CN111939162A - 活化ampk的化合物及其使用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于活化AMPK的化合物，其为腺嘌呤及/或其医药学上可接受的盐。并公开了该化合物的应用，此化合物适用于活化AMPK(AMP‑活化蛋白激酶)，并使用该化合物于预防或治疗生理状况或疾病，因此于哺乳动物预防或治疗可被AMPK改善的生理状况或疾病。

Description

活化AMPK的化合物及其使用

本发明是一件分案申请，原申请的申请日为2013年9月26日，申请号为201310444518.X，发明名称为：活化AMPK的化合物及其使用。

技术领域

本发明关于腺嘌呤，此化合物适用于活化AMPK(AMP-活化蛋白激酶)，并使用该化合物于预防或治疗生理状况或疾病。

背景技术

AMPK明确为细胞能量的感应器及能量需求的回应者。AMPK为异三元体由催化性α次单元体、调节性β、γ次单元体组成，所有次单元体在真核生物具高度保留性。AMPK活化是借由其上游激酶如LKB1、钙离子/携钙素依赖的蛋白质磷酸激酶(Ca²⁺/Calmodulindependent kinase)及TAK1磷酸化α次单元体具保留性的第172苏胺酸残基，由生理或病理压力造成高AMP/ATP比例亦活化AMPK。AMPK活化后会促进分解代谢路径进行并抑制合成代谢，借由减少ATP消耗及促进ATP生成进而恢复细胞能量平衡。

作为一能量代谢平衡调节者，AMPK被认为对代谢症候群，包括第二型糖尿病、心血管疾病、脂肪肝等为一具潜力的药物标的。许多代谢症候群都与胰岛素抵抗有关。胰岛素抵抗是为一病理状态，在此状况细胞无法对胰岛素进行回应，因此血液中过多的葡萄糖无法移除至骨胳肌或脂肪组织。在肌肉细胞中，AMPK活化以非胰岛素依赖性方式，通过转录调控增加葡萄糖运输蛋白(GLUT4)表现量，并诱导GLUT4转移至细胞膜上导致细胞摄取葡萄糖速率增加。AMPK活化亦分别借由抑制乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase)及羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMG-CoA reductase)抑制脂肪酸及胆固醇合成。此外AMPK活化导致数个转录因子的抑制，包括SREBP-1c,ChREBP and HNF-4a，并下降调节脂肪酸合成及糖质新生作用相关酵素的蛋白质表现。上述提及的研究发现，均支持AMPK是为代谢症候群尤其糖尿病的治疗标的。

除了能量代谢平衡调节外，AMPK亦参与数个细胞机制的调节，包括发炎反应、细胞生长、细胞雕亡、自体吞噬、老化及分化。许多研究显示AMPK为发炎反应抑制者。AMPK活化通过抑制细胞核转录因子(NF-κB)的讯息传递抑制发炎反应。细胞核转录因子的讯息传递为活化先天免疫及后天免疫主要路径，当AMPK活化后会通过刺激SIRT1、Forkhead box O(FoxO)或peroxisome proliferator-activated receptor co-activator 1α(PGC1α)抑制细胞核转录因子的转录活性以达到抑制发炎反应的效果。此外数个研究室亦证明AMPK活化抑制环氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)的蛋白质表现。环氧化酶-2是为一诱导性酵素，可被发炎性细胞激素及生长因子调控，其功能为将花生四烯酸转化成前列腺素因而导致发炎反应及疼痛，因此抑制环氧化酶的活性或表现已被证实具抗发炎作用。

数个AMPK活化剂已于生物体内实验被证实具抗发炎功能。举例而言，5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside(AICAR)于小鼠模式已被证实可缓解由三硝基苯磺酸或右旋糖酐硫酸酯钠所引起的急性及复发性结肠炎，AICAR治疗显著降低疾病小鼠的体重减少并减缓发炎反应。此外AICAR对于人类多发性硬化症动物模式(EAE)有明显的治疗效果，亦降低以脂多醣诱导小鼠肺损伤的严重程度。

细胞讯息传递路径失调可能会导致细胞异常生长，最终导致癌症。哺乳动物雷帕霉素标靶蛋白(mTOR)是为一丝胺酸/苏胺酸激酶，其调控细胞生长及自体吞噬作用。哺乳动物雷帕霉素标靶蛋白讯息传递路径的活性失调在许多不同癌症被发现，因此哺乳动物雷帕霉素标靶蛋白抑制剂被认为是癌症治疗的潜力药物。大量研究证实AMPK磷酸化tuberoussclerosis complex 2(TSC2)及Raptor达到抑制哺乳动物雷帕霉素标靶蛋白路径。各种AMPK活化剂包括AICAR、metformin、phenformin已被证实抑制哺乳动物雷帕霉素标靶蛋白讯息路径，并抑制癌细胞生长。此外AMPK活化通过抑制哺乳动物雷帕霉素标靶蛋白复合体-1诱导自体吞噬作用。由于AMPK抑制哺乳动物雷帕霉素标靶蛋白复合体-1，Ulk1上第757丝胺酸磷酸化减少，其后第317及777丝胺酸被AMPK磷酸化，Ulk1被AMPK磷酸化后随的启动自体吞噬作用。

综上所述，AMPK被认为对许多人类疾病或病理状况，包括发炎性疾病、伤口愈合、神经退化、癌症、氧化压力及心血管疾病为一很好的治疗标的。事实上，AMPK活化剂已被应用于至少24类疾病的临床试验，包括:细菌及真菌疾病、行为及心理失调、血液及淋巴疾病、癌症、肿瘤、消化系统疾病、耳鼻喉疾病、眼疾、腺体及贺尔蒙相关疾病、心血管疾病、免疫系统疾病、嘴巴及牙齿疾病、肌肉、骨胳、软骨疾病、神经系统疾病、营养及代谢性疾病、呼吸道疾病、皮肤及结缔组织疾病、伤口愈合等。

发明内容

本发明提供了一种新颖AMPK活化剂-腺嘌呤及使用该化合物于预防或治疗疾病。

本发明提供一种用于活化AMPK的化合物，其为腺嘌呤及/或其医药学上可接受的盐。

本发明提供上述化合物作为制备治疗可被AMPK活化剂改善的疾病或生理状况的药物的应用。

本发明提供上述化合物作为制备治疗发炎性生理状况或疾病的药物的应用。

本发明提供上述化合物作为制备预防或治疗前期糖尿病、第二型糖尿病、代谢症候群的一种或其组合的生理状况或疾病的药物的应用。

本发明提供上述化合物作为制备预防或治疗前期糖尿病、第二型糖尿病、代谢症候群的一种或其组合的生理状况或疾病的药物的应用。

本发明提供上述化合物作为制备预防或治疗阿兹海默症的药物的应用。

本发明提供上述化合物作为制备治疗可被自体吞噬作用改善的疾病或生理状况的药物的应用。

本发明提供上述化合物作为制备伤口愈合过程抑制疤痕形成的药物的应用。

本发明提供上述化合物作为制备加强伤口愈合的药物的应用。

本发明提供上述化合物作为制备哺乳动物中保护及治疗受活性氧族伤害的细胞的药物的应用。

本发明提供上述化合物作为制备预防或治疗癌症药物的应用。

根据本发明的实施例，提供一新颖AMPK活化剂-腺嘌呤，可于细胞内活化AMPK，因此可于哺乳动物预防或治疗可被AMPK改善的生理状况或疾病。

根据本发明的实施例，提供一通过活化AMPK降低血糖的方法，从而预防或治疗疾病包括：代谢症候群、前期糖尿病、第二型糖尿病、胰岛素抵抗，其中给予需要此治疗的哺乳动物有效剂量的腺嘌呤及/或医药学上可接受的盐。

根据本发明的实施例，提供一通过活化AMPK抗发炎的方法，从而预防或治疗发炎性状况或疾病，其中给予需要此治疗的哺乳动物有效剂量的腺嘌呤及/或医药学上可接受的盐。

根据本发明的实施例，提供一通过活化AMPK抑制纤维母细胞生长的方法，从而于伤口愈合期间预防疤痕组织生成。

根据本发明的实施例，提供一加强伤口愈合的方法，其中给予需要此治疗的哺乳动物有效剂量的腺嘌呤及/或医药学上可接受的盐。

根据本发明的实施例，提供一抑制反应性氧族(ROS)生成的方法，从而保护或治疗哺乳动物的细胞远离反应性氧族伤害，其中给予需要此治疗的哺乳动物有效剂量的腺嘌呤及/或医药学上可接受的盐。

根据本发明的实施例，提供一抑制癌细胞生长的方法，从而预防或治疗癌症，其中给予需要此治疗的哺乳动物有效剂量的腺嘌呤及/或医药学上可接受的盐。

本发明是关于腺嘌呤，此化合物适用于活化AMPK，并使用腺嘌呤于预防或治疗生理状况或疾病，包括：前期糖尿病、胰岛素抵抗、第二型糖尿病、代谢症候群、肥胖、发炎、伤口愈合、阿兹海默症、癌症、氧化压力及心血管疾病。

本发明发现，腺嘌呤为一新颖的AMPK活化剂，并具有各种生物性功能。近年来，AMPK活化已被证实有助于疾病的预防及治疗，如前期糖尿病、胰岛素抵抗、第二型糖尿病、代谢症候群、肥胖、发炎、伤口愈合、阿兹海默症、癌症、氧化压力、心血管疾病以及促进伤口愈合。本发明认为，此效果可归因于AMPK活化所导致但不限于降低环氧化酶-2表现量、抑制应性氧族(ROS)的生产及葡萄糖摄取活性的增加。

预期适应症

基于本发明的研究成果(见实施例)，腺嘌呤可通过活化AMPK作为使用于各种生理状况或疾病的治疗剂。以下提供预期适应症的示例性引导及证据。

腺嘌呤于高血糖、前期糖尿病、胰岛素抵抗、第二型糖尿病的治疗

最近已有报告指出AMPK活化剂包括metformin,A769662,AICAR于糖尿病或肥胖小鼠模式降低血浆葡萄糖浓度。于本发明中，1μM～600μM的腺嘌呤显著增加肌肉细胞C2C12的葡萄糖摄取(表2)。更进一步以高脂肪饲料喂养小鼠作为第二型糖尿病动物模型评估腺嘌呤对血浆葡萄糖浓度调节效果。与控制组的高脂肪饲料喂养小鼠比较，给予腺嘌呤显著减少高脂肪饲料喂养小鼠的血浆葡萄糖30％以上，并减少血浆三酸甘油酯35％以上，15％以上的体重减少(实施例3)。这里使用的术语「高血糖」是指一生理状况，其特征为血糖高于126毫克/分升。这里使用的术语「前期糖尿病」是指一生理状况，其特征为空腹血糖高于100毫克/分升但低于140毫克/分升。这里使用的术语「胰岛素抵抗」是指一生理状况，其中全身或组织包括肝脏、骨胳肌、脂肪组织无法对胰岛素反应。这里使用的术语「第二型糖尿病」亦指非胰岛素依赖型糖尿病或成人发病型糖尿病。是指代谢失调引起的胰岛素生产不足或胰岛素抵抗，其特征通常为空腹血糖高于140毫克/分升。根据此实施例，腺嘌呤被证实加速葡萄糖摄取，因此可作为与高血糖有关的生理状况或疾病的有效治疗方式。

腺嘌呤于发炎性疾病的治疗

各种AMPK活化剂已被证实于生物体内具抗发炎功能。举例而言，5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside(AICAR)于小鼠模式已被证实可缓解由三硝基苯磺酸或右旋糖酐硫酸酯钠所引起的急性及复发性结肠炎，AICAR治疗显著降低疾病小鼠的体重减少并减缓发炎反应。此外AICAR对于人类多发性硬化症动物模式(EAE)有明显的治疗效果，亦降低以脂多醣诱导小鼠肺损伤的严重程度。于本发明中，腺嘌呤于体外试验中抑制脂多醣诱导的发炎反应：于脂多醣刺激下，经腺嘌呤处理的巨噬细胞的发炎性细胞激素分泌量，包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)、介白素-1β(IL-1β)及介白素-6(IL-6)，与控制组相比有显著性减少。腺嘌呤亦减少人类巨噬细胞因脂多醣诱导表现的环氧化酶-2表现量(实施例4)。于三硝基苯磺酸诱导的发炎性肠病(IBD)小鼠模式中，给予腺嘌呤治疗组别的结肠发炎性细胞激素，包括肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素γ(INFγ)及介白素(IL-17)均较控制组小鼠显著减少，且挽救体重损失(实施例5)。

这里使用的术语「发炎性细胞激素」是指促进系统性发炎反应的细胞激素。这里使用的术语「发炎性疾病」是指与发炎相关的疾病，包括但不限制于僵直性脊椎炎、关节炎(骨关节炎、风湿性关节炎、干癣性关节炎)、气喘、动脉粥样硬化、克隆氏症、结肠炎、皮肤炎、大肠憩室炎、纤维肌痛症、肝炎、激躁性结肠症、系统性红斑性狼疮、肾炎、阿兹海默症、帕金森式症、溃疡性大肠炎等。近年来，许多报告已证实AMPK是环氧化酶-2上游调控者，可抑制环氧化酶-2的蛋白质表现。与先前研究相符，发明人发现一新颖AMPK活化剂，腺嘌呤，可有效抑制环氧化酶-2的蛋白质表现，由此可知腺嘌呤可抑制环氧化酶-2介导的发炎。根据本发明，腺嘌呤被发现可抑制发炎，因此可作为发炎相关的生理状况或疾病的治疗。

腺嘌呤于伤口愈合及疤痕形成

AMPK被认为可促进细胞能动性并加强伤口愈合。一AMPK活化剂，白藜芦醇，已被证实可加强手术伤口的愈合。除了伤口愈合外，在愈合过程中减少疤痕的形成一直为现代医学的首选目标。新生儿伤口愈合不同于成人的伤口愈合，不会伴随疤痕的形成，此间差异在于环氧化酶-2的活化。于成人的伤口愈合过程，环氧化酶-2活性会经由TGF-beta被提升，因而导致伤口处前列腺素生产的增加。前列腺素已被证实可促进纤维母细胞增生及胶原蛋白的形成，此两种因素可导致疤痕形成。因此，抑制环氧化酶-2的活性被认为可有效预防疤痕形成。于本发明中，腺嘌呤抑制纤维母细胞生长(实施例8)并降低环氧化酶-2的蛋白质表现。于动物模式中，于伤口处直接施用腺嘌呤不仅可加强伤口愈合并可减少疤痕生成(实施例9)。依据上述资料，局部施用腺嘌呤可有效加强伤口愈合并防止疤痕形成。

神经退化

许多细胞机制的缺陷已被证实与神经退化性疾病有关，包括发炎、细胞内运输、自体吞噬等。自体吞噬的功能在于移除细胞内失去功能的胞器或蛋白质团块，并且对细胞内平衡扮演重要角色。许多神经退化性疾病的发病机制涉及细胞内或细胞外蛋白质团块的沉积，而移除这些蛋白质团块已显示可改善此类疾病的进展。此外，自体吞噬途径受损或移除负责自体吞噬的蛋白质已被证实导致神经退化。AMPK活化已证实可促进自体吞噬路径。因此，通过活化AMPK以促进自体吞噬路径可作为预防或控制神经退化性疾病的有效策略。AMPK活化剂已被证实可经由自体吞噬路径减少类淀粉沉积。每日给予AMPK活化剂-白藜芦醇可增加阿兹海默症小鼠的寿命。另一AMPK活化剂-姜黄素亦被证实可作为阿兹海默症治疗的潜在药物。于本发明中，发明人发现腺嘌呤于神经细胞Neuro-2A中显著加强自体吞噬活性并降低A累积，此外腺嘌呤改善阿兹海默症疾病小鼠的认知功能(实施例6、7)。根据上述发现，腺嘌呤可作为神经退化性疾病的治疗使用。

这里使用的术语「神经退化」是指神经元结构或功能逐渐丧失的情况。神经退化性疾病是为神经退化的结果，包括但不限制于阿兹海默症、帕金森氏症、汉丁顿舞蹈症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、脊髓小脑萎缩症、脊髓性肌肉萎缩症等。

反应性氧族相关疾病

生物组织中，反应性氧族包括超氧化物自由基、羟基自由基及过氧化氢不断的被产生，且过量的反应性氧族与许多疾病有关，包括但不限制于:神经组织肌肉无力伴随运动失调与色素沉积性视网膜炎(NARP)、MELAS症候群、肌抽跃癫痫合并红色褴褛肌纤维症(MERRF)、Leber遗传性视神经萎缩症(LHON)、KSS症候群、阿兹海默症、帕金森氏症、汉丁顿舞蹈症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、弗里德赖希氏共济失调(FA)及老化。许多研究报告证实AMPK活化剂如AICAR，于高葡萄糖、棕梠酸或白蛋白诱导状况下，可减少反应性氧族产生。于本发明中，腺嘌呤降低HUVEC细胞中反应性氧族的生产(表6)，因此腺嘌呤可作为反应性氧族相关的生理状况或疾病的治疗使用。

癌症

AMPK活化抑制环氧化酶-2与哺乳动物雷帕霉素标靶蛋白途径，此二路径为癌细胞生长的重要机制。基于环氧化酶-2与哺乳动物雷帕霉素标靶蛋白对癌症的重要性，活化AMPK以达抑制环氧化酶-2与哺乳动物雷帕霉素标靶蛋白途径被认为是合理的癌症治疗策略。事实上，许多研究报告证实AMPK活化剂中断癌症发展，举例而言，phenformin及metformin于异体移植的癌症小鼠模式被发现抑制乳癌肿瘤发展及生长。于本发明中，腺嘌呤抑制人类肝癌细胞Hep G2、人类乳腺癌细胞MCF7及结肠癌细胞HT29的细胞生长(实施例11)。腺嘌呤对Hep G2、MCF7、HT29的50％生长抑制浓度分别为544.1,537.5and 531.9μM。于Hep G2移植小鼠模式，长期给予腺嘌呤显著延迟肿瘤生长。根据本发明，以腺嘌呤活化AMPK的治疗方式，可预防或控制癌症的形成或发展。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1

AMPK活性分析

于小鼠肌肉细胞C2C12、小鼠纤维母细胞3T3、人类肝癌细胞Hep G2、人类乳腺癌细胞MCF7及人类结肠癌细胞HT29人类脐带静脉内皮细胞HUVEC、人类急性单核白血球细胞株THP1、人类巨噬细胞U937、小鼠微神经胶细胞BV-2、神经母细胞瘤细胞Neuro2A及毛乳突细胞Dermal Papilla进行腺嘌呤对AMPK磷酸化影响的分析。细胞以Dulbecco's modifiedEagle's medium(DMEM)含10％胎牛血清(FBS),4mM L-glutamine,2mM sodium pyruvate及1％penicillin/streptomycin(Invitrogen GibcoBRL,Carlsbad,CA,USA)于37℃、5％CO₂环境下培养。3×10⁵细胞接种于6-well盘，24小时后以指定化合物处理细胞30分钟，接着溶解细胞并以西方墨点法进行分析。等量蛋白质以十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，接着转印至聚偏氟乙烯膜。转印后的聚偏氟乙烯膜浸泡至溶于PBS缓冲液的3％牛血清白蛋白60分钟后，分别加入抗磷酸化AMPK(Thr172)抗体(1:2000,Cell signaling)、抗AMPK抗体(1:2000,Cell signaling)，于4℃作用。16小时后加入对应的二抗于室温下反应1小时。具免疫反应带以冷光受质侦测，并以底片纪录信号。所得的信号扫描后以TotalLabQuant软件(TotalLab)进行分析。

腺嘌呤对AMPK活化的影响统整于表1。于所有测试细胞中，腺嘌呤均显著活化AMPK。

表(1)

实施例2

葡萄糖摄取-生物体外分析

使用萤光葡萄糖类似物(2-NBDG,Molecular Probes)于肌肉细胞C2C12分析腺嘌呤对葡萄糖摄取的影响。C2C12细胞以各浓度的腺嘌呤于37℃下处理30分钟后，加入500μM萤光葡萄糖类似物，于室温下培养5分钟后，细胞以Kreb-Hepes缓冲溶液清洗三次，并以70％乙醇固定。细胞内葡萄糖类似物的萤光以萤光光度计侦测。

腺嘌呤对葡萄糖摄取的影响统整于表2。腺嘌呤显著促进C2C12细胞的葡萄糖摄取且具浓度依赖性。数据表示为三个独立实验的平均值±标准差。

表(2)

试剂	浓度(microM)	葡萄糖摄取(％tocontrol)
			Adenine	1	117±8.1
	10	261±13.4
				100	315±11.9
	600	338±16.5

实施例3

腺嘌呤的抗糖尿病效果

为了进一步评估腺嘌呤对血浆葡萄糖水平调节的影响，以高脂肪饲料喂养小鼠作为第二型糖尿病动物模型进行试验。C57BL/6J小鼠饲养于22℃、12小时日/夜循环并以不限制饮食方式喂养高脂肪饲料(60％kcal％fat)或正常饲料。0.1-50毫克/公斤的腺嘌呤以腹腔注射方式给于24周龄小鼠，注射后1与3小时测量血糖值。腹腔注射高脂肪饲料喂养小鼠一天两次并持续6天，最后一次投药1小时后，收集血浆并测量血浆葡萄糖及三酸甘油脂含量。

与施打生理食盐水的高脂肪饲料喂养小鼠相比，发现腺嘌呤降低血浆葡萄糖量大于30％，降低三酸甘油脂量大于35％，并且降低体重15％以上。

实施例4

腺嘌呤抑制脂多醣引起的发炎反应

借由检测人类巨噬细胞内环氧化酶-2蛋白质量及肿瘤坏死因子α(TNF-α)、介白素-1β(IL-1β)及介白素-6(IL-6)分泌量评估腺嘌呤对发炎反应的影响。以50nM PMA处理24小时，诱导人类急性单核白血球细胞株THP1分化至巨噬细胞。THP1巨噬细胞进一步以50ng脂多醣含10～600μM腺嘌呤或载体刺激6小时，接着溶解细胞并以西方墨点法进行分析。等量蛋白质以十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，接着转印至聚偏氟乙烯膜。转印后的聚偏氟乙烯膜浸泡至溶于PBS缓冲液的3％牛血清白蛋白60分钟后，分别加入抗环氧化酶-2抗体(1:1000,Cell signaling)、抗机动蛋白抗体(1:5000,Cell signaling)，于4℃作用。16小时后加入对应的二抗于室温下反应1小时。具免疫反应带以冷光受质侦测，并以底片纪录信号。所得的信号扫描后以TotalLab Quant软件(TotalLab)进行分析。肿瘤坏死因子α(TNF-α)、介白素-1β(IL-1β)及介白素-6(IL-6)分泌量以酵素连结免疫吸附法分析。

腺嘌呤对免疫反应的影响统整于表3。与控制组胞比较，经腺嘌呤处理的巨噬细胞，其环氧化酶-2蛋白质表现量及肿瘤坏死因子α(TNF-α)、介白素-1β(IL-1β)及介白素-6(IL-6)分泌量均显著下降。

表(3)

实施例5

腺嘌呤于生物体抑制三硝基苯磺酸诱发的发炎反应

进一步以三硝基苯磺酸诱导的发炎性肠病(IBD)小鼠模式，评估腺嘌呤对发炎反应的影响。C57BL/6J小鼠饲养于22℃、12小时日/夜循环。以五个逐步提升的三硝基苯磺酸剂量：0.5mg、0.75mg、1.0mg、1.25mg与1.5mg溶于50％乙醇分别每周给予小鼠0.1mL诱发复发性结肠炎。第三次给予三硝基苯磺酸后每日以腹腔注射方式给予小鼠腺嘌呤(0.01,0.1,5或30mg/kg体重)或生理食盐水。第五次给予三硝基苯磺酸后两天即将小鼠牺牲。结肠组织溶解液的发炎性细胞激素：肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素γ(INFγ)及介白素(IL-17)以酵素连结免疫吸附法分析。

给予腺嘌呤治疗组别的结肠发炎性细胞激素包括肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素γ(INFγ)及介白素(IL-17)，均较控制组小鼠显著减少，且挽救体重损失。

实施例6

类淀粉β胜肽及自体吞噬活性分析

以神经母细胞瘤细胞Neuro2A分析腺嘌呤对类淀粉β胜肽的影响。

Neuro2A细胞以Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)含10％胎牛血清(FBS),4mM L-glutamine,2mM sodium pyruvate及1％penicillin/streptomycin(Invitrogen GibcoBRL,Carlsbad,CA,USA)于37℃、5％CO₂环境下培养。3×10⁵细胞接种于6-well盘，24小时后，细胞以APP695进行转染，并以腺嘌呤处理细胞24小时，接着溶解细胞并以西方墨点法进行分析。等量蛋白质以十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，接着转印至聚偏氟乙烯膜。转印后的聚偏氟乙烯膜浸泡至溶于PBS缓冲液的3％牛血清白蛋白60分钟后，分别加入抗类淀粉β胜肽抗体(1:1000,Abcam)、抗LC3抗体(1:1000,Cellsignaling)，抗机动蛋白抗体(1:5000,Cell signaling)，于4℃作用。16小时后加入对应的二抗于室温下反应1小时。具免疫反应带以冷光受质侦测，并以底片纪录信号。所得的信号扫描后以TotalLab Quant软件(TotalLab)进行分析。

腺嘌呤对类淀粉β胜肽及LC3-II/LC3-I比例的影响统整于表4。于Neuro2A细胞中，腺嘌呤显著性减少类淀粉β胜肽量并且增加LC3-II/LC3-I比例。由于LC3-I转换至LC3-II代表自体吞噬的活性，于腺嘌呤处理的细胞中，较控制组细胞较高的LC3-II/LC3-I比例，反映腺嘌呤活化自体吞噬作用的功能。

表(4)

实施例7

腺嘌呤于阿兹海默症实验小鼠模式解救类淀粉β胜肽诱导的神经退化

类淀粉β胜肽25-35购买自Sigma-Aldrich(St.Louis,Missouri)。胜肽溶解于无菌生理食盐水并注射前培养于37℃下7天。C57BL/6J小鼠饲养于22℃、12小时日/夜循环。成鼠以ketamine(500毫克/公斤)及xyline(100毫克/公斤)麻醉，并放置于立体定位注射仪。5nmol的类淀粉β胜肽25-35以10μl注射器注射至侧脑室，侧脑是座标为-0.5mm(前后向)、±1mm(内外侧向)、-2.5mm(背腹向)相对于前囱。每日以腹腔注射方式给予类淀粉β胜肽注射小鼠腺嘌呤或生理食盐水，腺嘌呤注射剂量为0.01,0.1,5或30毫克/公斤体重，连续注射4周。4周后，小鼠认知功能以莫里斯水迷宫方法分析。水迷宫以圆形水池进行，平台置于目标象限的水面下以进行隐藏平台试验。于5天隐藏平台试验期间，每次试验小鼠均随机放置于水池内做为起始点，每日6次试验。5日隐藏平台试验后1日进行探索性试验。进行探索性试验时，移除隐藏平台并以目标象限对面象限作为起始点。以摄录机纪录小鼠于迷宫中泳动60秒的情形，以软件分析小鼠寻找平台时间及泳动路径。

于隐藏平台试验中，经腺嘌呤治疗的小鼠，其寻找到平台所花费时间较控制组小鼠显著性减少。此试验结果证实腺嘌呤可挽救阿兹海默症实验小鼠受损的学习及记忆功能。再者，腺嘌呤治疗小鼠于探索性试验中，其停留于目标象线时间较控制组小鼠长，证明腺嘌呤增进记忆保留。

实施例8

腺嘌呤抑制纤维母细胞生长

人类纤维母细胞株3T3以Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)含10％胎牛血清(FBS),4mM L-glutamine,2mM sodium pyruvate及1％penicillin/streptomycin(Invitrogen GibcoBRL,Carlsbad,CA,USA)于37℃、5％CO₂环境下培养。于细胞生长试验中，1×10⁵细胞接种于6-well盘，24小时后，以指定浓度的腺嘌呤处理细胞72小时，计算存活的细胞数。细胞以trypsin-EDTA分离并以trypan blue进行染色，以血球计数器计算存活细胞数。

腺嘌呤对3T3细胞生长的影响统整于表5。由表5结果可知，腺嘌呤显著抑制3T3细胞生长并具剂量依赖性。数据表示为三个独立实验的平均值±标准差。

表(5)

腺嘌呤(microM)	细胞数(％tocontrol)
		0	100±4.3
10	91±2.7
		50	73±8.1
100	64±5.3
		200	48±2.8
500	33±6.4
		1000	27±11.3

实施例9

腺嘌呤加强伤口愈合并减少疤痕形成

C57BL/6J小鼠饲养于22℃、12小时日/夜循环。12周龄成鼠以ketamine(500毫克/公斤)及xyline(100毫克/公斤)麻醉，于小鼠背部以6-mm皮肤取样器制造伤口。形成伤口后，于伤口施用10～1200μM腺嘌呤或食盐水。皮肤伤口接着以半透性透明片伤口敷料固定。小鼠以腺嘌呤或生理食盐水处理14天后牺牲。疤痕形成以Masson’s trichrome染色分析(组织以4％paraformaldehyde固定)。

经14天处理后，腺嘌呤处理伤口的愈合速度较控制组快，且根据组织染色分析，以腺嘌呤处理的伤口再生组织，其疤痕显著较控制组伤口小。

实施例10

腺嘌呤降低反应性氧族生成

人类脐带静脉内皮细胞HUVEC以Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)含10％胎牛血清(FBS),4mM L-glutamine,2mM sodium pyruvate及1％penicillin/streptomycin(Invitrogen GibcoBRL,Carlsbad,CA,USA)于37℃、5％CO₂环境下培养。2×10⁴细胞接种于96-well黑盘，24小时后，将培养基置换成含5.6或30mM葡萄糖的DMEM培养基并加入指定浓度的腺嘌呤。处理24小时后，细胞内反应性氧族以H2DCF-DA侦测。细胞以PBS缓冲液清洗1次后，培养于100μM DCF 37℃ 30分钟。DCF萤光以盘式萤光分析仪分析(激发波长:485nm；散射波长：530nm)。

腺嘌呤对反应性氧族生成的影响统整于表6。腺嘌呤显著性减少高葡萄糖诱导的反应性氧族生成并具剂量依赖性。

表(6)

实施例11

癌细胞生长抑制试验

以人类肝癌细胞Hep G2、人类乳腺癌细胞MCF7及人类结肠癌细胞HT29进行腺嘌呤对癌细胞生长的影响。细胞以Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)含10％胎牛血清(FBS),4mM L-glutamine,2mM sodium pyruvate及1％penicillin/streptomycin(Invitrogen GibcoBRL,Carlsbad,CA,USA)于37℃、5％CO₂环境下培养。1×10⁵细胞接种于6-well盘，24小时后，以指定浓度的腺嘌呤处理细胞72小时，计算存活的细胞数。细胞以trypsin-EDTA分离并以trypan blue进行染色，以血球计数器计算存活细胞数。

腺嘌呤对Hep G2、MCF7、HT29的50％生长抑制浓度分别为544.1,537.5and 531.9μM。

实施例12

肿瘤生长试验

人类肝癌细胞Hep G2以Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)含10％胎牛血清(FBS),4mM L-glutamine,2mM sodium pyruvate及1％penicillin/streptomycin(Invitrogen GibcoBRL,Carlsbad,CA,USA)于37℃、5％CO₂环境下培养。5×10⁶细胞以皮下注射方式注射至8周龄NOD-SCID小鼠。移植后，每日以腹腔注射方式给予小鼠5、20、50毫克/公斤体重的腺嘌呤，每3日测量肿瘤大小。移植后14天，相较于控制组小鼠，给予腺嘌呤显著延缓肿瘤的生长。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种腺嘌呤及/或其医药学上可接受的盐作为制备治疗发炎性生理状况或疾病的药物的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述发炎性生理状况或疾病选自由僵直性脊柱炎、关节炎、气喘、动脉粥样硬化、发炎性肠病、皮肤炎、大肠憩室炎、溃疡性大肠炎、纤维肌痛症、肝炎、系统性红斑性狼疮、肾炎和神经退化性疾病所组成的组。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述发炎性生理状况或疾病是气喘。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述发炎性生理状况或疾病是发炎性肠病。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发炎性肠病选自由克隆氏症、结肠炎和激躁性结肠症所组成的组。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述发炎性生理状况或疾病是神经退化性疾病。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述神经退化性疾病选自由阿兹海默症、帕金森氏症、汉丁顿舞蹈症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、脊髓小脑萎缩症和脊髓性肌肉萎缩症所组成的组。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述神经退化性疾病是阿兹海默症。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述神经退化性疾病是帕金森氏症。

10.根据权利要求1至9中任一权利要求所述的应用，其特征在于，所述腺嘌呤及/或其医药学上可接受的盐的有效剂量是0.01毫克/公斤体重至30毫克/公斤体重。