CN111944746A

CN111944746A - 一种热刺激诱导细胞凋亡的方法

Info

Publication number: CN111944746A
Application number: CN202010772194.2A
Authority: CN
Inventors: 杨勇; 杨佳; 容蓉; 马青云; 于钦辉
Original assignee: Shandong University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Shandong University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2020-08-04
Filing date: 2020-08-04
Publication date: 2020-11-17
Anticipated expiration: 2040-08-04
Also published as: CN111944746B

Abstract

本发明属于细胞生物学技术领域，涉及一种热刺激诱导细胞凋亡的方法，具体为采用PCR控温系统作为热刺激来诱导细胞凋亡的方法。本发明采用梯度逐渐升温的方式；所述的梯度逐渐升温为温度升高后停留一段时间；升到目标温度后，保持一段时间后梯度逐渐降温。本发明建立了基于PCR精确控温系统梯度逐渐升温模式诱导细胞发生凋亡的模型，该方法早期凋亡率大于晚期凋亡率+坏死率，且重现性、稳定性好。早期凋亡率高可以实现对药物的效果验证及相关凋亡蛋白的检测；采用热刺激方法致细胞凋亡可用来模拟机体因多种原因（病原微生物感染、机体炎症反应、一些恶性类的肿瘤疾病等）导致的发热，这种发热导致的热刺激会对机体的心肌细胞等造成损伤。

Description

一种热刺激诱导细胞凋亡的方法

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，涉及一种热刺激诱导细胞凋亡的方法，具体为采用PCR控温系统或类似的精确控温装置作为热刺激来诱导细胞凋亡的方法。

背景技术

细胞凋亡的概念被提出是用于描述形态学上不同的细胞死亡方式。细胞凋亡被描述为一种独特的细胞死亡途径，细胞主动参与自身清除。对于细胞凋亡的研究，重复和稳定性的方法至关重要。引起细胞凋亡的因素有很多，如化学因素（过氧化氢、二硫苏糖醇、脂多糖、毒物等）、物理因素（缺氧、机械性损伤、高温、低温、电流等）、生物因素（各种致病菌、病毒、寄生虫、氧化低密度脂蛋白、融合蛋白、单克隆抗体）和变态反应等。

热刺激可以诱导许多细胞系的凋亡，但严重的热应激会对生物体及其器官产生负面影响，导致热休克，甚至导致猝死。热刺激诱导的活性氧的产生与各种细胞类型的凋亡有关。热刺激可通过内源性和外源性途径诱导细胞凋亡。大多数据表明，热刺激可通过激活固有的凋亡通路杀死细胞。例如，Bid是一个促凋亡的Bcl-2家族成员，通过Bax/Bak凋亡途径诱导热疗后细胞凋亡，这与它作为Bax和Bak直接激活剂的既定作用一致。对于外源性通路，热刺激对细胞骨架的影响因热刺激的温度和时间的不同而不同。热刺激的信号效应也取决于细胞类型。例如，U937细胞在44°C高温下20分钟可提高Fas的表达水平，同时激活caspase-8和caspase-3。但是，在Jurkat细胞中，42°C、30 min的轻度热刺激并没有引起Fas表达水平的升高，而caspase-8被激活，这表明热应激影响了Fas受体下游的Fas信号传导。

当机体遭遇细菌、病毒侵入时或有炎症发生时，机体发生机能障碍引起机体体温的升高，这种引起机体发热的刺激成为热源性刺激物。采用热刺激方法致细胞损伤可用来模拟机体因多种原因导致的发热使细胞受损这一现象。但是，目前，研究热刺激对细胞凋亡的影响体外实验多采用水浴加热或直接将培养箱温度调至热刺激温度培养的方法，重复和稳定性差。

发明内容

针对热刺激对细胞凋亡的重复和稳定性差，且坏死率高凋亡率低的问题，本研究提供了一种热刺激诱导细胞凋亡的方法，该方法采用梯度逐渐升降温的方法，实现早期凋亡率高的效果，进一步实现对药物的效果验证及相关凋亡蛋白的检测。同时采用热刺激方法致细胞损伤可用来模拟机体因多种原因导致的发热使细胞受损这一现象。

本发明的技术方案如下：

一种热刺激诱导细胞凋亡的方法，采用梯度逐渐升温的方式，所用设备为精确控温装置；所述的梯度逐渐升温为温度升高后停留一段时间，升到目标温度后，保持一段时间后梯度逐渐降温。

所述的设备为： PCR精确控温系统。

上述方法，具体包括以下步骤：

（1）细胞培养；

（2）细胞的处理：取对数生长期的细胞，接种于6孔板中，培养，待细胞长成单层后用胰蛋白酶消化处理，加入新鲜的DMEM培养基调整细胞密度，吸取细胞悬液；

（3）诱导凋亡：热刺激步骤（2）的悬液，加热程序为从37°C开始以0.5-1.5 °C为单位梯度逐渐升温，每个温度梯度保持时间为1-2 min；升至目标温度，保持50-80min，然后梯度逐渐降温；

（4）热刺激结束后，降至37°C，转移至新的6孔板中，置于37°C、5% CO₂培养箱中继续培养，分析细胞凋亡水平。

所述的步骤（2）细胞密度为1×10⁶-2×10⁶个/ml。

所述的步骤（3）采用的是PCR控温系统。

所述的步骤（3）加热程序的最高温度到44°C。

所述的步骤（4）培养时间为10-24h。

当机体遭遇细菌、病毒侵入时或有炎症发生时，机体发生机能障碍引起机体体温的升高，这种引起机体发热的刺激成为热源性刺激物。采用热刺激方法致细胞损伤可用来模拟机体因多种原因导致的发热使细胞受损这一现象。热刺激诱导的细胞凋亡可导致心肌缺血，心力衰竭，活性氧(ROS)产生过多，最终导致死亡。

细胞凋亡发生在一个狭窄的温度窗口，见图1。随着细胞向更高的温度转移，细胞凋亡率和细胞坏死率显著提高。直接升温模式与梯度逐渐升温模式相比，梯度逐渐升温模式优于直接升温模式，两种加热方法之间的区别在于温度升高的方式。将细胞预暴露于中等温度中，如38°C，2 min；39°C ，2 min；40°C ，2 min；41°C，2 min；42°C 2 min，短暂的时间停留这样可以诱导细胞耐热性，这是由低剂量热预处理诱导的适应性存活反应，细胞对接下来的热刺激环境变得有抗性。适度的热预处理可诱导细胞对热的瞬时抵抗力，并可以抑制随后更严重的热刺激诱导的细胞凋亡。耐热性和细胞死亡是细胞对应激的独特反应且这种反应依赖于热休克蛋白（HSP）。HSP具有维持细胞蛋白质自稳定的功能，它们作为细胞内某些功能蛋白的分子伴侣在肽链的折叠和拉伸，聚合和解聚，变性蛋白的降解和去除中起重要作用。

附图说明

图1为当热负荷超过临界限度时，细胞死亡情况；

图 2为热刺激后不同培养时间对凋亡率的影响；

图3为不同加热温度加热时间对细胞凋亡率的影响；

图4为PCR控温系统梯度逐渐升温模式重复实验结果；

图5 采用实施例1的方式热刺激处理后小鼠MCM细胞生长曲线（**P<0.01）；

图 6采用对比例1的方式热刺激处理对细胞凋亡率和坏死率的影响；

图 7 采用对比例1的方式热刺激处理的重复实验结果；

图8为 PCR控温系统直接升温模式于37°C、42°C、43°C、44°C下加热60 min凋亡结果；

图9为 PCR控温系统直接升温模式于43°C下加热不同时间凋亡结果；

图10为PCR两种加热模式对细胞凋亡结果。

本发明的有益效果

本发明建立了PCR控温系统梯度逐渐升温模式诱导细胞发生凋亡的模型，该方法早期凋亡率大于晚期凋亡率+坏死率，且重现性、稳定性好。早期凋亡率高可以实现对药物的效果验证及相关凋亡蛋白的检测。本发明采用热刺激方法致细胞凋亡可用来模拟机体因多种原因（病原微生物感染、机体炎症反应、一些恶性类的肿瘤疾病等）导致的发热，这种发热导致的热刺激会对机体的心肌细胞等造成损伤。

具体实施方式

由于本发明采用的是试剂盒考察的凋亡率和坏死率，坏死率包括晚期凋亡的细胞，因此本实施例中所有的凋亡率指的是早期凋亡率，可恢复的细胞，坏死率指的是晚期凋亡率+坏死率，晚期凋亡的细胞一般不可恢复。

实施例1

一种热刺激诱导小鼠MCM心肌细胞凋亡的方法，包括以下步骤：

（1）细胞培养

配制含有10％的胎牛血清、1％的青链霉素混合液的DMEM培养基。从液氮中取出MCM细胞冻存管，放于37°C温水中，用镊子夹住轻轻摇动使其迅速融化，立即将液体倒入盛有新鲜培养基的培养皿中。在 37°C、5% CO₂中培养至细胞状态良好时进行下一步实验。

（2）小鼠MCM心肌细胞的处理

取对数生长期的小鼠MCM心肌细胞，以每孔2×10⁵个接种于 6 孔板中，置于37°C、5%CO₂培养箱中培养。待细胞长成单层后用胰蛋白酶消化处理，加入新鲜的DMEM培养基调整细胞密度为2×10⁶个/ml。吸取上述细胞悬液100 μl加入到200 μl的PCR ep管中进行水浴加热处理或者PCR加热处理。

（3）诱导凋亡

采用PCR控温系统梯度逐渐升温模式。将步骤（2）的ep管置于PCR金属加热板上，加热程序为从37°C开始以1°C为单位梯度逐渐升温，过程为：37°C ，2min；38°C，2min；39°C，2min；40°C，2min；41°C，2min；42°C，2min；43°C，60min；42°C，2min；41°C，2min；40°C，2min；39°C，2min；38°C，2min；37°C，2min。热刺激结束后，转移至新的6孔板中，每孔500 μl经热刺激处理过的已调整好细胞密度的细胞悬液。该6孔板置于37°C、5% CO₂培养箱中继续培养，培养一段时间后流式细胞仪分析细胞凋亡水平。

（4）热刺激前后小鼠MCM心肌细胞的生长曲线

向16孔金电极板中加入50 μl培养基，将16孔金电极板放到RTCA Station上动态细胞分析监测系统（RTCA）会自动进行扫描，检查是否接触良好并开始测量基线。PCR热刺激处理后细胞，加入100 μl混合均匀的细胞悬液于已经测量好基线的16孔金电极板孔中，使每孔中细胞数目为10000个/100 μl。将16 孔金电极板置于超净台中室温放置30 min，再放到培养箱中RTCA Station上，系统则开始自动扫描。

按照上述步骤，采用PCR控温系统梯度逐渐升温模式，43°C，60 min热刺激之后在37°C、5% CO₂培养箱中继续培养，在培养至18 h、20 h、22 h、24 h时流式细胞仪检测细胞凋亡情况。我们发现，22 h之前随着培养时间的延长，细胞凋亡率所占比例逐渐提升。由图2可知Q3 象限细胞粒子随着培养时间的延长逐渐向Q4象限靠近，说明培养时间的延长会使细胞状态得以改善，细胞逐渐恢复为正常状态。

同时，考察了 PCR控温系统梯度逐渐升温模式不同加热温度加热时间对细胞凋亡率的影响，由图3可知，在41°C和42°C下延长加热时间并不能有效提高细胞凋亡率，反之细胞坏死率占比超过细胞凋亡率。

同时考察了43°C，60 min重复实验结果

图4可以看出，两次实验结果显示活力细胞、凋亡细胞、坏死细胞所占百分比都较接近，差异较小，重复性好。该实验证明，PCR控温系统逐渐升温模式致细胞凋亡模型可重复，且稳定性较好。在该实验条件下，细胞凋亡率合适，细胞凋亡模型成功建立。

最后考察了43°C 60 min热刺激处理后细胞的生长曲线

结果见图5，可以看出，正常组与热损伤组细胞初始浓度一样，待细胞经过短暂的悬浮然后贴壁生长。正常组细胞在指数生长期内，斜率大于热损伤组，表明细胞活性好于热损伤组，热刺激处理之后的细胞活力有所下降。37°C处理的细胞进入平台期的时间短于43°C热刺激处理组，进入平台期后热损伤组细胞指数（Cell index CI）值低于正常对照组。

实施例2

一种热刺激诱导小鼠MCM细胞凋亡的方法，包括以下步骤：

（3）诱导凋亡

采用PCR控温系统梯度逐渐升温模式。将步骤（2）的ep管置于PCR金属加热板上，加热程序为从37°C开始以1°C为单位逐级升温，过程为：37°C ，4min；38.5°C，4min；40°C，4min；41.5 °C，4min；43°C，60min；41.5°C，4min；40°C，4min；38.5°C，4min；37°C，4min。热刺激结束后，转移至新的6孔板中，每孔500 μl经热刺激处理过的已调整好细胞密度的细胞悬液。该6孔板置于37°C、5% CO₂培养箱中继续培养，培养22 h后流式细胞仪分析细胞凋亡水平。

其余步骤同实施例1。

实施例3

一种热刺激诱导U937细胞凋亡的方法，包括以下步骤：

（3）诱导凋亡

采用PCR控温系统梯度逐渐升温模式。将步骤（2）的ep管置于PCR金属加热板上，加热程序为从37°C开始以1°C为单位梯度逐渐升温，过程为：37°C ，1 min；37.5°C ，1 min；38°C，1min；38.5°C，1min；39°C，1min；39.5°C，1min；40°C，1min；40.5°C，1min；41°C，1min；41.5°C，1min；42°C，1min；42.5°C，1min；43°C，1min；43.5°C，1min；44°C，60min； 43.5°C，1min；43°C，1min；42.5°C，1min；42°C，1min；41.5°C，1min；41°C，1min；40.5°C，1min；40°C，1min；39.5°C，1min；39°C，1min；38.5°C，1min；38°C，1min；37.5°C ，1 min；37°C ，1 min。热刺激结束后，转移至新的6孔板中，每孔500 μl经热刺激处理过的已调整好细胞密度的细胞悬液。该6孔板置于37°C、5% CO₂培养箱中继续培养，培养22 h后流式细胞仪分析细胞凋亡水平。

其余步骤同实施例1。

对比例1

（3）诱导凋亡

将步骤（2）的ep管是置于事先调整好温度的数显电热恒温水浴锅中，加热到42、43、44°C，诱导60min，然后取出降温至37℃。

其余步骤同实施例1。

水浴加热不同温度对细胞凋亡率和坏死率的影响，见图1，从图1可以看出，

与正常对照组37°C相比，当加热温度为42°C和43°C时，提高加热温度和延长加热时间并不能有效提高细胞凋亡率，相反随着加热时间的延长，坏死率占比提高。加热温度为44°C时，细胞坏死率和凋亡率较正常对照组明显提高。水浴加热43°C，加热不同时间对细胞凋亡率和坏死率的影响，见图6，从图6可以看出，细胞坏死率占比较高，且随着加热时间的延长并不能有效提高细胞凋亡率占比。

水浴加热处理44°C，60 min重复实验结果，见图7，可以看出活力细胞、凋亡细胞、坏死细胞所占比例差异较大，重现性差，证明，水浴加热致细胞凋亡模型可重复性不高，稳定性较差。

对比例2

一种热刺激诱导小鼠MCM细胞凋亡的方法，包括以下步骤：

（3）诱导凋亡

第二种加热方法，采用PCR控温系统直接升温模式。将步骤（2）的ep管置于PCR金属加热板上，加热程序如下: 4°C，2 min；43°C，60min；4°C，2 min。

其余步骤同实施例1。

同时考察了PCR控温系统直接升温模式于37°C、42°C、43°C、44°C下加热60 min凋亡结果见图8。

同时考察了PCR控温系统直接升温模式于43°C下加热不同时间凋亡结果见图9。由图9可知，在43°C条件下加热，延长加热时间并不能有效提高细胞凋亡率的占比，反之细胞坏死率占比逐步提升。加热时间到达限度之后，细胞坏死率高于细胞凋亡率。

对比实施例1及对比例2，即均采用PCR控温系统，两种升温模式下细胞凋亡结果，见图10，可以看出，PCR控温系统直接升温模式细胞坏死率为11.4%，细胞凋亡率为7.39%，细胞坏死率明显高于细胞凋亡率。PCR控温系统梯度逐渐升温模式细胞坏死率为12.8%，细胞凋亡率为30.7%，细胞凋亡率高于细胞坏死率。

对比例3 过氧化氢诱导U937凋亡方法，包括以下步骤：

（3）诱导凋亡

选择生长良好的处于对数生长期U937细胞，接种于 6 孔培养板中，给予10%胎牛血清及 1% 双抗的 DMEM培养基培养。待细胞长成单层后，加入H₂O₂（300 nmol/L）干预培养，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

实施效果：

将实施例1-3及对比例1、2与37℃空白对照组相比，采用试剂盒双染法检测细胞早期凋亡率及坏死率，结果见表1。

。

Claims

1.一种热刺激诱导细胞凋亡的方法，其特征在于，采用梯度逐渐升温的方式，所用设备为精确控温装置；所述的梯度逐渐升温为温度升高后停留一段时间，升到目标温度后，保持一段时间后梯度逐渐降温。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的设备为： PCR精确控温系统。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）细胞培养；

（2）细胞的处理：取对数生长期的细胞，接种于孔板中，培养，待细胞长成单层后用胰蛋白酶消化处理，加入新鲜的DMEM培养基调整细胞密度，吸取细胞悬液；

（4）热刺激结束后，降至37°C，转移至新的孔板中，置于37°C、5% CO₂培养箱中继续培养，分析细胞凋亡水平。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤（2）细胞密度为1×10⁶-2×10⁶个/ml。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的步骤（3）采用的是PCR控温系统或类似的精确控温装置。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的步骤（3）加热程序的最高温度到44℃。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的步骤（4）培养时间为10-24h。