的正下方并通过渗透带通孔内填充的第二亲水材料导通，第二试剂加入口中的试剂通过试剂渗透通孔中的第一亲水材料流向渗透试剂加入口，渗透试剂加入口中的试剂在自动虹吸作用下分别流向第二检测通道，试剂经过结合垫后沿着第二检测通道流向第二渗透带，第二渗透带中的试剂通过渗透带通孔内填充的第二亲水材料引向第一渗透带，第一渗透带中的试剂沿着辅助通道流向第二检测结果显示区中的第二质控线和第二检测线并进行检测结果显示。
所述的第一检测通道、第二检测通道、第一试剂加入口、第二试剂加入口和渗透试剂加入口均通过疏水带线分割而成。
所述的第一试剂加入口、第二试剂加入口和渗透试剂加入口的疏水带线为圆环形。
利用所述的一种十种呼吸道病原体联合检测试纸的制备方法，包括胶体金制备的步骤、胶体金标记物制备的步骤和结合垫制备的步骤，还包括如下步骤：
步骤一、第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层的修饰处理：
裁取两块大小相同的硝酸纤维素膜，取其中一个硝酸纤维素膜作为第一硝酸纤维素层，并在该硝酸纤维素膜上用疏水材料作为隔离带分割出第一检测通道、第一试剂加入口、第二试剂加入口和辅助通道，并将第一检测通道和第一试剂加入口导通，将另一个硝酸纤维素膜作为第二硝酸纤维素层并用疏水材料在作为隔离带分割出第二检测通道和渗透试剂加入口，将第二检测通道和渗透试剂加入口导通；
步骤二、在步骤一中第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层分割出的第一检测通道和第二检测通道上分别加工质控线和检测线，
步骤三、取大小尺寸与第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层相匹配的防水双面胶带，在双面胶带上加工一个试剂渗透通孔和五个渗透带通孔；
步骤四、将制备的结合垫安装在步骤二中加工有质控线和检测线的第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层上，取步骤三中的双面胶带，并在一个试剂渗透通孔和五个渗透带通孔中填充由水和硝酸纤维素粉末混合制成的糊状物，将防水双面胶带上层保护膜解开并覆盖在第一硝酸纤维素层底部，五个渗透带通孔中的糊状物分别与辅助通道对应接触形成第一渗透带，试剂渗透通孔位于第二试剂加入口正下方，双面胶带和第一硝酸纤维素层粘贴完毕后，去掉双面胶带的下层保护膜，将第二硝酸纤维素层与双面胶带粘贴，渗透试剂加入口位于试剂渗透通孔正下方，第二检测通道分别与五个渗透带通孔中的糊状物接触形成第二渗透带；
步骤五、取大小尺寸与第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层相同的PVC底板，将PVC底板粘贴在步骤四中第二硝酸纤维素层底部，完成试纸的组装，将试纸加入密封袋中并加入干燥剂后避光保存。
所述的渗透带通孔的直径为1-2mm，渗透带通孔的深度为55-65μm。
所述的第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层的修饰处理方法采用光刻法、印刷法中的任意一种。
所述的光刻法是指利用掩膜进行局部曝光，使光刻胶局部固化，再洗去未固化的材料，从而在纸上制作出亲水通道的方法。
印刷法是指利用蜡、聚合物墨水等热固化材质，结合手绘、丝网印刷术、印章、打印等技术实现纸上图案化。
还可以采用切割法：利用人工切割、机器切割、激光切割等技术将纸材直接切割成适合的形状，从而获得通道。
本发明可以在一张纸上同时实现10种病原体的快速检测；通过两个样品滴加口，就可以实现10条检测线的同时检测，避免了频繁操作造成的污染以及大大降低了样品的消耗量，真正意义上实现多种疾病的联合检测，提高检测结果的准确性，而且该试纸还具备平行检测和多重检测的能力，通过调整试纸包被的抗体，一张试纸可以实现同时检测多次同种类型病原体，极大提高了检测的准确性，此外，检测线和质控线位于同一横轴/纵轴上，方便对检测结果进行比较。与其他试纸相比，在体积大小基本不变的情况下，将10种病原体检测集成到了一张试纸上，做到了便携且精准的特点，可为病原体的现场快速检测提供技术支持。
本发明的有益效果是：本发明采用纸基微流控技术，在保证轻量化、一体化的同时，可以同时检测十种呼吸道病原体，从而实现对常见呼吸道类疾病的检测。通过两个样品滴加口，一次取血两次滴加样品，就可以实现十条检测通道的同时检测，避免了频繁操作造成的污染以及大大降低了样品的消耗量，真正意义上实现多种疾病的联合检测，提高了检测结果的准确性。检测线和质控线位于同一横纵或纵轴，方便对检测结果进行观察。十个通道之间互不干扰，可以保证检测结果的完全独立。
附图说明
图1本发明的结构示意图。
图2为本发明中第一硝酸纤维素层的结构示意图。
图3为本发明中双面胶带的结构示意图。
图4为本发明中图3内A-A方向的剖视图。
图5为本发明中图3内B-B方向的剖视图。
图6为本发明中第二硝酸纤维素层的结构示意图。
图7为本发明中PVC底板的结构示意图。
图示标记：1、第一硝酸纤维素层，101、第一试剂加入口，102、第一检测通道，103、第二试剂加入口，104、第一检测结果显示区，105、第一渗透带，106、辅助通道，2、双面胶带,201、试剂渗透通孔，202、渗透带通孔，203、第一亲水材料，204、第二亲水材料，3、第二硝酸纤维素层，301、渗透试剂加入口，302、第二检测通道，303、第二渗透带，4、PVC底板。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围 。
实施一：
一种十种呼吸道病原体联合检测试纸，包括从上至下依次叠加设置的第一硝酸纤维素层1、防水双面胶带2、第二硝酸纤维素层3和PVC底板4，
第一硝酸纤维素层1上设置有五条竖向设置的第一检测通道102，第一检测通道102的其中一端设置有第一试剂加入口101，第一检测通道102靠近第一试剂加入口101处覆盖有结合垫，第一检测通道102远离第一试剂加入口101的一端上设置有第一质控线和第一检测线，第一质控线和第一检测线配合形成第一检测结果显示区104，试剂从第一试剂加入口101在自动虹吸作用下通过结合垫后流向第一质控线和第一检测线并显示检测结果，第一硝酸纤维素层1其中一侧边缘与最外侧的第一检测通道之间设置有第二试剂加入口103，第一硝酸纤维素层远离第二试剂加入口103一侧边缘与最外侧的第一检测通道之间设置有第二检测结果显示区，第二检测结果显示区包括五条与第一检测通道相互垂直的五条辅助通道106，五条辅助通道106靠近第一检测通道的一端上均设置有第一渗透带105，五条辅助通道远离第一检测通道的一端上均设置有第二质控线和第二检测线，
第二硝酸纤维素层3上设置有五条横向分布的第二检测通道302，第二硝酸纤维素层3上靠近第二检测通道的其中一端处设置有渗透试剂加入口301，五条第二检测通道均与渗透试剂加入口301导通，第二检测通道靠近渗透试剂加入口301的一端上覆盖有结合垫，每个第二检测通道远离渗透试剂加入口的一端上设置有第二渗透带303，
贯穿双面胶带2上开设有一个试剂渗透通孔201和五个渗透带通孔202，试剂渗透通孔201内填充有第一亲水材料203，每个渗透带通孔202内填充有第二亲水材料204，渗透试剂加入口301位于第二试剂加入口103正下方并通过试剂渗透通孔201内填充的第一亲水材料203导通，第二渗透带303位于第一渗透带105的正下方并通过渗透带通孔202内填充的第二亲水材料204导通，第二试剂加入口103中的试剂通过试剂渗透通孔201中的第一亲水材料203流向渗透试剂加入口301，渗透试剂加入口301中的试剂在自动虹吸作用下分别流向第二检测通道302，试剂经过结合垫后沿着第二检测通道流向第二渗透带303，第二渗透带303中的试剂通过渗透带通孔202内填充的第二亲水材料204引向第一渗透带205，第一渗透带205中的试剂沿着辅助通道106流向第二检测结果显示区中的第二质控线和第二检测线并进行检测结果显示，第一亲水材料和第二亲水材料均由水和硝酸纤维素粉末混合制成。
所述的第一检测通道、第二检测通道、第一试剂加入口、第二试剂加入口和渗透试剂加入口均通过疏水带线分割而成。
所述的第一试剂加入口、第二试剂加入口和渗透试剂加入口的疏水带线为圆环形。
所述的一种十种呼吸道病原体联合检测试纸的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、胶体金制备
将实验中所用到的容器均用王水（体积比为浓硝酸：浓盐酸=1：3）浸泡24h，所有试剂均用超纯水进行配制，首先，向500mL锥形瓶中加入450mL超纯水并加热至沸腾后，再加入50mL 1g/L的氯金酸水溶液（HAuCl4），并连续不断的搅拌加热至沸腾保持10min，在连续不断地搅拌下，逐滴加入质量分数为0.5％-1％的1mL 柠檬酸钠水溶液，继续加热搅拌30min后，溶液呈现出稳定的酒红色；关闭加热源，但保持搅拌直至溶液冷却至室温，制备得到金标溶液，然后将金标溶液放置于4℃的冰箱中保存备用；
步骤二、胶体金标记物制备
取10mL步骤一制备的金标溶液，并在金标溶液中加入一定量的0.1-0.2 mol/L碳酸钾（K2CO3）水溶液，调整混合溶液的pH为8.0左右得到金标复溶液，再将鼠抗人IgG抗体和兔IgG抗体分别用pH=8.0的硼酸盐水溶液稀释至0.2 mg/mL，将稀释后的鼠抗人IgG抗体和兔IgG抗体均加入离心管中，静置室温放置1h；之后在离心管中加入体积浓度为10％的BSA溶液500μl，室温条件下封闭2h，然后将离心管中溶液在8000r/min、4℃条件下进行离心45min，将离心管中溶液弃上清液后，将沉淀物重悬于1mL的金标复溶液中，放置于4℃冰箱中保存备用，抗体用量为8-10 μg/mL；
步骤三、结合垫制备
将结合垫放入容器中，加入50mL处理液（质量百分比浓度为1％BSA、质量百分比浓度为0.1％Tween-20、质量百分比浓度为3％蔗糖，余量为0.01mol/L pH7.2的PBS溶液）浸泡结合垫，10min后，置于37℃恒温烘箱中干燥12h；将步骤二中胶体金标记的鼠抗人IgG抗体和兔IgG抗体混合后喷涂在上述处理过的结合垫上，放入37℃恒温烘箱中干燥12h得到结合垫，将处理后结合垫放入锡箔纸中，加入少许干燥剂，用塑料薄膜封口机进行封口后，放置在通风、干燥、避光的环境中保存备用，组装试纸前将结合垫裁剪成3×7mm的大小。
步骤四、第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层的修饰处理：
裁取5.0×5.0 cm两块大小相同的硝酸纤维素膜，取其中一个硝酸纤维素膜作为第一硝酸纤维素层，使用SU-8 2010光刻胶对第一硝酸纤维素层进行构图，用疏水材料作为隔离带分割出第一检测通道、第一试剂加入口、第二试剂加入口和辅助通道，并将第一检测通道和第一试剂加入口导通，将另一个硝酸纤维素膜作为第二硝酸纤维素层并用疏水材料在作为隔离带分割出第二检测通道和渗透试剂加入口，将第二检测通道和渗透试剂加入口导通，具体方法为先将第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层用光刻胶浸润，再盖上透明的掩模板后放在紫外灯下照射（进行局部曝光）；之后用丙酮和异丙醇处理（洗去未固化的材料，在第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层上形成不同的亲水区域和疏水区域）；
步骤五、在步骤四中第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层分割出的第一检测通道和第二检测通道上分别加工质控线和检测线，用不含K+的PBS溶液将羊抗兔IgG抗体稀释至0.3mg/mL，将10种重组抗原稀释至0.2mg/mL（10种重组抗原分别为新冠病毒重组抗原、甲型流感病毒重组抗原、乙型流感病毒重组抗原、副流感病毒重组抗原、Q热立克次体重组抗原、肺炎支原体重组抗原、肺炎衣原体重组抗原、呼吸道合胞病毒重组抗原、腺病毒重组抗原、嗜肺军团菌重组抗原）；使用划膜机，以0.9μL/mL的划膜量将稀释好的上述羊抗兔IgG抗体和稀释好的病原体重组抗原划至第一检测通道和第二检测通道上，分别形成质控线（Control Line，C Line）和检测线（Test Line，T Line），划好后，将第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层放入37℃烘箱，烘干2h，放入密封袋并加入适量的干燥剂，避光保存备用；
步骤六、取大小尺寸与第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层相匹配的双面胶带，在双面胶带上使用激光切割机加工一个试剂渗透通孔和五个渗透带通孔，渗透带通孔的直径为2mm，渗透带通孔的深度为60μm；
步骤七、将制备的结合垫安装在步骤二中加工有质控线和检测线的第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层上，取步骤三中的双面胶带，并在一个试剂渗透通孔和五个渗透带通孔中填充由水和硝酸纤维素粉末混合制成的糊状物，将双面胶带上层保护膜解开并覆盖在第一硝酸纤维素层底部，五个渗透带通孔中的糊状物分别与辅助通道对应接触形成第一渗透带，试剂渗透通孔位于第二试剂加入口正下方，双面胶带和第一硝酸纤维素层粘贴完毕后，去掉双面胶带的下层保护膜，将第二硝酸纤维素层与双面胶带粘贴，渗透试剂加入口位于试剂渗透通孔正下方，第二检测通道分别与五个渗透带通孔中的糊状物接触形成第二渗透带；
步骤八、取大小尺寸与第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层相同的PVC底板，将PVC底板粘贴在步骤四中第二硝酸纤维素层底部，完成试纸的组装，将试纸加入密封袋中并加入干燥剂后避光保存。
实施二：
一种十种呼吸道病原体联合检测试纸，包括从上至下依次叠加设置的第一硝酸纤维素层1、双面胶带2、第二硝酸纤维素层3和PVC底板4，
第一硝酸纤维素层1上设置有五条竖向设置的第一检测通道102，第一检测通道102的其中一端设置有第一试剂加入口101，第一检测通道102靠近第一试剂加入口101处覆盖有结合垫，第一检测通道102远离第一试剂加入口101的一端上设置有第一质控线和第一检测线，第一质控线和第一检测线配合形成第一检测结果显示区104，试剂从第一试剂加入口101在自动虹吸作用下通过结合垫后流向第一质控线和第一检测线并显示检测结果，第一硝酸纤维素层1其中一侧边缘与最外侧的第一检测通道之间设置有第二试剂加入口103，第一硝酸纤维素层远离第二试剂加入口103一侧边缘与最外侧的第一检测通道之间设置有第二检测结果显示区，第二检测结果显示区包括五条与第一检测通道相互垂直的五条辅助通道106，五条辅助通道106靠近第一检测通道的一端上均设置有第一渗透带105，五条辅助通道远离第一检测通道的一端上均设置有第二质控线和第二检测线，
第二硝酸纤维素层3上设置有五条横向分布的第二检测通道302，第二硝酸纤维素层3上靠近第二检测通道的其中一端处设置有渗透试剂加入口301，五条第二检测通道均与渗透试剂加入口301导通，第二检测通道靠近渗透试剂加入口301的一端上覆盖有结合垫，每个第二检测通道远离渗透试剂加入口的一端上设置有第二渗透带303，
贯穿双面胶带2上开设有一个试剂渗透通孔201和五个渗透带通孔202，试剂渗透通孔201内填充有第一亲水材料203，每个渗透带通孔202内填充有第二亲水材料204，渗透试剂加入口301位于第二试剂加入口103正下方并通过试剂渗透通孔201内填充的第一亲水材料203导通，第二渗透带303位于第一渗透带105的正下方并通过渗透带通孔202内填充的第二亲水材料204导通，第二试剂加入口103中的试剂通过试剂渗透通孔201中的第一亲水材料203流向渗透试剂加入口301，渗透试剂加入口301中的试剂在自动虹吸作用下分别流向第二检测通道302，试剂经过结合垫后沿着第二检测通道流向第二渗透带303，第二渗透带303中的试剂通过渗透带通孔202内填充的第二亲水材料204引向第一渗透带205，第一渗透带205中的试剂沿着辅助通道106流向第二检测结果显示区中的第二质控线和第二检测线并进行检测结果显示，第一亲水材料和第二亲水材料均由水和硝酸纤维素粉末混合制成。
所述的第一检测通道、第二检测通道、第一试剂加入口、第二试剂加入口和渗透试剂加入口均通过疏水带线分割而成。
所述的第一试剂加入口、第二试剂加入口和渗透试剂加入口的疏水带线为圆环形。
所述的一种十种呼吸道病原体联合检测试纸的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、胶体金制备
将实验中所用到的容器均用王水（体积比为浓硝酸：浓盐酸=1：3）浸泡24h，所有试剂均用超纯水进行配制，首先，向500mL锥形瓶中加入450mL超纯水并加热至沸腾后，再加入50mL 1g/L的氯金酸水溶液（HAuCl4），并连续不断的搅拌加热至沸腾保持10min，在连续不断地搅拌下，逐滴加入质量分数为0.5％-1％的1mL 柠檬酸钠水溶液，继续加热搅拌30min后，溶液呈现出稳定的酒红色；关闭加热源，但保持搅拌直至溶液冷却至室温，制备得到金标溶液，然后将金标溶液放置于4℃的冰箱中保存备用；
步骤二、胶体金标记物制备
取10mL步骤一制备的金标溶液，并在金标溶液中加入一定量的0.1-0.2 mol/L碳酸钾（K2CO3）水溶液，调整混合溶液的pH为8.0左右得到金标复溶液，再将鼠抗人IgM抗体和兔IgM抗体分别用pH=8.0的硼酸盐水溶液稀释至0.2 mg/mL，将稀释后的鼠抗人IgM抗体和兔IgM抗体均加入离心管中，静置室温放置1h；之后在离心管中加入体积浓度为10％的BSA溶液500μl，室温条件下封闭2h，然后将离心管中溶液在8000r/min、4℃条件下进行离心45min，将离心管中溶液弃上清液后，将沉淀物重悬于1mL的金标复溶液中，放置于4℃冰箱中保存备用，抗体用量为8-10 μg/mL；
步骤三、结合垫制备
将结合垫放入容器中，加入50mL处理液（质量百分比浓度为1％BSA、质量百分比浓度为0.1％Tween-20、质量百分比浓度为3％蔗糖，余量为0.01mol/L pH7.2的PBS溶液）浸泡结合垫，10min后，置于37℃恒温烘箱中干燥12h；将步骤二中胶体金标记的鼠抗人IgM抗体和兔IgM抗体混合后喷涂在上述处理过的结合垫上，放入37℃恒温烘箱中干燥12h得到结合垫，将处理后结合垫放入锡箔纸中，加入少许干燥剂，用塑料薄膜封口机进行封口后，放置在通风、干燥、避光的环境中保存备用，组装试纸前将结合垫裁剪成3×7mm的大小。
步骤四、第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层的修饰处理：
裁取5.0×5.0 cm两块大小相同的硝酸纤维素膜，取其中一个硝酸纤维素膜作为第一硝酸纤维素层，使用印刷法对第一硝酸纤维素层进行构图，用疏水材料作为隔离带分割出第一检测通道、第一试剂加入口、第二试剂加入口和辅助通道，并将第一检测通道和第一试剂加入口导通，将另一个硝酸纤维素膜作为第二硝酸纤维素层并用疏水材料在作为隔离带分割出第二检测通道和渗透试剂加入口，将第二检测通道和渗透试剂加入口导通，具体方法为通过用低温蜡融化后用手绘的方法在第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层画出对应图案；
步骤五、在步骤四中第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层分割出的第一检测通道和第二检测通道上分别加工质控线和检测线，用不含K+的PBS溶液将羊抗兔IgM抗体稀释至0.3mg/mL，将10种重组抗原稀释至0.2mg/mL（10种病原体重组抗原为：新冠病毒重组抗原、甲型流感病毒重组抗原、乙型流感病毒重组抗原、副流感病毒重组抗原、Q热立克次体重组抗原、肺炎支原体重组抗原、肺炎衣原体重组抗原、呼吸道合胞病毒重组抗原、腺病毒重组抗原、嗜肺军团菌重组抗原）；使用划膜机，以0.9μL/mL的划膜量将稀释好的上述羊抗兔IgM抗体和稀释好的病原体重组抗原划至第一检测通道和第二检测通道上，分别形成质控线（Control Line，C Line）和检测线（Test Line，T Line），划好后，将第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层放入37℃烘箱，烘干2h，放入密封袋并加入适量的干燥剂，避光保存备用；
步骤六、取大小尺寸与第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层相匹配的双面胶带，在双面胶带上使用激光切割机加工一个试剂渗透通孔和五个渗透带通孔，渗透带通孔的直径为2mm，渗透带通孔的深度为60μm；
步骤七、将制备的结合垫安装在步骤二中加工有质控线和检测线的第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层上，取步骤三中的双面胶带，并在一个试剂渗透通孔和五个渗透带通孔中填充由水和硝酸纤维素粉末混合制成的糊状物，将双面胶带上层保护膜解开并覆盖在第一硝酸纤维素层底部，五个渗透带通孔中的糊状物分别与辅助通道对应接触形成第一渗透带，试剂渗透通孔位于第二试剂加入口正下方，双面胶带和第一硝酸纤维素层粘贴完毕后，去掉双面胶带的下层保护膜，将第二硝酸纤维素层与双面胶带粘贴，渗透试剂加入口位于试剂渗透通孔正下方，第二检测通道分别与五个渗透带通孔中的糊状物接触形成第二渗透带；
步骤八、取大小尺寸与第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层相同的PVC底板，将PVC底板粘贴在步骤四中第二硝酸纤维素层底部，完成试纸的组装，将试纸加入密封袋中并加入干燥剂后避光保存。
实施三：
一种十种呼吸道病原体联合检测试纸，包括从上至下依次叠加设置的第一硝酸纤维素层1、双面胶带2、第二硝酸纤维素层3和PVC底板4，
第一硝酸纤维素层1上设置有五条竖向设置的第一检测通道102，第一检测通道102的其中一端设置有第一试剂加入口101，第一检测通道102靠近第一试剂加入口101处覆盖有结合垫，第一检测通道102远离第一试剂加入口101的一端上设置有第一质控线和第一检测线，第一质控线和第一检测线配合形成第一检测结果显示区104，试剂从第一试剂加入口101在自动虹吸作用下通过结合垫后流向第一质控线和第一检测线并显示检测结果，第一硝酸纤维素层1其中一侧边缘与最外侧的第一检测通道之间设置有第二试剂加入口103，第一硝酸纤维素层远离第二试剂加入口103一侧边缘与最外侧的第一检测通道之间设置有第二检测结果显示区，第二检测结果显示区包括五条与第一检测通道相互垂直的五条辅助通道106，五条辅助通道106靠近第一检测通道的一端上均设置有第一渗透带105，五条辅助通道远离第一检测通道的一端上均设置有第二质控线和第二检测线，
第二硝酸纤维素层3上设置有五条横向分布的第二检测通道302，第二硝酸纤维素层3上靠近第二检测通道的其中一端处设置有渗透试剂加入口301，五条第二检测通道均与渗透试剂加入口301导通，第二检测通道靠近渗透试剂加入口301的一端上覆盖有结合垫，每个第二检测通道远离渗透试剂加入口的一端上设置有第二渗透带303，
贯穿双面胶带2上开设有一个试剂渗透通孔201和五个渗透带通孔202，试剂渗透通孔201内填充有第一亲水材料203，每个渗透带通孔202内填充有第二亲水材料204，渗透试剂加入口301位于第二试剂加入口103正下方并通过试剂渗透通孔201内填充的第一亲水材料203导通，第二渗透带303位于第一渗透带105的正下方并通过渗透带通孔202内填充的第二亲水材料204导通，第二试剂加入口103中的试剂通过试剂渗透通孔201中的第一亲水材料203流向渗透试剂加入口301，渗透试剂加入口301中的试剂在自动虹吸作用下分别流向第二检测通道302，试剂经过结合垫后沿着第二检测通道流向第二渗透带303，第二渗透带303中的试剂通过渗透带通孔202内填充的第二亲水材料204引向第一渗透带205，第一渗透带205中的试剂沿着辅助通道106流向第二检测结果显示区中的第二质控线和第二检测线并进行检测结果显示，第一亲水材料和第二亲水材料均由水和硝酸纤维素粉末混合制成。
所述的第一检测通道、第二检测通道、第一试剂加入口、第二试剂加入口和渗透试剂加入口均通过疏水带线分割而成。
所述的第一试剂加入口、第二试剂加入口和渗透试剂加入口的疏水带线为圆环形。
所述的一种十种呼吸道病原体联合检测试纸的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、胶体金制备
将实验中所用到的容器均用王水（体积比为浓硝酸：浓盐酸=1：3）浸泡24h，所有试剂均用超纯水进行配制，首先，向500mL锥形瓶中加入450mL超纯水并加热至沸腾后，再加入50mL 1g/L的氯金酸水溶液（HAuCl4），并连续不断的搅拌加热至沸腾保持10min，在连续不断地搅拌下，逐滴加入质量分数为0.5％-1％的1mL 柠檬酸钠水溶液，继续加热搅拌30min后，溶液呈现出稳定的酒红色；关闭加热源，但保持搅拌直至溶液冷却至室温，制备得到金标溶液，然后将金标溶液放置于4℃的冰箱中保存备用；
步骤二、胶体金标记物制备
取10mL步骤一制备的金标溶液，并在金标溶液中加入一定量的0.1-0.2 mol/L碳酸钾（K2CO3）水溶液，调整混合溶液的pH为8.0左右得到金标复溶液，再将10种病原体靶抗原I抗体（肺炎支原体靶抗原I抗体、肺炎衣原体靶抗原I抗体、呼吸道合胞病毒靶抗原I抗体、腺病毒靶抗原I抗体、嗜肺军团菌靶抗原I抗体、新冠病毒靶抗原I抗体、甲型流感病毒靶抗原I抗体、乙型流感病毒靶抗原I抗体、副流感病毒靶抗原I抗体、Q热立克次体靶抗原I抗体）和兔IgM抗体分别用pH=8.0的硼酸盐水溶液稀释至0.2 mg/mL，将稀释后的10种靶抗原I抗体和兔IgM抗体均加入离心管中，静置室温放置1h；之后在离心管中加入体积浓度为10％的BSA溶液500μl，室温条件下封闭2h，然后将离心管中溶液在8000r/min、4℃条件下进行离心45min，将离心管中溶液弃上清液后，将沉淀物重悬于1mL的金标复溶液中，放置于4℃冰箱中保存备用，抗体用量为8-10 μg/mL；
步骤三、结合垫制备
将结合垫放入容器中，加入50mL处理液（质量百分比浓度为1％BSA、质量百分比浓度为0.1％Tween-20、质量百分比浓度为3％蔗糖，余量为0.01mol/L pH7.2的PBS溶液）浸泡结合垫，10min后，置于37℃恒温烘箱中干燥12h；将步骤二中胶体金标记的10种靶抗原I抗体（肺炎支原体靶抗原I抗体、肺炎衣原体靶抗原I抗体、呼吸道合胞病毒靶抗原I抗体、腺病毒靶抗原I抗体、嗜肺军团菌靶抗原I抗体、新冠病毒靶抗原I抗体、甲型流感病毒靶抗原I抗体、乙型流感病毒靶抗原I抗体、副流感病毒靶抗原I抗体、Q热立克次体靶抗原I抗体）分别与兔IgM抗体混合后喷涂在不同的上述处理过的结合垫上，放入37℃恒温烘箱中干燥12h得到结合垫，将处理后结合垫放入锡箔纸中，加入少许干燥剂，用塑料薄膜封口机进行封口后，放置在通风、干燥、避光的环境中保存备用，组装试纸前将结合垫裁剪成3×7mm的大小；
步骤四、第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层的修饰处理：
裁取5.0×5.0 cm两块大小相同的硝酸纤维素膜，取其中一个硝酸纤维素膜作为第一硝酸纤维素层，使用印刷法对第一硝酸纤维素层进行构图，用疏水材料作为隔离带分割出第一检测通道、第一试剂加入口、第二试剂加入口和辅助通道，并将第一检测通道和第一试剂加入口导通，将另一个硝酸纤维素膜作为第二硝酸纤维素层并用疏水材料在作为隔离带分割出第二检测通道和渗透试剂加入口，将第二检测通道和渗透试剂加入口导通，具体方法为先制备聚二甲基硅氧烷混合液，取干净容器加入质量比例为10：1的聚二甲基硅氧烷单体与固化剂，搅拌均匀，抽真空除去气泡。将硝酸纤维素膜裁剪为9mm x 9mm 的尺寸。将混合好的聚二甲基硅氧烷混合液灌入玻璃毛细管中，用玻璃毛细管在第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层按照设计图案画线。线宽为1mm，图案画完后将涂有聚二甲基硅氧烷混合液的硝酸纤维素膜放置80℃的烘箱中，静置20min，然后取出冷却，聚二甲基硅氧烷固化，即获得多通道硝酸纤维素膜纸基微流控芯片。固化后的聚二甲基硅氧烷在硝酸纤维素膜上形成疏水区域，其他未经修饰的区域为亲水区域。滴加样品后，样品会沿着亲水区流动；
步骤五、在步骤四中第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层分割出的第一检测通道和第二检测通道上分别加工质控线和检测线，用不含K+的PBS溶液将羊抗兔IgM抗体稀释至0.3mg/mL，将10种病原体靶抗原Ⅱ抗体（新冠病毒靶抗原Ⅱ抗体、甲型流感病毒靶抗原Ⅱ抗体、乙型流感病毒靶抗原Ⅱ抗体、副流感病毒靶抗原Ⅱ抗体、Q热立克次体靶抗原Ⅱ抗体、肺炎支原体靶抗原Ⅱ抗体、肺炎衣原体靶抗原Ⅱ抗体、呼吸道合胞病毒靶抗原Ⅱ抗体、腺病毒靶抗原Ⅱ抗体、嗜肺军团菌靶抗原Ⅱ抗体）稀释至0.2mg/mL；使用划膜机，以0.9μL/mL的划膜量将稀释好的上述羊抗兔IgM抗体和稀释好的10种靶抗原Ⅱ抗体划至第一检测通道和第二检测通道上，分别形成质控线（Control Line，C Line）和检测线（Test Line，T Line），划好后，将第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层放入37℃烘箱，烘干2h，放入密封袋并加入适量的干燥剂，避光保存备用；
步骤六、取大小尺寸与第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层的双面胶带，在双面胶带上使用手动打孔机进行打孔加工一个试剂渗透通孔和五个渗透带通孔，渗透带通孔的直径为2mm，渗透带通孔的深度为60μm；
步骤七、将制备的结合垫安装在步骤二中加工有质控线和检测线的第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层上，取步骤三中的双面胶带，并在一个试剂渗透通孔和五个渗透带通孔中填充由水和硝酸纤维素粉末混合制成的糊状物，将双面胶带上层保护膜解开并覆盖在第一硝酸纤维素层底部，五个渗透带通孔中的糊状物分别与辅助通道对应接触形成第一渗透带，试剂渗透通孔位于第二试剂加入口正下方，双面胶带和第一硝酸纤维素层粘贴完毕后，去掉双面胶带的下层保护膜，将第二硝酸纤维素层与双面胶带粘贴，渗透试剂加入口位于试剂渗透通孔正下方，第二检测通道分别与五个渗透带通孔中的糊状物接触形成第二渗透带；
步骤八、取大小尺寸与第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层相同的PVC底板，将PVC底板粘贴在步骤四中第二硝酸纤维素层底部，完成试纸的组装，将试纸加入密封袋中并加入干燥剂后避光保存
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种十种呼吸道病原体联合检测试纸，其特征在于：包括从上至下依次叠加设置的第一硝酸纤维素层、防水双面胶带、第二硝酸纤维素层和PVC底板，
第一硝酸纤维素层上设置有五条竖向设置的第一检测通道，第一检测通道的其中一端设置有第一试剂加入口，第一检测通道靠近第一试剂加入口处覆盖有结合垫，第一检测通道远离第一试剂加入口的一端上设置有第一质控线和第一检测线，第一质控线和第一检测线配合形成第一检测结果显示区，试剂从第一试剂加入口在自动虹吸作用下通过结合垫后流向第一质控线和第一检测线并显示检测结果，第一硝酸纤维素层其中一侧边缘与最外侧的第一检测通道之间设置有第二试剂加入口，第一硝酸纤维素层远离第二试剂加入口一侧边缘与最外侧的第一检测通道之间设置有第二检测结果显示区，第二检测结果显示区包括五条与第一检测通道相互垂直的辅助通道，五条辅助通道靠近第一检测通道的一端上均设置有第一渗透带，五条辅助通道远离第一检测通道的一端上均设置有第二质控线和第二检测线，
第二硝酸纤维素层上设置有五条横向分布的第二检测通道，第二硝酸纤维素层上靠近第二检测通道的其中一端处设置有渗透试剂加入口，五条第二检测通道均与渗透试剂加入口导通，第二检测通道靠近渗透试剂加入口的一端上覆盖有结合垫，每个第二检测通道远离渗透试剂加入口的一端上设置有第二渗透带，
贯穿防水双面胶带上开设有一个试剂渗透通孔和五个渗透带通孔，试剂渗透通孔内填充有第一亲水材料，每个渗透带通孔内填充有第二亲水材料，渗透试剂加入口位于第二试剂加入口正下方并通过试剂渗透通孔内填充的第一亲水材料导通，第二渗透带位于第一渗透带的正下方并通过渗透带通孔内填充的第二亲水材料导通，第二试剂加入口中的试剂通过试剂渗透通孔中的第一亲水材料流向渗透试剂加入口，渗透试剂加入口中的试剂在自动虹吸作用下分别流向第二检测通道，试剂经过结合垫后沿着第二检测通道流向第二渗透带，第二渗透带中的试剂通过渗透带通孔内填充的第二亲水材料引向第一渗透带，第一渗透带中的试剂沿着辅助通道流向第二检测结果显示区中的第二质控线和第二检测线并进行检测结果显示。
2.根据权利要求1所述的一种十种呼吸道病原体联合检测试纸，其特征在于：所述的第一检测通道、第二检测通道、第一试剂加入口、第二试剂加入口和渗透试剂加入口均通过疏水带线分割而成。
3.根据权利要求2所述的一种十种呼吸道病原体联合检测试纸，其特征在于：所述的第一试剂加入口、第二试剂加入口和渗透试剂加入口的疏水带线为圆环形。
4.根据权利要求1所述的一种十种呼吸道病原体联合检测试纸，其特征在于：所述的第一亲水材料和第二亲水材料均由水和硝酸纤维素粉末混合制成。
5.利用权利要求1-4任意一项所述的一种十种呼吸道病原体联合检测试纸的制备方法，包括胶体金制备的步骤、胶体金标记物制备的步骤和结合垫制备的步骤，其特征在于：还包括如下步骤：
步骤一、第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层的修饰处理：
裁取两块大小相同的硝酸纤维素膜，取其中一个硝酸纤维素膜作为第一硝酸纤维素层，并在该硝酸纤维素膜上用疏水材料作为隔离带分割出第一检测通道、第一试剂加入口、第二试剂加入口和辅助通道，并将第一检测通道和第一试剂加入口导通，将另一个硝酸纤维素膜作为第二硝酸纤维素层并用疏水材料作为隔离带分割出第二检测通道和渗透试剂加入口，将第二检测通道和渗透试剂加入口导通；
步骤二、在步骤一中第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层分割出的第一检测通道和第二检测通道上分别加工质控线和检测线，
步骤三、取大小尺寸与第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层相匹配的双面胶带，在双面胶带上加工一个试剂渗透通孔和五个渗透带通孔；
步骤四、将制备的结合垫安装在步骤二中加工有质控线和检测线的第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层上，取步骤三中的双面胶带，并在一个试剂渗透通孔和五个渗透带通孔中填充由水和硝酸纤维素粉末混合制成的糊状物，将双面胶带上层保护膜解开并覆盖在第一硝酸纤维素层底部，五个渗透带通孔中的糊状物分别与辅助通道对应接触形成第一渗透带，试剂渗透通孔位于第二试剂加入口正下方，双面胶带和第一硝酸纤维素层粘贴完毕后，去掉双面胶带的下层保护膜，将第二硝酸纤维素层与双面胶带粘贴，渗透试剂加入口位于试剂渗透通孔正下方，第二检测通道分别与五个渗透带通孔中的糊状物接触形成第二渗透带；
步骤五、取大小尺寸与第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层相同的PVC底板，将PVC底板粘贴在步骤四中第二硝酸纤维素层底部，完成试纸的组装，将试纸加入密封袋中并加入干燥剂后避光保存。
6.根据权利要求5所述的一种十种呼吸道病原体联合检测试纸的制备方法，其特征在于：所述的渗透带通孔的直径为1-2mm，渗透带通孔的深度为55-65μm。
7.根据权利要求5所述的一种十种呼吸道病原体联合检测试纸的制备方法，其特征在于：所述的第一硝酸纤维素层和第二硝酸纤维素层的修饰处理方法采用光刻法或印刷法中的任意一种。
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