CN111944858B - 一种8’-羟基十四元大环内酯化合物及其制备方法与作为海洋防污剂的应用 - Google Patents

一种8’-羟基十四元大环内酯化合物及其制备方法与作为海洋防污剂的应用 Download PDF

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Abstract

一种8’羟基十四元大环内酯化合物及其制备方法与作为海洋防污剂，特别是针对污损硅藻的防污剂，制备时先对海洋来源真菌Cochliobolus lunatus，保藏编号为CGMCC No.8698，进行菌种培养，再在发酵培养基中对该真菌进行发酵培养，将所得发酵液过滤，得到菌丝和滤液，菌丝用二氯甲烷‑甲醇提取得粗浸膏Ⅰ，滤液用乙酸乙酯萃取得粗浸膏Ⅱ，将粗浸膏Ⅰ和Ⅱ合并得总粗浸膏，并进行正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析，再经HPLC高效液相制备色谱，将所得洗脱液浓缩，得到式I化合物。本发明提供一种海洋生物防污剂，特别是针对污损硅藻的防污剂，其特征在于以本发明的式I化合物、其药学上可接受的盐，用于防治污损硅藻附着引起的海洋生物污损。

Description

一种8’-羟基十四元大环内酯化合物及其制备方法与作为海 洋防污剂的应用
技术领域
本发明涉及一种8’-羟基十四元大环内酯化合物及其制备方法与应用，涉及一种对海洋污损生物，特别是污损硅藻Chlorella vulgaris, Chaetoceros socialis 和Navicula exigua具有很强的抑制活性的8’-羟基十四元大环内酯化合物及其制备方法与应用。
背景技术
海洋生物污损是有机分子、微生物、动物、植物、以及它们的副产物在海洋潜没设施表面的危害性积聚。这种危害性积聚经常发生在没有保护的海洋潜没设施的表面，包括海运和旅游的船舶，海军军舰，热交换器，海洋传感器以及水产养殖基地等。生物污损引起了巨大的经济损失，仅以美国海军军舰为例，每年在这方面的经济损失在18到26亿美元之间，而美国海军军舰数量仅占全球船舶数量的0.5%，因此海洋生物污损是极其严重的自然危害。生物膜的形成在生物污损过程的初级阶段，可以促进一系列大型污损生物的继续附着，控制生物膜的形成是防除生物污损的关键。底栖硅藻是生物膜形成的主要生物之一，它在材料表面的附着有助于生物膜的形成。自2008年全球取消了有毒防污剂有机锡的使用后，寻找安全高效的海洋防污剂成为国际上急需解决的课题。海洋天然产物被认为是新型海洋防污剂的重要来源。实际上，在过去的几十年里已经从海绵，珊瑚和海藻等海洋生物中发现了很多有强抗污损活性的化合物。然而，从上述大型生物中发现的活性化合物由于受到量的限制而大大影响了其潜在的应用。海洋微生物由于在实验室中可以大规模发酵，不易破坏自然环境，而成为活性海洋化合物的最重要来源。（J.A. Callow, M.E. Callow,Nat. Commun. 2011, 2, 244–253； C.M. Kirschner, A.B. Brennan, Annu. Rev. Mater. Res.2012, 42, 1–19； M. Schultz, J. Bendick, E. Holm, W. Hertel,Biofouling2011, 27, 87–98；N. Fusetani, Nat. Prod. Rep.2004, 21, 94–104；N.Fusetani, Nat. Prod. Rep. 2011, 28, 400–410；P.-Y. Qian, Y. Xu, N. Fusetani,Biofouling2010, 26, 223–234）。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来源于海洋真菌的8’-羟基十四元大环内酯化合物及其制备方法与作为海洋防污剂, 特别是针对污损硅藻的防污剂的应用，它能满足现有技术的上述需求。菌种保藏信息：保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号 中国科学院微生物研究所；保藏日期：2014年01月09日；保藏编号：CGMCC No.8698；分类命名：Cochliobolus lunatus。
本发明提供式I化合物或其药学上可接受的盐:
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
本发明提供式I化合物的制备方法，其特征在于先在菌种培养基中对真菌Cochliobolus lunatus，保藏编号为CGMCC8698，进行菌种培养，再在发酵培养基中对该真菌进行发酵培养，将所得发酵液过滤，得到菌丝和滤液，菌丝用二氯甲烷-甲醇提取得粗浸膏Ⅰ，滤液用乙酸乙酯萃取得粗浸膏Ⅱ，将粗浸膏Ⅰ和Ⅱ合并得总粗浸膏，并进行正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析，再经HPLC高效液相制备色谱，将所得洗脱液浓缩，得到式I化合物。
上述制备方法中菌种培养基优选含有土豆液、葡萄糖0.1%–5.0%（重量百分比，下同）、琼脂0.1%–3.0%、氯化钠0.05%–5%，其余为水，培养温度优选为0–30°C，培养时间优选为3–15天；发酵培养基优选含有土豆液、葡萄糖0.1%–5.0%（重量百分比，下同）、氯化钠0.05%–5%，其余为水，培养温度优选为0–30°C，培养时间优选为10–60天；所述的正相硅胶柱层析采用的固定相优选200–300目硅胶，流动相优选体积比为15%–60%的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂；所述的反相C18硅胶柱层析采用的流动相为体积比为20%–80%的甲醇–水混合溶剂；所述HPLC高效液相制备色谱中采用的色谱柱为本领域常规ODS C18柱，优选为Kromasil 10×250 mm, 7 μm，流速优选为1.0–5.0 mL/min，流动相优选体积比为40%–80%的甲醇-水混合溶剂。
本发明从海洋真菌中获得的8’-羟基十四元大环内酯化合物对海洋污损生物硅藻Chlorella vulgaris, Chaetoceros socialis, 和Navicula exigua具有很强的抑制活性，可用于开发海洋防污剂, 特别是针对污损硅藻的防污剂，应用前景广阔。
本发明的实施方案提供式I化合物或其药学上可接受的盐在制备海洋防污剂，特别特别是针对污损硅藻的防污剂的应用。
本发明中术语“药学上可接受的盐”是指非毒性的无机或有机酸和/或碱的加成盐。可参见“Salt selection for basic drugs”, Int. J. Pharm. (1986), 33, 201–217。
具体实施方式
为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。
实施例1
(1)海洋真菌Cochliobolus lunatus的菌种培养
菌种培养所用的培养基含有土豆液、葡萄糖1.0%（重量百分比，下同）、琼脂1.0%、氯化钠3.0%，其余为水，使用时制成试管斜面，真菌菌株在30℃ 下培养5天。
(2)海洋真菌Cochliobolus lunatus的发酵
发酵培养所用的培养基含有土豆液、葡萄糖1.0%（重量百分比，下同）、氯化钠3.0%，其余为水；真菌菌株于28℃培养60天。
(3) 式I化合物的提取分离
取10 L步骤（2）得到的发酵液过滤，得到菌丝和滤液，菌丝用二氯甲烷-甲醇提取得粗浸膏Ⅰ，滤液用乙酸乙酯萃取得粗浸膏Ⅱ，将粗浸膏Ⅰ和Ⅱ合并得总粗浸膏，并进行正相硅胶柱层析（固定相为200–300目硅胶；流动相为60%乙酸乙酯/石油醚混合溶剂，体积比）、反相C18硅胶柱层析（流动相为体积比为40%的甲醇–水混合溶剂）后，再经HPLC高效液相制备色谱分离（色谱柱为Kromasil 10×250 mm，7μm，流速为 2.0 mL/min，流动相为26%的乙腈-水混合溶剂，体积比），将所得洗脱液浓缩，得白色固体，即为式I化合物。
式I化合物的结构确证数据:
Cochliomycin G
Figure DEST_PATH_IMAGE002
:白色固体，比旋光值[α]24 D -11.5 (c 0.1, MeOH). 1H NMR (DMSO-d 6, 500 MHz): δ ppm 11.10 (1H, s, OH-2), 6.66 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-1´), 6.41 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-5), 6.35 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-3), 6.14 (1H, dt, J = 15.6, 7.2 Hz, H-2´), 5.07 (2H, overlapped, H-10´, OH- 4´), 4.99 (1H, br s, OH-5´), 4.72 (1H, d, J = 7.2 Hz, OH-8´), 4.20 (2H, overlapped, H-5´, H-8´), 3.99 (1H, br s, H-4´), 3.75 (3H, s, OCH3-4), 2.60 (1H, dd, J = 12.4, 4.6 Hz, H-7´), 2.39 (2H, overlapped, H-3´, H-7´), 2.24 (1H, m, H-3´), 1.80 (1H, t, J = 12.4 Hz, H-9´), 1.53 (1H, m, H-9´), 1.29 (3H, d, J = 6.2 Hz, H-11´). 13C NMR (DMSO-d 6, 125 MHz): δ 210.2 (C-6´), 169.7 (C-12 ´), 162.8 (C-4), 161.3 (C-2), 141.4 (C-6), 131.0 (C-2´), 130.0 (C-1´), 108.5 (C-1), 105.1 (C-5), 100.5 (C-3), 80.6 (C-5´), 72.0 (C-4´), 69.9 (C-10´), 63.2 (C-8´), 55.8 (OCH3-4), 50.1 (C-7´), 43.7 (C-9´), 37.1 (C-3´), 20.8 (C-11´); HREIMS m/z 403.1367 (calcd for C19H24O8Na+ , 403.1363).
实施例1中未具体指明的其他菌种培养、发酵条件，以及正相硅胶柱色谱分离、反相C18硅胶柱层析分离、高效液相色谱分离等其他实验操作条件均为本领域常规的实验操作条件，本领域的技术人员可以根据实际需要，进行合理的选择。
实施例2
在菌种培养基中对海洋真菌Cochliobolus lunatus进行菌种培养，再在发酵培养基中对该真菌进行发酵培养，将所得发酵液过滤，得到菌丝和滤液，菌丝用二氯甲烷-甲醇提取得粗浸膏Ⅰ，滤液用乙酸乙酯萃取得粗浸膏Ⅱ，将粗浸膏Ⅰ和Ⅱ合并得总粗浸膏，并进行正相硅胶柱层析、反相C-18硅胶柱层析后，再经HPLC高效液相制备色谱，将所得洗脱液浓缩，得无色晶体白色固体，即为式I化合物，其结构确证数据与实施例1中相应数据一致。其中所述菌种培养基中含有土豆液、葡萄糖、琼脂、粗海盐、水，所述发酵培养基中含有土豆液、葡萄糖、粗海盐、水；所述的色谱分离为正相硅胶柱色谱分离、反相硅胶柱层析和高效液相色谱分离。
为了探索更广泛的适用于制备本发明式Ⅰ化合物的方法，本实施例中菌种培养基、发酵培养基中各成分的添加，均按本领域中常规比例添加或按任意比例添加，色谱分离时所用硅胶的规格、反相硅胶的规格、色谱柱的型号及洗脱溶剂的选择，均为本领域的常规选择。实验结果表明，上述常规选择的制备方法，均能得到发明的白色固体，即式Ⅰ化合物，其结构确证数据与实施例1中相应数据一致，仅仅存在个别化合物在纯度及收率方面的微小差异。
实施例1–2的结果表明，按照本领域常规的菌种培养、发酵条件，常规的正相硅胶柱色谱分离、反相硅胶柱色谱分离、高效液相色谱分离的条件对海洋真菌Cochliobolus lunatus 进行菌种培养、发酵、分离纯化，均能得到本发明式Ⅰ结构的化合物。本发明式Ⅰ化合物的制备方法，优选实施例1–2中记载的方法。
实施例3
本发明的式I化合物对污损硅藻Chlorella vulgaris, Chaetoceros socialis和Navicula exigua抑制活性试验按照如下文献方法测试: Eisentraeger, A.; Dott,W.; Klein, J. Ecotox. Environ. Safe. 2003, 54, 346−354.
本发明的式I化合物对污损硅藻Chlorella vulgaris, Chaetoceros socialis和Navicula exigua有极强的抑制活性，其EC50 值分别为1.09, 0.92和 0.61 μg/mL。需要特别说明的是，从相同菌株Cochliobolus lunatus获得的有很强抗藤壶Balanus amphitrite幼虫附着活性的十四元大环内酯cochliomycin A，cochliomycin F，LL-Z1640-1和LL-Z1640-2对硅藻Chlorella vulgaris, Chaetoceros socialis 和Navicula exigua在10.0 μg/mL浓度下不显示抑制活性（文献：Shao, C.L., Wu, H.X., Wang, C.Y. J.Nat. Prod. 2011, 74, 629−633; Liu, Q.A., Shao, C.L., Gu, Y.C., Wang, C.Y. J.Agric. Food Chem. 2014, 62, 3183−3191）。
Figure DEST_PATH_IMAGE003
。
分析抑藻化合物cochliomycin G与抑制藤壶幼虫附着活性化合物cochliomycinA，cochliomycin F，LL-Z1640-1和LL-Z1640-2的结构后发现，其最大结构差别在于cochliomycin G含有8’位羟基，而其他化合物不含有该基团。这进一步说明，8’位羟基是该类十四元大环内酯化合物抑藻活性的重要活性官能团。这是首次发现8’-羟基十四元大环内酯化合物具有显著的抗污损藻附着活性。更为重要的是，本专利涉及的化合物cochliomycin G的抗污损活性远强于美国海军规定的潜在的天然防污损化合物EC50值25 μg/mL的标准，作为新型海洋防污剂, 特别是针对污损硅藻的防污剂的应用前景广阔。

Claims (1)

1.一种式I结构的8’-羟基十四元大环内酯化合物在制备针对污损硅藻的海洋防污剂中的应用，其特征在于其含有式I结构化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分，所述污损硅藻为Chlorella vulgaris, Chaetoceros socialis 和Navicula exigua，所述式I结构为
Figure 492703DEST_PATH_IMAGE001
。
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