CN111961584A - 基于微流控技术的脑脊液外泌体rna检测装置、系统及方法 - Google Patents

基于微流控技术的脑脊液外泌体rna检测装置、系统及方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及基于微流控技术的脑脊液外泌体RNA检测装置、系统及方法，属于生物工程技术领域，该装置包括脑脊液外泌体分离模块、脑脊液外泌体裂解模块以及脑脊液检测模块；脑脊液外泌体分离模块包括液体过滤流道；液体过滤流道的入口连接脑脊液注射微量泵；脑脊液外泌体裂解模块包括裂解流道；裂解流道的入口连接液体过滤流道的出口，同时裂解流道的入口还连接脑脊液外泌体裂解液微量泵；脑脊液检测模块包括脑脊液RNA检测池；脑脊液RNA检测池内设有若干个RNA荧光探针；脑脊液RNA检测池入口与裂解流道的出口连接；同时裂解流道的入口还连接核酸外切酶微量泵。通过该装置可以快速实现RNA含量的定性，达到早期诊断并及时复发检测的目的。

Description

基于微流控技术的脑脊液外泌体RNA检测装置、系统及方法
技术领域
本公开属于生物工程技术领域，具体是涉及基于微流控技术的脑脊液外泌体RNA检测装置、系统及方法。
背景技术
这里的陈述仅提供与本公开相关的背景技术，而不必然地构成现有技术。
胶质瘤是起源于神经胶质细胞的神经外胚层肿瘤，是中枢神经系统致死率最高的肿瘤，约占颅内肿瘤的50％左右。肿瘤呈明显浸润性生长，无明显的边界，侵袭性强，确诊后，5年生存率不足10％。而病理诊断是明确此病的金标准，除此之外,电子计算机断层扫描(CT)和核磁共振扫描(MRI)是神经胶质瘤诊断、分期分型、肿瘤随访的重要手段。与肝癌、直肠癌、甲状腺癌等恶性肿瘤不同的是，目前尚未发现用于胶质瘤诊断、随访及预后的生物学标志物。
微小RNA(miRNA)、长链非编码(lncRNA)是不编码蛋白质的RNA种类，在各种生物过程中具有关键功能，它们参与了广泛的生物学过程,如细胞的分化、增殖、凋亡、黏附及死亡等,这些与癌症的形成及演变都密切相关。研究表明，miRNA、lncRNA在预测胶质瘤患者亚群预后方面有直接作用，并可用于它们对后续治疗的反应。miRNA、lncRNA在正常患者及胶质瘤患者中的差异表达，提示miRNA、lncRNA可作为一种可能的生物学标志物用于胶质瘤的诊断及预后评估。由于颅内血脑屏障的存在，血液中的miRNA、lncRNA与中枢神经系统中的miRNA、lncRNA存在明显差异，而脑脊液(CSF)中的miRNA、lncRNA表达稳定，可作为理想的体液检测手段。脑脊液(CSF)包含细胞、外泌体和生物分子，如蛋白质、核酸和代谢物。其中外泌体是50-150nm囊泡，其从许多细胞类型释放到细胞外空间中，这种囊泡广泛分布在各种体液中，且其中富含mRNA和微小RNA(miRNA)、lncRNA等。脑脊液具有外泌体纯度高、无细胞干扰、几乎仅反映脑内情况等优点，属于神经科特有的常规检测方式，因此，从脑脊液中分离并提纯外泌体，并检测其中差异性表达的miRNA、lncRNA，可用于胶质瘤的早期诊断、预后评估、复发诊断等。
发明人发现：当前，无基于脑脊液外泌体的miRNA、lncRNA检测体系的提出及出现，其应用填补了胶质瘤体液活检的空白。
发明内容
针对现有技术存在的技术问题，本公开提供了基于微流控技术的脑脊液外泌体RNA检测装置、系统及方法。
本公开至少一实施例提出了基于微流控技术的脑脊液外泌体RNA检测装置,该装置包括脑脊液外泌体分离模块、脑脊液外泌体裂解模块以及脑脊液检测模块；这三个模块固定在PDMS芯片上：
脑脊液外泌体分离模块包括液体过滤流道；液体过滤流道的入口连接脑脊液注射微量泵；脑脊液外泌体裂解模块包括裂解流道；裂解流道的入口连接液体过滤流道的出口，同时裂解流道的入口还连接脑脊液外泌体裂解液微量泵；脑脊液检测模块包括脑脊液RNA检测池；脑脊液RNA检测池内设有若干个RNA荧光探针；脑脊液RNA检测池入口与裂解流道的出口连接；同时裂解流道的入口还连接核酸外切酶微量泵。
进一步地，固定脑脊液外泌体分离模块的PDMS芯片通过第一PDMS芯片和第二PDMS芯片从上到下叠加而成；这两个芯片上都设有液体过滤流道且两个芯片上的液体过滤流道相连通；在第一PDMS芯片和第二PDMS芯片之间设有多孔阳极氧化铝纳米滤膜。
进一步地，所述液体过滤流道为螺旋流体通道。
进一步地，所述多孔阳极氧化铝纳米滤膜通过离子键合装置固定在第一PDMS芯片和第二PDMS芯片之间。
进一步地，脑脊液外泌体裂解模块以及脑脊液检测模块设置在同一个PDMS芯片上，且该PDMS芯片上设置在醛基基片上部；所述RNA荧光探针固定醛基基片上。
进一步地，所述脑脊液RNA检测池由若干个纵向流道组成，每个纵向流道中都设有RNA荧光探针。
进一步地，用于固定脑脊液外泌体分离模块的PDMS芯片和用于固定脑脊液外泌体裂解模块以及脑脊液检测模块PDMS芯片的外表面分别固定一个外壳。
本公开至少一实施例还提出了基于微流控技术的脑脊液外泌体RNA检测系统，其特征在于，包括上述任一项所述基于微流控技术的脑脊液外泌体RNA检测装置。
本公开至少一实施例还提出了基于上述任一项所述基于微流控技术的脑脊液外泌体RNA检测装置的检测方法，该方法包括如下过程：
通过脑脊液注射微量泵向脑脊液外泌体分离模块中的液体过滤流道注入脑脊液进行过滤；
过滤后的脑脊液流入裂解通道中，同时脑脊液外泌体裂解液微量泵注射裂解液到裂解通道中对过滤后的脑脊液进行裂解形成单链RNA；
裂解后的脑脊液流入脑脊液RNA检测池内与RNA荧光探针进行PCR反应形成双链RNA结构；同时核酸外切酶微量泵释放核酸外切酶，去除未结合单链RNA及DNA，
最后将脑脊液检测模块放置于共聚焦显微镜下观察荧光强度，从而实现针对具体RNA的定性分析。
进一步地，通过脑脊液注射微量泵注入不同浓度梯度标准化的RNA反义链核苷酸探针，并通过RNA与荧光探针杂交反应及显微镜下的荧光拍摄，总结不同荧光亮度的标准曲线，对于将不同患者、不同时期、不同RNA的荧光强度的拍摄于标准曲线量化，实现对患者RNA含量的准确定位。
本公开的有益效果如下：
与现有技术相比，本公开的脑脊液外泌体RNA检测装置可快速实现对脑脊液外泌体的富集；使用最少量的脑脊液量达到检测患者RNA的效果；并可设计不同的RNA探针，实现对个性化的RNA探针芯片的定制；并快速实现RNA含量的定性，缩短时间及费用，对比脑胶质瘤患者术前、术后、术后复查的脑脊液标本结果，达到早期诊断并及时复发检测的目的。
附图说明
构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1为本公开实施例提供的脑脊液外泌体RNA检测装置的结构图；
图2为本公开实施例提供的脑脊液外泌体富集模块结构图；
图3为本公开实施例提供的脑脊液外泌体富集模块中上、下层PDMS芯片的正视图；
图4为本公开实施例提供的脑脊液外泌体富集模块模拟图；
图5为本公开实施例提供的脑脊液外泌体裂解模块以及脑脊液RNA检测模块结构图；
图6为本公开实施例提供的脑脊液外泌体RNA检测荧光实例图；
图7为本公开实施例提供的脑脊液检测芯片及其外壳；
图8为本公开实施例提供的脑脊液外泌体过滤芯片及其外壳。
其中，1、脑脊液注射微量泵；2、脑脊液富集芯片上层PDMS及流道；3、多孔阳极氧化铝(AAO)纳米滤膜；4、脑脊液富集芯片上层PDMS及流道；5、脑脊液外泌体裂解液微量泵；6、核酸外切酶微量泵；7、脑脊液裂解流道；8、醛基基底基因玻片；9、脑脊液miRNA检测池；10、第一聚四氟乙烯(PTFE)导管；11、液体流出通道；12、盖玻片；13、脑脊液检测芯片外壳；15、第二聚四氟乙烯(PTFE)导管。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本公开使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
在本公开的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本公开和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本公开的限制。
PDMS芯片的制作：
光刻机制作硅烷化处理的SU-8模具。称量PDMS，添加固化剂，充分的混合PDMS和固化剂，使用离心机或者真空泵抽出PDMS混合物中的气泡，在模具上浇筑PDMS，将浇筑好的PDMS于干燥烤箱中90℃烘烤2h；待模具及PDMS冷却后，缓慢剥离PDMS胶，并用手术刀片按照预留尺寸缓慢切割，使用打孔器制作导管进口。
如图1所示，本实施例提供了一种基于微流控技术的脑脊液外泌体RNA检测装置主要包括脑脊液外泌体分离模块、脑脊液外泌体裂解模块以及脑脊液miRNA、lncRNA检测模块。脑脊液外泌体分离模块主要收集脑脊液并且将脑脊液中的大分子杂志过滤掉；脑脊液外泌体裂解模块主要用将脑脊液外泌体裂解；脑脊液miRNA、lncRNA检测模块主要检测脑脊液外泌体RNA与荧光探针的结合情况。
进一步地，如图1-图4所示，本实施例中的脑脊液外泌体分离模块主要包括脑脊液富集芯片上层PDMS芯片2、脑脊液富集芯片下层PDMS芯片4以及多孔阳极氧化铝(AAO)纳米滤膜3，其中多孔阳极氧化铝(AAO)纳米滤膜3通过等离子键合装置设置在上下两层PDMS芯片之间，并且每层PDMS层内设有一个螺旋化的流体通道，上层的PDMS层芯片的顶部通过第一聚四氟乙烯(PTFE)导管10连接一个脑脊液注射微量泵1，所述第一聚四氟乙烯(PTFE)导管10与上PDMS芯片2内部的螺旋化流体通道的入口相连接，这样可以将脑脊液注射微量泵1中的脑脊液缓慢注射到螺旋通道中，设置螺旋通道的目的是增加脑脊液外泌体的滤过面积。
进一步，设置在上下两层PDMS芯片中间的多孔阳极氧化铝纳米滤膜层3为拥有一定的强度和弹性且孔径为200nm的双通道滤膜，这样直径为50-150nm的外泌体可自由透过AAO滤膜，从而将脑脊液中大分子杂志过滤在上层的PDMS芯片中，然后过滤后的的脑脊液会流入下层的PDMS芯片的继续过滤。
所述下层PDMS层芯片内部螺旋通道的出口通过第二聚四氟乙烯(PTFE)导管15连接到脑脊液外泌体裂解模块和脑脊液miRNA、lncRNA检测模块中，如图5所示，这两个模块设置在一个内部设有流道PDMS芯片基座上，同时所述基座的下方为经过醛基化处理的醛基基底基因玻片8，醛基基片为生物芯片的常用基底之一。
具体地，所述PDMS基座内部左侧从上到下设有由多条S型流体通道相互串联形成的一个脑脊液裂解流道7，在所述脑脊液裂解流道7的入口处连接两条注射通道，其中一个注射通道与上述下层PDMS层芯片内部螺旋通道通过第二聚四氟乙烯(PTFE)导管15相连通，另一条通道直接连接脑脊液外泌体裂解液微量泵5，这样通过脑脊液外泌体裂解液微量泵5注入裂解液将流入脑脊液裂解流道7中脑脊液外泌体充分裂解形成单链RNA，释放外泌体的miRNA、lncRNA等寡核苷酸序列。
进一步，所述脑脊液裂解流道7的出口也是连接两个通道，其中一个通道与核酸外切酶微量泵6相连通，另一个通道与脑脊液RNA检测池9相连通，其中所述脑脊液RNA检测池9内设有若干个RNA荧光探针，所述RNA荧光探针点样在了基座下方的醛基基底基因玻片8上,这样当裂解后的脑脊液流入脑脊液RNA检测池9后，通过对RNA的杂交PCR反应，实现RNA与荧光探针的结合，然后核酸外切酶微量泵6可以释放核酸外切酶，去除未结合单链RNA及DNA，最后将醛基基底基因玻片8置于于荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察荧光强度，从而实现针对具体RNA的定性分析。
需要说明的就是，所述脑脊液RNA检测池9是由多条纵向流道组成，并且每个流道中都设有RNA荧光探针，且这些流道都连接同一入口和同一出口。所述脑脊液RNA检测池9连接一个液体流出通道11用于将反应后的裂解液排出，继续下轮的检测。
这样通过对比脑胶质瘤患者术前、术后、术后复查的脑脊液RNA结果，针对不同RNA的效果，达到早期诊断、复发检测、免疫微环境指示及化疗药物敏感性等不同诊断的目的。具体检测效果实例图见图6。
所以上述实施例提供的外泌体RNA检测装置通过微量注射泵6注入不同浓度梯度标准化的RNA反义链核苷酸探针，并通过RNA杂交反应及共聚焦显微镜下的荧光拍摄，总结不同荧光亮度的标准曲线。通过对于将不同患者、不同时期、不同RNA的荧光强度的拍摄于标准曲线量化，实现对患者RNA含量的准确定位。通过针对患者不同RNA指标不同生物学效应的指示，达到对患者个体化治疗、及时早期诊断及复发检测的目的。除此之外，本公开上述实施例还公开了基于微流控技术的脑脊液外泌体RNA检测系统，该系统包括上述所述的微流控技术的脑脊液外泌体RNA检测装置、
另外本公开的外泌体RNA检测装置可在此基础上对芯片外壳进行改进，可以实现芯片的产业化，并可针对不同的RNA探针设计不同的芯片组合，实现量产。如图7和图8所示，所述脑脊液外泌体分离模块通过上下盖封装组合，其中上盖和下盖的侧壁上各设有一个通孔用于将聚四氟乙烯导管，所述脑脊液外泌体裂解模块以及脑脊液miRNA、lncRNA检测模块直接通过通过一个脑脊液检测芯片外壳13进行密封起来，所述顶盖上设有一个透明的盖玻片12对检测的情况进行观察。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本公开的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本公开进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本公开的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本公开的权利要求范围当中。
上述虽然结合附图对本公开的具体实施方式进行了描述，但并非对本公开保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本公开的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本公开的保护范围以内。

Claims (10)

1.基于微流控技术的脑脊液外泌体RNA检测装置,其特征在于：包括脑脊液外泌体分离模块、脑脊液外泌体裂解模块以及脑脊液检测模块；这三个模块固定在PDMS芯片上：
脑脊液外泌体分离模块包括液体过滤流道；液体过滤流道的入口连接脑脊液注射微量泵；脑脊液外泌体裂解模块包括裂解流道；裂解流道的入口连接液体过滤流道的出口，同时裂解流道的入口还连接脑脊液外泌体裂解液微量泵；脑脊液检测模块包括脑脊液RNA检测池；脑脊液RNA检测池内设有若干个RNA荧光探针；脑脊液RNA检测池入口与裂解流道的出口连接；同时裂解流道的入口还连接核酸外切酶微量泵。
2.如权利要求1所述的基于微流控技术的脑脊液外泌体RNA检测装置,其特征在于：固定脑脊液外泌体分离模块的PDMS芯片通过第一PDMS芯片和第二PDMS芯片从上到下叠加而成；这两个芯片上都设有液体过滤流道且两个芯片上的液体过滤流道相连通；在第一PDMS芯片和第二PDMS芯片之间设有多孔阳极氧化铝纳米滤膜。
3.如权利要求2所述基于微流控技术的脑脊液外泌体RNA检测装置，其特征在于，所述液体过滤流道为螺旋流体通道。
4.如权利要求2所述的基于微流控技术的脑脊液外泌体RNA检测装置,其特征在于：所述多孔阳极氧化铝纳米滤膜通过离子键合装置固定在第一PDMS芯片和第二PDMS芯片之间。
5.如权利要求1所述的基于微流控技术的脑脊液外泌体RNA检测装置,其特征在于：脑脊液外泌体裂解模块以及脑脊液检测模块设置在同一个PDMS芯片上，且该PDMS芯片上设置在醛基基片上部；所述RNA荧光探针固定醛基基片上。
6.如权利要求1所述的基于微流控技术的脑脊液外泌体RNA检测装置,其特征在于：所述脑脊液RNA检测池由若干个纵向流道组成，每个纵向流道中都设有RNA荧光探针。
7.如权利要求1所述的基于微流控技术的脑脊液外泌体RNA检测装置,其特征在于：用于固定脑脊液外泌体分离模块的PDMS芯片和用于固定脑脊液外泌体裂解模块以及脑脊液检测模块PDMS芯片的外表面分别固定一个外壳。
8.基于微流控技术的脑脊液外泌体RNA检测系统，其特征在于，包括上述权利要求1-7任一项所述基于微流控技术的脑脊液外泌体RNA检测装置。
9.基于权利要求1-7任一项所述基于微流控技术的脑脊液外泌体RNA检测装置的检测方法，其特征在于：
通过脑脊液注射微量泵向脑脊液外泌体分离模块中的液体过滤流道注入脑脊液进行过滤；
过滤后的脑脊液流入裂解通道中，同时脑脊液外泌体裂解液微量泵注射裂解液到裂解通道中对过滤后的脑脊液进行裂解形成单链RNA；
裂解后的脑脊液流入脑脊液RNA检测池内与RNA荧光探针进行PCR反应形成双链RNA结构；同时核酸外切酶微量泵释放核酸外切酶，去除未结合单链RNA及DNA，
最后将脑脊液检测模块放置于共聚焦显微镜下观察荧光强度，从而实现针对具体RNA的定性分析。
10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于：通过脑脊液注射微量泵注入不同浓度梯度标准化的RNA反义链核苷酸探针，并通过RNA与荧光探针杂交反应及显微镜下的荧光拍摄，总结不同荧光亮度的标准曲线，对于将不同患者、不同时期、不同RNA的荧光强度的拍摄于标准曲线量化，实现对患者RNA含量的准确定位。
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