CN111936459A - 通过新型ape1/ref-1抑制剂靶向于眼部疾病 - Google Patents

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Abstract

本文公开了用于抑制眼部疾病的[(2E)‑2‑[(3‑甲氧基‑1,4‑二氧代‑1,4‑二氢萘‑2‑基)亚甲基]‑N,N‑二乙基戊酰胺](APX2009)和(2E)‑2‑[(3‑甲氧基‑1,4‑二氧代‑1,4‑二氢萘‑2‑基)亚甲基]‑N‑甲氧基戊酰胺](APX2014)。

Description

通过新型APE1/REF-1抑制剂靶向于眼部疾病
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年2月8日提交的美国临时申请号62/628,093的优先权，其全部公开内容通过引用合并于此。
背景技术
本申请总体上涉及3-[(5-(2,3-二甲氧基-6-甲基-1,4-苯醌基)]-2-壬基-2-丙烯酸(APX3330)和/或其衍生物(例如，[(2E)-2-[(3-甲氧基-1,4-二氧代-1,4-二氢萘-2-基)亚甲基]-N,N-二乙基戊酰胺](APX2009)和(2E)-2-[(3-甲氧基-1,4-二氧代-1,4-二氢萘-2-基)亚甲基]-N-甲氧基戊酰胺](APX2014))用于抑制眼部疾病的用途。
眼部新生血管化是诸如增生性糖尿病性视网膜病(PDR)、早产儿视网膜病(ROP)和年龄相关的湿性黄斑变性(AMD)等疾病的关键病理生物学特征，这些都是失明的主要原因(Campochiaro，2013)。在PDR和ROP中，异常血管在视网膜内和视网膜上生长，而在湿性AMD中，新生血管从色素性视网膜下脉络膜层生长到视网膜中。在所有情况下，新生血管都会破坏视网膜结构，并可能出血，导致失明。尽管不能总是很好地表征促进新生血管化的确切刺激，但是缺氧和炎症都起着至关重要的作用。目前用于这些疾病的FDA批准的药物治疗都是靶向血管内皮生长因子(VEGF)信号通路的生物制剂，如兰尼单抗和阿柏西普(Prasad等，2010)。尽管这些治疗剂非常成功，但仍有相当一部分患者具有耐药性和难治性(Lux等，2007；Falavarjani和Nguyen，2013)。此外，还可能会引起严重的副作用，包括出血和眼内炎。因此，开发靶向其他信号通路的新型治疗方法至关重要。
发炎和缺氧在新生血管化中起关键作用。同时影响促炎的和低氧信号的治疗提供了独特的治疗策略。这样一种潜在的靶标是还原氧化因子1-脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(Ref-1/APE1)，一种在促进血管生成刺激的转导中起重要作用的细胞内信号联系。该双功能蛋白具有碱基切除修复必不可少的核酸内切酶(APE1)的作用，而Ref-1的活性是氧化还原敏感的转录激活因子(Shah等人，2017)。Ref-1氧化还原信号是一个高度调控的过程，该过程减少特定转录因子中氧化的半胱氨酸残基作为其反式激活的一部分(Xanthoudakis和Curran，1992；Xanthoudakis等，1992；Evans等，2000；Lando等，2000；Nishi等，2002；Seo等，2002；Li等，2010；Fishel等，2011；Cardoso等，2012；Kelley等，2012；Luo等，2012；Zhang等，2013；Fishel等，2015；Logsdon等，2016)。该氧化还原信号影响许多转录因子，包括HIF-1α，NF-κB等。HIF-1α和NF-κB的调节与血管新生和眼部疾病特别相关(Evans等，2000；Nishi等，2002；Seo等，2002；Fishel等，2011；Cardoso等，2012；Fishel等，2015；Logsdon等，2016)。
令人兴奋的是，Ref-1的活性在药理上可以作为目标点。3-[(5-(2,3-二甲氧基-6-甲基-1,4-苯醌基)]-2-壬基-2-丙烯酸(APX3330；以前称为E3330)是一种特定的Ref-1/APE1氧化还原抑制剂。APX3330已被广泛表征为Ref-1氧化还原活性的直接、高选择性抑制剂，它不影响蛋白质的核酸内切酶活性(Luo等，2008；Fishel等，2010；Su等，2011；Cardoso等，2012；Luo等，2012；Zhang等，2013；Fishel等，2015)。在视网膜发育过程中以及视网膜色素上皮(RPE)细胞、周细胞、脉络膜内皮细胞和视网膜内皮细胞中，Ref-1/APE1得到高度表达(Chiarini等，2000；Jiang等，2011；Li等，2014a)，更普遍地，Ref-1在存在炎症的组织区域经常被上调(Zou等，2009；Kelley等，2010)。APX3330先前被证明可阻挡体外血管生成，如视网膜和脉络膜内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成(Jiang等，2011；Li等，2014b)。实际上，玻璃体内(直接进入眼内)递送APX3330减少了极低密度的脂蛋白受体(VLDLR)基因敲除小鼠的视网膜新生血管化模型中的新生血管化(Jiang等，2011)，也减少了激光诱导的脉络膜新生血管化(L-CNV)中的新生血管化(Li等，2014b)，这是使用最广泛的动物模型，概括了湿性AMD的特征(Grossniklaus等，2010)。
尽管主要的临床候选抑制剂在临床前癌症研究中是有效的，但是在抗血管生成的和抗炎的转录因子(NF-κB，HIF-1α)抑制方面具有增强的功效以及新的化学性质的第二代Ref-1抑制剂是想要的。
发明内容
本申请涉及3-[(5-(2,3-二甲氧基-6-甲基-1,4-苯醌基)]-2-壬基-2-丙烯酸(APX3330)和/或其衍生物(例如，[(2E)-2-[(3-甲氧基-1,4-二氧代-1,4-二氢萘-2-基)亚甲基]-N,N-二乙基戊酰胺](APX2009)和(2E)-2-[(3-甲氧基-1,4-二氧代-1,4-二氢萘-2-基)亚甲基]-N-甲氧基戊酰胺](APX2014))用于抑制眼部新生血管化的用途。特别是发现在DNA结合试验中与APX3330相比，APX2009和APX2014提供了对Ref-1功能的增强抑制作用。两种化合物均对人视网膜微血管内皮细胞(HREC；GI50 APX2009：1.1μM，APX2014：110nM)和猕猴脉络膜内皮细胞(Rf/6a GI50 APX2009：26μM，APX2014：5.0μM)具有抗增殖作用。与对照相比，这两种化合物均显著降低了HREC和Rf/6a细胞形成中等纳摩尔浓度的管腔的能力，并且在划伤试验中均显著抑制了HREC和Rf/6a细胞迁移。
在离体情况下，APX2009和APX2014两者分别在低微摩尔浓度和高纳摩尔浓度下抑制脉络膜长芽。在激光诱导的脉络膜新生血管小鼠模型中，腹膜内APX2009治疗使病变体积相比于载体显著减少了4倍(p<0.0001，采用Dunnett事后检验的方差分析)，而没有明显的眼内的或全身的毒性。因此，在体外和离体情况下，用APX2009和APX2014抑制Ref-1会阻断眼部血管新生，而APX2009在体内对CNV是有效的全身治疗，从而使Ref-1抑制成为一种有希望的眼部新生血管化治疗方法。
因此，一方面，本申请涉及一种抑制有需要的受试者的眼部新生血管化的方法。该方法包括向受试者施用有效量的脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1氧化还原因子1(APE1/Ref-1)抑制剂、其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物。
在另一方面，本申请涉及抑制有需要的受试者的眼部新生血管化的方法，该方法包括向受试者施用有效量的脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1氧化还原因子1(APE1/Ref-1)抑制剂、其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物。
在另一方面，本申请涉及治疗有需要的受试者的早产儿视网膜病变(ROP)的方法，该方法包括向受试者施用有效量的脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1氧化还原因子1(APE1/Ref-1)抑制剂、其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物。
在另一方面，本申请涉及治疗有需要的受试者的年龄相关的湿性黄斑变性(AMD)的方法，该方法包括向受试者施用有效量的脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1氧化还原因子1(APE1/Ref-1)抑制剂、其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物。
附图说明
当考虑到以下详细描述时，将会更好地理解本公开内容，并且除了上述那些之外的特征、方面和优点将变得显而易见。这样的详细描述参考以下附图，其中：
图1A和图1B描述了Ref-1抑制剂的合成和活性。图1A描述了APX2009(6a)和APX2014(6b)的合成方案。包括APX3330(7)的结构以供参考。试剂和条件：a，2-碘-3-羟基-1,4-萘醌(iodolawsone，1)、2-丙基丙烯酸(2)、K2CO3、Pd(OAc)2，氩气，100℃，1小时，74％；b，(COCl)2、DMF、DCM、RT过夜，100％；c，DEA·HCl(APX2009)或CH3ONH2·HCl(APX2014)、DIPA·HCl、RT，45分钟，分别为62％和71％；d，NaOCH3/CH3OH，氩气，30分钟，RT，分别为96％和86％。图1B示出了，与EMSA中的APX3330相比，APX2009和APX2014是Ref-1诱导的AP-1DNA结合的更有效抑制剂。示出了来自同一实验的两种独立的凝胶。对于APX3330、APX2009和APX2014，氧化还原EMSA抑制的IC50分别为25μM、0.45μM和0.2μM。这些测定进行了多次，结果相似。
图2A-2D描述了化合物APX2009和APX2014在体外抑制HREC和Rf/6a细胞中的内皮细胞增殖。APX2009(图2A)和APX2014(图2B)在人视网膜内皮细胞(HREC)中的剂量依赖性效应，以及APX2009(图2C)和APX2014(图2D)在Rf/6a脉络膜内皮细胞中的剂量依赖性效应。使用alamarBlue测定法测量体外增殖。示出了中点生长抑制(GI50)值。平均值±S.E.M.，每剂n＝3。
图3A-3D描述了化合物APX2009和APX2014抑制HREC中的S期。在用所示浓度的APX2009和APX2014处理HREC后，检测到(图3A)EdU(红色)和Ki-67(绿色)(图3C)，核(蓝色)用DAPI染色；比例尺＝100μm。图3B示出了EdU的定量。图3D示出了HREC中Ki-67的定量。平均值±S.E.M.，每剂n＝3视野。与DMSO对照(采用Dunnett事后检验的单向方差分析)相比，**，p<0.01；****，p<0.0001。来自三个独立实验的代表性数据，见图4A和图5。
图4A描述了所有剂量的EdU染色的完整视野(与图3A-3D相同的实验)，表明APX2009和APX2014在HREC中剂量依赖地降低DNA合成。比例尺＝100μm。
图4B描述了用于指定治疗的碘化丙啶细胞周期概况。
图4C显示了细胞周期阶段的量化。平均值±S.E.M.，n＝3次独立实验。
图5描述了针对所有剂量的Ki-67染色的各自独立的通道图像(与图3A-3D相同的实验)，表明APX2009和APX2014在HREC中剂量依赖地降低增殖。比例尺＝100μm。
图6A和6B描述了APX2009和APX2014在HREC中不诱导细胞死亡。图6A示出了用于细胞死亡的TUNEL染色(红色)和用于核染色的DAPI(蓝色)。在这些图像中未观察到TUNEL阳性细胞。星形孢菌素充当阳性对照。比例尺＝100μm。图6B示出了定量数据，其显示了各种处理后TUNEL阳性细胞的百分比。平均值±S.E.M.，n＝3。ns，不明显(采用Dunnett事后检验的单向方差分析)。来自两个独立实验的代表性数据。
图7A-7D示出了化合物APX2009和APX2014在体外抑制HREC和Rf/6a细胞中的内皮细胞迁移。图7A描述了APX2009和APX2014对HREC中细胞迁移的影响。经各种处理(显示最高剂量)的HREC成片单层是有伤口的，并对伤口闭合进行8小时监测。图7B示出了对细胞迁移的定量分析，表明APX化合物显著阻断了HREC的迁移。图7C描述了APX2009和APX2014对Rf/6a细胞中细胞迁移的影响。经各种处理(显示最高剂量)的Rf/6a成片单层是有伤口的，并对伤口闭合进行16小时监测。图7D示出了细胞迁移的定量分析，表明APX化合物显著阻断了Rf/6a细胞的迁移。平均值±S.E.M.，每剂n＝3。与DMSO对照(采用Dunnett事后检验的单向方差分析)相比，**，p<0.01；***，p<0.001。比例尺＝500μm。
图8A-8D描述了APX2009和APX2014在体外抑制HREC和Rf/6a细胞的迁移。显示了(图8A)APX2009和(图8B)APX2014对HREC中细胞迁移的影响。用不同浓度的每种化合物处理的HREC成片单层是有伤口的，并对伤口闭合进行8小时监测。显示了(图8C)APX2009和(图8D)APX2014对Rf/6a细胞中细胞迁移的影响。用不同浓度的每种化合物处理的Rf/6a细胞成片单层是有伤口的，并对伤口闭合进行16小时监测。比例尺＝500μm。
图9A-9D描述了化合物APX2009和APX2014在体外抑制HREC和Rf/6a细胞中的内皮管形成。图9A描述了在指定浓度的APX化合物存在下，HREC在基质胶上的管形成；图9B显示了APX2009和APX2014化合物对HREC管形成的定量分析。测量管状长度，并将其表示为相对于DMSO对照。图9C描述了在指定浓度的APX化合物存在下，Rf/6a在基质胶上的管形成；图9D显示了APX2009和APX2014化合物对Rf/6a管形成的定量分析。测量管状长度，并将其表示为相对于DMSO对照。平均值±S.E.M.，n＝3孔。与DMSO对照(采用Dunnett事后检验的单向方差分析)相比，**，p<0.01；***，p<0.001。来自三个独立实验的代表性数据。比例尺＝500μm。
图10A-10D描述了APX2009和APX2014在体外抑制HREC中的内皮管形成。显示了在指定浓度的APX2009(图10A)和指定浓度的APX2014(图10B)存在下，HREC在基质胶上的管形成。此外，显示了在指定浓度的APX2009(图10C)存在下和在指定浓度的APX2014(图10D)存在下Rf/6a细胞在基质胶上的管形成。比例尺＝500μm。
图11A-11D描述了化合物APX2009和APX2014抑制TNF-α介导的NF-κB信号传导和促血管新生靶基因mRNA表达。用指定浓度的APX2009和APX2014处理HREC后，通过免疫荧光检测p65(红色)和用DAPI染色核(蓝色)；化合物剂量相关性地降低了p65核移位，红色和蓝色信号之间的重叠减少证明了这一点。BAY 11-7082是阳性对照NF-κB抑制剂。比例尺＝100μm。HREC中的(图11B)VEGFA、(图11C)VCAM1和(图11D)CCL20 mRNA表达水平。APX2009和APX2014剂量相关性地抑制每种转录物的水平。平均值±S.E.M.，n＝3次技术重复。与DMSO对照相比，*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001(采用Dunnett事后检验的单向方差分析)。来自三个独立实验的代表性数据。
图12A-12D描述了化合物APX2009和APX2014以浓度相关性方式抑制脉络膜长芽。图12A是用指定的APX2009浓度或载体(0.5％DMSO)对照处理后48小时形成的脉络膜长芽的代表性的相衬图像。图12B示出了用ImageJ软件从APX2009处理的脉络膜组织块边缘到芽根末端的四个垂直方向平均的长芽距离的量化。图12C是用指示的APX2014浓度或载体(0.2％DMSO)对照处理后48小时形成的脉络膜长芽的代表性图像。图12D示出了使用ImageJ软件从脉络膜组织块的边缘到芽根末端的四个垂直方向平均的长芽距离的量化。平均值±S.E.M.，n＝4-5个脉络膜/每次治疗；N＝3-4双眼。***，p<0.001；****，p<0.0001(采用Dunnett事后检验的方差分析)。比例尺＝500μm。
图13A-13C描述了在激光诱导的脉络膜新生血管化(L-CNV)小鼠模型中用APX3330的全身性Ref-1抑制阻止了新生血管化。图13A显示了激光后7天获得的代表性光学相干断层扫描(OCT)图像，显示了载体的眼部中的CNV病变(左)和50mg/kg静脉注射APX3330(右)治疗动物。图13B示出了激光治疗后14天来自共聚焦显微镜的凝集素染色的CNV病变的代表性图像。图13C示出了使用ImageJ软件在第14天从Z-堆叠图像对CNV病变血管体积的量化。平均值±S.E.M.，n＝7-9双眼/治疗。*p<0.05(不成对的学生的t检验)。比例尺＝100μm。
图14A-14D描述了L-CNV小鼠模型中腹膜内APX2009抑制脉络膜新生血管化。图14A显示了激光后7天和14天获得的代表性OCT图像，显示了未受影响的对照、载体、静脉注射12.5mg/kg和25mg/kg APX2009化合物且每天注射两次、直到激光治疗后14天的CNV病变。图14B描述了CNV的荧光素血管造影术(FA)，其显示了APX2009对血管渗漏的抑制作用。图14C是来自共聚焦显微镜的代表性图像，用于激光治疗后14天的凝集素染色的CNV病变。图14D示出了使用ImageJ软件在第14天从Z-堆叠图像对CNV病变血管体积的量化。平均值±S.E.M.，n＝8-10双眼/治疗。ns，不明显；与DMSO对照相比，***，p<0.001(采用Tukey事后检验的单向方差分析)。比例尺＝100μm。
图15A-15C描述了APX2009在L-CNV小鼠模型中抑制脉络膜新生血管化。图15A描述了激光治疗后14天的L-CNV病变中的双染色凝集素和Griffonia simplicifoliaisolectin B4(GSIB4)共聚焦图像。图15B示出了在第14天使用ImageJ软件对来自GS-IB4染色的图像的Z-堆叠的CNV病变血管体积的量化。ns，不明显；****，p<0.0001(采用Tukey事后检验的单向方差分析)。图15C示出了在14天内载体和APX2009注射组的小鼠体重的量化。在任何时间点(重复测量双向方差分析)，各治疗之间的体重均没有观察到显著差异。平均值±S.E.M.，n＝8-10双眼/治疗。比例尺＝100μm。
图16描述了已知的HIF-调控基因的样品数据，该基因被HREC中APX2009的指定浓度下调。通过主成分(PC)回归对RNA-Seq数据进行分析，其中重要基因与APX2009处理的PC的关联性r>0.42。途径富集分析(pathway enrichment analysis)显示，这些基因富集受HIF1A(p＝0.02)调控。
图17描述了Ref-1在湿性AMD中被上调。对Ref-1染色(棕色)的人眼切片显示在内核层(INL)、外核层(ONL)和脉络膜的核中表达，特别是在湿性AMD中，而不是在年龄相匹配的对照中。比例尺＝50μm。GCL，神经节细胞层。
具体实施方式
本公开内容总体上涉及APE1抑制剂，例如3-[(5-(2,3-二甲氧基-6-甲基-1,4-苯醌基)]-2-壬基-2-丙烯酸(APX3330)和/或其衍生物(例如，[(2E)-2-[(3-甲氧基-1,4-二氧代-1,4-二氢萘-2-基)亚甲基]-N,N-二乙基戊酰胺](APX2009)和(2E)-2-[(3-甲氧基-1,4-二氧代-1,4-二氢萘-2-基)亚甲基]-N-甲氧基戊酰胺](APX2014))，用于抑制眼部新生血管化。另外，本公开内容涉及APX2009和APX2014在治疗诸如增生性糖尿病视网膜病变(PDR)、早产儿视网膜病变(ROP)和与年龄相关的湿性黄斑变性(AMD)等疾病中的用途。
在合适的实施方案中，本公开内容包括向有需要的受试者施用有效量的APE1抑制剂，该APE1抑制剂能够与APE1蛋白相互作用，从而引起APE1蛋白在APE1的氨基末端部分中展开，抑制APE1与神经元中其他蛋白质相互作用或执行其氧化还原信号功能的能力。更特别地，本公开内容中使用的APE1抑制剂阻断APE1/Ref-1将NF-κB和AP-1从氧化态转化为还原态的能力，从而改变其转录活性。
因此，在特别合适的实施方案中，APE1抑制剂具有下式：
Figure BDA0002711687210000091
其中R1选自烷基、烷氧基、羟基和氢；R2是烷基；R3和R6独立地选自烷氧基和芳基；R4和R5独立地选自烷氧基和芳基，或者R4和R5一起形成取代或未取代的萘醌；
X选自CH＝CR2和NCH，其中R2选自C1-C10烷基和CF3CH2CH2；和
Y选自N(Rz)R2或NR∧OR∧，其中Rz独立地选自C1-C6烷基、杂烷基、环烷基和环杂烷基，直链或支链或任选取代的基团，或者Rz和R2与连接的氮一起形成任选取代的杂环；其中每个R∧独立地选自氢、烷基、杂烷基、环己基和环杂烷基，它们各自被任选取代，或者两个R∧与连接的氮和氧一起形成任选取代的杂环。
特别合适的APE1抑制剂包括3-[(5-(2,3-二甲氧基-6-甲基-1,4-苯醌基)]-2-壬基-2-丙烯酸(以下称为“E3330”或“3330”或“APX3330”)和/或其类似物(例如，[(2E)-2-[(3-甲氧基-1,4-二氧代-1,4-二氢萘-2-基)亚甲基]-N,N-二乙基戊酰胺](以下称为“APX2009”)、(2E)-2-[(3-甲氧基-1,4-二氧代-1,4-二氢萘-2-基)亚甲基]-N,N-二甲基戊酰胺](以下称为“APX2007”)、(2E)-2-[(3-甲氧基-1,4-二氧代-1,4-二氢萘-2-基)亚甲基]-N-甲氧基戊酰胺](以下简称“APX2014”)、(2E)-2-(3-甲氧基-1,4-二氧代-1,4-二氢萘-2-基)-N,N,2-三甲基丙-2-烯酰胺(以下称为“APX2032”))。其他合适的类似物如下所示以及如表1中所示。关于APX3330的更多信息可以在Abe等人的美国专利第5,210,239号中找到，关于APX2009的信息可以在Kelley等人的J Pharmacol Exp Ther.2016年，11月，359(2)：300-309中找到，每一个都在此通过引用纳入本文，其范围与此一致。
Figure BDA0002711687210000101
Figure BDA0002711687210000111
Figure BDA0002711687210000121
Figure BDA0002711687210000131
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在本文中发现，APE1抑制剂，特别是APX2009和/或APX2014的施用，抑制APE1蛋白与神经元中的其他蛋白相互作用。特别是，APX2009和APX2014通过阻止Ref-1诱导的转录因子(可能的候选因子包括NF-κB和HIF-1α，两者均可调控VEGF)的活化来发挥其抗血管生成作用。
用于本发明方法中的APE1抑制剂，其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物的合适剂量将取决于许多因素，包括：例如个体的年龄和体重、需要治疗的眼部新生血管化有关的病症或疾病的严重程度、组合物的性质、给药途径及其组合。最终，本领域技术人员(例如，医师、兽医、科学家以及其他医学和研究专业人员)可以容易地确定合适的剂量。例如，本领域技术人员可以以低剂量开始，可以增加剂量直至达到期望的治疗效果或结果。可选地，本领域技术人员可以以高剂量开始，可以降低剂量直至达到实现期望的治疗效果或结果所需的最小剂量。
在一个特别合适的实施方案中，APE1/Ref-1抑制剂是APX2009，并且每天向受试者施用约12.5mg/kg至约35mg/kg的APX2009。
在一个特别合适的实施方案中，APE1/Ref-1抑制剂是APX2014，并且每天向受试者施用约12.5mg/kg至约35mg/kg的APX2014。
在一些实施方案中，通过包含APE1抑制剂和药学上可接受的载体的组合物施用APE1抑制剂。药学上可接受的载体可以是，例如，赋形剂、载体(vehicles)、稀释剂及其组合。例如，当组合物要口服时，它们可以配制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂或糖浆剂。或对于肠胃外给药，它们可以配制成注射剂(肌肉内的，皮下的，髓内的，鞘内的，心室内的，静脉内的，玻璃体内腔的)、滴注剂或栓剂。这些组合物可以通过常规方法制备，并且如果需要，可以将活性化合物(例如，APX2009，APX2014)与任何常规添加剂(例如，赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、增溶剂、助悬剂、乳化剂、涂层剂或其组合)混合。
应该理解，本发明的药物组合物可以进一步包括其他已知的治疗剂、药物，将合成化合物修饰成前药等，以减轻、介导(mediating)、预防和治疗本文所述的疾病、病症和疾患。例如，在一个实施方案中，APE1抑制剂可以与用于治疗眼部新生血管化的一种或多种当前的治疗剂和药物(例如，抗VEGF治疗，包括：例如，抗VEGF生物制剂(如兰尼单抗、贝伐单抗、阿柏西普)；血管生成因子的反义RNA、RNA沉默(RNA silencing)或RNA干扰(RNAi)，包括：靶向VEGF表达的核糖酶；SRPK家族激酶抑制剂，
Figure BDA0002711687210000171
和其他靶向血小板衍生生长因子(PDGF)的药剂；角鲨胺((1S,2S,5S,7R,9R,10R,11S,14R,15R)-N-{3-[(4-氨基丁基)氨基]丙基}-9-羟基-2,15-二甲基-14-[(2R,5R)-6-甲基-5-(磺氧基)庚-2-基]四环[8.7.0.0^{2,7}.0^{11,15}]十七烷-5-铵)；X-82(Tyrogenix，马萨诸塞州尼德姆高地)；PAN-90806(PanOptica，新泽西州伯纳兹维尔)；TNP470(Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯)和夫马菌素(2E,4E,6E,8E)-10-{[(3R,4S,5S,6R)-5-甲氧基-4-[(2R)-2-甲基-3-(3-甲基丁-2-烯基)环氧乙烷-2-基]-1-氧杂螺[2.5]辛-6-基]氧}-10-氧代-癸-2,4,6,8-四双链酸)；蛋白激酶C抑制剂；VEGF受体激酶抑制剂；色素上皮衍生因子(PEDF)；内皮抑素；血管抑素；醋酸阿奈可他；氟羟氢化泼尼松((11β,16α)-9-氟-11,16,17,21-四羟基孕-1,4-二烯-3,20-二酮)；维替泊芬(3-[(23S,24R)-14-乙烯基-5-(3-甲氧基-3-氧代丙基)-22,23-双(甲氧羰基)-4,10,15,24-四甲基-25,26,27,28-四氮杂六环[16.6.1.13,6.18,11.113,16.019,24]二十八烷醇-1,3,5,7,9,11(27),12,14,16,18(25),19,21-十二碳烯-9-基]丙酸；卟吩姆钠(光卟啉)；维生素和矿物质(维生素C和E、β-胡萝卜素、锌、铜、叶黄素、玉米黄质、ω-3脂肪酸)等)一起使用。
用于本发明方法中的包括APE1抑制剂和/或药物载体的药物组合物可以被施用于有需要的个体/受试者。如本文所用，“有需要的受试者”是指处于眼部疾病和/或眼部新生血管化风险中或患有眼部疾病和/或眼部新生血管化的个体，或处于眼部疾病和/或与眼部新生血管化有关的疾病或病症的风险中或患有眼部疾病和/或与眼部新生血管化有关的疾病或病症的个体(例如，早产儿视网膜病变(ROP)，增生性糖尿病视网膜病变(PDR)，糖尿病性视网膜病变，与年龄相关的湿性黄斑变性(AMD)，病理性近视，高血压性视网膜病变，闭塞性脉管炎，息肉样脉络膜血管病，糖尿病性黄斑水肿，葡萄膜性黄斑水肿，视网膜中央静脉阻塞，视网膜分支静脉阻塞，角膜新生血管化，视网膜新生血管化，眼组织胞浆病，新生血管性青光眼，视网膜细胞瘤等等，及其组合)。另外，本文中还使用“有需要的受试者”来指处于眼部新生血管化或与眼部新生血管化有关的疾病或病症的风险中或被医疗专业人员诊断为具有眼部新生血管化或与眼部新生血管化有关的疾病或病症的个体。这样，在一些实施例中，本文公开的方法针对普通人群的子集，使得在这些实施例中，并非所有普通人群都可以从该方法中受益。基于前述内容，因为本发明某些方法实施例针对已识别个体的特定子集或子类(即，“需要”协助解决本文所述的一个或多个特定疾患的受试者的子集或子类)，则并非所有个体都属于本文所述的个体的子集或子类。特别地，需要帮助的个体是人类。例如，需要帮助的个体也可以是一种研究动物，比如非人类的灵长类动物、小鼠、大鼠、兔子、牛、猪，以及本领域技术人员所知道的其他类型的研究动物。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。
本发明的这些实施例和其他实施例的各种功能和优点将通过下面所示的实施例得到更全面的理解。这些实施例旨在说明目前披露的好处，但没有举例说明披露的全部范围。
实施例
实施例1
在该实施例中，分析了APX2009和APX2014对AP-1DNA结合以及细胞增殖和迁移的功能。
材料和方法
合成方法。化合物通过Cascade Custom Chemistry(Eugene，OR)合成，并由Apexian Pharmaceuticals提供。总而言之(图1A)，iodolawsone(2-碘-3-羟基-1,4-萘醌)可从Cascade Custom Chemistry获得。使用Alltech Alltima C185u色谱柱(250×5.6mm，流速1mL/min)在40℃下进行HPLC。采用水：A1：甲醇为15:10:75的流动相洗脱，其中使用700mL的水、300mL的甲醇和3mL的三甲胺制得A1，并向其中加入磷酸使pH达到3.4。
(E)-2-((3-羟基-1,4-二氧代-1,4-二氢萘-2-基)亚甲基)戊酸(3)。在配有机械搅拌器和气体分散烧结管的2L 3-颈烧瓶中，放入2-碘代-3-羟基-1,4-萘醌(iodolawsone，1)(18g，0.06mol)和2-丙基丙烯酸2(17.1g，0.15mol)于碳酸钾(41.4g，0.3mol)与水(600mL)的溶液中。搅拌反应混合物，并用氩气吹扫30分钟。加入乙酸钯(II)(0.67g，0.003mol)，并继续吹扫另外的30分钟。将得到的混合物在油浴中于100℃加热。HPLC分析显示，1小时后反应完成。将反应混合物冷却至室温，并将黑色的Pd金属过滤。将滤液置于装有机械搅拌器的2L 3-颈烧瓶中，在冰甲醇浴中冷却，并用50％H3PO4(160mL)酸化至pH 2。搅拌1小时后，收集固体，并用水(1L)、20％丙酮于水(500mL)的混合物进行洗涤，并风干，得到12.3g(72％)的深黄色固体状的(3)。HPLC分析显示纯度为98％。NMR(d6-DMSO)δ12.6(br s,1H),11.65(brs,1H),8.0(m,2H),7.8(m,2H),7.15(s,1H),2.1(m,2H),1.4(m,2H),0.8(m,3H)。
(E)-2-((3-羟基-1,4-二氧代-1,4-二氢萘-2-基)亚甲基)戊酰氯(4)。在室温下于20分钟内，向(3)(4.0g，0.014mol)和DMF(0.1mL)在二氯甲烷(75mL)的悬浮液中加入草酰氯(17.5mL 2M的CH2Cl2溶液，0.035mol)。将所得混合物在室温搅拌过夜，然后在减压下浓缩，得到4.5g(100％)(4)，为棕色固体。该固体直接用于下一步。NMR(CDCl3)δ7.8-8.2(m,2H),7.7-7.8(m,2H),7.4(s,1H),2.1-2.4(m,2H),1.2-1.7(m,2H),0.6-1.0(m,3H)。
(E)-N,N-二乙基-2-((3-氯-1,4-二氧代-1,4-二氢萘-2-基)亚甲基)戊酰胺(5a)。在室温下于45分钟以内，向粗品(4)(9.7g，0.03mol)于二氯甲烷(50mL)的溶液中加入二乙胺盐酸盐(4.97g，0.045mol)和二异丙胺(11.6g，0.09mol)于二氯甲烷(50mL)中的溶液。HPLC分析表明，15分钟后反应完成。反应混合物用水(100mL)、1M HCl(2×100mL)和盐水(100mL)洗涤。有机相用1PS纸干燥并浓缩成深红色固体。固体经含无水硫酸钠(20g)的硅胶(150g)快速层析，上部填充正己烷。柱子采用125mL的15％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱馏分1-4，采用25％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱馏分5-8，采用35％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱馏分9-16，以及采用50％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱馏分17-32。通过TLC(乙酸乙酯：己烷；1:1)核对所有馏分，并且通过HPLC核对一些馏分。将产物在馏分21至30中洗脱。将它们合并并在减压下浓缩，得到橙色固体。将该固体悬浮在15％乙酸乙酯的己烷(50mL)溶液中，搅拌15分钟。收集固体并风干，得到6.7g(62％)的橙色固体的(5a)。HPLC分析显示，纯度为99％。NMR(CDCl3)δ8.1-8.3(m,2H),7.7-7.8(m,2H),6.1(s,1H),3.6(br d,4H),2.2(t,2H),1.45(m,2H),1.25(br s,(6H),0.9(t,3H)。
(E)-N-甲氧基-2-((3-氯-1,4-二氧代-1,4-二氢萘-2-基)亚甲基)戊酰胺(5b)。在氩气下以及室温冷却的水浴中，在1小时内，向粗品(4)(由DCM(300mL)中的(3)(20.0g，0.7mol)与DMF(0.5mL)和草酰氯(2M，在DCM中，87.5mL，0.0175mol)制得)在100mL DCM中的溶液，加入甲氧基胺盐酸盐(7.0g，0.084mol)和DIPEA(27.1g，0.21mol)于DCM(100mL)中的溶液。30分钟后，HPLC显示反应完成。混合物用水(100mL)、1M HCl(100mL)和盐水(100mL)洗涤。有机相用1PS纸干燥并浓缩成橙色油。将粗油在硅胶(350g)上用己烷/EtOAc进行色谱分离。产物用60％EtOAc/己烷洗脱。合并纯馏分，得到19g固化的油。将该固体与己烷(100mL)一起研磨，过滤，得到98％纯度的16.6g黄色固体形式的(5b)(71％)。
(E)-N,N-二乙基-2-((3-甲氧基-1,4-二氧代-1,4-二氢萘-2-基)亚甲基)戊酰胺(6a)。在氩气吹扫下，向(5a)(5.0g，0.014mol)的甲醇(100mL)溶液中，一次性加入甲醇钠的甲醇溶液(4.2mL，5M的MeOH溶液)。30分钟后，HPLC显示反应完成。通过使用3M HCl(3.5mL)将反应混合物酸化至pH 3，然后在减压下浓缩。将得到的残渣溶于乙酸乙酯(150mL)，采用水(2×75mL)和盐水(1×100mL)洗涤，通过1PS滤纸过滤并在减压下浓缩以产生固化的油。将该固体与己烷(50mL)一起研磨30分钟，并收集固体并风干，得到4.8g(96％)的(6a)，APX2009，为浅橙色固体。HPLC分析显示，纯度为99％。NMR(CDCl3)δ8.15(m,2H),7.75(m,2H),6.2(s,1H),4.1(s,3H),3.6(br d,4H),2.2(t,2H),1.4(m,4H),1.25(br d,4H),0.85(t,3H)。
(E)-N-甲氧基-2-((3-甲氧基-1,4-二氧代-1,4-二氢萘-2-基)亚甲基)戊酰胺(6b)。在氩气吹扫下，向(5b)(10.0g，0.03mol)的甲醇(100mL)溶液中，一次性加入甲醇钠的甲醇溶液(9.0mL，5M的MeOH溶液)。30分钟后，HPLC显示反应完成。使用3M HCl将混合物酸化至pH 2-3。将该混合物减压浓缩至残渣。将残渣溶于乙酸乙酯(150mL)中，并用水(100mL)和盐水(100mL)洗涤。将有机相用1PS纸干燥，并在减压下浓缩成固化的油。将该固体与己烷(150mL)一起研磨30分钟，并过滤，得到8.7g(83％)的(6b)，APX2014，为黄色固体。HPLC分析显示，纯度为99％。NMR(CDCl3)δ8.8(br s,1H),8.1(m,2H),7.75(m,2H),6.7(s,1H),4.15(s,3H),3.9(s,3H),2.2(m,2H),1.4(m,2H),0.85(t,3H)。
合成APX3330，如Luo等，Antioxid Redox Signal 10：18531867(2008)中所述。
电泳迁移率变动测定法(EMSA)。如先前所述进行这些测定(Luo等人，AntioxidRedox Signal 10:18531867(2008)；Kelley等人，Antioxid Redox Signal14:1387-1401(2011)；Su等人，Biochemistry 50:82-92(2011)；Luo等人，Biochemistry 51:695-705(2012)；Zhang等人，Biochemistry 52:2955-2966(2013))。简而言之，将增量的APX3330、APX2009或APX2014与纯化的Ref-1蛋白在EMSA反应缓冲液中预培养30分钟。使用AP-1靶向DNA序列和AP-1蛋白进行EMSA测定。
细胞。主要的人视网膜微血管内皮细胞(HREC)获自Cell Systems，Inc.(Kirkland，WA)，而Rf/6a猕猴脉络膜内皮细胞系获自ATCC(Manassas，VA)。对细胞进行维护，如此(Basavarajappa等人，EMBO Mol Med 9:786-801(2017))所述，至少每年重新排序一次，并定期评估支原体污染。
体外细胞增殖测定。如先前所述测量内皮细胞增殖(Basavarajappa等人，PLoSOne 9:e95694(2014)；Basavarajappa等人，EMBO Mol Med 9:786-801(2017))。简而言之，将2.5×103个细胞接种到100μL的生长培养基中，并铺在96孔透明底黑色平板的每个孔中，并培养24小时。加入APX2009、APX2014或DMSO载体(DMSO最终浓度＝1％)，然后将平板在100μL完全培养基中于37℃和5％CO2下培养24-48小时。将AlamarBlue试剂(11.1μL)添加到平板的每个孔中，并在4小时后使用Synergy H1平板阅读器(BioTek，Winooski，VT)在激发和发射波长分别为560nm和590nm处获取荧光读数。GI50是使用GraphPad Prism v.7.0计算的。
EdU公司，Ki-67染色和TUNEL。除了使用室玻片而不是盖玻片外，这些测定方法如先前所述(Basavarajappa等人，PLoS One 9:e95694(2014)；Basavarajappa等人，EMBO MolMed 9:786-801(2017))进行。简而言之，将细胞(每孔30,000个)接种在涂覆有附着因子的8孔室玻片上，并使其附着过夜。用指定的化合物浓度处理细胞17小时(过夜)。为了测定增殖，将细胞与EdU在完全培养基中于37℃下培养8小时。然后将细胞在4％多聚甲醛中固定20分钟，并使用于PBS中制备的0.25％Triton X-100透化。将细胞与抗Ki-67(D3B5)的兔特异性单克隆抗体(#9129；Cell Signaling，Danvers，MA)(1:400)在4℃下培养过夜。第二抗体是Alexa Fluor山羊抗兔488(A11034；Invitrogen，Carlsbad，CA)，其带有用于核染色的DAPI复染色。使用Click-iT EdU成像试剂盒(Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚)检测掺入EdU的增殖细胞。或者，按照制造商的说明，使用Click-iT TUNEL检测试剂盒(Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚)对凋亡细胞进行可视化，用Hoechst33342复染色进行核染色，并用1μM星形孢菌素进行17小时处理作为阳性对照。使用Zeiss AxioImager D2显微镜或LSM 700共聚焦显微镜对细胞成像，并使用ImageJ软件在每个孔的三个低倍(TUNEL)或高倍(Ki-67和EdU)视野计数阳性细胞的百分比。
细胞周期分析。HREC(2×106)在EGM-2培养基中生长。将细胞在EBM-2培养基中血清饥饿过夜，然后在完全培养基中用指定浓度的APX2009或APX2014以及DMSO对照处理24小时。将细胞在冰冷的PBS中洗涤两次，然后在4℃下的66％乙醇溶液中固定过夜。将固定的细胞再次在冰冷的PBS中清洗两次，然后37℃下将颗粒物在碘化丙锭染色溶液中重悬30分钟(20μg/mL碘化丙锭在含0.1％Triton X-100和100μg/mL的核糖核酸酶A的1xPBS中制得)。培养之后将细胞用流式细胞仪(FACSCalibur，BD Biosciences，加利福尼亚州圣何塞)分析。脉冲形状分析用于排除双峰和碎屑。然后使用ModFit软件(v.5.0)通过FL2面积直方图评估单个细胞群体，并生成细胞周期图。
体外细胞迁移测定。监测内皮细胞迁移，如先前所述(Basavarajappa等人，PLoSOne 9:e95694(2014)；Basavarajappa等人，EMBO Mol Med 9:786-801(2017))。简而言之，将HREC和Rf/6a生长至在12孔板中融合。使用无菌的10μL微量移液器吸头，在每个孔的中心划伤伤口，并将包含DMSO(DMSO最终浓度＝1％)或不同浓度APX2009化合物或APX2014化合物的新鲜完全培养基加入孔中。通过数字亮视野显微镜在不同时间点对孔成像，并手动计数迁移到划痕区域的细胞数量。
体外基质管腔形成测定。监测HREC和Rf/6a细胞在体外形成管腔的能力，如之前所述(Basavarajappa等人，PLoS One 9:e95694(2014)；Basavarajappa等人，EMBO Mol Med9:786-801(2017))。简而言之，将细胞用指定浓度的APX2009化合物或APX2014化合物或DMSO处理48小时，然后将100μL含有DMSO(DMSO最终浓度＝1％)或APX化合物的生长培养基中的1.5×104个细胞添加到预涂覆有50μL Matrigel基膜的96孔平板的每个孔中。使用ImageJ软件(v.1.48；http：//image.bio.methods.free.fr/ImageJ/？Angiogenesis-Analyzer-for-ImageJ.html)中的血管生成分析器插件，在不同时间点拍摄每个孔的数码照片以测量体外管腔的形成。
NF-κBp65核移位测定。NF-κB核移位测定是通过在涂覆有附着因子的8孔室玻片上接种30,000HREC/孔进行的。将细胞在EGM-2培养基中生长过夜，然后使用指定浓度的APX2009和APX2014或10μM BAY 11-7082(西格玛，圣路易斯，密苏里州)作为阳性对照NF-κB抑制剂处理。培养17小时后，用指示浓度的化合物或DMSO的EBM-2(最小培养基)替换培养基1小时。然后在37℃下，在EBM-2中用10ng/ml TNF-α刺激细胞20分钟，以激活NF-κB。然后将细胞固定在4％多聚甲醛中，并使用于PBS中制备的0.5％Triton X-100溶液透化。将细胞与抗NF-κBp65的单克隆抗体(sc-8008；Santa Cruz，Santa Cruz，CA)(1:50)在4℃下培养过夜，然后与Alexafluor 555山羊抗小鼠二级抗体(1:2000)培养一小时。用Hoechst 33342对细胞进行反染色，以实现核染色，然后使用Everbrite hardset固封介质进行固封。使用Zeiss AxioImager D2显微镜对细胞成像。
qRT-PCR。测定的进行，如先前所述(Basavarajappa等人，PLoS One9:e95694(2014)；Basavarajappa等人，EMBO Mol Med 9:786-801(2017))。从使用Trizol(Invitrogen)指示处理的细胞中提取RNA。使用随机引物和iScript逆转录酶(Bio-Rad，Hercules，CA)从1μg RNA合成cDNA。在384孔板中以10μL体积将PCR进行定量，在ViiA7热循环仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)上使用Fast Advanced Master Mix和TaqMan探针进行。使用的引物/探针如下：VEGFA(Hs00900055_m1)，VCAM1(Hs01003372_m1)和CCL20(Hs01011368_m1)，以及管家基因对照HPRT(Hs02800695_m1)和TBP(Hs00427620_m1)。使用ΔΔCt方法分析数据。将基因的表达水平相对于两个管家基因进行标准化，并针对DMSO处理的样品进行校准。
动物。所有动物实验均得到印第安纳大学医学院机构动物护理和使用委员会的批准，并遵循视觉和眼科学研究协会关于在眼科和视觉研究中使用动物声明的指南。6-8周龄的野生型雌性C57BL/6小鼠购自Envigo(印第安纳州印第安纳波利斯；用于脉络膜长芽实验)或Jackson实验室(ME，Bar Harbor，用于L-CNV)，并在标准条件下饲养(Wenzel等人，MolVis 21:515-522(2015))。通过腹膜内注射90mg/kg盐酸氯胺酮和5mg/kg甲苯噻嗪对小鼠在所有程序进行麻醉，并腹膜内注射阿替美唑(1mg/kg)来逆转。治疗按笼随机分配。
脉络膜长芽测定。评估离体脉络膜长芽，如先前所述(Sulaiman等人，Sci Rep 6:25509(2016)；Basavarajappa等人，EMBO Mol Med 9:786-801(2017))。简而言之，从7至8周龄的小鼠眼中将脉络膜-巩膜解剖，并将碎片包埋在基底膜基质中(生长因子降低)，并在含有抗生素的EGM-2培养基中生长72小时，以使其开始长芽。加入指示浓度的APX2009化合物和APX2014化合物(在DMSO中，最终的DMSO浓度分别为0.5％和0.2％)，并使生长进行48小时。拍摄图像并通过使用ImageJ软件在每个样品的四个方向上测量脉络膜片边缘到生长前沿的距离来量化生长。
激光诱导的脉络膜新生血管化。诱导L-CNV，如先前所述(Sulaiman等人，J OculPharmacol Ther 31：447-454(2015)；Sulaiman等人，Sci Rep 6:25509(2016)；Basavarajappa等人，EMBO Mol Med 9:786-801(2017))。假设30％的变异性，则研究具有80％的机会检测到50％的效应量差异，α＝0.05。简而言之，将麻醉小鼠的瞳孔用1％的托品酰胺(Alcon Laboratories Inc.，Forth Worth，TX)扩张，并用羟丙甲纤维素眼科缓和溶液(Gonak)(Akorn，Lake Forest，IL)润滑。使用盖玻片可以观察眼部的后极。532nm眼科氩绿激光与裂隙灯(50μm光斑大小，50ms持续时间和250mW脉冲)耦合的三次烧伤分别传递到3点、9点和12点的方位，视盘的两盘直径。激光光凝后感觉到的鼓泡或爆裂声被认为是Bruch膜的成功破裂。从该实施例中排除未观察到鼓泡的病变。为了评估APX3330的抗血管生成活性，将小鼠腹膜内注射化合物(50mg/kg体重)，每天两次，5天注射/2天休息，如先前体内使用的那样(Fishel等，Mol Cancer Ther 10:1698-1708(2011)；Lou等.，Oncol Lett 7：1078-1082(2014)；Biswas等人，Am J Physiol Cell Physiol 309:C296-307(2015))。载体是PBS中42％氢化蓖麻油：2％乙醇。对于APX2009，除非另有说明，否则剂量为12.5mg/kg体重或25mg/kg体重，每天两次直至激光治疗14天。载体是丙二醇、Kolliphor HS15、吐温80(PKT)(McIlwain等人，Oncotarget doi.org/10.18632/oncotarget.23493.(2017))。每天对小鼠称重。
体内成像。在指定的时间使用Micron III眼内成像系统(Phoenix ResearchLabs，Pleasanton，CA)，在L-CNV小鼠上进行光学相干断层扫描(OCT)，如前所述(Sulaiman等，Sci Rep 6:25509(2016))。简而言之，在操作之前，将麻醉过的小鼠眼部用1％的托品酰胺溶液(Alcon，Fort Worth，TX)扩张，并用羟丙甲纤维素眼科缓和剂溶液(Gonak)(Akorn，Lake Forest，IL，USA)润滑。然后将小鼠放在定制的加热台上，该加热台可以自由移动以定位小鼠眼部以进行成像。每个病变均拍摄了几个水平的和垂直的OCT图像。激光照射后14天，通过腹膜内注射50μL 25％荧光素钠(Fisher Scientific，匹兹堡，宾夕法尼亚州)进行荧光素血管造影。使用Micron III系统和Streampix软件拍摄眼底图像。
脉络膜铺片免疫荧光。L-CNV诱导后14天，获得小鼠眼睛。摘除眼球，并在4％多聚甲醛/PBS中固定过夜。去除眼前节、晶状体和视网膜，并准备后眼杯以用于脉络膜铺片。将后眼杯用PBS洗涤，并在含0.3％Triton X-100、5％牛血清白蛋白(BSA)的封闭缓冲液中于4℃下透化2小时。封闭后，在4℃下，用罗丹明标记的蓖麻凝集素I(Vector Labs，Burlingame，CA)和来自Griffonia simplicifolia的Alexa FluorTM 488共轭-同工凝集素B4(GS-IB4)(Molecular Probes，Thermo Fisher Scientific)在浓度为1:250的缓冲液中(含0.3％Triton X-100和0.5％BSA的PBS)中对眼杯的脉管系统进行双重染色16–20小时。抗体培养后，将全部铺片用PBS洗涤3次，每步在4℃下用0.1％Triton X-100洗涤15分钟。洗涤后，将脉络膜铺片封固于水性封固介质(VectaShield；Vector Laboratories，Inc.)中，盖上盖玻片，以通过共聚焦Z堆叠成像(LSM 700，Zeiss，Thornwood，NY)进行观察，以估计病变体积。每个光学切片的染色面积之和乘以切片之间的距离(3μm)，得出CNV病变体积，并使用ImageJ软件定量病变体积。如果病变符合已发布的质量控制标准，则病变仅用于分析(Poor等人，Invest Ophthalmol Vis Sci 55:6525-6534(2014))。将眼睛中的所有病变平均以代表单个n。
统计分析。使用GraphPad Prism 7软件进行统计分析。采用Dunnett事后检验的单向方差分析用于迁移、管腔形成和脉络膜长芽实验。单向方差分析与Tukey的事后检验一起用于APX2009体内实验。APX3330体内实验使用未配对的学生t检验。两侧p值<0.05被认为具有统计学意义。
结果
Ref-1抑制剂APX2009和APX2014比APX3330更有效。合成了APX2009(6a)和APX2014(6b)(图1A)，与APX3330(7)(图1B)相比，证明这两种化合物对Ref-1诱导的转录因子与DNA结合的抑制作用均得到增强，具有实质不同的理化特性。新化合物具有较低的分子量，并且没有APX3330的羧酸酯基和长烷基链。通过计算机基于clogP值(APX3330＝4.5，APX2009＝2.7和APX2014＝1.9)的计算确定，新化合物的亲油性也显著降低。
APX2009和APX2014阻断内皮细胞增殖。存活率提高的内皮细胞增殖支持细胞组成新的血管，从而致使血管生成。进行增殖的测定以便测量血管生成的或抗血管生成的活性。作为我们这两种新的Ref-1抑制剂的抗血管生成潜能的初步测试，评估了它们抑制HREC和Rf/6a脉络膜内皮细胞增殖的能力(图2A-2D)。两种化合物在alamarBlue分析中均剂量依赖性地阻断了两种细胞类型的增殖，其中APX2014的效力比APX2009更强。如其他抗血管生成化合物所示，原发性HREC对这两种化合物的敏感性均高于Rf/6a脉络膜细胞系。
APX2009和APX2014在不诱导凋亡的情况下阻断了S期。在HREC中更详细地评估了化合物的活性。两种化合物都减少了通过S期的细胞数量，这通过减少的Ki-67染色和减少的EdU掺入得到证明(图3A-3D；图4A和图5)。在高剂量的化合物下，G0/G1期内的细胞适度增加，同时G2/M期内的细胞也随之减少，这也是显而易见的(图4B和4C)。然而，如通过TUNEL评估的，没有化合物以抗增殖剂量诱导细胞凋亡(图6A和6B)。
APX2009和APX2014阻断了内皮细胞的迁移。新生血管化涉及一系列协同事件，包括细胞外基质降解、细胞迁移、细胞增殖和内皮细胞形态发生。为了了解APX2009和APX2014化合物对内皮细胞迁移的影响，进行了刮擦-创伤试验(图7A-7D；图8A-8D)。两种化合物在此再次是剂量-依赖有效的，在这些测定的短时间内没有引起明显的细胞毒性。
APX2009和APX2014阻断了内皮细胞管的形成。内皮细胞在细胞外基质(如，基底膜基质)上覆盖后，组织并形成毛细血管状结构。将内皮细胞组织成三维管网络对于血管生成至关重要。这样，基底膜基质管形成测定法是体内血管生成潜能的良好体外预测指标。在该测定中，APX2009和APX2014两者均以比单独抑制迁移所需的浓度低的浓度显著地抑制管形成，强有力地说明抗血管生成活性(图9A-9D；图10A-10D)。
APX2009和APX2014抑制NF-κB活性。由于在以前Ref-1抑制曾与NF-κB活性降低有关(Shah等人，2017)，因此根据对HREC中化合物的反应评估了该通路的活性，以确定APX2009和APX2014是否通过预期的机制发挥作用。首先，根据对TNF-α的反应(通路活性的关键指标)评估了NF-κB的p65亚单位向核内的移位。在APX2009-处理和APX2014-处理的HREC中，p65的移位是剂量-依赖性地减弱(图11A)。此外，VEGFA、VCAM1以及CCL20的mRNA的生成，其全部都在NF-κB下游，被这些化合物降低了3至10倍(图11B，11C和11D)。
在离体情况下，APX2009和APX2014阻断了血管生成。作为活性的进一步测试，使用鼠类脉络膜外植体的脉络膜长芽测定法用于测试组织中复杂的微血管床中的APX化合物的功效(图12A-12D)。在该测定中，脉络膜细胞从脉络膜组织块中生长到周围的基底膜基质中。两种化合物均显著减少了长芽，而APX2014的功效更高。与对照相比，在10μM下，APX2009使长芽减少了约70％(图12A和12B)，而与对照相比，在1μM(测试的最高浓度)下，APX2014使长芽减少了约60％(图12C和12D)。
用母体化合物APX3330的全身Ref-1抑制可以预防L-CNV。先前通过使用APX3330的Ref-1抑制来减弱眼部新生血管化的努力依赖于化合物的玻璃体内递送。尽管这是标准治疗抗-VEGF生物制剂的递送途径，并且确保药物到达人体的正确位置，但它劳动强度大，使患者感到不适，并存在潜在地视力威胁的眼内炎的风险。因此，探讨了全身(腹膜内)Ref-1抑制是否可以为L-CNV的治疗提供替代途径。作为概念验证阶段的证明，采用腹膜内注射第一代Ref-1抑制剂APX3330(7)，递送50mg/kg，每日两次，5天给药/2天休息，持续2周。选择这种给药方案是因为它先前在临床前肿瘤研究中是成功且无毒的。用APX3330治疗的动物表现出明显降低的L-CNV体积(图13A-13C)。
更有效的衍生物APX2009的全身给药显著降低了L-CNV。考虑到APX3330是一种有效的全身性L-CNV抑制剂，对新二代Ref-1抑制剂的效果进行了分析。
选择APX2009用于该实验，因为以前已在动物中对其进行了安全剂量。使用先前采用的两种剂量方案，即使用12.5mg/kg或25mg/kg，每天两次，持续两周。较低的剂量没有降低L-CNV，但是25mg/kg的剂量具有显著的作用(图14A-14D)。通过在第7天进行的OCT成像，定性地证明了这一点，并且在第14天时更为显著(图14A)。另外，在第14天通过荧光素血管造影术在病变中定性观察到少量的荧光素渗漏(图14B)。最后，通过凝集素(图14C)和同工凝集素B4(图15A-15C)的离体染色评估L-CNV病变体积，与载体相比，25mg/kg APX2009使L-CNV病变体积降低了约四倍(图14D)。
观察到的效果可能归因于氧化还原信号抑制，而不是DNA修复抑制，因为这些化合物对氧化还原信号抑制具有特异性。Ref-1的分子独特功能部分(氧化还原和DNA修复)是完全独立的。例如，APE1/Ref-1在65位(C65A)处的半胱氨酸突变消除了氧化还原功能，但不影响DNA修复功能，反之亦然。此外，Ref-1抑制剂(例如，APX3330)不抑制APE1活性。实际上，APX3330和APX2009可以增强神经元中APE1的修复活性，可能有助于这些药物的神经保护作用，在新生血管化眼病中感光细胞死亡的情况下可以提供额外的好处。
考虑到它们的抗Ref-1氧化还原信号活性，APX2009和APX2014可能通过阻断Ref-1诱导的转录因子的激活来发挥其抗血管生成作用。可能的候选药物包括NF-κB和HIF-1α，两者均可调节VEGF。在视网膜色素上皮细胞中，APX3330降低了NF-κB和HIF-1α的活性，同时降低了VEGF的表达。此外，APX3330对一型糖尿病大鼠中风的治疗显著降低了总血管密度和VEGF表达。然而，在眼部新生血管化的情况下，由Ref-1抑制调节的确切转录因子仍有待确定。
在体内测试的两种化合物(APX3330和APX2009)中未观察到明显的眼内或全身毒性，在迁移、管形成和脉络膜长芽测定中也未观察到实质性细胞死亡。这些发现与APX3330在人体内的出色安全性相吻合。尽管如此，新化合物的眼内毒性和眼内药代动力学仍有待彻底检查。
耐受性良好的全身药物疗法在治疗新生血管眼部疾病方面具有显著潜力。现有的已获批准的药物都是需要在眼科医生诊所进行玻璃体内注射的生物制剂。口服可生物利用的药物(与APX3330一样)可以在家中服用，可能是每天一次的药。与玻璃体内注射相比，这种疗法的权衡要比玻璃体内注射(每月一次或更短)所需的剂量更加频繁，并且与玻璃体内疗法相比，全身暴露更为明显。但是，鉴于Ref-1抑制剂的安全性很强，这可能是可控制的。此外，通过这种疗法，患者和医疗系统的成本可能会大大降低，因为可以减少就诊和注射程序。
总之，现在已经首次表明全身施用Ref-1抑制剂(APX2009和APX2014)可以减弱L-CNV。因为L-CNV是作为湿性AMD基础的脉络膜新生血管化的广泛使用模型，这表明Ref-1抑制对这一适应症有治疗作用。体外数据表明，Ref-1抑制作用还可以有效阻断涉及视网膜内皮细胞的血管生成。因此，这些抑制剂也可能用于视网膜新生血管疾病，如，ROP和PDR。
实施例2
在该实施例中，分析了Ref-1敲减对NF-κB信号传导相关基因的影响。
将人视网膜内皮细胞(HREC)(Cell Systems，Inc.Kirkland，WA)铺在6孔板中，并用0.1μM APX2009、1μM APX2009或DMSO处理6小时和24小时。用PBS处理后，将细胞洗涤一次，收集并冷冻。重复该过程，收集4个不同传代(passage)的处理过的细胞。在300μLTrizol(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司)中提取RNA，并在-80℃下急速冷冻。使用SMARTer系统(Clontech，Mountain View，CA)从细胞生成cDNA。使用具有高灵敏度DNA芯片的安捷伦生物分析仪(Agilent Technologies，美国加利福尼亚州圣克拉拉)评估dscDNA的数量和质量。总共选择了48个SCR和48个siAPE1细胞进行测序。IUSM基因组学设施使用Nextera试剂盒(Illumina，圣地亚哥，加利福尼亚)准备了函数库。使用Illumina HiSeq4000对DNA进行测序。
Ref-1激活NF-κB和HIF-1α信号传导：HIF-1α蛋白的氧化还原依赖性稳定对于HIF-1的激活是必需的，并且通过Ref-1的氧化还原信号传导调节HIF-1的DNA-结合活性。缺氧驱动的基因表达不仅仅通过HIF来实现；对缺氧有反应的其他TF包括NF-κB、AP-1等等。缺氧引起的分子变化可影响眼睛和癌症中的血管生成。新型化合物APX2009和APX2014抑制NF-κB活化并降低HREC中靶基因的表达。在RNA-Seq实验中证实了这一点，表明APX2009以浓度依赖性方式阻断了HIF调控的基因(图16)。
实施例3
在该实施例中，分析了Ref-1在眼部血管生成中的作用。
挖掘蛋白质图谱用于Ref-1的表达数据。此外，对来自湿性AMD患者和年龄匹配的对照的去识别化死后眼组织中的Ref-1进行了免疫组织化。组织切片被脱蜡。DAB用于检测并用DAPI复染。视网膜和脉络膜的图像在EVOS fl数字显微镜上拍摄。
Ref-1在发育中的小鼠视网膜以及视网膜色素上皮(RPE)细胞、视网膜周细胞、脉络膜内皮细胞(CEC)和视网膜内皮细胞(REC)中高度表达。在RNA水平上，视网膜中的表达高于36种其他组织类型中的三分之一(https://www.proteinatlas.org/ENSG00000100823-APEX1/tissue)。初步证据还表明，与年龄相匹配的对照相比，人的湿性AMD患者眼睛的视网膜和脉络膜中Ref-1被上调(图17)，表明疾病相关性。

Claims (25)

1.一种在有需要的受试者中抑制眼部新生血管化的方法，所述方法包括向该受试者施用有效量的脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1氧化还原因子1(APE1/Ref-1)抑制剂、其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述APE1/Ref-1抑制剂具有下式：
Figure FDA0002711687200000011
其中，R1选自烷基、烷氧基、羟基和氢；R2为烷基；R3和R6独立地选自烷氧基和芳基；R4和R5独立地选自烷氧基和芳基，或者R4与R5一起形成取代的或未取代的萘醌；
X选自CH＝CR2和NCH，其中R2选自C1-C10烷基和CF3CH2CH2；和
Y选自N(Rz)R2或NR∧OR∧，其中Rz独立地选自C1-C6烷基、杂烷基、环烷基和环杂烷基，直链或支链或任选取代的基团，或者Rz和R2与连接的氮一起形成任选取代的杂环；其中每个R∧独立地选自氢、烷基、杂烷基、环己基和环杂烷基，它们各自被任选取代，或者两个R∧与连接的氮和氧一起形成任选取代的杂环。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述APE1/Ref-1抑制剂选自[(2E)-2-[(3-甲氧基-1,4-二氧代-1,4-二氢萘-2-基)亚甲基]-N,N-二乙基戊酰胺](APX2009)、(2E)-2-[(3-甲氧基-1,4-二氧代-1,4-二氢萘-2-基)亚甲基]-N-甲氧基戊酰胺](APX2014)、其药学上可接受的盐和药学上可接受的溶剂化物，及其组合。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述APE1/Ref-1抑制剂为APX2009，并且每天向所述受试者施用约12.5mg/kg至约35mg/kg的APX2009。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述APE1/Ref-1抑制剂为APX2014，并且每天向所述受试者施用约12.5mg/kg至约35mg/kg的APX2014。
6.根据权利要求1所述的方法，还包括向所述受试者施用至少一种其他治疗剂。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述其他治疗剂选自抗VEGF治疗、维生素、矿物质及其组合。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述抗VEGF治疗选自兰尼单抗、贝伐单抗、阿柏西普及其组合。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述受试者患有选自以下的疾病：早产儿视网膜病变(ROP)、增生性糖尿病视网膜病变(PDR)、糖尿病性视网膜病变、与年龄相关的湿性黄斑变性(AMD)、病理性近视、高血压性视网膜病、闭塞性脉管炎、息肉样脉络膜脉管病、糖尿病性黄斑水肿、葡萄膜性黄斑水肿、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞、角膜新生血管化、视网膜新生血管化、眼组织胞浆病、新生血管性青光眼、视网膜母细胞瘤及其组合。
10.一种在有需要的受试者中治疗早产儿视网膜病变(ROP)的方法，所述方法包括向该受试者施用有效量的脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1氧化还原因子1(APE1/Ref-1)抑制剂、其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述APE1/Ref-1抑制剂具有下式：
Figure FDA0002711687200000021
其中，R1选自烷基、烷氧基、羟基和氢；R2为烷基；R3和R6独立地选自烷氧基和芳基；R4和R5独立地选自烷氧基和芳基，或者R4与R5一起形成取代的或未取代的萘醌；
X选自CH＝CR2和NCH，其中R2选自C1-C10烷基和CF3CH2CH2；和
Y选自N(Rz)R2或NR∧OR∧，其中Rz独立地选自C1-C6烷基、杂烷基、环烷基和环杂烷基，直链或支链或任选取代的基团，或者Rz和R2与连接的氮一起形成任选取代的杂环；其中每个R∧独立地选自氢、烷基、杂烷基、环己基和环杂烷基，它们各自被任选取代，或者两个R∧与连接的氮和氧一起形成任选取代的杂环。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述APE1/Ref-1抑制剂选自[(2E)-2-[(3-甲氧基-1,4-二氧代-1,4-二氢萘-2-基)亚甲基]-N,N-二乙基戊酰胺](APX2009)、(2E)-2-[(3-甲氧基-1,4-二氧代-1,4-二氢萘-2-基)亚甲基]-N-甲氧基戊酰胺](APX2014)、其药学上可接受的盐和药学上可接受的溶剂化物，及其组合。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述APE1/Ref-1抑制剂为APX2009，并且每天向所述受试者施用约12.5mg/kg至约35mg/kg的APX2009。
14.根据权利要求12所述的方法，其中，所述APE1/Ref-1抑制剂为APX2014，并且每天向所述受试者施用约12.5mg/kg至约35mg/kg的APX2014。
15.根据权利要求10所述的方法，还包括向所述受试者施用至少一种其他治疗剂。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述其他治疗剂选自抗VEGF治疗、维生素、矿物质及其组合。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述抗VEGF治疗选自兰尼单抗、贝伐单抗、阿柏西普及其组合。
18.一种在有需要的受试者中治疗与年龄相关的湿性黄斑变性(AMD)的方法，所述方法包括向该受试者施用有效量的脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1氧化还原因子1(APE1/Ref-1)抑制剂、其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述APE1/Ref-1抑制剂具有下式：
Figure FDA0002711687200000041
其中，R1选自烷基、烷氧基、羟基和氢；R2为烷基；R3和R6独立地选自烷氧基和芳基；R4和R5独立地选自烷氧基和芳基，或者R4与R5一起形成取代的或未取代的萘醌；
X选自CH＝CR2和NCH，其中R2选自C1-C10烷基和CF3CH2CH2；和
Y选自N(Rz)R2或NR∧OR∧，其中Rz独立地选自C1-C6烷基、杂烷基、环烷基和环杂烷基，直链或支链或任选取代的基团，或者Rz和R2与连接的氮一起形成任选取代的杂环；其中每个R∧独立地选自氢、烷基、杂烷基、环己基和环杂烷基，它们各自被任选取代，或者两个R∧与连接的氮和氧一起形成任选取代的杂环。
20.根据权利要求18所述的方法，其中，所述APE1/Ref-1抑制剂选自[(2E)-2-[(3-甲氧基-1,4-二氧代-1,4-二氢萘-2-基)亚甲基]-N,N-二乙基戊酰胺](APX2009)、(2E)-2-[(3-甲氧基-1,4-二氧代-1,4-二氢萘-2-基)亚甲基]-N-甲氧基戊酰胺](APX2014)、其药学上可接受的盐和药学上可接受的溶剂化物，及其组合。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述APE1/Ref-1抑制剂为APX2009，并且每天向所述受试者施用约12.5mg/kg至约35mg/kg的APX2009。
22.根据权利要求20所述的方法，其中，所述APE1/Ref-1抑制剂为APX2014，并且每天向所述受试者施用约12.5mg/kg至约35mg/kg的APX2014。
23.根据权利要求18所述的方法，进一步包括向所述受试者施用至少一种其他治疗剂。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述其他治疗剂选自抗VEGF治疗、维生素、矿物质及其组合。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述抗VEGF治疗选自兰尼单抗、贝伐单抗、阿柏西普及其组合。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3056240A1 (en) * 2017-03-20 2018-09-27 Indiana University Research And Technology Corporation Use of ape1/ref-1 inhibitors in combination therapies for treatment of cancer
CA3056810A1 (en) 2017-04-21 2018-10-25 University Of Tasmania Therapeutic compounds and methods
KR20240049212A (ko) * 2021-04-30 2024-04-16 오큐파이어 파마, 인크. 당뇨병성 망막병증 및 관련 병태의 치료 방법 및 조성물
WO2024059664A2 (en) * 2022-09-14 2024-03-21 Ocuphire Pharma, Inc. Salts and esters of apx3330 and therapeutic uses thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009042542A1 (en) * 2007-09-26 2009-04-02 Indiana University Research And Technology Corporation Benzoquinone derivative e3330 in combination with chemotherapeutic agents for the treatment of cancer and angiogenesis
WO2012167122A1 (en) * 2011-06-03 2012-12-06 Indiana University Research And Technology Corporation Compounds, compositions and methods for treating oxidative dna damage disorders
CN103781753A (zh) * 2011-05-26 2014-05-07 印第安纳大学研究及科技有限公司 用于治疗ape1介导的疾病的醌化合物

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI102273B (fi) 1989-09-11 1998-11-13 Eisai Co Ltd Kinonijohdannaiset, niiden valmistaminen ja niiden farmakologinen käyt tö

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009042542A1 (en) * 2007-09-26 2009-04-02 Indiana University Research And Technology Corporation Benzoquinone derivative e3330 in combination with chemotherapeutic agents for the treatment of cancer and angiogenesis
CN103781753A (zh) * 2011-05-26 2014-05-07 印第安纳大学研究及科技有限公司 用于治疗ape1介导的疾病的醌化合物
WO2012167122A1 (en) * 2011-06-03 2012-12-06 Indiana University Research And Technology Corporation Compounds, compositions and methods for treating oxidative dna damage disorders

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FENIL SHAH等: ""Exploiting the Ref-1-APE1 node in cancer signaling and other diseases: from bench to clinic"", 《NPJ. PRECISION ONCOLOGY》 *
MR KELLEY等: "Identification and Characterization of New Chemical Entities Targeting Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease 1 for the Prevention of Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy", 《JOURNAL OF PHARMACOLOGY AND EXPERIMENTAL THERAPEUTICS》 *
SPSP BABU等: ""Ref-1/APE1 Inhibition with Novel Small Molecules Blocks Ocular Neovascularization"", 《JOURNAL OF PHARMACOLOGY AND EXPERIMENTAL THERAPEUTICS》 *

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