CN111936614A - 在微流控芯片中具有不通气的气体腔的微流控芯片 - Google Patents

Abstract

一种用于微生物学测试的微流控芯片中的温育区段，其中所述温育区段形成在具有上主面和下主面的基板中，所述区段包括温育孔，样品可以通过其输入所述温育孔中的入口通道，和通过微流控连通通道连接至所述温育孔的气体腔，其中所述气体腔是不通气的，并且气体腔的底部通过连通通道连接至温育孔的底部。

Description

在微流控芯片中具有不通气的气体腔的微流控芯片

技术领域

本发明的领域是适用于微生物学测试的微流控芯片中的单个温育区段的几何形状。此类测试包括微生物识别和抗微生物药敏测试(AST)。每个区段可以包含具有给定浓度的抗生素(或抗生素的组合)。单个芯片包括多个温育区段，该温育区段包含，例如，不同浓度的不同抗生素，允许检测抗生素耐性并确定每种抗生素的最小抑制浓度(ΜLC)。

背景技术

专利申请EP 1696238 A2公开了一种用于微生物学测试的芯片，其包括在其中进行细菌培养的多个独立温育区段。这些区段是使用注射模制制造的塑料板上的出口孔。每个区段连接至小的空气阱(air trap)。在正确放置测试卡的情况下(即在细菌培养期间)，该阱位于放置样品室的孔上方。该阱用于去除可能会干扰光学测量的细菌悬浮液中的气泡。然而，其不能提供细菌生长所必需的合适空气通道。该芯片必须用可渗透的箔封闭以进行培养。该箔在专利申请EP 0745667 A1中说明。为了确保合适的透氧性，该箔由透氧性聚甲基戊烯制成。

欧洲专利EP 0903569 B1描述了一种由三个部分组成的微生物学测试芯片。两个外部部分构成每个温育区段的上壁和下壁，且中央元件构成侧壁。这种设计意味着该芯片需要由透明材料制成(这至少适用于外层)，使得在每个区段中对培养物进行光学测试。它们具有从底部到顶部加宽的环形截面，并且它们通过具有小截面的排气通道连接在一起。当填充该温育区段时，样品通过通风管将空气喷入到温育区段内。导管的小尺寸允许除去气体，而同时防止水样品流入。在申请US 2009/0155128中所示的芯片中，以类似的方式从温育区段中去除空气。

WO 2013/045631 A1教导了不通风的充气室，其中气体用于控制液体从分配通道进入室的流动(降低室内的气体温度导致气体压力下降并将液体吸入室中)。充气室和分配通道径向放置。这种几何构型不提供与细菌培养的孔的气体交换，也不允许在芯片上密集分布腔室。

因此，在现有技术中，还没有其中用于微生物学测试的芯片上的温育孔与气体腔相连，特别是以不限制其生长的方式满足培养的微生物的气体交换，特别是氧气交换的需求的解决方案。在已知的芯片中，在填充的同时，将空气从温育区段中排出，排出其容积之外，或至特定的空气阱中。通过微流控通道的网络向细菌提供空气使其无法确保其物理分离，否则其可以通过用矿物油填充微流控通道以抵消任何交叉污染而实现。使用的另一种解决方案是专用的透空气箔。描述的发明使得可以用不可渗透的箔密封芯片情况下在温育区段中进行细菌培养。

发明内容

本发明的目的是提供用于微生物学和类似测试的改进的温育区段。

这通过具有权利要求1的特征的温育区段而实现。进一步的改进通过从属权利要求的特征提供。

附图说明

图1A显示了在使用时的温育区段的根据本发明的实施方式的斜上方视图，图1B显示了在使用时温育区段的斜下方的视图。

图2显示了沿图1A的线l-l′的截面。

图3示意性地显示了根据本发明的包括多个温育区段的芯片的一个主侧面的平面视图。

图4示意性地显示了图3的芯片的相对的主侧面的平面视图。

具体实施方式

在以下与位置或取向有关的术语中，如“上部”、“下部”、“水平”、“垂直”、“上方”和“下方”与处于正常使用位置的温育区段有关。在附图所示的实施方式中，该正常使用位置是包含温育区段的芯片的表面定位为样品储池的出口位于样品储池的入口下方的位置。

在本申请的上下文中，每当提及“细菌”时，其同样适用于其他微生物，如例如单细胞真菌。

图1A、1B和图2示意性地显示了形成于优选恒定厚度的基板1中的温育区段S的实例。基板优选是平面的，具有上主面3和优选平行的下面5。该基板可以由任何液体和蒸汽不可渗透的材料，例如聚合物、金属或玻璃制成。如图2所示，上表面被不可渗透的透明材料如聚合物膜的上层7覆盖，且下主表面被不可渗透的透明材料如聚合物膜的下层9覆盖。入口开口11通向用于将样品从入口开口输送至温育孔的入口通道13。可替代地或另外地，入口开口可以通向形成于基板中的样品输送通道(未显示)。入口通道优选在主面上形成为凹槽17。入口通道延伸到温育孔21的上端25的侧壁19并向其中敞开。温育孔优选为延伸穿过基板而不穿过不可渗透材料的上和下层的垂直通孔23的形式。温育孔在其上端25和下端27处由相应的上部和下部不可渗透的透明膜覆盖。在温育井的下端，形成于基板下面的优选水平的凹槽29构成微流控连通通道31，其也可以称为气体交换通道，通向不通气气体腔35的底部34处的侧壁33并向其中敞开。凹槽进入气体腔的侧壁的端部的深度是预定的深度。凹槽另一端进入温育孔的深度可以小于、等于或大于该预定深度。“不通气气体腔”是指在使用期间空气或其他流体只能通过连通通道进入或离开气体腔。气体腔是预定深度的盲孔37的形式。温育孔的容积V_i大于气体腔的容积V_g。连通通道的容积V_c优选小于气体腔的容积。

优选地，如图3所示，多个温育区段S在芯片39上形成为网络。该芯片可以设置有样品输送通道41的网络。这些通道连接至一个或多个通过基板中的通孔45通向样品储池的样品输入通道43。优选地，通道的网络布置为分形网络，这意味着样品从样品储池行进至每个温育孔的距离对于每个温育区段是相同的距离。每个温育区段的入口通道的形状可以，例如，通过或多或少地弯曲而适应，以帮助实现此目的。

温育孔优选包含不同量的待测物质，例如，抗生素，和任何其他辅助物质和/或微生物生长指示剂，以及进行微生物测试所需的这些或任何其他试剂的任何组合。这些物质(以下统称为“试剂”)在附着一层不可渗透的透明材料之后且在附着两层不可渗透的透明材料的中第二层之前，可以装入温育孔中。优选这些试剂以使其暴露于水溶液中时被释放的方式附着于温育区段的壁上。

不可渗透的透明材料的层7、9(如优选由例如聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、环状烯烃聚合物或环状烯烃共聚物制成的聚合物箔)形成可以照亮温育孔21并随后检测散射光或荧光的光学窗口。气体腔优选构造为使得在附接不可渗透的透明材料的下层之前仅从板的一侧打开。优选地，气体腔位于将样品引导至温育孔的入口通道13下方，并与入口通道通过预定厚度的基板材料隔开。使进气通道与气体腔重叠可以更有效地利用芯片上的空间，使得采用易于处理的尺寸(例如，128mm×85mm)的芯片，可以在芯片上放置大量紧密间隔的温育区段(最多640或更多)，这通过允许在单次测试期间进行更多的细菌培养而改进其功能性。应当注意的是，独立的反应孔的数量是限制现有技术的AST测试卡的功能的主要因素。在单个芯片上容纳大量的温育区段的可能性使得可以采集样品中细菌的药物敏感性的综合信息(即，通过允许测试更多抗生素或其组合的可能的耐性，确定需要进行比测定抗生素浓度断点更大量的温育的真正ΜLC，可能发现耐药机制)。在这方面，温育区段可以获得独特的性能，其显著超过现有技术中已知的AST测试卡的性能。

细菌生长所需的气体包含于气体腔中，由此其扩散到温育孔的悬浮液中。采用这种方案，可以使用不可渗透的箔密封芯片，其比可渗透的箔便宜，并提供了防止样品蒸发的更好保护。从温育区段的内腔中提供空气意味着在将样品输入到温育区段后，可以密封入口开口和/或入口通道。这可以通过例如将非水性流体如矿物油输入到入口开口中而实现。这防止了区段之间的污染，并也防止了样品溶液的蒸发。

芯片39包含通向温育区段的入口的微流控通道41的网络。当要使用芯片且温育区段被填充时，样品可以从由操作员事先通过样品储池中的入口端口46装载的样品储池47的出口45施加到网络的输入端43。样品通过微流控通道41的网络从样品储池流至输送通道，其从微流控通道的主网络分支，且每个通道通向温育区段的各自入口开口。通过将在其样品储池中具有样品的芯片放置于密封的容器如填充的室中并降低室中的压力而使芯片处于低于尽快大气压力的气氛中，从而通过从温育区段和微流控通道中排出空气穿过样品储池中的样品并排到芯片之外，在通道和温育区段的网络中形成负压，而实现填充。随后可以增加周围大气中(例如，填充室中)的压力，从而引起样品从样品储池移动到温育区段。样品储池的容量应该足以确保每个温育孔均接收正确剂量的样品。优选地，压力此时不升高到环境大气压，以允许使用进一步的压力增加，以允许将密封液体，例如非水性液体或油施加到微流控通道的网络(经由样品储池从非水性液体容器50的出口48或通过另一条路径)该密封液体在将外部压力提高到例如大气压时被吸入到入口通道中，从而密封入口通道。其防止样品蒸发和温育区段之间的交叉污染。

在本发明的进一步的实施方式中，入口通道、连通通道和气体腔的位置被颠倒，即气体腔形成为从基板的上表面起的盲孔，连通通道形成为基板的上中的凹槽，且入口通道形成为基板的下表面中的凹槽。

在根据本发明的温育区段的一个实施方式中，温育区段中各个部分的容积如下：

优选地，气体腔的容积V_g大于或等于温育孔的容积V_i的5％，并等于或小于温育孔的容积V_i的100％，优选等于或小于温育孔的容积V_i的90％，更优选等于或小于温育孔的容积V_i的80％，且最优选小于温育孔的容积V_i的70％，或气体腔的容积V_g大于或等于温育孔的容积V_i的10％，并且等于或小于温育孔的容积V_i的90％，优选等于或小于温育孔的容积V_i的70％，更优选等于或小于温育孔的容积V_i的50％，且最优选小于温育孔的容积V_i的30％，或气体腔的容积V_g大于或等于温育孔的容积V_i的20％，并且等于或小于温育孔的容积V_i的70％，优选等于或小于温育孔的容积V_i的50％，更优选等于或小于温育孔的容积V_i的40％，且最优选小于温育孔的容积V_i的30％。

温育孔的容积V_i优选大于或等于0.5μL且小于或等于5μL，气体腔的容积V_g优选大于或等于0.5μL且小于或等于1.5μL，更多优选温育孔的容积V_i大于或等于1μL且小于或等于2.5μL，气体腔的容积V_g优选大于或等于0.7μL且小于或等于1.3μL；并且，最优选的是，温育孔的容积V_i大于或等于2.2μL且小于或等于2.4μL，气体腔的容积V_g大于或等于0.9μL且小于或等于1.2μL。

连通通道的容积V_c优选大于或等于温育孔的容积V_i的2％且小于或等于温育孔的容积V_i的10％。

优选在本发明的所有实施方式中，温育孔的最小线性尺寸，例如其直径或宽度或从连通通道到入口通道的线性距离等于或小于2mm，优选等于或小于1.5mm，更优选等于或小于1.0mm，最优选等于或小于0.5mm。

计算出氧气扩散通过具有给定高度的培养基层所需的时间，并将其与细菌将消耗培养基中的全部氧气的时间比较。这些计算基于2.5μL的温育孔容积的实例以及以下假设：

·考虑最简单的扩散变体，其中颗粒扩散x的平均距离，其可以用方程

近似，其中D是发生扩散的介质的常数；

·根据亨利(Henry)定律计算稳态下溶解于培养基中的氧气量，根据该定律，培养基中的氧气浓度与其分压直接成正比(对于孔中存在的空气，如果未压缩，其为0.22×1个大气压＝0.22个大气压)；

·当将氧气从气体腔扩散到培养基所需的时间比细菌消耗溶解于培养基中的全部氧气的时间短得多时，细菌将获得足够的氧气而使其生长。

还计算了细菌在其中立即扩散的简化情况下将利用气体腔中收集的所有氧气的时间。

在最简单的变体中，通过比较腔室中收集的氧气摩尔数和以摩尔/分钟表示的氧气消耗速率(这是基于文献确定的)，计算确定出给定数量的细菌(以OD或CFU/mL和培养基的容积表示)将花费多长时间消耗气体腔(具有给定的容积)中收集的氧气。在分析的实例中，使用了大肠杆菌的数据，然而文献允许人们假设其很可能是大多数细菌的代表值，这也由克莱伯(Kleiber)定律证明。另外，为了提高估算的可靠性，对于部分计算，假设消耗速率比通过实验确定的大肠杆菌值大一个数量级。

在更复杂的情况下，计算从给定的OD或CFU/mL到给定倍数的细菌生长期间的总耗氧量。假设根据公式

可以计算出时间t的给定时刻下的当前耗氧量M，其中N₀是细菌的初始数量，

是对应于以摩尔/分钟计的耗氧量的常数，并且g是对应于细菌数量加倍的时间的常数。然后，通过积分可以计算总耗氧量，并且对于以分钟计的结束时间T，其为：

下表显示了总氧气消耗量，假设培养以OD＝0.001在容积为2.5μL的温育孔中开始，且氧气消耗为

假设细菌加倍时间为30分钟，并且假设在超过3.3×10⁹CFU/mL后出现细菌生长抑制。由于估计了最大消耗量，因此还假设当达到最大细菌数时，氧气消耗量不会下降。

以上数据表明，在24小时的测试周期中，所需的气体腔容积较小，并且不会显著限制细菌生长。此外，甚至需要更小的容积以达到细菌的最大可能浓度，这是给出有关细菌生长的相关信息的最后时刻，即温育孔中的后续过程对于使用根据本发明的温育区段的微生物鉴定或AST测试而言并不重要。对于大气压下容积为2.5μL的孔，如果假设该时间应比氧气消耗时间短一个数量级，则限制细菌生长的因素可以是扩散时间，这由约1.4×10⁵CFU(对应于OD 0.07和5.6×10⁷CFU/mL)可能变得有意义。尽管气体腔的空气中的氧气余量较高，也可能就是这种情况。考虑到扩散时间与距离的平方成正比，培养基层应制备成尽可能薄。

为了避免限制本发明的所有实施方式中的气体扩散，优选地从气体腔到温育孔的连通通道的长度小于0.5mm，更优选小于0.4mm，更加优选等于或小于0.3mm，且最优选等于或小于0.2mm。

芯片中空气压力的增加将允许更多的氧气扩散到培养基中，这也将提高细菌饲养的效率。例如，在10bar的压力下，在任何时间下向培养基中输送比在大气压下多10倍的氧气。

本发明的一个方面涉及一种以悬浮液引入到芯片上的样品尺寸中的细菌分离物。细菌的悬浮液受迫流入温育区段，每个温育区段先前供给有干燥形式的抗生素(例如，不同量的不同类型的抗生素)以及可能的辅助物质和/或细菌生长指示剂和进行微生物测试所需的这些试剂或任何其他试剂的任何组合。在用样品填充温育孔后，这些抗生素和物质溶解于样品中。

温育区段的性质允许在药物敏感性测试或其他此类微生物学测试期间具有合适的功能性，即温育区段允许细菌的培养和重复的光学测量以检测其潜在的生长。具体地，温育区段：(1)可以进行气体交换，使得其不是限制细菌群体生长速率的因素，并且(2)为光学研究提供了合适长度且不受干扰的光路。

包含温育区段的芯片应该具有足够的气密性以防止样品在测试期间泄漏或溢出和蒸发。

Claims (12)

1.一种用于微生物学测试的微流控芯片中的温育区段(S)，其中，所述温育区段形成在具有上主面(3)和下主面(5)的基板(1)中，所述区段包括温育孔(21)，入口通道(13)，样品可以通过其输入所述温育孔中，和通过微流控连通通道(31)连接至所述温育孔的气体腔(35)，其特征在于，所述气体腔是不通气的，并且所述气体腔的底部通过连通通道(31)连接至所述温育孔的底部。

2.根据权利要求1所述的温育区段，其特征在于：

所述温育孔的容积V_i优选大于或等于0.5μL且小于或等于5μL，所述气体腔的容积V_g优选大于或等于0.5μL且小于或等于1.5μL，

更优选地，所述温育孔的容积V_i大于或等于1μL且小于或等于2.5μL，所述气体腔V_g的容积优选大于或等于0.7μL且小于或等于1.3μL；并且，

最优选地，所述温育孔的容积V_i大于或等于2.2μL且小于或等于2.4μL，所述气体腔的容积V_g大于或等于0.9μL且小于或等于1.2μL。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的温育区段，其中，所述气体腔的容积V_g大于或等于所述温育孔的容积V_i的5％，且等于或小于所述温育孔的容积V_i的100％，优选等于或小于所述温育孔的容积V_i的90％，更优选等于或小于所述温育孔的容积V_i的80％，并且最优选小于所述温育孔的容积V_i的70％。

4.根据权利要求1或权利要求2所述的温育区段，其中，所述气体腔的容积V_g大于或等于所述温育孔的容积V_i的10％，且等于或小于所述温育孔的容积V_i的90％，优选等于或小于所述温育孔的容积V_i的70％，更优选等于或小于所述温育孔的容积V_i的50％，并且最优选小于所述温育孔的容积V_i的30％。

5.根据权利要求1或权利要求2所述的温育区段，其中，所述气体腔的容积V_g大于或等于所述温育孔的容积V_i的20％，且等于或小于所述温育孔的容积V_i的70％，优选等于或小于所述温育孔的容积V_i的50％，更优选等于或小于所述温育孔的容积V_i的40％，并且最优选小于所述温育孔的容积V_i的30％。

6.根据前述权利要求中任一项所述的温育区段，其特征在于，所述温育孔的最小线性尺寸等于或小于2mm，优选等于或小于1.5mm，更优选等于或小于1.0mm，最优选等于或小于0.5mm。

7.根据前述权利要求中任一项所述的温育区段，其特征在于，所述连通通道的长度优选小于0.5mm，更优选小于0.4mm，更加优选等于或小于0.3mm，且最优选等于或小于0.2mm。

8.根据前述权利要求中任一项所述的温育区段，其特征在于，所述温育孔形成为从所述基板的所述上主面至所述下主面的通孔(23)。

9.根据前述权利要求中任一项所述的温育区段，其特征在于，所述气体腔形成为所述基板的所述下主面中的盲孔(37)。

10.根据前述权利要求中任一项所述的温育区段，其特征在于，所述连通通道的容积V_c大于或等于所述温育孔的容积V_i的2％且等于或小于所述温育孔的容积V_i的10％。

11.微流控芯片，包括多个根据前述权利要求中任一项所述的温育区段，其中所述芯片的所述基板具有被不可渗透的透明材料的上层(7)覆盖的上表面和被不可渗透的透明材料的下层(9)覆盖的下主表面。

12.根据权利要求11所述的微流控芯片，其特征在于，所述基板由聚合物制成，优选聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、环烯烃聚合物或环烯烃共聚物。

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