CN111939318A - 一种还原氧化石墨烯丝素蛋白复合膜制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种还原氧化石墨烯丝素蛋白复合膜制备方法，包括空心纳米颗粒、高分子基质和导管壁主体，所述导管壁主体由空心纳米颗粒和高分子基质构成，所述空心纳米颗粒平均分布在高分子基质内部。该应用于亚低温脑保护治疗的介入医用导管壁结构，为全新的医用介入导管壁结构，将纳米空心材料引入医用介入导管壁中，降低导管材料导热系数，制备得到保温隔热医用导管，通过在导管壁中加入纳米空心颗粒，达到降低导管导热系数的目的；通过调控导管壁中纳米空心颗粒的体积分数，获得所需的导热系数的介入导管，上述的纳米空心颗粒均为生物惰性材料，具有良好的生物相容性，介入体内不会对人体产生毒性及引发炎症、免疫反应。

Description

一种还原氧化石墨烯丝素蛋白复合膜制备方法

技术领域

本发明涉及医用材料制备技术领域，具体为一种还原氧化石墨烯丝素蛋白复合膜制备方法。

背景技术

丝素蛋白是经过家蚕脱胶处理后得到的天然高分子纤维蛋白，主要由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和酪氨酸组成（占总量的 95%以上），作为一种天然活性蛋白，丝素蛋白在生物医用材料与组织工程领域里的应用研究受到越来越多的关注，它具有如下优点：1生物相容性好，丝素蛋白具有较低的免疫原性、良好的生物相容性、生物可降解性，对骨细胞的黏附和增殖具有促进作用；2力学性能好，丝素蛋白被公认为是一种力学性能优越的天然生物材料，天然蚕丝（含丝胶蛋白）的极限拉伸强度高达500MPa,弹性模量为5-12Gpa，其强度密度比约为钢的十倍；3良好的可加工性，丝素蛋白具有良好的可加工性，可根据应用需求加工成多孔支架、微球、纤维、微管和膜层等形状，其中丝素蛋白膜层可以通过滴落涂布法、刻蚀法、电纺丝和电喷涂法、电泳沉积法、旋涂法和浸涂法等方法制备得到；4结构可控性好，丝素蛋白膜层亲疏水性、膜层形貌和力学性质等结构和性质可调控性强，因此可用于医疗器械植入物表面改性和涂层制备领域，使其具有抗凝血、抗菌和促进细胞黏附等特性。

石墨烯是由sp²杂化碳原子组成的具有蜂窝状晶体点阵结构的二维层状纳米材料，作为一种新型纳米材料，石墨烯具有优异的力学性能，电子迁移率高，热传导率高，比表面积大，同时具有良好的生物相容性和一定的成骨活性和抗菌性。在生物医学领域里可以被用于生物传感器制备、细胞成像、生物纳米探针制备、药物输送与缓释、组织工程研究、抗菌材料和生物复合材料制备等领域。但由于石墨烯表面具有π-π共轭疏水结构，在液态环境中分散性差、易于团聚，因此可利用石墨烯衍结构氧化石墨烯(GO)，GO表面及其边缘含有亲水性含氧官能团，在水中具有优越的分散性，且GO可通过后期还原反应制备得到还原氧化石墨烯(rGO)，在维持石墨烯sp²杂化碳原子π-π共轭结构的同时，赋予其一定的亲水性，提高其分散性。

基于石墨烯优异的力学性能、良好的生物相容性、促成骨活性和一定的抗菌性，石墨烯及其衍生物增强纳米复合材料与涂层制备已经成为研发新型生物材料的研究热点，因此本发明专利采用滴落涂布法制备GO/丝素蛋白复合膜层，并利用抗坏血酸为还原剂进一步制备得到rGO/丝素蛋白复合膜层。

目前关于石墨烯及其衍生物/丝素蛋白纳米复合材料的制备已成为科学界研究的前沿和热点，其中大部分的研究主要集中在GO/丝素蛋白水凝胶和膜层制备及其力学性能研究，且国内外还没有文献和专利报道过综合利用滴落涂布法与抗坏血酸还原法制备rGO/丝素蛋白复合膜层并对其体外促进间充值干细胞成骨分化进行系统研究。

所以我们提出了一种还原氧化石墨烯丝素蛋白复合膜制备方法，以便于解决现有技术所得丝素蛋白膜层力学性能差、成骨活性低的缺点的问题。

发明内容

本发明为解决上述技术问题，提供一种还原氧化石墨烯丝素蛋白复合膜制备方法，以便于解决现有技术所得丝素蛋白膜层力学性能差、成骨活性低的缺点的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种还原氧化石墨烯丝素蛋白复合膜制备方法，其特征在于：包括如下步骤。

S1:将桑蚕茧剪碎，称取5g桑蚕茧，然后将其置于2L浓度为0.02 mol/L Na₂CO₃溶液中煮沸30min，去除蚕丝表面丝胶蛋白，煮沸结束后用去离子水清洗脱胶丝素蛋白数次，并自然晾干。

S2:将S1制备的丝素蛋白在60℃下溶解于9M LiBr约4h，待丝素蛋白完全溶解后，用透析膜透析72h，得到质量体积分数为6-7 w/v%的丝素蛋白水溶液，将所述丝素蛋白水溶液存放在-20℃冰箱中冷冻处理。

S3:将S2制备的6-7 w/v% 丝素蛋白冷冻固体冷冻干燥处理，得到丝素蛋白固体粉末。

S4:将S3制备的丝素蛋白固体粉末加入六氟异丙醇(HFIP)溶剂中，过夜放置直至完全溶解，得到12.5 mg/mL 丝素蛋白HFIP溶液。

S5:将GO水溶液按照一定质量比(GO/丝素蛋白 wt%)加入S4制备的丝素蛋白HFIP溶液中，迅速搅拌均匀，GO质量分数为0.01~1 wt%。

S6:取24孔细胞培养板，每孔加入60μLS5制备的丝素蛋白/GO溶液，放置于通风橱内过夜自然干燥，待膜层干燥后，向孔板内加入 90%甲醇溶液2mL/孔，诱使丝素蛋白结构发生β-折叠结构转变，孔板至于通风橱内过夜自然晾干。

S7:次日，将孔板置于41 mmol/L 抗坏血酸溶液中，在95℃条件下加热5min得到丝素蛋白/rGO膜层。

S8:还原后，分别用去离子水、70%乙醇溶液清洗膜层3次，然后将样品转移至超净台内，用0.22μm孔径滤膜过滤后的70%乙醇溶液清洗3次，无菌PBS清洗3次，以待接种细胞使用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明rGO/丝素蛋白复合膜制备方法操作简单方便，膜层成分易于控制，且在还原GO过程中未引入有毒还原剂，生物相容性高，与纯丝素蛋白膜层相比，rGO/丝素蛋白复合膜层对人间充质干细胞的黏附增殖和成骨分化均具有促进作用，推动了丝素蛋白在骨组织修复与重建用领域的应用。

附图说明

图1不同GO浓度的丝素蛋白六氟异丙醇(HFIP)溶液光学照片(a)，不同GO (上排)与还原后的rGO (下排)浓度的丝素蛋白复合膜层宏观光学照片以及未镀膜玻片照片(b)，玻片表面纯丝素蛋白膜层照片(c)；

图2 rGO/丝素蛋白复合膜层与hMSC细胞在增殖培养基中共培养1天，7天后细胞DNA含量；

图3 hMSC细胞与rGO/丝素蛋白复合膜层共培养1天(a-f)，7天(g-l)后细胞荧光染色形貌图。其中(a,g)为对照组细胞培养皿，rGO浓度分别为0%(b,h)，0.05%( e,i)，0.1%( d,j)，0.5%( b,h)，1%(f,l)；

图4 hMSC细胞与rGO/丝素蛋白复合膜层在成骨分化培养基中与hMSC细胞共培养1天和4周后细胞DNA含量；

图5 hMSC细胞与不同rGO含量的rGO/丝素蛋白复合膜层在成骨分化培养基中与hMSC细胞共培养4周后细胞内Ca含量；

图6 hMSC细胞与rGO/丝素蛋白复合膜层在成骨分化培养基中共培养4周后 ALP，茜素红染色和冯·高斯染色。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-6，本发明提供一种技术方案：一种还原氧化石墨烯丝素蛋白复合膜制备方法，其特征在于：包括如下步骤。

S1:将桑蚕茧剪碎，称取5g桑蚕茧，然后将其置于2L浓度为0.02 mol/L Na₂CO₃溶液中煮沸30min，去除蚕丝表面丝胶蛋白，煮沸结束后用去离子水清洗脱胶丝素蛋白数次，并自然晾干。

S2:将S1制备的丝素蛋白在60℃下溶解于9M LiBr约4h，待丝素蛋白完全溶解后，用透析膜透析72h，得到质量体积分数为6-7 w/v%的丝素蛋白水溶液，将所述丝素蛋白水溶液存放在-20℃冰箱中冷冻处理。

S3:将S2制备的6-7 w/v% 丝素蛋白冷冻固体冷冻干燥处理，得到丝素蛋白固体粉末。

S4:将S3制备的丝素蛋白固体粉末加入六氟异丙醇(HFIP)溶剂中，过夜放置直至完全溶解，得到12.5 mg/mL 丝素蛋白HFIP溶液。

S5:将GO水溶液按照一定质量比(GO/丝素蛋白 wt%)加入S4制备的丝素蛋白HFIP溶液中，迅速搅拌均匀，GO质量分数为0.01~1 wt%。

S6:取24孔细胞培养板，每孔加入60μLS5制备的丝素蛋白/GO溶液，放置于通风橱内过夜自然干燥，待膜层干燥后，向孔板内加入 90%甲醇溶液2mL/孔，诱使丝素蛋白结构发生β-折叠结构转变，孔板至于通风橱内过夜自然晾干。

S7:次日，将孔板置于41 mmol/L 抗坏血酸溶液中，在95℃条件下加热5min得到丝素蛋白/rGO膜层。

S8:还原后，分别用去离子水、70%乙醇溶液清洗膜层3次，然后将样品转移至超净台内，用0.22μm孔径滤膜过滤后的70%乙醇溶液清洗3次，无菌PBS清洗3次，以待接种细胞使用。

所得涂敷有rGO/丝素蛋白的24孔板，向培养板内接种干细胞,所用干细胞为在增殖培养基中培养至第四代的人间充质骨髓干细胞,增殖培养基为含有10%胎牛血清、1% 青霉素/链霉素、0.1ng/mL bFGF的高葡萄糖含量DMEM培养基。按照5000/cm²接种密度，接种于rGO/丝素蛋白膜层表面，在增殖培养基中培养1周，每2~3天更换一次培养基，以检测复合膜层与hMSC细胞体外相容性。

为研究rGO/丝素蛋白膜层对hMSC细胞体外成骨活性影响，将细胞按照5,000/cm²接种密度，接种于rGO/丝素蛋白膜层表面，在成骨分化培养基中共培养3周，每2~3天更换一次培养基,所用成骨分化培养基为含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素、100 nM地塞米松、10 mM β-甘油磷酸钠和50μg/mLL-抗坏血酸-2-磷酸酯钠的低葡萄糖含量DMEM培养基。

得到的rGO/丝素蛋白膜层表面黏附的干细胞DNA含量、细胞形貌、成骨分化后细胞内钙含量及成骨细胞矿化情况分别用如下试剂盒测试： Picogreen 试剂盒(MolecularProbes, OR)、荧光显微镜、Calcium (CPC) Liquicolor® Kit试剂盒(StanbioLaboratory, USA)和“碱性磷酸酶(ALP)、苏木精-伊红(H&E)和冯·高斯(Von Kossa，V.K.)染色试剂盒”。

rGO/丝素蛋白膜层制备过程中混合液、膜层还原前后光学照片如图1所示，不同GO浓度的丝素蛋白六氟异丙醇(HFIP)溶液光学照片，除纯丝素蛋白溶液外，当加入GO后溶液呈淡黄色，且随着GO浓度增加而颜色变深。采用滴涂法在细胞培养皿表面制备复合膜层，为方便观察膜层颜色，将混合液滴涂在圆形载玻片表面，待溶液挥发后得到丝素蛋白/GO复合膜层(图1上排)。然后将玻片至于抗坏血酸溶液中，高温加热数分钟，将GO还原为rGO，膜层颜色从棕黄色变为淡黑色。

rGO/丝素蛋白膜层对hMSC 细胞的黏附增殖作用如图2所示，rGO/丝素蛋白复合膜层与hMSC细胞在增殖培养基中共培养1天和7天后细胞DNA含量。根据DNA含量可计算出hMSC细胞数量。细胞接种密度约为50ng/孔，在增殖培养基中培养1天后，与对照组细胞培养皿相比，rGO/丝素蛋白复合膜层上的hMSCs细胞数量增加，但当rGO浓度较高时(1%)，细胞数量和对照组无差异。共培养7天后，与对照组相比，纯丝素蛋白膜层可以促进hMSC细胞增殖，且加入rGO后(0.05%~0.5%)，细胞增殖率进一步增大。当rGO浓度为1%时，细胞增殖率与纯丝素蛋白膜层没有统计学差异。该结果表明，当rGO浓度在一定范围内时(<1%), rGO/丝素蛋白复合膜层对hMSC细胞增殖没有抑制作用，具有良好的体外细胞相容性。

rGO/丝素蛋白膜层表面hMSC 细胞黏附形貌如图3所示，当共培养1天后，hMSC细胞在细胞培养皿底部铺展良好，呈现出多边形形貌；hMSC细胞在丝素蛋白及复合膜层表面生长良好，可观察到细胞伪足向外周伸展。当培养7天后，细胞均匀铺满细胞培养皿及复合膜层表面，表明其具有良好的体外细胞相容性，对hMSC细胞增殖没有抑制作用。

rGO/丝素蛋白膜层对hMSC细胞成骨分化活性影响如图4所示，将细胞接种于膜层表面在成骨培养基中共培养1天和4周后，对照组培养皿表面细胞DNA含量略低于丝素蛋白膜层，成骨分化培养4周后，DNA含量增加了约18倍，丝素蛋白/1% rGO膜层表面细胞DNA含量略低于对照组。

rGO/丝素蛋白膜层表面hMSC细胞成骨分化后钙含量如图5所示，与hMSC细胞共培养4周后，丝素蛋白及复合膜层表面成骨细胞内Ca含量明显高于对照组细胞培养皿内细胞。当rGO浓度大于0.5%时，丝素蛋白/rGO复合膜层对hMSC成骨分化活性的促进作用大于纯丝素蛋白膜层。表明加入一定量的rGO可以促进hMSC的成骨分化活性。

rGO/丝素蛋白膜层表面hMSC细胞成骨分化后细胞染色结果如图6所示，ALP染色结果表明hMSC成骨分化为骨细胞并分泌产生碱性磷酸酶，不同实验组见没有观察到差异。作为阴离子染料，茜素红可与一些金属阳离子(如钙离子)络合生成红色络合物，用以识别细胞内沉积的钙盐。与茜素红染色相似，冯·高斯染色原理是将细胞内矿化基质中的磷酸类、碳酸类钙盐转化为磷酸根、碳酸根，然后与银离子结合，利用紫外照射等方法将银离子还原为褐色/黑色银单质，达到对细胞内矿化结染色的目的。据此可知，根据图6中茜素红和冯·高斯染色结果，与对照组和纯丝素蛋白膜层相比，当膜层内含有rGO时，在其表面培养的hMSC诱导分化的骨细胞内钙盐沉积量增加。

技术方案二：将高分子基质2材料溶解于适当溶剂中，加入一定比例的空心纳米颗粒1，一并加入适量固化剂、粘合剂、表面改性剂及增塑剂等相关助剂的一种或多种，空心纳米颗粒1可选自纳米空心球的Si、SiO2、ZrO2、TiO2、Pst等及纳米中空纤维中的陶瓷纤维、硅酸铝纤维、聚酯纤维和聚丙烯纤维等一种或多种，空心纳米颗粒1在实施方案前，进行分散性表面改性，高分子基质2为常用的生物相容性好的高分子材料选自聚醚共聚酰胺、聚碳酸酯、硅树脂环、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、乙缩醛、聚氨酯、尼龙、尼龙66等的一种或多种，充分搅拌溶液使粒子在溶液中分散混合均匀，使用沉淀法或溶剂蒸发法得到母料，将母料制粒，以该母粒作为原料，挤出导管成形，获得上述具有低导热系数导管壁主体3的导管。

技术方案三：在高分子基质2单体溶液中，搅拌条件下，加入一定比例的空心纳米颗粒1及聚合引发剂，空心纳米颗粒1可选自纳米空心球的Si、SiO2、ZrO2、TiO2、Pst等及纳米中空纤维中的陶瓷纤维、硅酸铝纤维、聚酯纤维和聚丙烯纤维等一种或多种，空心纳米颗粒1在实施方案前，进行分散性表面改性，高分子基质2为常用的生物相容性好的高分子材料选自聚醚共聚酰胺、聚碳酸酯、硅树脂环、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、乙缩醛、聚氨酯、尼龙、尼龙66等的一种或多种，应用原位聚合法制备得到母料，将母料制粒，以该母粒作为原料，挤出导管成形，获得上述具有低导热系数导管壁主体3的导管。

本发明导管壁结构，可适用的医用导管包括但不限于外周穿刺的中心静脉导管、经外周穿刺的静脉导管、中心静脉导管、导引导管、微导管、中间导管等，且本说明书中未作详细描述的内容均属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种还原氧化石墨烯丝素蛋白复合膜制备方法，其特征在于：包括如下步骤:

S1:将桑蚕茧剪碎，称取5g桑蚕茧，然后将其置于2L浓度为0.02 mol/L Na₂CO₃溶液中煮沸30min，去除蚕丝表面丝胶蛋白，煮沸结束后用去离子水清洗脱胶丝素蛋白数次，并自然晾干:

S2:将S1制备的丝素蛋白在60℃下溶解于9M LiBr约4h，待丝素蛋白完全溶解后，用透析膜透析72h，得到质量体积分数为6-7 w/v%的丝素蛋白水溶液，将所述丝素蛋白水溶液存放在-20℃冰箱中冷冻处理:

S3:将S2制备的6-7 w/v% 丝素蛋白冷冻固体冷冻干燥处理，得到丝素蛋白固体粉末:

S4:将S3制备的丝素蛋白固体粉末加入六氟异丙醇(HFIP)溶剂中，过夜放置直至完全溶解，得到12.5 mg/mL 丝素蛋白HFIP溶液:

S5:将GO水溶液按照一定质量比(GO/丝素蛋白 wt%)加入S4制备的丝素蛋白HFIP溶液中，迅速搅拌均匀，GO质量分数为0.01~1 wt%:

S6:取24孔细胞培养板，每孔加入60μLS5制备的丝素蛋白/GO溶液，放置于通风橱内过夜自然干燥，待膜层干燥后，向孔板内加入 90%甲醇溶液2mL/孔，诱使丝素蛋白结构发生β-折叠结构转变，孔板至于通风橱内过夜自然晾干:

S7:次日，将孔板置于41 mmol/L 抗坏血酸溶液中，在95℃条件下加热5min得到丝素蛋白/rGO膜层:

S8:还原后，分别用去离子水、70%乙醇溶液清洗膜层3次，然后将样品转移至超净台内，用0.22μm孔径滤膜过滤后的70%乙醇溶液清洗3次，无菌PBS清洗3次，以待接种细胞使用。

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