CN111954522A - 用于包封和持续释放蛋白治疗剂的聚合物纳米颗粒组合物 - Google Patents

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CN111954522A CN201980023590.0A CN201980023590A CN111954522A CN 111954522 A CN111954522 A CN 111954522A CN 201980023590 A CN201980023590 A CN 201980023590A CN 111954522 A CN111954522 A CN 111954522A
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Abstract

描述了用于通过可扩展和可再现的方法包封和持续释放蛋白治疗剂的新的生物可降解纳米颗粒平台。具体地，描述了包含复合物的纳米颗粒，所述复合物包含蛋白或肽以及反荷离子聚合物。

Description

用于包封和持续释放蛋白治疗剂的聚合物纳米颗粒组合物
相关申请的引用
本申请要求2018年1月29日提交的美国临时专利申请62/623,018的权益，该申请特此通过引用并入用于所有目的，如同其在本文中完整阐述一样。
发明背景
蛋白治疗剂是一种越来越普遍的治疗方式。单克隆抗体、受体陷阱(trap)、生长因子和经设计的蛋白已成为自身免疫性状况、癌症和眼科状况以及其他的重要治疗。蛋白药物诸如Avastin、Enbrel、利妥昔单抗、Lucentis、Eylea、Optivo、Keytruda和其他药物的年销售额高达数十亿美元。这些药物在制药流水线中占有大的且越来越大的份额。作用的特异性和相对较少的脱靶效应使这些药物特别有吸引力。尽管这些方式越来越重要，但能够实现时空受控的给药谱的蛋白递送媒介物并不容易获得。
对于包括抗体的蛋白治疗剂的递送，成功的递送系统的理想特征包括生物可降解性、高装载能力、受控或持续的长期释放、维持蛋白治疗剂的高稳定性以及可扩展的生产工艺。高装载水平是期望的，因为它在实现相同的治疗效果的同时将减少递送材料的剂量，因为这些材料中的大多数在体内高浓度时可能对健康组织造成副作用。因此，生物可降解材料也是优选的，以降低毒性并避免在货物释放后将这些材料清除出体外的手术过程。由于蛋白治疗剂在体内的低稳定性，递送系统需要持续的长期释放以在延长的时间段内维持体内的治疗浓度，这将降低施用频率。此外，配制和制备过程应维持蛋白治疗剂的生物活性。最后，可扩展且方便的生产方法对于这样的递送系统的可靠制造和临床转化至关重要。例如，Nutropin Depot，一种长期的装载人类生长激素促生长素(somatropin)的可注射聚合物贮库(depot)，由于制造成本高，已于2004年被Genentech和Alkermes撤出市场。
在开发蛋白递送系统以满足上述关键要求方面已经取得了巨大进展。然而，蛋白治疗剂的生物物理性质(即，高水溶度、大分子量和残余表面电荷)使得将它们包封在持续释放装置中更具挑战性。最常被研究的用于蛋白治疗剂的递送系统包括水凝胶和固体聚合物纳米颗粒或微米颗粒(microparticle)。已经开发了用于配制优化的多种制备方法。尽管当使用这些系统和制备方法来递送蛋白治疗剂时，已经显示出有希望的结果，但是它们中很少能同时满足所有上述要求。
由亲水性聚合物诸如聚乙二醇(PEG)、透明质酸、葡聚糖、藻酸盐和明胶制备的水凝胶系统由于其亲水性和容易的蛋白装载工艺(避免装载的蛋白治疗性货物的变性)，是用于蛋白递送的有吸引力的平台。为了实现持续释放谱，需要交联来形成网络，并且交联可以通过共价键合、离子或疏水相互作用来实现。蛋白治疗剂从水凝胶中的释放速率由水凝胶中的网孔尺寸和聚合物体积分数以及装载的蛋白治疗剂分子的尺寸来控制。通常，具有较小网孔尺寸、较高聚合物体积分数和较大的装载的蛋白治疗剂的水凝胶会产生较慢的释放。水凝胶系统的局限性在于，由于所用递送材料的亲水性，难以实现持续的长期释放。
另一种广泛使用的用于蛋白递送的载体系统是由疏水或两亲聚合物制备的纳米颗粒/微米颗粒。聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)及其共聚物、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)因其生物相容性和可调节的生物可降解性而成为用于颗粒制备的最广泛使用的聚合物。最常用的用于将蛋白包封到纳米颗粒/微米颗粒中的方法是双乳液法，其中形成水/油/水(w/o/w)乳液系统；油相是载体聚合物溶解于水不混溶的有机溶剂中的溶液，第一水相是蛋白治疗剂的水性溶液，且第二水相是作为分散相的水性溶液。在一些罕见的情况下，替代地形成水包油包固体(s/o/w)系统，而第一水相被固体蛋白颗粒替代，分散在有机溶剂中的聚合物溶液中。在这两种情况下，当有机溶剂逐渐蒸发或提取时，双乳液系统保持稳定，产生将蛋白溶液截留在其中的固体聚合物颗粒。与水凝胶相比，该系统具有延长释放持续时间的优点，因为蛋白通过疏水材料的扩散可以忽略不计，并且因此包封的蛋白治疗剂的释放速率很大程度上取决于聚合物基质的降解速率。然而，该工艺通常产生低装载水平。此外，该工艺中使用的有机溶剂和聚合物基质中的疏水环境增加装载的蛋白治疗剂变性的风险。装载的蛋白从这些颗粒中的特征性释放遵循三个阶段：突发释放、休眠和具有可变动力学的连续释放阶段。这样的释放谱使得体内治疗结果难以控制。
最近，Prud'homme小组开发了一种用于为增强装载水平使用快速纳米沉淀(FNP)工艺制备装载蛋白的纳米颗粒的方法[1]。FNP使用动力学受控工艺，通过使用受限冲击射流(CIJ)或多入口涡流混合器(MIVM)装置，以连续且可扩展的方式产生纳米颗粒，并已被用于有效产生用于包封小分子量疏水药物的纳米颗粒。使用改动的FNP工艺，将蛋白治疗剂和两亲共聚物一起溶解于水混溶的有机溶剂诸如DMSO或甲醇中，并且然后在CIJ或MIVM装置中与极性较低的非溶剂诸如氯仿或丙酮快速混合，形成反相(即具有疏水壳的亲水核)纳米 颗粒，其中蛋白和共聚物的亲水链段在核中，且共聚物的疏水链段在壳上。然后通过壳交联来稳定纳米颗粒。例如，使用聚(丙烯酸正丁酯)7.5kDa-b-聚(丙烯酸)5.5kDa，它们已经成功地将溶菌酶(14.3kDa)作为模型蛋白以高装载水平(>50％)装载到纳米颗粒(<100nm)中。然而，不清楚在该纳米颗粒组装工艺之后，包封的蛋白的二级结构是否存在变化；并且更重要的是，来自该系统的包封的蛋白的释放谱仍待表征。
疏水离子配对(HIP)已被报道为一种用于蛋白包封的方法。通过聚电解质复合，带净正电荷的蛋白通过与带相反电荷的剂诸如葡聚糖硫酸酯复合而被中和，形成复合纳米颗粒，这为蛋白提供了保护作用并促进了到纳米颗粒中的包封。通过纳米沉淀或双乳液法将HIP复合物装载到使用疏水聚合物或两亲聚合物制备的纳米颗粒中。Mitra等人报道了溶菌酶与葡聚糖硫酸酯HIP复合物的成功复合，然后将其装载到PLGA纳米颗粒中，实现了30天内接近零级的释放动力学。在另一项研究中，同一小组通过纳米沉淀或双乳液法以约85％的高包封率将与葡聚糖硫酸酯复合的IgG-Fab片段装载到PLGA纳米颗粒中[2]。这些HIP复合物和纳米颗粒是使用人工混合工艺制备的，具有有限的可扩展性和较高的批次间(batch-to-batch)可变性。因此，商业上期望用于通过可扩展和可再现的方法包封和持续释放蛋白治疗剂的新的生物可降解纳米颗粒平台。
发明概述
本发明是用于通过可扩展和可再现的方法包封和持续释放蛋白治疗剂的新的生物可降解纳米颗粒平台。溶菌酶(14.3kDa,pI 11.3)、卵清蛋白(45kDa,pI 4.5)和IgG(150kDa,pI 6.8)被用作蛋白治疗剂的模型。存在两种不同的制备这些纳米颗粒平台的方法。在一种实施方案中，溶菌酶或IgG与葡聚糖硫酸酯的聚电解质复合物(PEC)通过称为快速纳米复合(FNC)的连续工艺产生，并且然后在称为快速纳米沉淀(FNP)的溶剂交换工艺中与嵌段共聚物诸如PEG-PLLA或PEG-PCL共沉淀。在一种单独的实施方案中，PEC复合(FNC)和作为快速纳米沉淀(FNP)的结果的聚合物纳米颗粒形成这两个工艺被组合在一个单步相分离工艺中。在该工艺中，聚阳离子溶液(通常是溶液的pH被调整到低于pI的蛋白溶液)、聚阴离子溶液(例如葡聚糖硫酸酯、硫酸肝素或核酸)和溶解于水混溶的溶剂中的嵌段共聚物(选择溶剂对以适当的速率适当地诱导相分离)以一组优化的流速被引入到限定的室中，以实现有效的混合，从而获得具有有效的PEC装载的固体或胶束纳米颗粒。先前从未报道过聚电解质复合和溶剂诱导的相分离或自组装可以同时实现，使得纳米颗粒(当使用聚酯时)或胶束(当使用PEG-共-聚酯嵌段共聚物时)与PEC(例如蛋白和DS)和疏水聚合物共沉淀并均匀混合，从而实现蛋白从纳米颗粒的持续释放。
尽管混合工艺和混合室几何形状有相似性，但我们的纳米颗粒配制在纳米颗粒的结构和组成方面与Prud'homme等人制备的那些是不同的。我们的纳米颗粒由单片基质(monolithic matrix)构成，蛋白遍及纳米颗粒分布，而Prud'homme等人[1]制备的反胶束将蛋白包装在被疏水聚合物壳包围的胶束的亲水PEG核中。我们的纳米颗粒的组成包含蛋白与聚阴离子(当蛋白溶液的pH低于其pI时)或聚阳离子(当蛋白溶液的pH高于其pI时)和疏水聚合物或PEG-b-聚合物嵌段共聚物的PEC。疏水聚合物不必包含亲水嵌段。Prud'homme等人[1]的胶束不包含PEC，即反荷离子聚电解质。
尽管我们的纳米颗粒和Mitra等人[2]制备的纳米颗粒之间用于蛋白包封的原始材料相似，但我们的发明描述了一种新的纳米颗粒制备工艺，其产生能够实现更宽范围的包封能力(装载水平、以及蛋白和PEC的类型)的新的纳米颗粒制剂。使用我们的工艺，我们将离散的PEC纳米颗粒包封在疏水聚合物纳米颗粒中，其中PEC用作与疏水聚合物共沉淀的核，产生多核基质纳米颗粒的结构，其中PEC均匀遍及核分布中)。更具体地，在单步工艺中，PEC瞬间形成，并用作核诱导疏水聚合物固体纳米颗粒或胶束的共沉淀，产生PEC遍及纳米颗粒的均匀分布。它还能够实现更宽范围的PEC包封。
本发明的一种实施方案是纳米颗粒，所述纳米颗粒包含：包含蛋白或肽和反荷离子聚合物的复合物，其中反荷离子聚合物具有使其能够与蛋白静电结合的电荷。作为实例，纳米颗粒的合适尺寸在20nm至2000nm；100nm至1800nm；500nm至1000nm；20nm至1000nm；20nm至500nm；20nm至150nm的范围内。用于本发明的蛋白或肽的实例可以具有在2,000至200,000；10,000至150,000；20,000至100,000；30,000至70,000；2,000至100,000；或100,000至200,000范围内的分子量。纳米颗粒还包含基质，该基质包含遍及生物可降解聚合物均匀分布的复合物。合适的基质可以是非水溶性的(或疏水的)。合适的反荷离子聚合物可以带正电荷和/或负电荷。合适的反荷离子聚合物的实例包括葡聚糖硫酸酯、肝素(硫酸肝素)、透明质酸或其组合。作为实例，大多数蛋白可用于本发明，包括多肽和抗体。用于本发明的合适的生物可降解聚合物的实例包括包含PEG的共聚物。共聚物的实例包括PLLA、PGA、PLGA、PCL、它们的PEG化嵌段共聚物或其组合。用于本发明的一种合适的生物可降解聚合物是PEG-b-PLLA。
本发明的另一种实施方案是制备纳米颗粒的方法，所述方法包括：(a)通过使用第一连续混合工艺混合蛋白和反荷离子聚合物来形成聚电解质复合物；(b)使用第二连续混合工艺与生物可降解聚合物共沉淀；和(c)形成包含遍及生物可降解聚合物基质均匀分布的蛋白-聚电解质复合物的纳米颗粒。令人惊讶的是，本发明人发现了一种制备本发明纳米颗粒的一步法，由此纳米颗粒可以通过同时进行步骤(a)和(b)而形成，并且第一连续工艺和第二连续工艺优选地是快速纳米复合(FNC)。具体地，一步工艺优选地通过溶剂诱导的快速纳米沉淀(FNP)将聚电解质复合物(PEC)和生物可降解聚合物混合。本发明的方法通过蛋白和反荷离子聚合物之间的静电吸引形成聚电解质复合物(PEC)。纳米颗粒通过生物可降解聚合物与聚电解质复合物(PEC)一起沉淀形成。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有本发明所属技术领域的技术人员通常理解的含义。以下参考文献为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(第2版1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker编著，1988)；The Glossary of Genetics,第5版，R.Rieger等人(编著)，Springer Verlag(1991)；和Hale&Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。如本文使用的，除非另外指明，否则以下术语具有以下归于它们的含义。
如本公开内容中使用的，术语“抗体”是指免疫球蛋白或其片段或衍生物，并且包括任何包含抗原结合位点的多肽，无论其是在体外还是在体内产生的。该术语包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、非特异性抗体、人源化抗体、单链抗体、嵌合抗体、合成的抗体、重组抗体、杂交抗体(hybrid antibody)、突变的抗体和接枝抗体(grafted antibody)。除非另外由术语“完整”修饰，如在“完整抗体”中一样，否则为了本公开内容的目的，术语“抗体”还包括保留了抗原结合功能即特异性结合(例如PD-L1)的能力的抗体片段，诸如Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、Fd、dAb和其他抗体片段。通常，这样的片段将包含抗原结合结构域。
术语“抗原结合结构域”、“抗原结合片段”和“结合片段”是指包含负责抗体与抗原之间的特异性结合的氨基酸的抗体分子的部分。在其中抗原很大的情况下，抗原结合结构域可以仅与抗原的一部分结合。抗原分子中负责与抗原结合结构域特异性相互作用的部分被称为“表位”或“抗原决定簇”。抗原结合结构域通常包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)，然而，它不必然必须包含两者。例如，所谓的Fd抗体片段仅由VH结构域组成，但仍保留完整抗体的一些抗原结合功能。
抗体的结合片段通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促裂解或化学裂解来产生。结合片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv和单链抗体。“双特异性”或“双功能性”抗体以外的抗体被理解为其结合位点中的每一个都相同。用酶木瓜蛋白酶消化抗体，产生两个相同的抗原结合片段(也被称为“Fab”片段)，和一个没有抗原结合活性但具有结晶能力的“Fc”片段。用酶胃蛋白酶消化抗体，产生一个F(ab’)2片段，其中抗体分子的两条臂保持连接，并包含两个抗原结合位点。F(ab’)2片段具有交联抗原的能力。当在本文中使用时，“Fv”是指保留抗原识别位点和抗原结合位点的抗体的最小片段。当在本文中使用时，“Fab”是指包含轻链的恒定结构域和重链的CHI结构域的抗体片段。
“反荷离子聚合物”意指具有电荷的聚合物，使得该聚合物能够与蛋白静电结合。实例包括带净正电荷的蛋白与具有净负电荷的反荷离子聚合物结合，或反之亦然。
“疾病”意指损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何状况或紊乱。疾病的实例包括癌症。
“片段”意指多肽的一部分。该部分优选地含有参考多肽的整体长度的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。片段可以含有10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个氨基酸。
术语“mAb”是指单克隆抗体。本发明的抗体包括但不限于完整天然抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、Fab、Fab’、单链V区片段(scFv)、融合多肽和非常规抗体。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，以指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或更多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的类似物或模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。多肽可以被修饰，例如，通过添加碳水化合物残基来形成糖蛋白。术语“多肽”、“肽”和“蛋白”包括糖蛋白以及非糖蛋白。
“参考序列”是用作序列比较的基础的确定序列(defined sequence)。参考序列可以是指定的序列的子集或全部。对于多肽，参考多肽序列的长度将通常是至少约16个氨基酸，优选地至少约20个氨基酸，更优选地至少约25个氨基酸，并且甚至更优选地约35个氨基酸，约50个氨基酸或约100个氨基酸。
如本文使用的，术语“受试者”预期指对其进行本文描述的方法的任何个体或患者。通常，受试者是人类，但如本领域技术人员将理解的，受试者可以是动物。因此，其他动物，包括哺乳动物诸如啮齿类动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、犬、兔、农场动物包括牛、马、山羊、绵羊、猪等，以及灵长类动物(包括猴、黑猩猩、猩猩和大猩猩)也被包括在受试者的定义内。
本文提供的范围被理解为该范围内所有值的简写。例如，1至50的范围被理解为包括来自由以下组成的组的任何数字、数字的组合或子范围：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。
如本文所用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等是指使紊乱和/或与其相关的症状减轻或改善。应理解，尽管不排除在外，但治疗紊乱或状况不要求紊乱、状况或与其相关的症状被完全消除。
除非特别说明或从上下文中明显的，否则如本文使用的，术语“或”被理解为包含性的。除非特别说明或从上下文中明显的，否则如本文使用的，术语“一(a)”、“一(an)”和“该/所述(the)”被理解为单数或复数。
除非特别说明或从上下文中明显的，否则如本文使用的，术语“约”被理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准差内。约可以被理解为在所述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％之内。除非从上下文另外明确的，否则本文提供的所有数值都由术语约修饰。
本文提供的任何组合物或方法可以与本文提供的任何其他组合物和方法中的一种或更多种组合。
附图简述
图1.具有蛋白治疗剂和反荷离子聚电解质的包封的PEC的纳米颗粒的两步(FNC-FNP)制备工艺的示意图。这里示出了第二步的三入口装置。根据FNP工艺中溶剂交换的具体要求，可以将其转换为双入口或四入口混合室。
图2.使用四入口的多入口涡流混合器对蛋白治疗剂进行单步包封的示意图。PEC与生物可降解聚酯纳米颗粒共沉淀，并遍及聚合物纳米颗粒或胶束核分布。可调尺寸，平均30nm至1000nm，且PDI<0.3。蛋白装载水平范围为2％至25％。蛋白治疗剂在2周至3周的时间段内的持续释放。
图3.通过DLS测量的溶菌酶/DS PEC纳米颗粒(A)和溶菌酶/DS:PEG-b-PLLA纳米颗粒(B)在水中的尺寸分布。以三种不同的溶菌酶与聚合物的重量比制备了三批次核壳纳米颗粒(NP1、NP2和NP3)，显示出平均颗粒尺寸范围为124nm至170nm，具有窄的尺寸分布(PDI～0.17-0.19)(表1)。(C)溶菌酶与聚合物的比对纳米颗粒尺寸分布的影响。(D)在DI水中测量的NP1至NP3的平均ζ电位。
图4A-图4B.NP1(A)和NP2(B)的TEM图像。
图5.在37℃在PBS(pH 7.4)中溶菌酶从NP1-NP3的体外释放谱。
图6A-图6B.(A)在37℃在PBS中IgG从NP4-NP7的体外释放谱(pH 7.4)。(B)在37℃在PBS中IgG从NP8-NP11的体外释放谱(pH 7.4)。
图7.NP4和NP8释放谱的比较。
图8A-图8B.与仅具有溶菌酶的mPEG-PCL纳米颗粒、仅具有DS的mPEG-PCL纳米颗粒和没有mPEG-PCL的溶菌酶/DS PEC纳米颗粒相比，通过动态光散射(DLS)测量的具有包封的溶菌酶/葡聚糖硫酸酯(DS)PEC的mPEG-PCL纳米颗粒在水中的强度平均尺寸分布，(A)在所有四个入口的流速为0.5mL/min，以及(B)四个入口各自的流速为2mL/min(DS、溶菌酶、mPEG-PCL)和4mL/min(水)。
图9A-图9B.(A)具有包封的纳米金标记的免疫球蛋白G(IgG)/DS PEC的mPEG-PCL纳米颗粒的透射电子显微术(TEM)图像。比例尺＝100nm。(B)指示IgG在纳米颗粒中的分布的更高放大倍率的TEM。箭头是纳米金标记的IgG的实例。比例尺＝50nm。
图10A-图10B.在两周时间段内，在37℃的PBS(pH 7.4)中，蛋白治疗剂从蛋白/DS:mPEG-PCL纳米颗粒的体外释放谱，(A)使用IgG作为从NP19释放的模型蛋白，以及(B)使用卵清蛋白(OVA)作为从NP27释放的模型蛋白。
发明详述
本发明包括用一种或更多种蛋白和反荷离子聚电解质的包封的聚电解质复合物(PEC)制备纳米颗粒的方法。该工艺由包括两个顺序的步骤：(1)将选择的蛋白治疗剂与聚阴离子(例如葡聚糖硫酸酯(DS)、肝素(硫酸肝素)和透明质酸等)在低于蛋白等电点(pI)的pH复合，产生悬浮在水或水性溶剂中的PEC，和(2)将PEC悬浮液与溶解于水混溶的有机溶剂(例如乙腈(ACN)、二甲基亚砜(DMSO)、四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)和异丙醇(IPA)等)中的生物可降解聚合物PEG-b-PLLA(或PLLA、PGA、PLGA、PCL、或它们与PEG的共聚物，或它们的组合)共沉淀；这两个步骤通过将溶液射流以一组预定的流速注入通过受限冲击射流混合器或多入口涡流混合器来实现。该两步工艺导致含有PEC的纳米颗粒的形成(图1)。
可选地，纳米颗粒通过同时聚电解质复合和快速纳米沉淀工艺形成，该工艺包括连续注入以下的溶液射流：(1)溶解于在低于蛋白等电点(pI)的pH的水性溶剂中的选择的蛋白治疗剂，(2)溶解水性溶剂中的聚阴离子，例如葡聚糖硫酸酯(DS)、肝素(硫酸肝素)和透明质酸等，(3)溶解于水混溶的有机溶剂(例如乙腈(ACN)、二甲基亚砜(DMSO)、四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)和异丙醇(IPA)等)中的生物可降解聚合物PEG-b-PLLA(或PLLA、PGA、PLGA、PCL或它们与PEG的共聚物，或它们的组合)，和(4)另外的溶剂射流，以维持获得特定的溶剂极性，以便以一组预定的流速通过受限冲击射流混合器或多入口涡流混合器，诱导有效的相分离和纳米颗粒形成，导致含有PEC的纳米颗粒的形成(图2)。
本发明还包括通过本发明的方法制备的纳米颗粒系统。该纳米颗粒系统由生物可降解聚合物基质构成，该生物可降解聚合物基质中嵌入了具有以下特征的蛋白-聚离子PEC：(1)PEC纳米颗粒，用作与生物可降解聚合物纳米颗粒共沉淀的多核(任选地，一些纳米颗粒还含有PEG冠(corona))，而PEC遍及聚合物纳米颗粒分布；(2)具有平均30nm至1000nm的可调尺寸和0.3或更低的多分散指数(PDI)；(3)蛋白装载水平范围为2w/w％至25w/w％；和(4)蛋白治疗剂在范围在2周至3个月的时间段内的持续释放。
为了说明本发明，本发明人描述了装载溶菌酶、卵清蛋白和IgG的PLLA纳米颗粒或者PEG-b-PLLA或PEG-b-PCL胶束纳米颗粒的制备及表征的实例。
实施例1.溶菌酶/DS:PEG-b-PLLA纳米颗粒的制备
方法
PEC纳米颗粒核的制备及表征：将溶菌酶以5mg/mL的浓度溶解于去离子(DI)水中，随后通过添加0.1M HCl溶液将pH调整至4.0。然后将1毫升溶菌酶溶液与等体积的DS溶液(20mg/mL，pH被调整至4.0)以5mL/min的流速通过具有两个入口的CIJ混合器快速混合。使用动态光散射(DLS)Zetasizer Nano(Malvern Instruments,Worcestershire,UK)表征所获得的溶菌酶/DS PEC纳米颗粒的尺寸。每个样品被运行三次来测量，并且数据被报告为三次读数的平均值±标准差。
PEG-b-PLLA胶束纳米颗粒的制备及表征：将1毫升在先前步骤中获得的溶菌酶/DSPEC纳米颗粒悬浮液(2.5mg/mL)与等体积的以不同浓度(7.5mg/mL、12.5mg/mL和25mg/mL)溶解于DMSO中的PEG5k-b-PLLA20k溶液以5mL/min的流速通过双入口CIJ混合器快速混合。获得了具有不同溶菌酶与聚合物重量比(1:3、1:5和1:10)的三种纳米颗粒(NP1、NP2和NP3)。将纳米颗粒针对DI水使用截留分子量(MWCO)为3.5kDa的透析膜透析12小时以去除DMSO，其中每2小时更换一次水。将所获得的溶液使用MWCO为100kDa的过滤器以4,500rpm通过超滤纯化20min，以去除过量的蛋白和DS。未被包封的溶菌酶的量通过BCA测定来测量，并且包封效率(EE)使用以下公式来计算：EE(％)＝(M总-M游离)/M总×100％，其中M总代表总进料溶菌酶的质量，并且M游离代表游离溶菌酶的质量。对纳米颗粒使用DLS Zetasizer Nano通过颗粒尺寸和ζ电位进行表征。每个样品被运行三次来测量，并且数据被报告为三次读数的平均值±标准差。用于TEM成像的样品通过将10微升纳米颗粒溶液添加到涂覆有碳膜的离子化镍网格上进行制备。10min后，将溶液移出，并且将6微升2％乙酸铀酰滴添加到网格。30秒后，将溶液移除，并且将网格在室温放置干燥。然后使用Technai FEI-12电子显微镜对样品成像。
蛋白的体外释放：将1mL含有1mg溶菌酶的装载溶菌酶的纳米颗粒悬浮液添加到1-mL透析管(SpectrumLab,MWCO 50kDa)中，然后将其浸没在含有5mL的PBS(pH 7.4)的小瓶中。将小瓶放入在37℃的振荡速度为100rpm的培养箱中。收集外部的PBS介质，并且每天用纯(free)PBS替换。将收集的介质通过冷冻干燥浓缩，并且在400微升DI水中进一步重构。采用微量二辛可宁酸(BCA)测定来定量释放的溶菌酶的量。
结果和讨论
PEC纳米颗粒的制备和表征：通过FNC快速混合后，溶菌酶和DS在水性溶液中形成均匀的PEC纳米颗粒，其平均颗粒尺寸为64nm，并且多分散指数(PDI)为0.18(图3)。
表1.NP1至NP3的颗粒尺寸、PDI、ζ电位、溶菌酶EE和装载水平的总结
Figure BDA0002708792410000131
实施例2.包封IgG的PEG-b-PLLA纳米颗粒的制备及表征
方法
IgG/DS PEC纳米颗粒的制备及表征：将IgG以5mg/mL的浓度溶解于DI水中，随后通过添加0.1M HCl溶液将pH调整至4.0。然后将1毫升IgG溶液与等体积的DS溶液(20mg/mL，pH被调整至4.0)以5mL/min的流速通过具有两个入口的CIJ混合器快速混合。获得的PEC纳米颗粒悬浮液立即用于制备PEG-b-PLLA纳米颗粒。
IgG/DS:PEG-b-PLLA纳米颗粒的制备及表征：将1mL在先前步骤中获得的IgG/DSPEC纳米颗粒悬浮液(2.5mg/mL)与等体积的两种不同浓度(12.5mg/mL和25mg/mL)的PEG5k-b-PLLA20k DMSO溶液以5mL/min或10mL/min的流速通过双入口CIJ混合器快速混合，以获得具有两种不同的IgG与聚合物比例(1:5和1:10)的四种不同的核壳纳米颗粒制剂(NP4至NP7，表2)(图5)。将纳米颗粒针对DI水使用MWCO为3.5kDa的透析膜透析12小时以去除DMSO，其中每2小时更换一次水。将所获得的溶液使用MWCO为100kDa的过滤器以4,500rpm通过超滤纯化20min，以去除过量的IgG和DS。滤液中的IgG的量通过微量BCA测定来测量，并且EE使用以下公式计算：EE(％)＝(M总-M游离)/M总×100％，其中M总代表总进料IgG的质量，并且M游离代表游离IgG的质量。对核壳纳米颗粒使用DLS Zetasizer Nano通过尺寸和ζ电位进行表征。每个样品被运行三次来测量，并且数据被报告为三次读数的平均值±标准差。
IgG的体外释放：将1mL含有1mg IgG的装载IgG的纳米颗粒悬浮液添加到1-mL透析管(SpectrumLab,MWCO 300kDa)中，然后将其浸没在含有5mL的PBS(pH 7.4)的小瓶中。将小瓶放入在37℃的振荡速度为100rpm的培养箱中。每天收集和更新浴中的PBS溶液。将收集的介质通过冷冻干燥浓缩，并且使用400微升DI水进一步重构。采用微量BCA测定来定量释放的IgG的量。
结果
核壳纳米颗粒的制备及表征：以两种不同的IgG与聚合物比例和两种不同的流速制备IgG/DS:PEG-b-PLLA纳米颗粒(NP4至NP7)，显示出范围为35nm至96nm的Z平均颗粒尺寸与窄的尺寸分布(PDI值为～0.16-0.26)(表2)。降低IgG与聚合物比例或流速会显著增加纳米颗粒的尺寸。这些结果表明，纳米颗粒的颗粒尺寸可以通过调整IgG与聚合物的重量比以及流速来改变。所有的纳米颗粒都显示出负的表面电荷，其ζ电位范围为-24mV至-33mV。包封效率范围为62％至88％，包封效率随流速的增加或IgG与聚合物比例的降低而增加。
表2.NP4至NP7的平均颗粒尺寸、PDI、ζ电位、IgG的EE和装载水平的总结
Figure BDA0002708792410000141
体外释放谱：使用透析法研究了NP4至NP7在PBS(pH 7.4)中的体外释放谱。如图5A中示出的，所有四种纳米颗粒都显示出相似的双相释放谱，在最初的两天期间突发释放，随后在34天内接近零级释放。此外，NP4至NP7显示出相似的释放速率，到第34天，从NP4至NP7分别释放约57％、54％、53％和51％的IgG；并且到第76天分别为95％、87％、85％、82％。
实施例3.IgG/DS:PEG-b-PCL纳米颗粒的制备
方法
IgG/DS:PEG-b-PCL纳米颗粒的制备及表征：使用与实施例2的方法部分中描述的相同的程序制备和表征IgG/DS:PEG-b-PCL纳米颗粒，不同之处在于将PEG5k-b-PLLA20k替换为PEG5k-b-PCL20k。四种纳米颗粒NP8-NP11以两种不同的IgG与聚合物比例(1:5和1:10)和两种不同的流速(5mL/min和10mL/min)来制备(图5B)。
IgG的体外释放：将1mL含有200微克IgG的IgG/DS:PEG-b-PCL的纳米颗粒溶液添加到1-mL透析管(SpectrumLab,MWCO 300kDa)中，然后将其浸没在含有5mL的PBS(pH 7.4)的小瓶中。将小瓶放入在37℃的振荡速度为100rpm的培养箱中。每天收集并更换PBS滤液。将收集的介质通过冷冻干燥浓缩，并且使用400微升DI水进一步重构。采用微量BCA测定来定量释放的IgG的量。
结果
核壳纳米颗粒的制备及表征：NP8-NP11显示出范围为54nm至69nm的Z平均颗粒尺寸与窄的尺寸分布(PDI值为～0.13-0.22)(表3)。特别地，我们发现IgG与聚合物比例的降低或流速的降低增加了颗粒尺寸，这与IgG/DS:PEG-b-PLLA纳米颗粒的结果一致。所有的纳米颗粒都显示出负的表面电荷，其ζ电位范围为-24mV至-30mV。NP8至NP11的EE范围为69％至90％，EE随流速的增加或IgG与聚合物比例的降低而增加。
表3.NP8至NP11的Z平均尺寸、PDI、ζ电位、IgG包封效率和装载水平
Figure BDA0002708792410000151
IgG的体外释放：使用透析法研究了在PBS(pH 7.4)中IgG从NP8至NP11的体外释放谱。如图5中示出的，所有四种纳米颗粒都显示出相似的双相释放谱，在最初的两天期间突发释放，并且随后在接下来的27天内接近零级释放。此外，所有四种纳米颗粒制剂都产生了相似的释放速率，到第27天释放了40％-45％的IgG。预期这些纳米颗粒具有更长的释放时间段，遵循类似于第4天至第27天之间的释放趋势。
IgG/DS:PEG-b-PLLA纳米颗粒和IgG/DS:PEG-b-PCL纳米颗粒之间的比较：图6中比较了在相同条件下制备的NP4和NP8的释放谱。可以看出：(1)NP4在前两天具有突发释放，释放了20％的IgG，而NP8在前4天内仅释放了15％的IgG；(2)通过外推释放谱估计，NP8可能具有比NP4更长的释放持续时间(图6)。这些结果表明，该系统的释放谱可以通过选择具有不同降解速率的不同聚合物来改变。
实施例4.溶菌酶/DS:mPEG-b-PCL纳米颗粒通过一步法的制备
方法
溶菌酶/DS:mPEG-b-PCL纳米颗粒的制备及表征：将溶菌酶以0.5mg/mL的浓度溶解于去离子(DI)水中，并且使用0.1M NaOH将其pH调整至8.0。将1毫升溶菌酶(pH 8.0,0.5mg/mL)与等体积的不同浓度(1.5mg/mL、2.5mg/mL、5.0mg/mL、7.5mg/mL，溶解于DMSO中)的mPEG10K-b-PCL40K、葡聚糖硫酸酯(0.5mg/mL，溶解于DI水中)和DI水(pH 7.4)以不同流速比通过四入口的多入口涡流混合器(MIVM)混合(表4)。将纳米颗粒针对4升DI水针对透析膜(MWCO 3.5kDa)透析24小时，以去除DMSO，其中每6小时更换一次水。将所获得的溶液使用15毫升再生纤维素过滤器(
Figure BDA0002708792410000161
Ultra,MWCO 100kDa)以4,500rpm通过超滤浓缩20分钟。流过液中的游离溶菌酶的量通过微量BCA测定测量。纳米颗粒的流体动力学直径和ζ电位使用Malvern Zetasizer通过动态光散射(DLS)确定，并且形貌通过透射电子显微术(TEM)分析。如实施例1中描述的来确定包封效率(EE％)。
为了制备包括溶菌酶:mPEG-b-PCL纳米颗粒、DS:mPEG-b-PCL纳米颗粒和溶菌酶/DS纳米颗粒的对照纳米颗粒，如上文描述的制备和表征每种组分溶液。对于溶菌酶:mPEG-b-PCL纳米颗粒、DS:mPEG-b-PCL纳米颗粒和溶菌酶/DS PEC纳米颗粒的每种，缺失的组分—分别是DS、溶菌酶和mPEG-b-PCL—被替代为相应组分的单独的溶剂。然后以与溶菌酶/DS:mPEG-b-PCL纳米颗粒相同的方式制备及表征纳米颗粒。
结果和讨论
在MIVM室内产生紊流模式的快速混合条件下，溶菌酶和DS形成复合物，然后由于在混合条件下溶剂极性变化导致沉淀，复合物被mPEG-b-PCL涂覆。溶菌酶/DS纳米复合物用作mPEG-b-PCL沉淀的成核位点，这确保mPEG-b-PCL纳米颗粒以连续和可扩展的方式快速且均匀生长。如实施例1中描述的，优化溶菌酶与DS的重量比例。mPEG-b-PCL溶液、DS溶液、溶菌酶溶液和DI水的流速控制为9:9:9:1。通过改变mPEG-b-PCL:溶菌酶的质量比和溶液的流速，产生了具有70nm至120nm的平均尺寸的不同批次的纳米颗粒，通过多分散指数(PDI)测量其分布相对较窄。在表4中测试的所有条件下，溶菌酶的包封接近完全(>97.2％)。通常，较高的流速产生较小的纳米颗粒尺寸。
表4.NP12至NP18的颗粒尺寸、PDI、ζ电位、EE和LL的总结
Figure BDA0002708792410000171
溶菌酶/DS纳米复合物在mPEG-b-PCL纳米颗粒内的包封通过从最终的纳米颗粒制剂中减去组分，同时保持溶菌酶与DS的重量比例恒定(3:1)，并且还将mPEG-b-PCL溶液、DS溶液、溶菌酶溶液和DI水的流速从1:1:1:1调节至1:1:1:2来探索(表5)。对于两种流速条件，溶菌酶/DS:mPEG-b-PCL纳米颗粒的流体动力学直径最小。每种缺少一种组分的纳米颗粒制剂都比所有组分混合在一起的纳米颗粒制剂更大。没有mPEG-b-PCL包衣的溶菌酶/DS复合物具有高度负ζ电位，当添加mPEG-b-PCL包衣后，ζ电位降低，同时颗粒尺寸更紧凑，这表明复合物被截留在聚合物基质中，从而屏蔽了负电荷。
表5.减法组分纳米颗粒的颗粒尺寸、PDI和ζ电位的总结。
Figure BDA0002708792410000181
实施例5.卵清蛋白(OVA)/DS:mPEG-b-PCL纳米颗粒通过一步法的制备及表征
方法
OVA/DS:mPEG-b-PCL纳米颗粒的制备及表征：将卵清蛋白(OVA)以0.5mg/mL的浓度溶解于DI水中，随后通过添加0.1M HCl溶液将其pH调整至2.0。将1mL的OVA溶液与等体积的DS溶液(0.5mg/mL)、不同浓度(1.5mg/mL、2.5mg/mL、5.0mg/mL、7.5mg/mL，溶解于DMSO中)的mPEG10K-b-PCL40K和DI水(pH 7.4)混合。将这些纳米颗粒如实施例1中描述的进行表征。
结果
类似于实施例4中描述的，如表5中列出的，通过调整聚合物与OVA的质量比以及不同溶液的流速比，在不同的快速混合条件下制备OVA/DS:mPEG-PCL纳米颗粒。这些纳米颗粒表现出强的表面负电荷，ζ电位范围为-11.4mV至-26.2mV。包封效率范围为77.9％至88.6％，与聚合物:OVA的质量比或流速几乎没有相关性。
表5.NP19至NP26的颗粒尺寸、PDI、ζ电位、OVA的EE和装载水平的总结。
Figure BDA0002708792410000182
实施例6.IgG/DS:mPEG-b-PCL纳米颗粒通过一步法的制备及表征
方法
IgG/DS:mPEG-b-PCL纳米颗粒的制备及表征：将人类IgG以0.5mg/mL的浓度溶解于DI水中，随后通过添加0.1M HCl溶液将其pH调整至4.0。然后，在表6中列出的条件下，使用与实施例4和5的方法部分描述的相同的程序，制备并表征IgG/DS:mPEG-b-PCL纳米颗粒。
IgG在IgG/DS:mPEG-b-PCL纳米颗粒内的分布通过TEM的表征：按照制造商的方案，首先使用Mono-Sulfo-NHS-Nanogold(1.4-nm Au纳米颗粒，Nanoprobes)标记IgG。然后使用与表5中示出的以上关于NP21描述相同的方法包封Au标记的IgG。然后这些Au-IgG/DS:mPEG-b-PCL纳米颗粒使用透射电子显微术(FEI Tecnai 12)成像，随后使用如实施例1中描述的程序进行乙酸铀酰(2％w/v)负染。
结果
纳米颗粒中的IgG包封：制备的IgG/DS:mPEG-b-PCL纳米颗粒(NP27-NP36)表明，纳米颗粒的颗粒尺寸可以以与实施例5中描述的OVA包封的方式类似的方式通过调整聚合物与IgG的质量比以及流速比来改变。所有的纳米颗粒都显示出负的表面电荷，其ζ电位范围为-13.4mV至-23.6mV。IgG的包封效率范围为91.3％至95.6％，与聚合物:IgG的质量比或流速没有相关性。
表6.NP27至NP34的颗粒尺寸、PDI、ζ电位、IgG的EE和装载水平的总结
Figure BDA0002708792410000191
IgG在IgG/DS:mPEG-PCL纳米颗粒内的分布：IgG-Au(1.4nm Au纳米颗粒缀合的金)在IgG/DS-mPEG-b-PCL内的分布通过TEM确定(图9)，其表明，高于5:1(mPEG-b-PCL:IgG)质量比，IgG-Au遍及纳米颗粒基质分布。对多个样品的图像分析表明，IgG-Au的相对均匀分布似乎受到mPEG-b-PCL:IgG质量比的影响，这表明在较高质量比的情况下复合物包装密度较低，并且反之亦然。
实施例7.对OVA和IgG从通过一步制备法制备的蛋白/DS:mPEG-PCL纳米粒的体外释放的表征
方法
将1mL的0.3-0.5mg/mL OVA/DS:mPEG-b-PCL纳米颗粒或IgG/DS:mPEG-b-PCL纳米颗粒添加到1-mL Float-a-Lyzer透析管(SpectrumLab,MWCO 300kDa)中，然后将其浸没在含有6mL的PBS(含有0.5w/v％NaN3，pH 7.4)的小瓶中。然后将这整个透析装置放入填充有30mL的DI水的50-mL离心管中，并且使用
Figure BDA0002708792410000201
密封以使蒸发最小化。将离心管放入37℃的200rpm的振荡培养箱中。在时间点2h、6h、12h、24h和48h收集6-mL PBS溶液，并且此后每天收集。将收集的介质样品在-80℃冷冻，冻干，并且然后使用DI水重构，得到3×和6×浓缩的蛋白释放样品。微量BCA或NanoOrange测定被用来定量释放的OVA或IgG的量。
结果：体外释放谱
OVA从NP19的体外释放谱：使用透析法研究了在PBS(pH 7.4)中OVA从NP19的体外释放谱。如图10A中示出的，NP19在前两天内显示出双相释放谱，类似于通过两步制备法制备的NP，随后在14天内零级释放。到第14天，NP19具有约38.8％的累积释放，预计到第36天完全释放。
IgG从NP27的体外释放谱：使用相同的方法分析了在PBS(pH 7.4)中IgG从NP27的体外释放谱。如图10B中示出的，NP27显示出相似的释放谱，在最初两天期间有轻微的突发释放，随后在接下来的12天内零级释放。到第14天，NP27具有26.0％的IgG累积释放，预计到第54天完全释放。感兴趣的是，这种释放谱比OVA从类似制剂(NP19)释放地稍慢。这些数据表明，虽然不同蛋白的一般持续释放动力学相似，但蛋白治疗剂的尺寸性质可能影响从纳米颗粒的释放速率。
通过同时进行以下工艺的步骤(a)和(b)，发现了制备纳米颗粒的单步工艺，这是令人惊讶的结果。该工艺的第一步是(a)通过使用第一连续混合工艺混合蛋白和反荷离子聚合物来形成聚电解质复合物。该工艺的第二步是(b)使用第二连续混合工艺与生物可降解聚合物共沉淀。该工艺的第三步是(c)形成包含遍及生物可降解聚合物基质分布的蛋白-聚电解质复合物的纳米颗粒。
本发明包括一种制备生物可降解纳米颗粒的连续且可扩展的方法，所述生物可降解纳米颗粒具有蛋白PEC遍及纳米颗粒的均匀分布、高有效载荷能力和蛋白治疗剂的持续释放。为了调节蛋白的释放并提供有效的保护和包封，通过称为FNC的连续工艺将蛋白治疗剂与携带相反电荷的聚电解质复合成PEC纳米颗粒。然后使用FNP方法通过CIJ混合器或MIVM将所得的PEC纳米颗粒(未干燥)与PEG-b-PLLA或PEG-b-PCL聚合物共沉淀，以形成胶束纳米颗粒。通过改变蛋白与聚合物的重量比和/或输入溶液的流速比，装载蛋白的纳米颗粒显示出负的表面电荷、窄尺寸分布和可调的颗粒尺寸。最重要的是，这些纳米颗粒能够实现蛋白的持续和延长的释放。这些纳米颗粒的释放速率可以经由控制蛋白与聚合物的重量比或选择不同的二嵌段共聚物来调节。鉴于纳米颗粒生产工艺的可再现性和可扩展性，以及由这些纳米颗粒实现的持续长期释放，该平台在制备多种蛋白治疗剂(包括许多抗体药物)的纳米颗粒方面具有巨大潜力。
在本公开内容的特定实施方案中，可以向受试者给予或施用本发明的纳米颗粒，其包含药剂，诸如蛋白、肽、抗体、化学品、核酸或其组合。纳米颗粒可以以固体、液体或气雾剂的形式施用至受试者。纳米颗粒可以通过如将由本领域普通技术人员已知的静脉内、皮内、经皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、直肠内、局部(topically)、肌内、皮下、粘膜、口服、局部(topically)、局部(locally)、吸入(例如气雾剂吸入)、注射、输注、连续输注、直接局部灌注浸润靶细胞、经由导管、经由灌洗、以乳状物形式、以脂质组合物形式(例如脂质体)或者通过其他方法或者以上方式的任何组合进行施用(参见，例如Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版Mack Printing Company,1990，其通过引用并入本文)。
此外，根据本公开内容，适于施用的本发明的纳米颗粒在具有或没有惰性稀释剂的情况下在药学上可接受的载体中提供。载体应当是可同化的，并包括液体、半固体，即糊剂或固体载体。任何常规介质、剂、稀释剂或载体在用于实践本发明方法的可施用组合物中使用是合适的，除非其对受体或包含在其中的组合物的疗效有害。载体或稀释剂的实例包括脂肪、油、水、盐水溶液、脂质、脂质体、树脂、粘合剂、填料等或其组合。组合物还可以包含各种抗氧化剂，以减缓一种或更多种组分的氧化。此外，防止微生物的作用可以通过防腐剂诸如各种抗细菌剂和抗真菌剂包括但不限于对羟基苯甲酸酯类(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合来实现。
根据本发明，纳米颗粒可以任何方便且实用的方式与载体组合，即，通过溶解、悬浮、乳化、掺和、包封、吸收等。对于本领域技术人员来说，这类程序是常规的。
在本发明的具体实施方案中，本发明的纳米颗粒可以与半固体或固体载体充分组合或混合。混合可以以任何方便的方式诸如研磨进行。在混合工艺中，还可添加稳定剂，以保护组合物免于损失治疗活性，即，在胃内变性。用于在组合物中使用的稳定剂的实例包括缓冲剂、氨基酸类诸如甘氨酸和赖氨酸、糖类诸如右旋糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇、甘露醇等。
在另外的实施方案中，本发明可以涉及药用脂质媒介物组合物的使用，该组合物包含本发明的纳米颗粒和一种或更多种脂质和水性溶剂。如本文使用的，术语“脂质”将被定义为包括特征在于不溶于水并且用有机溶剂可提取的宽范围的物质中的任一种物质。本领域技术人员熟知这一大类的化合物，并且如本文使用的术语“脂质”并不局限于任何特定的结构。实例包括含有长链脂肪烃及其衍生物的化合物。脂质可以是天然存在的或合成的(即由人类设计或生产)。然而，脂质通常是一种生物物质。生物脂质在本领域中是熟知的，并且包括例如中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜类、溶血脂、糖鞘脂、糖脂、硫脂、具有醚和酯连接的脂肪酸的脂质和可聚合脂质及其组合。当然，除本文具体描述的化合物之外的被本领域技术人员理解为脂质的化合物也被本发明的组合物和方法涵盖。
本领域普通技术人员将熟悉可被采用以将一种或更多种纳米颗粒分散在脂质媒介物中的一系列技术。例如，一种或更多种本发明的纳米颗粒可以被分散在含有脂质的溶液中、用脂质溶解、用脂质乳化、与脂质混合、与脂质组合、与脂质共价键合、作为悬浮液包含在脂质中、包含在胶束或脂质体中或与其复合，或另外通过本领域普通技术人员所知的任何方式与脂质或脂质结构缔合。分散可以或可以不导致形成脂质体。
施用至动物患者的本发明的纳米颗粒的实际剂量可根据物理和生理因素诸如体重、状况严重程度、待治疗疾病的类型、先前或并行的治疗干预措施、患者特发病和施用途径确定。取决于剂量和施用途径，优选剂量和/或有效量的施用次数可根据受试者的反应而有所不同。不管怎样，负责施用的从业人员将确定组合物中的活性成分浓度，以及用于个体受试者的适合剂量。
在某些实施方案中，包含本发明的纳米颗粒的药物组合物可以包含例如至少约0.1％的活性化合物。在其他实施方案中，活性化合物可构成例如约2％至约75％之间的单位重量，或约25％至约60％之间，以及其中可得出的任何范围。当然，每种治疗上有用的组合物中活性化合物的量可以以这样的方式制备，使得可以在任何给定的单位剂量化合物中获得合适的剂量。制备这样的药物制剂的领域的技术人员将考虑诸如溶解度、生物可利用度、生物半衰期、施用途径、产品货架期以及其他药理学考虑的因素，并因此各种剂量和治疗方案可以是期望的。在其他非限制性实例中，剂量也可以包括每次施用从约1微克/kg/体重、约5微克/kg/体重、约10微克/kg/体重、约50微克/kg/体重、约100微克/kg/体重、约200微克/kg/体重、约350微克/kg/体重、约500微克/kg/体重、约1毫克/kg/体重、约5毫克/kg/体重、约10毫克/kg/体重、约50毫克/kg/体重、约100毫克/kg/体重、约200毫克/kg/体重、约350毫克/kg/体重、约500毫克/kg/体重至约1000mg/kg/体重或更多，以及其中可得出的任何范围。在根据本文所列数值可得出的范围的非限制性实例中，基于上述数值，可以施用约5mg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5微克/kg/体重至约500毫克/kg/体重等的范围。
消化器官用组合物和制剂
在本公开内容的一种实施方案中，本发明的纳米颗粒被配制成以经消化器官途径施用。消化器官途径包括其中组合物直接接触消化道的所有可能施用途径。具体地，本文所公开的药物组合物可以口服给药、含服施用、直肠施用或舌下施用。因此，这些组合物可以用惰性稀释剂或用可同化的可食用载体来配制，或者这些组合物可以被封闭在硬壳或软壳明胶胶囊内，或它们可以被压成片剂，或它们可以直接掺入到饮食食物中。
在某些实施方案中，包含活性化合物的纳米颗粒可以掺入有赋形剂，并以可服用片剂、含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、薄片(wafer)等形式使用(Mathiowitz等人，1997；Hwang等人，1998；美国专利第5,641,515号、第5,580,579号和第5,792,451号；每一项通过引用以其整体明确并入本文)。片剂、锭剂、丸剂、胶囊等也可含有以下物质：粘合剂，诸如例如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶或其组合；赋形剂，诸如例如磷酸二钙、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁或其组合；崩解剂，诸如例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸或其组合；润滑剂，诸如例如硬脂酸镁；甜味剂，诸如例如蔗糖、乳糖、糖精或其组合；调味剂，诸如例如薄荷、冬青油、樱桃调味剂、柑橘调味剂等。当剂量单位形式是胶囊时，它除了以上类型的材料之外还可以含有液体载体。多种其他材料可以作为包衣存在或以其他方式改变剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以涂覆有虫胶、糖或两者。当剂型为胶囊时，除以上类型材料之外，其可以含有诸如液体载体的载体。明胶胶囊、片剂或丸剂可以被肠溶包衣。肠溶包衣防止组合物在pH为酸性的胃或肠上部发生变性。参见，例如，美国专利第5,629,001号。到达小肠后，小肠内的碱性pH使包衣溶解，并允许组合物释放并被特化细胞例如肠上皮细胞和派尔斑M细胞(Peyer's patch M cell)所吸收。糖浆或酏剂可以包含活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和调味剂诸如樱桃或柑橘调味剂。当然，用于制备任何剂量单位形式的任何材料应当是药学上纯的并且在所采用的量是基本上无毒的。此外，活性化合物可以被掺入到持续释放制品和制剂中。
对于口服施用，包含本公开内容的纳米颗粒的组合物可选地可以掺入有一种或更多种赋形剂以呈漱口水、洁齿剂、含片、口腔喷雾剂或口腔舌下施用的制剂的形式。例如，可以将所需量的活性成分掺入适当的溶剂，诸如硼酸钠溶液(朵贝尔溶液)中制备漱口水。可选地，可以将活性成分掺入到诸如含有硼酸钠、甘油和碳酸氢钾的口服溶液中，或分散在洁齿剂中，或以治疗有效量添加到可以包含水、粘合剂、研磨剂、调味剂、起泡剂和保湿剂的组合物中。可选地，组合物可被塑造成片剂或溶液形式，其可被放置在舌下或以其他方式在口中溶解。
适于其他消化器官施用模式的另外的制剂包括栓剂。栓剂是具有各种重量和形状、通常含药的、用于插入直肠的固体剂型。插入后，栓剂在腔流体中软化、溶化或溶解。通常，对于栓剂，传统载体可以包括例如聚亚烷基二醇、甘油三酯或其组合。在某些实施方案中，栓剂可由含有例如约0.5％至约10％且优选约1％至约2％的范围内的活性成分的混合物形成。
肠胃外组合物和制剂
在另外的实施方案中，本发明的纳米颗粒可以经由肠胃外途径施用。如本文使用的，术语“肠胃外”包括避开消化道的途径。具体地，本文公开的药物组合物可以例如但不限于静脉内、皮内、肌内、动脉内、鞘内、皮下或腹膜内施用(美国专利第6,7537,514号、第6,613,308号、第5,466,468号、第5,543,158号、第5,641,515号和第5,399,363号，每一项都通过引用以其整体明确并入本文)。
包含作为游离碱或药学上可接受的盐的活性化合物的纳米颗粒的溶液可以在水中、合适地与表面活性剂(诸如羟丙基纤维素)混合来制备。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中以及在油中制备。在通常的储存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂，以防止微生物的生长。适于可注射使用的药物形式包括无菌水性溶液或分散体和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末(美国专利5,466,468，其通过引用以其整体明确并入本文)。在所有情况下，形式必须是无菌的、并且必须是流动的，达存在易于注射的能力的程度。它必须在制造和储存条件下是稳定的，并且必须防止微生物诸如细菌和真菌的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。可以例如通过使用包衣诸如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的颗粒尺寸，以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。微生物作用的防止可以通过多种抗细菌剂和抗真菌剂来实现，所述多种抗细菌剂或抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，将优选的是包含等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中使用延迟吸收的剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。
对于以水性溶液形式进行的肠胃外施用，例如，如果需要，应当对溶液进行适当缓冲，并且用充足的盐水或葡萄糖使液体稀释剂首先实现等渗。这些特定水性溶液尤其适于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在这一点上，可以采用的无菌水性介质将是本领域技术人员根据本公开内容所已知的。例如，可以将一个剂量溶解于等渗NaCl溶液中，并且添加皮下灌注术流体或注射在提议的输注部位(参见例如，“Remington's PharmaceuticalSciences”第15版，第1035-1038和1570-1580页)。取决于待治疗的受试者的状况，剂量必然会发生一些变化。不管怎样，负责施用的人员将会确定用于个体受试者的适合剂量。此外，对于人类施用，制品应当满足如FDA机构的生物制品标准所要求的无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准。
无菌可注射溶液通过将所需量的活性化合物掺入适当的溶剂中，然后通过过滤法除菌制备，所述溶剂根据需要具有多种上文枚举的其他成分。通常，分散体通过将多种灭菌的活性成分掺入到无菌媒介物中来制备，所述无菌媒介物包含基础分散介质和来自上文枚举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，所述技术从之前的活性成分加任何另外所需成分的无菌过滤的溶液产生其粉末。在具有或没有稳定剂的情况下，将粉状组合物与液体载体诸如例如水或盐水溶液组合。
各种各样的药物组合物和制剂
在本发明的其他优选实施方案中，包含活性化合物或剂的纳米颗粒可以被配制用于经由多种各种各样的途径施用，例如，局部(即经皮)施用、粘膜施用(鼻内、阴道等)和/或吸入。用于局部施用的药物组合物可以包含纳米颗粒，该纳米颗粒包含被配制用于给药应用的活性化合物，诸如软膏、糊剂、乳膏或粉末。软膏包括用于局部应用的所有油性、吸附性、乳液性和水溶性基的组合物，而乳膏和洗剂是仅包括乳液性基剂的组合物。局部施用的药物可以含有渗透强化剂，以促进活性成分通过皮肤的吸附。合适的渗透强化剂包括甘油、醇、烷基甲基亚砜、吡咯烷酮和月桂氮卓酮(luarocapram)。对于用于局部应用的组合物而言，可能的基剂包括聚乙二醇、羊毛脂、冷膏和凡士林以及任何其他合适的吸收性、乳液性或水溶性软膏基剂。必要时，局部制品还可包含乳化剂、胶凝剂和抗微生物防腐剂，以保存活性成分和提供均匀的混合物。本发明的经皮施用还可以包括使用“贴剂”。例如，贴剂可以以预定速率和以连续的方式在固定的时间段内提供一种或更多种活性物质。
在某些实施方案中，包含本发明的纳米颗粒的药物组合物可以通过滴眼剂、鼻内喷雾剂、吸入剂和/或其他气雾剂递送媒介物进行递送。经由鼻气雾剂喷雾剂将组合物直接递送至肺部的方法已经在例如美国专利第5,756,353号和第5,804,212号中描述(每一项通过引用以其整体明确并入本文)。同样地，使用鼻内微米颗粒树脂(Takenaga等人，1998)和溶血磷脂酰-甘油化合物(美国专利第5,725,871号，其通过引用以其整体明确并入本文)的药物递送在制药领域也是熟知的。同样地，聚四氟乙烯支持物基质形式的经粘膜药物递送在美国专利第5,780,045号中描述(其通过引用以其整体明确并入本文)。
术语气雾剂是指分散在液化或加压气体喷射剂中的精细分离的固体或液体颗粒的胶体系统。本发明用于吸入的典型气雾剂将由活性成分在液体喷射剂中的悬浮液或在液体喷射剂与合适溶剂的混合物中的悬浮液组成。合适的喷射剂包括烃和烃醚。合适的容器将根据喷射剂的压力要求而不同。气雾剂的施用将根据受试者的年龄、体重以及症状的严重程度和反应而不同。
本公开内容的试剂盒
本文描述的任何组合物可以被包含在试剂盒中。在一种非限制性实例中，本发明的纳米颗粒(例如，包含剂或活性组合物)可以被包含在试剂盒中。试剂盒可以包含适当等分的本发明的纳米颗粒，并且在一些情况下，包含一种或更多种另外的剂。试剂盒的组分可以以水性介质或以冻干形式包装。试剂盒的容器装置(means)通常将包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他容器装置/工具，组分可以放置并且优选地，合适地等分在所述容器装置中。在试剂盒中存在多于一种组分的情况下，试剂盒通常还将包含第二、第三或其他另外的容器，另外的组分可以单独放置在所述容器中。然而，小瓶中也可以包含成分的多种组合。本发明的试剂盒通常还将包含用于容纳一种或更多种本发明的纳米颗粒的装置和用于商业销售的呈紧密封闭形式的任何其他试剂容器。这样的容器可以包括在其中保存期望的小瓶的注射或吹塑模制的塑料容器。
当试剂盒的组分在一种和/或更多种液体溶液中提供时，液体溶液是水性溶液，无菌水性溶液是特别优选的。一种或更多种本发明的纳米颗粒可以被配制成可注射的组合物。在这种情况下，容器装置本身可以是注射器、移液管和/或其他类似的装置，制剂可以从该装置被应用至身体的感染区域，注射到动物中，和/或甚至应用至试剂盒的其他组分和/或与试剂盒的其他组分混合。然而，试剂盒的组分也可以作为干燥粉末提供。当作为干燥粉末提供试剂和/或组分时，粉末可以通过添加合适的溶剂来重构。设想溶剂也可以被提供在另一容器装置中。
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本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利均通过引用并入本文，其程度如同每一个参考文献被单独和具体指出通过引用并入本文并且其全文在本文被列出一样。
除非本文另外指示或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在所附权利要求书的上下文中)使用的术语“一(a)”和“一(an)”以及“该/所述(the)”和相似的指示物，应被解释为覆盖单数和复数两者。除非另外说明，否则术语“包含/包括(comprising)”、“具有(having)”、“包括/包含(including)”和“包含/含有(containing)”应被解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。除非本文另外指示，否则本文的值的范围的描述仅旨在用作单独提及落在范围内的每个单独的值的简写方法，并且每个单独的值被并入本说明书中，如同其在本文中单独列举一样。本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行，除非本文另外指示或以其他方式与上下文明显矛盾。除非另外说明，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围构成限制。本说明书中的语言不应被解释为表示任何未被要求保护的元素对于本发明的实施是必需的。
本文描述了本发明的优选实施方案，包括本发明人已知的用于实施本发明的最佳方式。在阅读前面的描述之后，这些优选实施方案的变化对于本领域普通技术人员来说可以变得明显。本发明人预期本领域技术人员适当地使用此类变化，并且本发明人旨在以不同于本文具体描述的方式实施本发明。因此，本发明包括被适用法律许可的在此所附权利要求书中描述的主题的所有修改形式和等同物。此外，除非本文另外指示或以其他方式与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖以上描述的要素的所有可能变化形式的任何组合。

Claims (17)

1.一种纳米颗粒，所述纳米颗粒包含：
包含药剂和反荷离子聚合物的复合物，其中所述反荷离子聚合物具有使其能够与所述药剂静电结合的电荷；和
基质，所述基质包含遍及生物可降解聚合物分布的所述复合物。
2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述反荷离子聚合物带正电荷。
3.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述反荷离子聚合物带负电荷。
4.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述药剂带正电荷。
5.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述药剂带负电荷。
6.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述药剂选自由以下组成的组：蛋白、肽、多肽、抗体或其组合。
7.根据权利要求3所述的纳米颗粒，其中所述反荷离子聚合物选自由以下组成的组：葡聚糖硫酸酯(DS)、肝素(硫酸肝素)、透明质酸或其组合。
8.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述生物可降解聚合物是选自包含以下的组的共聚物：PLLA、PGA、PLGA、PCL、它们的PEG化嵌段共聚物或其组合。
9.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述生物可降解聚合物是PEG-b-PLLA；PEG-b-PCL；或其组合。
10.一种制备纳米颗粒的方法，所述方法包括：
(a)通过使用第一连续混合工艺混合药剂和反荷离子聚合物来形成聚电解质复合物；
(b)使用第二连续混合工艺与生物可降解聚合物共沉淀；和
(c)形成包含遍及生物可降解聚合物基质分布的聚电解质复合物的纳米颗粒。
11.根据权利要求10所述的方法，其中步骤(a)和步骤(b)同时进行。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述第一连续工艺是快速纳米复合(FNC)。
13.根据权利要求10所述的方法，其中形成所述聚电解质复合物(PEC)是通过所述药剂和所述反荷离子聚合物之间的静电吸引。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述聚电解质复合物(PEC)和所述生物可降解聚合物的混合是通过溶剂诱导的快速纳米沉淀(FNP)。
15.根据权利要求10所述的方法，其中形成纳米颗粒通过所述生物可降解聚合物与所述聚电解质复合物(PEC)一起沉淀而发生。
16.一种药物递送的方法，所述药物递送的方法包括：
将纳米颗粒施用至需要药剂的受试者来预防或治疗疾病，所述纳米颗粒包含复合物和基质，所述复合物包含所述药剂和反荷离子聚合物，其中所述反荷离子聚合物具有使其能够与所述药剂静电结合的电荷；所述基质包含遍及生物可降解聚合物分布的所述复合物；并且
与未施用所述纳米颗粒的参考受试者相比，治疗或预防所述疾病。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述药剂选自由以下组成的组：蛋白、肽、抗体、化学品、核酸及其组合。
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