CN111944830A - 一种抗除草剂基因及其构建的载体、表达的多肽和基因的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗除草剂基因及其构建的载体、表达的多肽和基因的应用。本发明阐明了国际上多年未能探明的植物转运除草剂的抗性机理，发掘了新的除草剂抗性基因资源转运蛋白基因ABCC8，基于新功能基因培育了新的抗除草剂作物种质材料，为我国抗除草剂转基因作物新品种的培育提供了保障。

Description

一种抗除草剂基因及其构建的载体、表达的多肽和基因的 应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体的说，涉及抗除草剂基因及其构建的载体、编码的蛋白质，以及利用该基因在抗除草剂转基因植物研制方面的应用。这种基因可以用来在植物中表达而使植物获得对除草剂的抗性能力，从而可以利用除草剂选择性地防除杂草。

背景技术

草甘膦(glyphosate)是一种非选择性除草剂，具有理化性质稳定、高效、广谱、低毒、低残留、易被微生物分解，不破坏土壤环境等优点，已广泛应用于农业生产中，成为目前世界上生产量最大的农药品种。草甘膦是一种内吸传导型除草剂，喷洒于植物茎叶后，即可被植物吸收，并迅速输导到整个植株及其根部，从而杀灭杂草，不仅能杀死地上部分，并且能作用于根部，正做到斩草除根，可有效防除那些靠根系繁殖的多年生杂草。然而作为一种非选择型除草剂，其杀灭杂草的同时，对农作物同样具有灭生性，一定程度上限制了其使用范围和使用时间。因此，培育具有草甘膦抗性的农作物具有重要意义，不仅可有效防控杂草而且可减少农业生产费用。

草甘膦的作用机理主要是竞争性抑制莽草酸途径中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性。该酶是真菌、细菌、藻类和高等植物体内芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)生物合成过程中一个关键性的酶。部分细菌的EPSPS已发现对草甘膦具有抗性，并且被分离获得。植物可以通过转基因表达细菌的抗性EPSPS而获得抗草甘膦的能力。农杆菌(Agrobacterium tumefaciens sp CP4)和Salmonella typhimurium CT7的EPSPS在植物中表达而获得的抗性已在生产中应用(美国专利453590,4769061,5094945)。但是为了提高转基因农作物的抗性水平和增加抗性基因的多样性，生产应用中仍然需要新的抗草甘膦基因和以此为基础的转基因抗草甘膦植物。

自从1976年美国孟山都公司的草甘膦类除草剂(农达)研制成功并得到广泛应用以来，作物抗草甘膦基因研究成为抗除草剂基因工程研究的热点。随着抗草甘膦基因克隆的发展，抗草甘膦转基因作物也相继问世并大面积推广应用。草甘膦抗性基因的来源主要有2种，一是通过筛选抗草甘膦物种，从而克隆得草甘膦抗性基因。目前，已在微生物Salmonella typhimurium、Agrobacterium tumefaciens sp CP4、Achromobacter sp.LBAA和Pseudomonas sp.PG2982等中发现了具有抗性的EPSPS基因，其中部分基因已在部分作物中已批准商业化生产。二是对EPSPS基因突变，获得草甘膦抗性突变体，如已商业化生产的抗草甘膦玉米GA21中抗性基因是利用位点突变后克隆获得的。

ABC转运蛋白(ATP-binding cassette transporters，三磷酸腺苷结合盒转运蛋白)超家族作为最大跨膜蛋白家族，广泛存在于从低等的古细菌到人类在内的所有生物体中。最早于1976年在人类肿瘤的研究中首次提出了基于ABC转运蛋白的多药抗性MDR(multidrug resistance)的概念，引起了医学研究领域的广泛关注。后续研究证实ABC转运蛋白在癌变或正常器官和组织中均参与药物以及内外源化合物的吸收、分布和排泄，因此被认为是参与内外源物质解毒作用的重要蛋白酶家族。近年来，随着人类和哺乳动物ABC转运蛋白的深入研究，越来越多的体内体外实验证实多抗蛋白基因可以介导多种结构不相关药剂的转运。此发现受到了农药研究学者的广泛关注，迄今为止，ABC转运蛋白已被证实与大量不同种类的化学药剂的转运或抗性相关。而能够转运除草剂(包括草甘膦)并导致抗性的ABC转运蛋白尚未被发现。

本发明首先发现了抗草甘膦稗草品种，然后利用其基因组序列的信息克隆了其ABC转运蛋白基因ABCC8，并且进一步在水稻、玉米和大豆中证明了ABCC8基因的抗草甘膦能力及其在发展转基因抗草甘膦农作物中的用途。而本发明涉及的利用全新转运蛋白基因ABCC8来实现植物抗除草剂草甘膦从未有人报道。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种在植物中能高效表达的抗除草剂基因。该基因为ABC转运蛋白基因ABCC8。

基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示，以及与SEQ ID NO:1所示序列具有不小于71％相同性的序列中的任意一条。

本发明所述的除草剂包括草甘膦。除了草甘膦，可能还有其他除草剂可以被转运蛋白以类似的方式去除从而让植物产生抗性。

本发明的抗除草剂基因的核苷酸序列可以有多种不同的变异，包括但不限于：1)利用同一个氨基酸的不同密码子而获得的不同的核苷酸序列，这些序列编码相同活性的蛋白质多肽；2)通过导入核苷酸序列的变异但是仍然编码具有抗除草剂能力的蛋白质的核苷酸序列。这种变异可以是随机的变异，也可以是针对性的点变异，还可以是插入或者缺失变异。本领域的一般技术人员就能够通过分子生物学的方法产生上述变异。

利用本发明提供的核苷酸序列，也可以获得具有相同功能的同源基因。一种方法是利用本发明提供的核酸为探针杂交DNA文库获得同源基因，另一种方法是根据本发明提供的核酸序列设计引物通过PCR而克隆同源基因。不仅如此，本领域的技术人员还利用本发明提供的核酸序列和蛋白质序列，通过分子信息学的方法从基因组库中找出高同源性的基因。如利用BLAST(www.ncbi.nih.gov)方法，根据本发明提供的核苷酸序列和蛋白质多肽的氨基酸序列，发现与本发明提供的基因同源性比较高的基因。

本发明的第二个目的是提供上述的抗除草剂基因编码的多肽。

所述的多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:5(即EcABCC8基因编码的多肽)所示，或者与SEQ ID NO:5所示序列具有不小于70％相同性的序列。

这种蛋白质在植物细胞中能提高细胞的抗除草剂(例如草甘膦)的能力。

通常与本发明的抗除草剂基因EcABCC8至少有71％，77％，87％的相同性的核苷酸序列表达的蛋白质可能具有抗草甘膦的活性，并且可以通过现在已有的方法进行确定，如利用本发明实施例4、5、6的方法。

本发明的第三个目的是提供表达上述抗除草剂基因的表达载体，该载体包含上述的抗除草剂基因序列。

所述的表达载体，还包含在植物中表达上述的抗除草剂基因所需要的其他元器件。

利用本发明提供的抗除草剂基因核苷酸序列，可以构建能够在植物中表达的人工基因。同样，根据本发明提供的抗除草剂蛋白质多肽序列，也可以人工合成核酸序列，并进一步构建能够在植物中表达的人工基因。能够在植物中表达的人工基因构件包括启动子、抗除草剂基因和终止子。例如，在转化单子叶植物时启动子可以是玉米Ubiqutin-1启动子，或者水稻Actin启动子；而终止子可以是根癌农杆菌终止子(Nos)或者其他终止子。该表达构件可以通过农杆菌(如Agrobacterium菌株)、基因枪方法或者其他方法整合到植物的基因组中，然后用1-5mM的除草剂，如草甘膦培养基进行筛选培养。再进行分化而获得转化芽，经过生根培养基培养就可以获得种植的转基因苗。进一步，抗草甘膦转基因植物可以通过喷施草甘膦筛选。

本发明的第四个目的是提供所述的抗除草剂基因在植物抗除草剂中的应用。

所述的应用是将抗除草剂基因转入植物中进行表达，使植物获得抗除草剂能力。

所述的植物包括水稻、玉米、棉花、小麦、大豆、草坪草或牧草。

本发明的第五个目的是提供所述的抗除草剂基因在获得抗除草剂植物中的应用。具体是将表达抗除草剂基因的载体转入植物中表达。

本发明提供的上述应用：具体还包括利用植物基因转化技术将上述抗除草剂基因表达框导入植物细胞，再将其分化培育成相应的转基因植株。所获得的植株具有抗除草剂能力。

本发明适用于所有植物，包括双子叶和单子叶植物。

本发明提供基因为植物本源基因，即来自植物本身的基因，相较起来对植物本身的影响更小、对作物环境都更加安全。

抗草甘膦基因EPSPS的核心技术和产业化应用的绝大部分专利由孟山都、拜耳等跨国公司拥有。更严峻的事实是，这些跨国公司一直通过对基因序列进行小范围改动和修饰的手段对其核心专利进行延长保护，使其变为“新”专利，从而有效规避所谓的20年专利有效期，试图达到独占这些功能基因和转化技术的目的。我国近年也获得部分EPSPS基因专利授权，但是多数专利都是建立在国外核心专利的基础之上，如果想要使转基因产业化，国外掌握的“专利使用权”是一道绕不过去的坎。

本发明的有益效果

本发明阐明了国际上多年未能探明的植物转运除草剂的抗性机理，发掘新的具有完全自主知识产权的除草剂抗性基因资源转运蛋白基因ABCC8，基于新功能基因培育了具有完全自主知识产权的抗除草剂作物种质材料，为我国抗除草剂转基因作物新品种的培育不受制于人提供了保障。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是转运蛋白基因(EcABCC8)在稗草抗性种群中R和敏感种群S中的表达情况；

图2是转运蛋白基因(EcABCC8)部分测序结果截选；

图3是转运蛋白基因(EcABCC8)植物表达载体的构建及转化过程，(a)目标片段EcABCC8基因的扩增,(b)目标片段EcABCC8基因和pox质粒酶切产物片段,(c)转化出的愈伤组织图片,(d)转化出的小苗图片；

图4是植物表达载体的构建示意图；

表达框(a)由启动子、稗草抗草甘膦基因EcABCC8和终止子组成，(b)由启动子、水稻抗草甘膦基因OsABCC8和终止子组成，(c)由启动子、玉米抗草甘膦基因ZmABCC8和终止子组成，(d)由启动子、大豆抗草甘膦基因GmABCC8和终止子组成；

图5为实施例3中转稗草抗草甘膦基因EcABCC8水稻对草甘膦的耐受度检测结果；

图6为实施例4中转水稻抗草甘膦基因OsABCC8水稻对草甘膦的耐受度检测结果；

图7为实施例5中转玉米抗草甘膦基因ZmABCC8玉米对草甘膦的耐受度检测结果；

图8为实施例6中转大豆抗草甘膦基因GmABCC8大豆对草甘膦的耐受度检测结果；

图9为实施例7中EcABCC8在水稻中同源基因的敲除载体构建；(a)敲除的序列所处位置，(b)敲除载体的构建，(c)敲除后的测序结果；

图10为实施例7中EcABCC8在水稻中同源基因的敲除后对不同浓度草甘膦敏感性检测结果，其中(a)26g ha^-1、(b)53g ha^-1、(c)105g ha^-1和(d)210g ha^-1。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但本发明的保护范围并不仅限于此。应理解，这些实施例仅用于举例说明本发明的方法，而不用于限制本发明的范围。凡未注明具体实验条件的或无特殊说明的实验方法，均为本领域技术人员熟知的常规条件和常规方法。

实施例1抗草甘膦稗草的抗性测定

稗属杂草(简称稗草，Echinochloa crusgalli)隶属禾本科，为一年生杂草，是18种世界性恶性杂草之一，也是我国稻田中分布最广、危害最严重的主要杂草之一。为了明确稗草对草甘膦的抗药性水平，采用整株测定法研究了采集的稗草生物型对草甘膦的敏感性水平。结果表明发现采集的抗性稗草生物型R能够在2160g ha^-1草甘膦(4倍田间推荐剂量)下正常生长，其鲜重抑制中剂量(ED₅₀)值为771.8g ha^-1；而对照的敏感稗草生物型S则不能在270g ha^-1草甘膦(1/2倍田间推荐剂量)条件下生长，其ED₅₀值为22.5g ha^-1，相对抗性倍数达34.3倍。因此抗性稗草生物型可能包含有抗草甘膦基因。

实施例2抗性基因的克隆

一种植物抗草甘膦可能有多种机理，如拥有抗草甘膦的EPSPS基因；拥有能够降解草甘膦的酶；能够限制草甘膦的吸收，或者拥有修饰草甘膦的酶使草甘膦失去活性等。对抗性稗草种群进行靶标抗性机理的研究，从抗性种群中各挑取20株进行草甘膦靶标基因5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolypyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS，EC 2.5.1.1.9)片段的克隆，将克隆到的基因序列与敏感稗草种群S的基因序列进行了比对。结果发现R种群未有靶标酶突变，说明该种群无靶标酶抗性机理。通过转录组测序技术，成功获得了2个稗草种群(R，S)的转录组数据。以稗草基因组数据库为参考基因组，统计评估测序的质量值时，发现其碱基Q30都在90％以上，表明测序质量非常可靠成功测序结果(见表1)。

表1稗草转录组的原始数据分析

^aGC碱基所占总碱基数的百分比。

^b读数时平均循环数≥30的百分比。

对组装后的基因表达量进行进一步分析，发现在R和S之间差异表达的基因共有2320个，这其中与非靶标抗性相关的基因共12个(见表2)。

表2差异表达的代谢抗性相关基因及其验证结果

使用转录组测序的RNA样本对发现的这12个非靶标抗性相关差异基因进行荧光定量PCR验证，结果发现：与敏感种群S相比，抗性种群中R中转运蛋白基因(EcABCC8)始终高表达(见图1)。以提取的稗草总RNA为模板，根据转录组得到的稗草ABCC8基因的EST序列片段，根据3’端和5’端拼接序列设计两条特异引物

F：catgtcctgatacaatggtagg，SEQ ID NO:6；

R:gcggcaatggcagataagta，SEQ ID NO:7

进行PCR扩增并克隆、测序(见图2)，最终成功获得稗草EcABCC8基因的全长(SEQID NO:1)。

实施例3 EcABCC8基因过表达载体的构建和转基因抗草甘膦水稻的获得

1)构建EcABCC8基因过表达载体。

根据EcABCC8基因并结合pox表达载体的多克隆酶切位点，加上相应的双酶切位点及保护碱基，设计特异性引物

F：tgttacttctgcagggtaccatggccgttcttggctgg；(SEQ ID NO:8)

R:cggatccataacgcgttcatgttgaattccgcttggt，(SEQ ID NO:9)

扩增的片段与克隆载体混匀后进行连接反应，连接反应结束后转化大肠杆菌感受态细胞，对能扩增出预期目标片段的质粒进行双酶切验证，验证均正确的重组克隆载体进行序列测定，最终得到重组克隆载体。

重组克隆载体序列经测定分析后，进行过表达载体的构建。用双酶切重组克隆载体质粒，相同的限制酶同时双酶切空载体pox质粒(购买自武汉伯远生物科技有限公司)，分别回收重组克隆载体质粒酶切产物的目标片段和pox质粒酶切产物大片段(见图3a、b)。将所回收的稗草ABCC8基因的全长片段与pox质粒载体片段用连接酶连接，得到含稗草EcABCC8基因全长表达序列的表达载体pox-EcABCC8。

2)抗性愈伤组织的筛选及对草甘膦的敏感性测定。

以水稻种子为材料，去除颖壳后经乙醇消毒后，置于含有2,4-D的培养基上28℃暗培养，3周后选取致密的愈伤组织颗粒用于转化。利用农杆菌菌株将重组质粒转入其感受态细胞中，得到带有表达载体pox-EcABCC8阳性农杆菌，并培养新鲜农杆菌菌液。水稻愈伤组织浸入此菌液中，并转入选择培养基筛选抗性愈伤组织。具体过程：取培养好的菌液1ml于1.5ml离心管中，4℃，5000rmp，离心1min，去上清，将离心得到的菌体用含200μmol/LAs的30ml AAM液体培养基制成悬浮液。(As母液浓度100Mmol/L，配制时可以在30毫升的AAM液体培养基中加入60μL的As母液即可)将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5分钟(愈伤量没过50ml离心管锥形部位即可)，期间不停的摇动。将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40分钟；将愈伤组织置于共培养基上(共培养基上面垫上一层9cm无菌滤纸)，组培室28℃暗培养2.5天。

抗性愈伤组织的筛选和分化。将共培养后的愈伤组织放在含有Hygromycin的筛选培养基上，暗培养14天，再转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选14天。从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有Hygromycin的分化培养基上，先暗培养3天，然后转至光照条件下培养，经过15-25天左右，有绿点出现，30-40天后进一步分化出小苗。(见图3c、d)。

转基因植株的筛选。当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时，将小苗移到生根培养基上，培养两周左右。选择高约10cm、根系发达的小苗，洗去培养基，在温室内移栽入土，获得转化植株。使用草甘膦处理转基因水稻，以带有pox-GFP过表达的转基因水稻为对照，观察其对草甘膦的敏感性。结果发现带有pox-GFP过表达的转基因愈伤在草甘膦浓度为田间剂量(540g ha^-1)时就停止了生长，而带有稗草pox-EcABCC8基因过表达的转基因水稻在2160g ha^-1草甘膦(4倍田间推荐剂量)下仍然不受影响，因此我们得出结论：稗草EcABCC8基因的过量表达，可使转基因水稻对草甘膦产生抗性。

实施例4 EcABCC8在水稻中同源基因的表达和抗草甘膦性能测定

水稻已经完成全基因组的DNA序列测定。通过序列分析，确定了水稻中EcABCC8的同源基因，被命名为OsABCC8,其核苷酸序列为SEQ ID No:2。利用核苷酸序列对比分析程序分析，发现OsABCC8和EcABCC8的核苷酸序列的相同性为77％，氨基酸序列相同性为79％。由于EcABCC8被本发明证明具有抗草甘膦的能力，因此与EcABCC8高度同源的基因OsABCC8也可能具有抗性。

为了证明OsABCC8是否具有抗草甘膦能力，扩增了水稻中编码OsABCC8蛋白质多肽的全长片段。同样经过pox载体构建，设计特异性引物F：tgttacttctgcagggtaccatggccggccggagcggc(SEQ ID NO:10)；R:cggatccataacgcgttcatgttgcattccgctt(SEQ ID NO:11)，得到含水稻OsABCC8基因全长表达序列的表达载体pox-OsABCC8。

再经过抗性愈伤组织的培养和转基因植株的筛选，成功得到了OsABCC8过表达的转基因水稻，载体构建、基因转化、抗性筛选过程均参照实施例3。使用草甘膦处理转基因水稻，发现带有pox-GFP过表达的转基因愈伤在草甘膦浓度为田间剂量(540g ha^-1)时就停止了生长，而带有水稻pox-OsABCC8基因过表达的转基因水稻在2160g ha^-1草甘膦(4倍田间推荐剂量)下仍然不受影响，因此我们得出结论：水稻OsABCC8基因的过量表达，可使转基因水稻对草甘膦产生抗性。

实施例5 EcABCC8在玉米中同源基因的表达和抗草甘膦性能测定

玉米已经完成全基因组的DNA序列测定。通过序列分析，确定了玉米中EcABCC8的同源基因，被命名为ZmABCC8,其核苷酸序列为SEQ ID No:3。利用核苷酸序列对比分析程序分析，发现ZmABCC8和EcABCC8的核苷酸序列的相同性为87％，氨基酸序列相同性为88％。。由于EcABCC8被本发明证明具有抗草甘膦的能力，因此与EcABCC8高度同源的基因ZmABCC8也可能具有抗性。

采用重组酶方法构建玉米ZmABCC8的过表达载体，用限制性内切酶BamHI和SacI酶切pCombia3300-ubi空载体(购买自百格基因科技(江苏)有限公司)，再根据载体和ZmABCC8序列设计引物：

F：ttctgcaggtcgactctagaggatccatgttagcggccgtaatggctga；(SEQ ID NO:12)

R:tttgaacgatcggggaaattcgagctctcatgttgaatttctcttggtatta(SEQ ID NO:13)。

PCR反应后产物取3ul点胶看条带是否正确，大小4500bp，正确即对原液回收。再重组连接体系，即可得到所要过表达载体pCombia3300-ZmABCC8。

玉米的转化方法已经比较成熟，例如利用农杆菌转化玉米的方法。将载体质粒pCombia3300-ZmABCC8通过电击法，电击器上2500V/6ms进行电击，促使质粒进入农杆菌EHA105中，PCR进行鉴定。以新鲜剥离的1mm左右的玉米幼胚为材料，将剥取的玉米胚放入含有1.8mL农杆菌悬浮液的2ml塑料离心管中，30min内大约处理未成熟幼胚150个；吸去悬浮液，余下玉米胚在管中然后加入1.0ml农杆菌悬浮液，放置5min。将离心管中的幼胚悬浮后倒入共培养基上，并用移液器吸去表面多余的农杆菌菌液，于23℃黑暗共培养3天。共培养后，将幼胚转移到休息培养基中，于28℃黑暗培养6天后，放至含双丙氨膦的筛选培养基上，开始筛选培养两周，然后新的筛选培养基上筛选培养2周。将抗性愈伤组织转移至分化培养基中，25℃，5000lx，光照培养3周；将分化生出的小苗转移至生根培养基上，25℃，5000lx，光照培养直到生根；将小苗转入小盆中生长，一定生长阶段后移栽于温室中，3-4个月后收获后代种子。

使用草甘膦处理转基因玉米，以未转pCombia3300-ZmABCC8的玉米品种为对照，观察其对草甘膦的敏感性。结果发现未转pCombia3300-ZmABCC8的玉米品种在草甘膦浓度为田间剂量(540g ha^-1)时就停止了生长，而带有玉米ZmABCC8基因过表达的转基因玉米在2160g ha^-1草甘膦(4倍田间推荐剂量)下仍然不受影响，因此我们得出结论：玉米ZmABCC8基因的过量表达，可使转基因玉米对草甘膦产生抗性。

实施例6 EcABCC8在大豆中同源基因的表达和抗草甘膦性能测定

大豆已经完成全基因组的DNA序列测定。通过序列分析，确定了大豆中EcABCC8的同源基因，被命名为GmABCC8,其核苷酸序列为SEQ ID No:4。利用核苷酸序列对比分析程序分析，发现GmABCC8和EcABCC8的核苷酸序列的相同性为71％，氨基酸序列相同性为70％。由于EcABCC8被本发明证明具有抗草甘膦的能力，因此与EcABCC8高度同源的基因GmABCC8也可能具有抗性。

采用重组酶方法构建大豆GmABCC8的过表达载体，用限制性内切酶NcoI和BstelI酶切pCAMBIA3301空载体(购买自百格基因科技(江苏)有限公司)，再根据载体和GmABCC8序列设计引物：

F:gagagaacacgggggactcttgaccatggatctatatgcagatgatttctca(SEQ ID NO:14)；

R:cgatcggggaaattcgagctggtcaccttattcaatgttgctgcctgctaac(SEQ ID NO:15)。

PCR反应后产物取3ul点胶看条带是否正确，大小4380bp左右，正确即对原液回收。再重组连接体系，即可得到所要过表达载体pCAMBIA3301-GmABCC8。

大豆的转化方法也已经比较成熟。将pCAMBIA3301-GmABCC8载体通过电击法，电击器上2500V/6ms进行电击，促使质粒转入农杆菌EHA105中，PCR进行鉴定。以萌发1天的大豆为材料，放入含有50ml农杆菌悬浮液的培养皿中，2个小时内大约处理150个大豆外植体，室温放置30min进行侵染。侵染结束后弃去农杆菌菌液，外植体放于共培养基中，23℃黑暗共培养3天。共培养后，将胚转移到休息培养基中，于25℃光培养7天后，放至含草丁膦的筛选培养基上，筛选培养三周，诱导抗性芽。然后转到含草丁膦的伸长培养基上光培养6-9周。将再生伸长的幼苗进行生根，然后移植到温室中单株培养，检测转基因大豆的抗除草剂能力。

使用草甘膦处理转基因大豆，以未转pCAMBIA3301-GmABCC8的大豆品种为对照，观察其对草甘膦的敏感性。结果发现未转pCAMBIA3301-GmABCC8的大豆品种在草甘膦浓度为田间剂量(540g ha^-1)时就停止了生长，而带有pCAMBIA3301-GmABCC8基因过表达的转基因大豆在2160g ha^-1草甘膦(4倍田间推荐剂量)下仍然不受影响，因此我们得出结论：大豆GmABCC8基因的过量表达，可使转基因大豆对草甘膦产生抗性。

实施例7 EcABCC8在水稻中同源基因的敲除和草甘膦敏感性检测

将EcABCC8在水稻中同源基因OsABCC8基因(LOC_Os06g36650)提交至NCBI进行检索，确定外显子序列。根据gRNA设计原则，在OsABCC8基因的第1个外显子5'端处，寻找PAM(protospacer-adjacent-motif)位点为“NGG”，长度为19bp的候选序列，并通过水稻RhoGAP家族Ⅱ类8个成员同源序列比对验证候选序列的特异性，在筛选到的靶位点5'端添加BsaI限制性内切酶的识别位点和保护碱基。gRNA制备反应条件为95℃变性10min、55℃退火10min，获得互补双链的gRNA。将上述制备的gRNA与植物表达载体pBWA(V)H-cas9i2连接，构建敲除载体Cas9-OsABCC8。

经农杆菌介导的日本晴胚性愈伤的遗传转化、筛选和再分化培养，共获得10株独立的T0代转基因水稻。编辑靶点扩增和测序显示，这10株转基因水稻均为杂合突变。其中，株系1、2、3、5、8、10均为碱基缺失突变，株系4、6、7、9为碱基插入突变，这说明T0代转基因水稻中OsABCC8基因的序列已经发生改变。

对T1代转基因水稻筛选鉴定方法与T0代相同。在检测的50株转基因水稻中，测序结果证实11株未被编辑(占22％)，24株为杂合突变体(48％)，15株为纯合突变体(30％)。在15株纯合突变体中，10株在编辑靶点插入1个碱基“C”(命名为株系Allele1)，5株在编辑靶点缺失1个碱基“C”(命名为株系Allele2)。采用DNAMAN软件进行多序列比对，结果显示，在株系Allele1和株系Allele2中，OsABCC8的氨基酸序列都发生了移码突变，最终造成无义突变。据此推测，在敲除ABCC8的水稻中，将无法产生正常的OsABCC8蛋白。使用不同浓度的草甘膦(26g ha^-1、53g ha^-1、105g ha^-1和210g ha^-1)处理转基因水稻，以未敲除OsABCC8的水稻品种为对照WT，观察其对草甘膦的敏感性。结果发现敲除OsABCC8和未敲除OsABCC8的水稻品种在草甘膦浓度为210g ha^-1时均被彻底杀死。而在其它几个剂量下，敲除OsABCC8的转基因水稻株系Allele1和株系Allele2的生长，相较未敲除OsABCC8的水稻品种WT都要更差，因此我们得出结论：水稻OsABCC8基因的敲除，可使转基因水稻对草甘膦的敏感性增加。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 湖南省农业生物技术研究所

<120> 一种抗除草剂基因及其构建的载体、表达的多肽和基因的应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4299

<212> DNA

<213> 稗草(Echinochloa crusgalli)

<400> 1

atggccgttc ttggctggtc gccgtcgtgg gcttgcgggc ggctcaccgt cgcgtcgccg 60

tgcgtgcaga gggccctgat cgactgcgtc aatggcgcgc tccttgtcgc gtacgccgcc 120

gcgctggttg ccgccgcctg cgccaggcgg cggcggtggg ccagcgccgc tggccggagc 180

agcggcgaca ctcgctggtg gcggtggggg ctggccttgg tctccgcatg ctgcgtcgcg 240

gccgccgtgg gttacggcgt cgacggcttc cagcacgcct cggacgccgc ggcggcggcg 300

gctccttgct tcttcagggc gctggtctgg atcgcgctgg cgacctcgct gcacgtcaag 360

cccagccggc cggcggcggc cgtggccgtg ctctggtggg cgctcttctc gctgctcgtc 420

accgcgtaca atgccgatat cctaatcggc ggcggcgcgc tcgacgtcgc ggagatggtc 480

gcgtggccgg tgaacctcct cctgctgctc tgtgcgctcg gctcggtgct gcgccgccgg 540

agccgcgggc ggcaccacga cgcctccggt gacaaccaca acggcggcct gtcggagcat 600

ctgatcggca aggacgacga cgaagccgcc gtgcccacct cggagctcta ccgctccggc 660

ctgttccgcc agctcgcctt ctcgtggctg aaccctctgc tccgcctcgg ccgctccaag 720

gcgctggacc tcgccgacat cccgctcatc gccggcgagg acaccgcgga gcacagctcg 780

cacaagttcg ccgaggcctg gagccgccac gtgcacggca aggccaggac ccgccggagc 840

gtgggcagga acagcctcgc ccttgtcctg ggcaagtgct tcctcggcga gatcctgctc 900

accggcttct acgcgttcct gagaacgctg tccatagcgg tggcgcccct gctgctcttc 960

gcgttcgtgt ggtacagcaa ccaggaggtg agggacctcc gggtcggcct ggccctcgtc 1020

ggctgcctgc tgctcatgaa gctcgtcgag tcgctgtcgc agcggcactg gttcttcgac 1080

tccaggagaa ccgggatgcg catccggtcg gcgctgatgg cggtcatctt ccagaagcag 1140

ctcaggctgt ccagtcaggg gaggaagaac cactccaccg gcgagatcgt caactacatc 1200

gccgtcgacg cgtaccggct cggcgacgct atcagctggt tgcacatggg gtggagctcg 1260

ccacttcagc tggtgtttgc agtagccacg ctcttctggg ctctgaagct tggggctctt 1320

ccgggtctgg tgcccctagt catcttcggc ttcctcaacg tgccgttcgc gaagatcctg 1380

caagggtacc aggccaaatt catggttgca caggacgaga ggctccggtc gacatccgag 1440

atactgaaca gcatgaagat catcaagctg cagtcatggg aggagaagtt ccggaacatg 1500

gtcgagtcac tcagggacgg tgagttcaaa tggctgaggg agacccagat gaagaaggcc 1560

tatggtgcgg tcatgtattg gatgtccccg accgtcgtct ctgcggtgat gtacaccgcg 1620

acagcaatca tggggagtgc acccctgaat gccagcactc tcttcacggt cttggccacc 1680

ctgagggtaa tggctgagcc tgtgaggttt cttcctgaga tcctcacaat gatgatccag 1740

tacaaggtgt cgttagaccg tattgagagg tttcttctcg aagatgagat cagagaggag 1800

gatgtgaaga gggtaccatc agataactct gatatcagag ttcaagtcca agacgggaat 1860

ttcagctgga atgctaccgg agctaatctg gtggcatatg tttcacagaa ttcctggata 1920

cagagcggta ctgttcgtgc taacatactc ttcgggaagc ctttcaacaa ggaactgtat 1980

gagaaggcaa tcaaatcttg tgccttggac aaggatattg aaaatttcga ccatggagac 2040

ctgacagaga ttggccagag aggactgaac atgagcggag gtcagaagca aaggattcag 2100

ctggcaagag ccgtctacaa tgatgcagat gtttatctgc tggatgatcc tttcagtgca 2160

gttgatgccc acaccgcggc agttcttttc tatgactgtg tgatgacagc acttgctcag 2220

aagactgtag ttcttgtgac ccaccaagtt gaatttctga ctgaaactag tagaattctg 2280

gtaatggaag gcggtcaagt tagtcagcaa ggaaaatatt cagaactact ggaatctggg 2340

acagcattcg aaaagctggt ttcagctcac cagtcttcga tcacagaatt agatactagt 2400

gccagtcaac agaaccaagt tcaagggcaa ctggtgcctg acgaaaacat agtgccgagt 2460

gcgctgcagg ctacaaggca ggctagtgac atcgaagtcg ctgcgaaagg tccttcagca 2520

gcaatccagc ttacagaaga ggaagagaag gggatcggtg acctgggatg gaagccatac 2580

aaagactaca taaatgtatc caagggtgtt ttccaattct ctggcatgtg tacttctcag 2640

gtgctcttca catgctttca gatcgcgtcc acatattggt tggccgtggc tgttcagatg 2700

gataacgtca gtgctgcact tctagttggg gcctattctg ggctctctat cttcagctgc 2760

ttctttgcct actttagaag tttgttcgca gctgttctgg gcctcaaggc gtccaaaaca 2820

ttcttcagtg ggctaatgga ttctgtattc aaggctccca tgtcattttt tgactcaacg 2880

ccggtgggaa gaattttaac aagggcatct tcagatttaa gcattctaga cttcgacata 2940

ccttactcca tggcttttgt tactaccggc agtattgagg ttgtcacgac agtacttgtc 3000

atgggtactg taacttggca agtcttggtt gtagcaatcc cagttacaat caccatggta 3060

tatgttcaga ggtactatgt atcctcagct agagagctag taagaatcaa tggaacaaca 3120

aaggcacctg taatgaatta tgcatcggag tcaattcttg gtgtggtgac catcagggca 3180

tttgcagcaa cagagaggtt catccgcagc aacatgcagc ttatcgacac tgacgcgaca 3240

atgttcttcc acactgttgc tgcgcaagaa tgggtgctta taagagtgga ggcactgcag 3300

tccttgacaa taattacagc agcattgttc cttgttttgg ttcctccagg agtaatttca 3360

ccaggctttg cgggactttg cctctcctat gctttgacgc tgacttcagc acaggttttc 3420

ttgacaaggt tctattcata cttggaaaac tacatcatct cagtggagcg aatcaagcag 3480

tatatgcacc tcccagcaga gccacctgct attatacccg aaaatagagc tccaacttca 3540

tggccacagg agggaaggat agacctgcaa gatttgaaga taagataccg tccaaatgca 3600

ccgcttgttc ttaaaggaat tacttgcacc tttgctgcgg ggaacaagat tggggttgta 3660

gggaggacag gaagtgggaa atcaacactc atcagctcat tgttccgtct tgttgatcca 3720

tcatgtggaa ggatacttat tgataagttg gatatctgct ccataggcct aaaggatctg 3780

agaactaaat tgagtattat ccctcaagaa ccaacgcttt tccggggaac tgtgcgcaac 3840

aatttggatc cccttggcct gcattctgac caagagatat gggaggcctt ggacaagtgt 3900

caactgaaga cagcaattag cagcacccct gatcttcttg atacagtagt gagcgatgat 3960

ggcgataact ggagcgctgg acagcgtcag ctcttctgtc ttggcagagt tctcctccgc 4020

aggaacaaaa ttctagttct agatgaggcg acagcatcca ttgactctgc aacagatgcg 4080

atcctgcaga aagtaatcag acagcagttt tcaagttgca cggtgataac catagctcac 4140

agggttccaa ctgtgacaga cagtgacagg gtcctggtac tgtcctacgg gaagcttctt 4200

gaatatgaaa caccagccaa actattggaa gacaagcagt cagcctttgc taaacttgtg 4260

gctgagtatt gggctaatac caagcggaat tcaacatga 4299

<210> 2

<211> 3588

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 2

atggccggcc ggagcggcga gaacggcggc gccggcggcg gcgacctgtc ggagcctctg 60

ctcggcaagg aggcgcctcg ccggtactcg gagctgtacg gcgccggcgt gctcagccgg 120

ctgtccttct cgtggctgaa cccgctgctc cgcctcggcc gctccaaggc gctcgacctc 180

gccgacgtcc cgctcatcgc ctccgaggac ggcgcggcgc gcgcgtcgga gaggttcgcc 240

gaggcatgga gcctccacgg ccatggcaag gacggcggcg gtggcggccg cctcgtcggc 300

gtgctgctca gcagccacaa ggcagaggag gaggagcgcc gggacctcgc cgccgccggc 360

gcatcggcgg cggtggcgct ggtcggctcg ctgctggcga tcaagctcgc cgagtcgctg 420

tcgcagcggc actggttctt cagctcgcgg cggacgggga tgcgcgtccg gtcggcgctg 480

atggcggccg tgttccggaa gcagctccgg ctgtcggcgc gcgcgcggcg gcgccactcc 540

gccggcgagg tcgtcggcta cgtcgccgtc gacgcgtacc gcctcggcga cgccgtcagc 600

tggctccaca cgtcgtggag ctcgccgctg cagctcgccc tcgccgtcgc caccctcctc 660

tgggcgctcc gcctcggcgc gctcccgggc ctcgtgcccc tcgtcgcctt cggcttcctc 720

aacgtgccgt tcgccagggc cctccagggc taccagtcca ggttcatggc ggcgcaggac 780

ggccggctcc ggtcgacgtc ggaggccctc gccggcatga gggccatcaa gctccagtca 840

tgggagggcg cgttccggcg agccgtcgag tcgcgcctcg gcggcgagtt cgcgtggctg 900

agggaggcgc agctgaagaa ggcctacggc gccgtgctct actgggcggc gcccaccgtg 960

gtgtccgccg tcatgttcgc cgccacggcc gccgccggca gcgcgccgct cgacgccggc 1020

acggtgttca ccgcgctcgc cgcgctcagg gccatgtcgg agccggtgag gatgctgccg 1080

gaggccatga cgatgatgat ccagtacaag gtgtcgctgg aacgcatcgg gaggttcctc 1140

gccgaggagg agatcaaaca ggacgacgtg acgagagcgg cgacgacgac gacgacgacg 1200

aagaattcgg atgcgggaat catccatgtc caggatggaa gcttcagctg gagtgggagt 1260

gaagctgagc tgacactgaa gaatgctcac ctcagcattc gcagagggga gaaggtggca 1320

gtttgtggcc cggttggctc agggaaatct tcactcctct gtgcattgct tggggagata 1380

cctagaacat caggaatgag tggcactgtt cgcgacaaca tcctcttcgg gaagcccttc 1440

gagaacttcg accatggaga cctgacagag atcggccaga gaggaatcaa catgagcggt 1500

ggtcagaagc agaggattca gctggccaga gccgtgtaca gtgatgcaga tgtgtacctc 1560

ctagatgatc ctttcagcgc ggtcgatgcg cacaccgctg cggttctgtt ctatgtaaga 1620

gcactttcag agaagactgt agttcttgtg actcaccagg ttgaatttct caccgagact 1680

gatcggattc tggtaatgga agatggttat gtcaaacaac aaggtgttta cgcagagcta 1740

atggaatccg ggacagcatt tgagaagctt gtctcagctc acaagtcctc aatcacagca 1800

ttggatgatt ccagccagca aagccaagtc caggagcaaa atgtgactga tgaaaataca 1860

tcaggacaac cttctgcaaa atacatcagt gatattgatt caatctctgc aaaaggccaa 1920

ccttctgcaa cccagctcac agaagaggaa gaaaaggaga ttggagacct tggatggaag 1980

ccatataagg actacatcaa tgtgtccaag ggaatcacac atctctgtgt gatgggtgtt 2040

actcaggtgc tcttcacatc cttccagatg atggccacat tctggctggc agtggctgtc 2100

cagatgaacg tcagtagtgc tctcctggta ggggcatatt cagggctgtc catcttgagc 2160

tgctgctttg cctatatcag aaccctttat gcagctaagt tggggctcaa ggcctccaaa 2220

gcattcttta ccggcctaat ggattctgtg ttcaaggccc ccatgtcttt ctttgattca 2280

acaccggttg gaagaatctt gacaagggca tcttcagatt taagcatcct ggactttgac 2340

ataccttact ccgtggctta tgtcgtcgtt ggcgctacaa gagatctagc aagaatcaat 2400

ggaacaacaa aggcaccagt catgaactat gcggcggaat caattcttgc tgtggtgacc 2460

atcaggtctt ttggggaaac agacaggttc atccgcaata acctacttct tatcgatacc 2520

gacgcgacat tgttcttcca cacagttgcg gcgcaagagt gggttctcat aagagtagaa 2580

gcactgcaga gcctgacact actaacagca gcactgctcc ttgttttggc tcctccagga 2640

gcagtctcac caggctttgc gggtctcagc ctctcctttg ctttgtcgct gacagcagtt 2700

caggttttcc tgacaaagtt ctactcctac atggaaaact atattatttc agttgagaga 2760

ataaagcagt atatgcacct tccaccagag cctccagcca ttataccaga gaatagggct 2820

ccaagttcat ggccacagga gggacaaatt gacctgcaag atctcaaggt cagataccgc 2880

ccaaacatgc ctcttgtcct caaaggaatc acttgcacat ttcctgctgg aaacaaaatt 2940

ggggttgtag ggagaacggg aagtgggaaa tcgacactca tcagctcatt gttccgcctc 3000

gttgatcctg cgggtgggag gatactcatt gacaacttgg atatcagctc tattggtctc 3060

aaggatctaa gaacaaaact gagcattatc ccccaagaac ctacactttt cagaggaact 3120

gtgcgcaaca acttggatcc tcttggtctg cattccgatg aagagatatg ggaggccttg 3180

gagaagtgtc aactacagac agccattcgc agcacacctg ctcttcttga tacagtagtg 3240

agtgatgatg gcagtaactg gagtgttggg cagcggcagc tcttctgtct tggcagagtt 3300

ctcctccgta ggaacaagat tcttgtgtta gatgaagcaa cggcatccat cgactccgca 3360

actgatgcaa tcattcagag ggtcatcagg cagcaattct caagttgcac tgtggtaact 3420

atcgctcaca gggttccaac tgtaacagac agtgacaagg tcatggtact ttcatatggg 3480

aagcttatag aatatgacac gcccgccaag ttgttggaag ataaacaaac agcctttgct 3540

aaacttgtgg ctgaatattg ggctaattcc aagcggaatg caacatga 3588

<210> 3

<211> 4482

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays L.)

<400> 3

atgttagcgg ccgtaatggc tgatagcggc gatgcggcca tggccgttgt tcttggctgg 60

tcgtcatctt ggatctgcgg ggaagaggac ggcgggcggc tcaccctcac cgtcgcgtcc 120

aagtgcgtgc agaggacact catagactgc gtcaatgtgg tcctgttcat cgcgtacgtc 180

tgcacgctgg ctgccgcctg cgtcaggcgg cggcagcgct ctgcagatgc gagcagcggg 240

aggagcggcg ctcctagtag gtgggtgctg ctcgtcgtct ccacgtgctg cgtggcagct 300

gccgtggcct actgtgtcac ggctctccaa gacgcctacg acatcaagac ggcggttcct 360

tacttcgtca ggggcctggt ctggatcgcg ctggcggcct cgctgcacgc ccagccgacg 420

aggccggcga gggtcgtggc cgtgctctgg tgggtgctct tgtcgctgct ggccaccgcg 480

tacaattcgg agatccttgc cggggggcac agcctggacc tcgcggagat gattgcgtgg 540

ccggtgagcc tcctcctgct gctctgcgcc ctcggctccc tgctgccgcg gggcgacggg 600

caccactacc gggacgcctc caacggcagc agcggcttgt cggagcctct gatcggcaat 660

gacagaaccg tgccaacctc ggagttgtac cgcgctggcc tgttcggcca gcttgccttc 720

tcgtggttga accctctgct ccgtgtcggc cgctccaagg cgctggacct cggcgacatc 780

ccgctcatcg ccaccgacga caccgcgcac cacacgtcgc agcagttcac ggaggcctgg 840

agccgccacg tgagcgacaa agccaggagc cgccggggcg tgggcagcaa cagcctcgcc 900

ctcgtcttgg gcaagtgctt cctcagcgag atcctgctca ccggcttcta cgccttcctg 960

agaatgctgt ccatagcagt tgcccccctg ctgctcttcg ggttcgtgtg gtacagcaac 1020

caggaggaac gagacctccg ggtcggcctg tcccttgtcg gctgcctgct gctcgccaag 1080

ctcgtggagt cgctgtcgca gcggcattgg ttcttcagct cgaggaggac cgggatgcgt 1140

atccggtcag cgctgatggc ggtcatcttc cagaagcagc tcaggctgtc cattcagggg 1200

aggaacaacc actccactgg cgagattgtc aactacattg cggttgatgc gtaccggctt 1260

ggcgacgcca tcagctggct gcacatgggg tggacctcgc cacttcagct cgtctttgca 1320

gttgccacgc tcttctgggc actcaagctt ggggctcttc ctggtctagt cccgctagtc 1380

atctttggtt tcctcaacgt gccattcgcg aaaatgctgc aggggtacca ggccaagttc 1440

atggttgcac aggacgagag gctccggtcc acgtcggaga tactcaacag catgaagatc 1500

atcaagctgc agtcgtggga agacaagttc cgcagcacga tcgagtcgct cagggacggc 1560

gagttcaaat ggctgaggca gacccagatg aagaaggcct atggtgcagt catgtactgg 1620

atgtccccga cggtcgtctc tgctgtcatg tacacagcaa cggccatcat ggggagtgct 1680

cccctgaatg ctagcacgct cttcacggtc ttggccaccc tgagggtaat gtctgagcca 1740

gtgaggatgc ttccggaggt cctcacaatg atgatccagt acaaggtggc attagatcga 1800

attgagaagt tccttctcga agacgagatc agagaggacg atgtgaaaag ggtaccttca 1860

gatgactctg gtgtcagagt tcgagtccaa gccggaaatt tcagctggaa ggcaagcgga 1920

gctgatctgt cactgaggaa tgttaacctt cgcgtgaacc gaggagagaa ggtggccgta 1980

tgcggcccag ttggctcagg gaaatcttca ctcctgtatg cattacttgg ggagatacca 2040

agattatcag gatcagttga agtttttggt tcagtagcat acgtttcaca gagctcgtgg 2100

atacagagtg ggactgttcg tgacaacata ctctttggga agcctttcaa caaggaactg 2160

tatgataagg cgatcaaatc ttgtgctctg gacaaggata tcgaaaattt tgaccatgga 2220

gacctcacag agatcggtca gagaggactg aacatgagtg gaggccagaa gcaaaggatt 2280

cagctggctc gagccgtcta cagtgatgca gatgtttatc tactggatga cccattcagt 2340

gcagttgatg cgcataccgc tgcagtcctt ttctatgaat gtgtgatgac agcacttgca 2400

gagaagactg tcgtccttgt gacccaccag gttgaatttc tgactgaaac cgataggatt 2460

ctggtaatgg aaggtggtca agttagtcaa caagggaaat attcagaact cctgggatct 2520

gggacagcat ttgagaaact ggtgtctgct caccagtctt cgatcacagc attggatacc 2580

agtgctagcc aacagaacca agttcaaggg caacaagagt ctgatgaata catagtgcca 2640

agtgcgcttc aggttataag gcaggccagc gacatcgacg tgaccgcaaa gggcccttca 2700

gcagcaatac agcttacaga agaggaagag aagggcattg gcgacctggg atggaagcca 2760

tacaaagaat atataaatgt atccaagggg gctttccaat tctctggcat gtgtattgct 2820

caagtgctct tcacgtgctt ccagatcgca tccacatatt ggttggcagt ggctgttcag 2880

atgggtaacg tcagtgctgc acttcttgtt ggggcatatt ctggactctc tatcttcagc 2940

tgcttctttg cctactttag aagctgtttt gcggctattc tgggtctcaa ggcctccaaa 3000

gcattctttg gcgggctaat ggactccgta ttcaaggctc ccatgtcatt ttttgactca 3060

acaccagtgg gaagaatttt aacgagggca tcttcagatt tgagcattct agacttcgac 3120

ataccttact ccatggcttt tgtggcgacg ggcggcattg aggttgttac cacagtactg 3180

gtcatgggta ctgtaacttg gcaagtcctg gttgtagcga tcccagttgc tgtcaccatg 3240

atatatgttc agaggcacta cgtttcctca gctagggagc tagtaagact caacggaaca 3300

acaaaggcac ctgtaatgaa ctatgcatca gaatcaattc tcggtgtggt gacgatcagg 3360

gcatttgcag caactgagag gtttatctac agcaacatgc agctcatcga cactgatgcc 3420

acactgttct tccataccat tgccgcacaa gagtgggtac tcataagagt agaggcactg 3480

cagtccttga caataatcac agcagcattg ttccttgttc tggttcctcc aggagcaatt 3540

tctccgggct ttgcaggact ttgtctctcc tatgctttga ctttaacttc agcacaaata 3600

ttcttgacaa ggttctattc gtacttggaa aactacatca tctcggttga acgaatcaag 3660

cagtatatgc acctcccagt ggagccacct gccattatac cagatagtag acctccaact 3720

tcgtggccgc aggagggaag gatagacctg caagatttga agataagata ccgtccaaat 3780

gcgccgcttg tcctcaaagg aatcacttgc acttttgctg ctgggaacaa gattggggtt 3840

gtagggagga caggaagtgg aaaatcaaca cttatcagct cattgttccg tctcgttgat 3900

ccggcgggtg ggaggatact tattgacaag ttggatattt gctccattgg ccttaaggat 3960

ctaagaacta aactaagtat tatccctcaa gaacctacac ttttcagggg aaccgtgcgc 4020

aacaatttgg atccccttgg ccagcattct gatgaagaga tatgggaggc cttggagaag 4080

tgtcaactga agacagcaat cagcaccacc tctgctcttc tggatacagt tgtgagtgat 4140

gatggcgata actggagtgc tggacagcgt cagctcttct gtcttggcag agttctccta 4200

cgcaggaaca aaattctagt tctagacgag gcaacagcat ccatcgactc tgcaacagat 4260

gcaatcctgc agaaagtaat caggcagcag ttctcaagtt gcacggttat aaccatagct 4320

cacagggtac caactgtgac agacagtgac aaggtcatgg tcctgtccta cgggaagctt 4380

ctagaatatg aaacaccagc caagctgttg gaagacaaac aatcagcatt tgctaaactt 4440

gtggctgagt attgggctaa taccaagaga aattcaacat ga 4482

<210> 4

<211> 4394

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 4

atggatctat atgcagatga tttctcatgg acttgtctga aggattttga attcacttct 60

ttctgttcgc aaagaaccac aatagacacc ataaatctac tttttgtgtg tttcttctac 120

acgtctatga ttatcagtat aatcagaaga tgttctataa gttgtagttt caggacaaaa 180

tggactttcc ttgttgcctc tatctgctgc gctattatta gcattgcttt ttacagtatt 240

ggcttgtgga ttctcatagt caaaactgat aacaccaagc aactgagctg ggtagcttgc 300

gttgtcagag gatttgtttg gacttctttg gcagtttctc tgcttgttca gagagaaaaa 360

tggatcaaaa ttctgaactg tgcctggtgg acatgttcct gtgtactggt ttcatctctc 420

atcatagaga ttctgttgag aaagcatgca atagaaattt ttgatatagt acaatggctt 480

acacacttcc ttcttctgtt ttgtgccttc caaaatctat gttactatgt ctctcaaagt 540

ctgccagaaa gcttatctga accactgtta gctcaagaag ttgacactaa acaaacagaa 600

ctaggccata gtacctttct cagcaaattg actttctctt gggttaactc cttactccgt 660

ctgggttact caaagccact agctcttgaa gacatccctt cccttctttc tgaagatgaa 720

gcagaatttg cgtaccaaaa ctttatgcat acatgggaat cccttgtaag ggagagtagc 780

aaggacaata ccaaaaactt ggttctctgg tctgttgtta gaactcactt aaaagagaac 840

atactcatag ctttttatgc actacttaga accatagctg tgactgtttc gcctttaata 900

ctttatgctt ttgtcaacta ctcaaatagc agggatgcca agcaaacaaa tctcaaagaa 960

ggtctttcca tagttggttt tcttattctc tccagagtgg ttgattctgt gtcccagaga 1020

cattggtttt ttgattccag gagatcagga ttgaagataa gatcagctct gatggtggca 1080

gtgtataaaa aacagctaaa gctttctagc tcggcaagga gaaggcactc aacaggtgaa 1140

attgtgaatt acattgctgt tgacacatat cgtatgggag aatttccatg gtggtttcat 1200

atatcatgga cttctgcagt acaacttgtt ctctctgttg gtgtcctttt tggtgttgtt 1260

ggtgttggtg ctcttcctgg tttagtccca cttgttatat gtggacttat caatgtacca 1320

tttgctaaga tcctacaaca ttgtatggca cagttcatga tttcacagga tgagcgtctt 1380

agatcaactt cagaaattct gaatagcatg aaaatcatta agttacaatc ctgggaggac 1440

aaattcaaga atttggttga gaacctacgt gctaaagagt tcatctggct gtctaagtca 1500

cagatgatga aatcttatgg aacatttctg tattggatgt cacctaccat cgtttctgct 1560

gttgttttcc tcggttgtgc tcttttcaat agtgccccgt tgaatgctgg aaccattttc 1620

acagtttttg caacgttgag gaacttgtca gaacctgttc gaatgattcc agaggctcta 1680

tccatgatga tccaagttaa ggtatccttt gatcgtctca ataccgtttt gcttgatgaa 1740

gagctagata gtagcaatgc taacagaaga aatataaacc aaagttcggt taatgctgtg 1800

gaaatccaag ccggaaattt catttgggat cacgaatcag tatttccaac tttaagagat 1860

gtgaatttac aaattgaaca aggacagaaa atcgcagttt gtgggcctgt tggcgctgga 1920

aaatcatctc ttttatttgc agtacttgga gagtttccaa agatctcagg aaccgttaat 1980

gtgtctggca ctgtagccta tgtttctcaa acttcttgga tacaaagtgg gacagttcga 2040

gataatatac tctttggaaa gccaatggac aaaacaagat atgatgatgc cattaaagtt 2100

tgtgctttag acaaggatat taatgatttt agccatggtg atctgactga aataggtcag 2160

cgagggatta acatgagtgg aggacaaaag caaaggattc aactagctcg tgcagtctac 2220

aatgacgctg acatctatct ccttgatgac cctttcagtg cagttgatgc tcacactgct 2280

gctatcctct tcaatgactg tgtaatgatg gctctaagag agaaaacagt cattctagtc 2340

actcatcaag tggagtttct ctcacaagtg gatacaatcc tggtaatgga aggtggaaaa 2400

gttactcaag caggtaatta tgtgaatctc ttgacatctg ggacagcctt tgaacaactt 2460

gtgagcgctc ataaggaagc aatttcagag ttggaacaaa ataatgaaaa caaaactcat 2520

acagaagagt ctcaaggttt ttatctcact aaaaaccaaa gtgaggggga gatttcttac 2580

aagggtcaac ttggggtaca gcttacacaa gaagaagaaa aagagattgg tgatgttggc 2640

tggaagacaa tctgggatta tatttcattt tccaggtgtt caatgatgct gtgttggatc 2700

atattgggac aatttgcttt tgttgtttta caggctgcgt caacgttttg gcttgttcaa 2760

gccattgaaa ttccaaaatt aagtagtgtc accttgattg gagtttactc attaatttca 2820

tttggtggta ctgtatttgc atttctaagg actagcattg gtgcacacct cggattaaaa 2880

gcttctacag ccttcttctc aagtttcact acttctatct tcaatgctcc tatgctgttc 2940

tttgattcaa cccctgtagg aaggatttta acccgcgcat catcagattt aactattttg 3000

gactttgata tacccttttc catcactttt gtagcttctg ttccaattga aattttgatg 3060

ataattggta taatggttta cgtaacatgg caagttctca ttgttgctgt tccagcaatg 3120

gttgcatcaa aatatgttca gggatattat caagcctcag caagggaatt gataaggatt 3180

aatggaacca caaaagctcc tgtcatgaat tttgcagctg agacatcact tggattggtt 3240

actgtaagag catttaatat ggcagacaga ttttttaaaa attacttaaa acttgtggac 3300

acagacgcag cactgttctt ttattctaat gcggccatgg aatggttagt tttaaggatt 3360

gaaactcttc aaaatttgac agtcatcact gcagctttgc tgcttgttct agttcctcag 3420

ggatacgtgt ccccaggcct tgtggggctg tctctctctt atacattcac cttgacagga 3480

acccaaatat ttttgactcg atggtattgc aacttattaa actatattat ctctgttgag 3540

agaatcaagc aattcattca gcttccagaa gagcctcctg ccattgtgga ggacaaccgg 3600

cctccatctt catggccttc caaaggcagg attgaccttc aagccttaga gataagatat 3660

cgtcctaatg ctccattagt gcttaagggt atcacttgta cgtttaagga aggaagtaga 3720

gtgggagttg taggaaggac tggaagtgga aaaagtacgc tcataagtgc tctttttcgc 3780

ttagttgagc cagcaagtgg tgatattctt atagatggga ttaacatatg ctcaataggg 3840

ttgaaggatt tgaaaataaa gctaagcatc atccctcaag aaccaactct tttcaaggga 3900

agcattagaa ccaacttgga ccctctaggc ctgtactcag atgatgattt atggaaggca 3960

ttagaaaaat gtcagcttaa ggaaactatc agccgtctac caaatctctt ggactctttg 4020

gtgagtgatg aaggtggaaa ttggagcttg ggacagcgcc aactattttg tcttggaaga 4080

gtactactta agaggaacag aattctagtt ctggatgaag ctaccgcatc cattgactct 4140

gccacagatg ccattctaca acaaataatt agacaagaat ttgccaaatg cacagttata 4200

acagtggctc acagggttcc aactgtaata gatagtgaca tggtcatggt cctctcctat 4260

gggaaacttg tggaatatga tgagccttca aagctaatgg acaccaactc ctcgttctct 4320

aagctggtag ctgaatattg gtccagctgc agaaagaatt ctccacaaac gttagcaggc 4380

agcaacattg aata 4394

<210> 5

<211> 1432

<212> PRT

<213> 稗草(Echinochloa crusgalli)

<400> 5

Met Ala Val Leu Gly Trp Ser Pro Ser Trp Ala Cys Gly Arg Leu Thr

1 5 10 15

Val Ala Ser Pro Cys Val Gln Arg Ala Leu Ile Asp Cys Val Asn Gly

20 25 30

Ala Leu Leu Val Ala Tyr Ala Ala Ala Leu Val Ala Ala Ala Cys Ala

35 40 45

Arg Arg Arg Arg Trp Ala Ser Ala Ala Gly Arg Ser Ser Gly Asp Thr

50 55 60

Arg Trp Trp Arg Trp Gly Leu Ala Leu Val Ser Ala Cys Cys Val Ala

65 70 75 80

Ala Ala Val Gly Tyr Gly Val Asp Gly Phe Gln His Ala Ser Asp Ala

85 90 95

Ala Ala Ala Ala Ala Pro Cys Phe Phe Arg Ala Leu Val Trp Ile Ala

100 105 110

Leu Ala Thr Ser Leu His Val Lys Pro Ser Arg Pro Ala Ala Ala Val

115 120 125

Ala Val Leu Trp Trp Ala Leu Phe Ser Leu Leu Val Thr Ala Tyr Asn

130 135 140

Ala Asp Ile Leu Ile Gly Gly Gly Ala Leu Asp Val Ala Glu Met Val

145 150 155 160

Ala Trp Pro Val Asn Leu Leu Leu Leu Leu Cys Ala Leu Gly Ser Val

165 170 175

Leu Arg Arg Arg Ser Arg Gly Arg His His Asp Ala Ser Gly Asp Asn

180 185 190

His Asn Gly Gly Leu Ser Glu His Leu Ile Gly Lys Asp Asp Asp Glu

195 200 205

Ala Ala Val Pro Thr Ser Glu Leu Tyr Arg Ser Gly Leu Phe Arg Gln

210 215 220

Leu Ala Phe Ser Trp Leu Asn Pro Leu Leu Arg Leu Gly Arg Ser Lys

225 230 235 240

Ala Leu Asp Leu Ala Asp Ile Pro Leu Ile Ala Gly Glu Asp Thr Ala

245 250 255

Glu His Ser Ser His Lys Phe Ala Glu Ala Trp Ser Arg His Val His

260 265 270

Gly Lys Ala Arg Thr Arg Arg Ser Val Gly Arg Asn Ser Leu Ala Leu

275 280 285

Val Leu Gly Lys Cys Phe Leu Gly Glu Ile Leu Leu Thr Gly Phe Tyr

290 295 300

Ala Phe Leu Arg Thr Leu Ser Ile Ala Val Ala Pro Leu Leu Leu Phe

305 310 315 320

Ala Phe Val Trp Tyr Ser Asn Gln Glu Val Arg Asp Leu Arg Val Gly

325 330 335

Leu Ala Leu Val Gly Cys Leu Leu Leu Met Lys Leu Val Glu Ser Leu

340 345 350

Ser Gln Arg His Trp Phe Phe Asp Ser Arg Arg Thr Gly Met Arg Ile

355 360 365

Arg Ser Ala Leu Met Ala Val Ile Phe Gln Lys Gln Leu Arg Leu Ser

370 375 380

Ser Gln Gly Arg Lys Asn His Ser Thr Gly Glu Ile Val Asn Tyr Ile

385 390 395 400

Ala Val Asp Ala Tyr Arg Leu Gly Asp Ala Ile Ser Trp Leu His Met

405 410 415

Gly Trp Ser Ser Pro Leu Gln Leu Val Phe Ala Val Ala Thr Leu Phe

420 425 430

Trp Ala Leu Lys Leu Gly Ala Leu Pro Gly Leu Val Pro Leu Val Ile

435 440 445

Phe Gly Phe Leu Asn Val Pro Phe Ala Lys Ile Leu Gln Gly Tyr Gln

450 455 460

Ala Lys Phe Met Val Ala Gln Asp Glu Arg Leu Arg Ser Thr Ser Glu

465 470 475 480

Ile Leu Asn Ser Met Lys Ile Ile Lys Leu Gln Ser Trp Glu Glu Lys

485 490 495

Phe Arg Asn Met Val Glu Ser Leu Arg Asp Gly Glu Phe Lys Trp Leu

500 505 510

Arg Glu Thr Gln Met Lys Lys Ala Tyr Gly Ala Val Met Tyr Trp Met

515 520 525

Ser Pro Thr Val Val Ser Ala Val Met Tyr Thr Ala Thr Ala Ile Met

530 535 540

Gly Ser Ala Pro Leu Asn Ala Ser Thr Leu Phe Thr Val Leu Ala Thr

545 550 555 560

Leu Arg Val Met Ala Glu Pro Val Arg Phe Leu Pro Glu Ile Leu Thr

565 570 575

Met Met Ile Gln Tyr Lys Val Ser Leu Asp Arg Ile Glu Arg Phe Leu

580 585 590

Leu Glu Asp Glu Ile Arg Glu Glu Asp Val Lys Arg Val Pro Ser Asp

595 600 605

Asn Ser Asp Ile Arg Val Gln Val Gln Asp Gly Asn Phe Ser Trp Asn

610 615 620

Ala Thr Gly Ala Asn Leu Val Ala Tyr Val Ser Gln Asn Ser Trp Ile

625 630 635 640

Gln Ser Gly Thr Val Arg Ala Asn Ile Leu Phe Gly Lys Pro Phe Asn

645 650 655

Lys Glu Leu Tyr Glu Lys Ala Ile Lys Ser Cys Ala Leu Asp Lys Asp

660 665 670

Ile Glu Asn Phe Asp His Gly Asp Leu Thr Glu Ile Gly Gln Arg Gly

675 680 685

Leu Asn Met Ser Gly Gly Gln Lys Gln Arg Ile Gln Leu Ala Arg Ala

690 695 700

Val Tyr Asn Asp Ala Asp Val Tyr Leu Leu Asp Asp Pro Phe Ser Ala

705 710 715 720

Val Asp Ala His Thr Ala Ala Val Leu Phe Tyr Asp Cys Val Met Thr

725 730 735

Ala Leu Ala Gln Lys Thr Val Val Leu Val Thr His Gln Val Glu Phe

740 745 750

Leu Thr Glu Thr Ser Arg Ile Leu Val Met Glu Gly Gly Gln Val Ser

755 760 765

Gln Gln Gly Lys Tyr Ser Glu Leu Leu Glu Ser Gly Thr Ala Phe Glu

770 775 780

Lys Leu Val Ser Ala His Gln Ser Ser Ile Thr Glu Leu Asp Thr Ser

785 790 795 800

Ala Ser Gln Gln Asn Gln Val Gln Gly Gln Leu Val Pro Asp Glu Asn

805 810 815

Ile Val Pro Ser Ala Leu Gln Ala Thr Arg Gln Ala Ser Asp Ile Glu

820 825 830

Val Ala Ala Lys Gly Pro Ser Ala Ala Ile Gln Leu Thr Glu Glu Glu

835 840 845

Glu Lys Gly Ile Gly Asp Leu Gly Trp Lys Pro Tyr Lys Asp Tyr Ile

850 855 860

Asn Val Ser Lys Gly Val Phe Gln Phe Ser Gly Met Cys Thr Ser Gln

865 870 875 880

Val Leu Phe Thr Cys Phe Gln Ile Ala Ser Thr Tyr Trp Leu Ala Val

885 890 895

Ala Val Gln Met Asp Asn Val Ser Ala Ala Leu Leu Val Gly Ala Tyr

900 905 910

Ser Gly Leu Ser Ile Phe Ser Cys Phe Phe Ala Tyr Phe Arg Ser Leu

915 920 925

Phe Ala Ala Val Leu Gly Leu Lys Ala Ser Lys Thr Phe Phe Ser Gly

930 935 940

Leu Met Asp Ser Val Phe Lys Ala Pro Met Ser Phe Phe Asp Ser Thr

945 950 955 960

Pro Val Gly Arg Ile Leu Thr Arg Ala Ser Ser Asp Leu Ser Ile Leu

965 970 975

Asp Phe Asp Ile Pro Tyr Ser Met Ala Phe Val Thr Thr Gly Ser Ile

980 985 990

Glu Val Val Thr Thr Val Leu Val Met Gly Thr Val Thr Trp Gln Val

995 1000 1005

Leu Val Val Ala Ile Pro Val Thr Ile Thr Met Val Tyr Val Gln Arg

1010 1015 1020

Tyr Tyr Val Ser Ser Ala Arg Glu Leu Val Arg Ile Asn Gly Thr Thr

1025 1030 1035 1040

Lys Ala Pro Val Met Asn Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Leu Gly Val Val

1045 1050 1055

Thr Ile Arg Ala Phe Ala Ala Thr Glu Arg Phe Ile Arg Ser Asn Met

1060 1065 1070

Gln Leu Ile Asp Thr Asp Ala Thr Met Phe Phe His Thr Val Ala Ala

1075 1080 1085

Gln Glu Trp Val Leu Ile Arg Val Glu Ala Leu Gln Ser Leu Thr Ile

1090 1095 1100

Ile Thr Ala Ala Leu Phe Leu Val Leu Val Pro Pro Gly Val Ile Ser

1105 1110 1115 1120

Pro Gly Phe Ala Gly Leu Cys Leu Ser Tyr Ala Leu Thr Leu Thr Ser

1125 1130 1135

Ala Gln Val Phe Leu Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Leu Glu Asn Tyr Ile

1140 1145 1150

Ile Ser Val Glu Arg Ile Lys Gln Tyr Met His Leu Pro Ala Glu Pro

1155 1160 1165

Pro Ala Ile Ile Pro Glu Asn Arg Ala Pro Thr Ser Trp Pro Gln Glu

1170 1175 1180

Gly Arg Ile Asp Leu Gln Asp Leu Lys Ile Arg Tyr Arg Pro Asn Ala

1185 1190 1195 1200

Pro Leu Val Leu Lys Gly Ile Thr Cys Thr Phe Ala Ala Gly Asn Lys

1205 1210 1215

Ile Gly Val Val Gly Arg Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr Leu Ile Ser

1220 1225 1230

Ser Leu Phe Arg Leu Val Asp Pro Ser Cys Gly Arg Ile Leu Ile Asp

1235 1240 1245

Lys Leu Asp Ile Cys Ser Ile Gly Leu Lys Asp Leu Arg Thr Lys Leu

1250 1255 1260

Ser Ile Ile Pro Gln Glu Pro Thr Leu Phe Arg Gly Thr Val Arg Asn

1265 1270 1275 1280

Asn Leu Asp Pro Leu Gly Leu His Ser Asp Gln Glu Ile Trp Glu Ala

1285 1290 1295

Leu Asp Lys Cys Gln Leu Lys Thr Ala Ile Ser Ser Thr Pro Asp Leu

1300 1305 1310

Leu Asp Thr Val Val Ser Asp Asp Gly Asp Asn Trp Ser Ala Gly Gln

1315 1320 1325

Arg Gln Leu Phe Cys Leu Gly Arg Val Leu Leu Arg Arg Asn Lys Ile

1330 1335 1340

Leu Val Leu Asp Glu Ala Thr Ala Ser Ile Asp Ser Ala Thr Asp Ala

1345 1350 1355 1360

Ile Leu Gln Lys Val Ile Arg Gln Gln Phe Ser Ser Cys Thr Val Ile

1365 1370 1375

Thr Ile Ala His Arg Val Pro Thr Val Thr Asp Ser Asp Arg Val Leu

1380 1385 1390

Val Leu Ser Tyr Gly Lys Leu Leu Glu Tyr Glu Thr Pro Ala Lys Leu

1395 1400 1405

Leu Glu Asp Lys Gln Ser Ala Phe Ala Lys Leu Val Ala Glu Tyr Trp

1410 1415 1420

Ala Asn Thr Lys Arg Asn Ser Thr

1425 1430

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

catgtcctga tacaatggta gg 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcggcaatgg cagataagta 20

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgttacttct gcagggtacc atggccgttc ttggctgg 38

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cggatccata acgcgttcat gttgaattcc gcttggt 37

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgttacttct gcagggtacc atggccggcc ggagcggc 38

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cggatccata acgcgttcat gttgcattcc gctt 34

<210> 12

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttctgcaggt cgactctaga ggatccatgt tagcggccgt aatggctga 49

<210> 13

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tttgaacgat cggggaaatt cgagctctca tgttgaattt ctcttggtat ta 52

<210> 14

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gagagaacac gggggactct tgaccatgga tctatatgca gatgatttct ca 52

<210> 15

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cgatcgggga aattcgagct ggtcacctta ttcaatgttg ctgcctgcta ac 52

Claims (10)

1.一种抗除草剂基因，为ABC转运蛋白基因ABCC8。

2.根据权利要求1所述的抗除草剂基因，该基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示，以及与SEQ ID NO:1所示序列具有不小于71％相同性的序列中的任意一条。

3.根据权利要求1所述的抗除草剂基因，其特征在于，所述的除草剂包括草甘膦。

4.权利要求1或2或3所述的抗除草剂基因编码的多肽。

5.一种抗除草剂基因表达载体，其特征在于，包含权利要求1或2或3所述的抗除草剂基因。

6.权利要求1或2或3所述的抗除草剂基因在植物抗除草剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将抗除草剂基因转入植物中进行表达，使植物获得抗除草剂能力。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的植物包括水稻、玉米、棉花、小麦、大豆、草坪草或牧草。

9.权利要求1或2或3所述的抗除草剂基因在获得抗除草剂植物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将表达抗除草剂基因的载体转入植物中表达。

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