CN111929441A - 肺癌诊断及其预后评估中使用的生物标记物及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了肺癌诊断及其预后评估中使用的生物标记物及试剂盒，属于生物医药技术领域。本申请的肺癌诊断及其预后评估中使用的生物标记物为ABHD4基因，本申请通过实验证实ABHD4蛋白在非小细胞肺癌患者癌组织中存在异常表达；同时通过组织芯片染色分析发现ABHD4是判断非小细胞肺癌患者预后的独立因素。检测个体组织中ABHD4蛋白表达量可以诊断个体是否患非小细胞肺癌及评估患者预后，为临床治疗提供决策支持，可见ABHD4基因在制备肺癌诊断及其预后评估中使用的生物标记物及试剂盒中将具有广泛的用途。

Description

肺癌诊断及其预后评估中使用的生物标记物及试剂盒

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及肺癌诊断及其预后评估中使用的生物标记物及试剂盒。

背景技术

肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤，是癌症相关死亡的主要原因，每年全世界约有140万人死于肺癌。肺癌在病理学分型上主要可分为小细胞肺癌(small-cell lungcancer，SCLC)和非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)，其中NSCLC约占85％，包括鳞癌，腺癌，大细胞癌等。超过一半的NSCLC患者确诊时已有淋巴结或远处转移，失去手术机会，即使是已行手术切除的患者术后仍易复发转移。尽管现在对于非小细胞肺癌的诊断和治疗取得了显著疗效，但是对于大多数患者而言，病情改善仍然非常有限。事实上，总的5年生存率仍然低于15％。因此，非小细胞肺癌的早期诊断是疾病诊治的关键。

ABHD家族属于操纵α/β折叠酶水解酶家族中的一部分，在信号转导、脂类代谢及代谢性疾病中均发挥重要作用。ABHD蛋白质存在于几乎所有的报告基因，由这些蛋白质共享的保守结构基序可以预测脂质合成和降解的共同作用。已有研究表明ABHD家族中多种基因参与肿瘤的发生发展，其中ABHD4在RWPE-1人正常前列腺上皮细胞、NP69鼻咽癌细胞及OVCAR3人卵巢癌细胞中均有表达，敲除ABHD4后可抑制失巢凋亡过程。而关于ABHD4在包括肺癌的其他肿瘤中的作用尚无研究。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明所要解决的技术问题是提供ABHD4基因的新用途，用于制备肺癌诊断及其预后评估中使用的生物标记物及试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

ABHD4基因(Gene ID：63874)在制备用于肺癌诊断的试剂盒中的应用。

所述肺癌是非小细胞肺癌。

所述试剂盒通过测定样本中ABHD4基因表达产物的水平来诊断肺癌及评估患者预后。

ABHD4基因在制备用于肺癌患者预后判断的试剂盒中的应用。

所述肺癌是非小细胞肺癌。

所述试剂盒通过测定样本中ABHD4基因表达产物的水平来诊断肺癌及评估患者预后。

用于肺癌诊断的生物标记物，为ABHD4基因。

用于肺癌患者预后判断的生物标记物，为ABHD4基因。

本申请通过收集6组NSCLC术后患者的肺癌组织和相对应的癌旁组织，采用免疫印迹实验检测6组配对标本中ABHD4的表达情况，结果显示，ABHD4在肺癌组织中表达较低，在相对应的癌旁组织中明显升高，两者比较有统计学意义(P＜0.05)。从而在蛋白质层面证明了ABHD4在NSCLC患者的癌组织存在低表达。

本申请通过收集282例肺癌组织制作成组织芯片，并进行免疫组化染色分析发现，ABHD4在NSCLC组织中的表达与相对应的癌旁组织相比呈显著低表达。进一步证明ABHD4蛋白在NSCLC组织中呈低表达。最后通过Kaplan-Meier法绘制生存曲线，结果提示，ABHD4高表达组较ABHD4低或无表达组生存率高，预后较好。证明了ABHD4高表达是NSCLC预后良好的独立预后因素。

有益效果：与现有的技术相比，本发明的优点在于：本申请实验证实ABHD4基因在肺癌患者癌组织中存在异常低表达。并采用组织芯片和免疫组化技术检测、分析发现ABHD4高表达组患者预后较高表达组好，可见ABHD4基因在制备肺癌诊断及其预后评估中使用的生物标记物及试剂盒，将具有广泛的应用。

附图说明

图1是在6对配对的NSCLC组织(T)和癌旁正常组织(N)中ABHD4蛋白的表达情况结果图；图中，A为免疫印迹实验检测肺癌及其癌旁组织中ABHD4的蛋白水平，GAPDH为内参，B是A的量化柱形图；

图2是通过组织芯片免疫组化染色观察ABHD4在肺癌及癌旁组织中的表达结果图；图中，A为肺腺癌，B为正常癌旁组织；

图3是Kaplan-Meier生存曲线分析ABHD4的表达与肺癌患者预后的关系结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

以下实施例中使用的主要试剂为：

(1)二步法免疫组化检测试剂盒：兔抗人ABHD4多克隆抗体(免疫组化试验用)：Abcam公司；兔抗人GAPDH一抗(免疫组化试验用)：美国Cell Signaling公司；HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)：上海碧云天生物技术；无水酒精：国药集团化学制剂公司；二甲苯：国药集团化学制剂公司；DAB显色剂：DAKO；苏木素染液：南通麦杰生物科技有限公司；柠檬酸(PH6.0)抗原修复液：南通麦杰生物科技有限公司。

(2)细胞培养及转染所需试剂：胎牛血清：四季青生物公司；RPMI-1640：Hyclone公司；胰蛋白酶：美国Gibco公司；青、链霉素100U/mL：美国Gibco公司；磷酸盐缓冲液(PBS)：上海碧云天生物技术；DMSO：美国Gibco公司；RPMI-1640完全培养液：分别加入RPMI-1640与胎牛血清混匀，使其终浓度分别为90％，10％，1×，4℃保存。细胞冻存液：将RPMI-1640完全培养液、胎牛血清和DMSO按5∶4∶1比例配制，4℃保存。

(3)Western blot实验试剂：1×TBST：取Tris2.42g、NaCl8.0g、Tween-200.5mL，混合溶解，定容至1L，常温保存。1×转膜Buffer：甘氨酸14.4g、Tris3.03g，加适量双蒸水搅拌溶解，再加200mL无水甲醇，定容至1L，混合均匀(用时配制)。封闭液100mL：取脱脂奶粉5g，加入100mL1×TBST，混合溶解即可(需用时配制)。BCA蛋白测定试剂盒：Biosharp；兔抗人ABHD4多克隆抗体(免疫组化试验用)：Abcam公司；兔抗人GAPDH一抗(免疫组化试验用)：美国Cell Signaling公司；HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)：上海碧云天生物技术；ECL发光试剂盒：美国Thermofisher公司。

以下实施例中使用的主要仪器如下：

超低温冰箱：日本SANYO公司；生物安全柜：美国Thermo公司；离心管、枪头等耗材：美国Coring公司；多功能脱色摇床：上海智城分析仪器制造有限公司；电子天平：瑞士METTLER TOLEDO公司；温磁力搅拌器：海门麒麟医用仪器厂；凝胶成像系统：美国BIO-RAD公司；台式冷冻离心机：日本HITACHI公司；脱水机：武汉俊杰电子有限公司；包埋机：武汉俊杰电子有限公司；病理切片机：上海徕卡仪器有限公司；组织摊片机：浙江省金华市科迪仪器公司；冷冻机台：武汉俊杰电子有限公司；烤箱：上海慧泰仪器有限公司；微波炉：美的微波电器制造有限公司；CO₂细胞培养箱：NUAIRE公司；电热恒温水浴箱：美国Thermo公司。

实施例1蛋白免疫印迹法检测

6对肺癌组织均由南通大学附属医院心胸外科提供，新鲜组织收集后在30min内给以液氮冷冻处理，之后置于-80℃冰箱保存。

1)组织蛋白提取：

(1)配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂(1mL抽提试剂中加入5μL蛋白酶抑制剂混合液，5μL PMSF和5μL磷酸酶混合液)。

(2)将组织从液氮或者-80℃冰箱中取出，称重，切小块放入管中。

(3)加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂(250mg组织中加入1mL抽提试剂)。

(4)每管加入2粒钢珠，使用样品快速制备系统匀浆20s至组织完全裂解。

(5)裂解液在预冷的离心机中14000g离心15min。上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。

(6)BCA法测蛋白质浓度。

(7)将提取的蛋白质保存于-80℃，或按4∶1的比例将提取的蛋白质与5×SDS pageloading buffer混合，迅速混匀，100℃煮沸5min，保存于-20℃。

2)凝胶电泳

(1)清洗玻璃板：蘸点洗洁精轻轻擦洗，两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在架子上晾干。梳子应用自来水洗干净后再用蒸馏水冲洗，临用前晾干。

(2)配胶：玻璃板对齐后放入夹板固定卡紧，然后放置于制胶器上并准备灌胶，操作前先往玻璃板间灌水，检查是否漏。然后按配胶试剂盒说明书选择合适的分离胶浓度配制，ABHD4的蛋白分子量为42KD，所以选取10％的分离胶(1.7mL蒸馏水，1.3mL 30％Acr-Bis(29：1)，1.9mL 1M Tris，pH8.8，0.05mL 10％SDS，0.05mL 10％过硫酸铵，0.03mL TEMED)及5％的浓缩胶(1.4mL蒸馏水，0.33mL 30％Acr-Bis(29：1)，0.25mL 1M Tris，pH6.8，0.02mL10％SDS，0.02mL 10％过硫酸铵，0.002mLTEMED)。之后用1mL枪吹吸摇匀即可灌胶。灌胶时掌握好速度，避免气泡产生，分离胶加至小玻板2/3宽处，大约在插入梳子的下缘1cm处，然后立即在胶上加异丙醇，待分离胶凝固后，配4％浓缩胶，将剩余空间灌满浓缩胶，最后把将梳子插入浓缩胶中。梳子插入浓缩胶时，应确保没有气泡产生。

(3)上样与电泳：在等待浓缩胶凝固的时候先将样品从-80℃中取出置于4℃解冻，待到浓缩胶凝固后，取下胶板放在电泳槽中，然后向两胶的内槽中间加入电泳缓冲液(1L蒸馏水，3.02g Tris，18.8g甘氨酸，1g SDS)使其浸过加样孔，之后将梳子慢慢拔出，一般在第一个孔内加入marker，然后用移液枪吸取适量样品加入加样孔内。上样后加入电泳液并立即开始电泳，起始电压为80V，当marker有分离的趋势后转换电压为120V，等电泳刚刚跑出溴酚蓝时终止电泳，并继续进行下一步转膜步骤。

3)转膜

(1)按上一步胶的尺寸剪下适当大小的PVDF膜，放于甲醇中，浸泡10s左右，浸泡时间不宜过长，然后将膜转移到转膜缓冲液中。

(2)将PVDF膜和双层滤纸放在转膜缓冲液中平衡。按照黑-胶-膜的顺序夹好，中间避免产生气泡，然后向电泳槽内加入预冷的转膜缓冲液，电泳槽外侧用冰盒保证低温环境，根据目的蛋白分子量的不同，恒流300mA转膜，时间大概需要90min。

(3)转膜结束后，小心取出PVDF膜，剪角来标记电泳方向及膜的正反面，有蛋白的一面为正面。

4)抗原抗体反应

(1)将上一步中取出的PVDF膜放入5％脱脂牛奶(1.5g脱脂奶粉，30mL TBST缓冲液)中，室温摇床上封闭1-2h，时间不宜过长。

(2)封闭结束，用TBST缓冲液(1L蒸馏水，8g氯化钠，2.42g Tris，0.5mL Tween-20)漂洗PVDF膜，目的是为了去除PVDF膜上残留的牛奶。

(3)封闭后将PVDF膜放于抗体孵育盒中，加入一抗稀释液稀释后的一抗，4℃摇床上过夜。

(4)从冰箱中取出孵育盒和PVDF膜，用TBST溶液漂洗膜3遍，每遍5min。

(5)将漂洗过的PVDF膜重新放于抗体孵育盒中，加入用5％脱脂奶粉稀释的荧光二抗，室温避光摇床上孵育1h。

(6)从孵育盒中取出PVDF膜，TBST溶液漂洗膜3遍，每遍10min。

(7)使用吸水纸将膜上的多余液体吸干，显影。

(8)使用Image J图像处理软件对图像进行灰度统计分析。

收集6组NSCLC术后患者的肺癌组织和相对应的癌旁组织，用免疫印迹法检测6组配对标本中ABHD4的表达情况，如图1显示，A是采用免疫印迹实验检测肺癌及其癌旁组织中ABHD4的蛋白水平，B是A的量化柱形图。结果发现ABHD4在肺癌组织中表达较低，在相对应的癌旁组织中明显升高，两者比较有统计学意义(P＜0.05)。

实施例2免疫组织化学法检测

收集了282例多聚甲醛固定石蜡包埋的肺癌组织样本，所有组织均为2008年至2009年在南通大学附属医院胸外科住院并接受手术治疗的标本，所有患者术前均未经过放、化疗，临床数据(包括年龄、性别、吸烟、分期、组织类型、分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移和TNM分期)均有书面记录。282例肺癌组织经福尔马林固定，石蜡包埋，选择没有明显缺损的蜡块组织，制作组织芯片。

1)组织芯片制作

(1)对原始蜡块进行HE染色观察，在相应蜡块上确定区域并标记取样点。

(2)用组织包埋机制作合适的空白受体蜡块，在蜡块上设计8×10组织列阵。

(3)用组织芯片仪抽提原始蜡块组织芯，并且有规律地排列在空白受体蜡块上。

(4)将组织芯片块在58℃恒温箱中加热，使组织芯片和受体蜡块融为一体。

(5)将组织芯片块在-4℃冷冻3h左右，以20微米/转的进刀速度用全自动组织切片机对组织芯片块进行修整，直到80％的组织芯片完全暴露。

(6)用全自动组织切片机以4微米/转的进刀速度对组织芯片块进行切片，然后置于42℃水浴中，最后将切片裱在经过防托片处理过的载玻片上。

(7)将切片放置在60℃恒温烤箱中烤3个小时。

(8)将芯片保存在切片盒中，置4℃保存，用于后续实验。

2)免疫组化染色

(1)烤片脱蜡：将组织芯片块放在切片架上，然后放在62℃烤箱中烤2小时，后将组织芯片放在二甲苯中脱蜡，共两次，每次十分钟。

(2)水化：将组织芯片依次放入无水乙醇I、无水乙醇II、90％乙醇、75％乙醇、50％乙醇、纯水中各5分钟，然后放在PBS溶液中洗3次，每次3分钟。

(3)抗原修复：将组织芯片放在盛有抗原修复液的容器中，放在微波炉中高火煮沸3分钟，后在低火下继续加热15分钟，然后拿出放在室温下自热冷却，再用PBS漂洗3分钟×3次。

(4)阻断内源性过氧化物酶：将组织芯片放置在孵育盒中，用纸吸去组织块以外的水，然后每张芯片滴加3％过氧化氢，室温下避光孵育30分钟，后用PBS漂洗3分钟×3次。

(5)封闭：用纸吸去组织块以外的水，将切片放在孵育盒中，然后每张滴加600μl非免疫动物血清，室温封闭30分钟，轻轻甩去血清。

(6)加一抗：配制适当浓度的一抗工作液，然后每张芯片上滴加600μl，4℃过夜。然后用PBS漂洗3分钟×3次。

(7)加二抗：在孵育盒中每张芯片上滴加600μl二抗，室温孵育15分钟，然后用PBS漂洗3分钟×3次。

(8)DAB显色：除去PBS溶液，在每张芯片上滴加500μl DAB显色剂，显微镜下观察染色情况，显色1-3分钟，后放在蒸馏水终止显色。

(9)苏木素染色：用纸吸去组织芯片上的水，苏木素复染15秒，蒸馏水水洗至水澄清。

(10)脱水：将组织芯片依次放在50％乙醇、75％乙醇、90％乙醇、100％乙醇、二甲苯中各3分钟。

(11)封片：组织芯片风干后，在芯片上滴加中性树胶，然后轻轻盖上盖玻片。

(12)树胶干后显微镜下拍照。

3)免疫组化染色结果的判断

在高倍镜下观察ABHD4蛋白的阳性强度和阳性百分比两个指标。免疫组化结果评分采用双盲法，由两位有经验的病理科医师对组织芯片上每个位点的染色情况进行判断，分别记录染色阳性细胞百分比及强度。染色强度按肿瘤细胞染色程度计分：无着色：0分；淡黄色为弱阳性：1分；浅棕色或者深黄色为中等阳性：2分；棕褐色为强阳性：3分。根据染色强度和阳性百分比乘积进行判断：0-120分为低表达，120-300分为高表达。

免疫组化染色结果如图2所示(A1、B1×40倍镜下；A2-B2×400倍镜下)，图A1为肺腺癌，图B1为癌旁组织。可见，ABHD4在肿瘤细胞的细胞核和细胞质中均表有达，且在肿瘤组织中呈低表达，在癌旁正常组织中呈高表达，染色成黄棕色。根据免疫组化结果，采用X-tile将282例数据分为ABHD4低表达组和ABHD4高表达组(以100分为界)，采用卡方检验研究ABHD4表达与临床病理参数如年龄、性别、分化程度、肿瘤类型、临床分期的相关性。有175例(70.92％)的患者ABHD4低表达，统计分析显示ABHD4的低表达与分化程度(P＝0.001)、肿瘤类型(P＜0.001)、淋巴结转移(P＝0.006)及肿瘤的TNM分期(P＜0.001)密切相关，而与其它临床参数如性别、年龄、吸烟无明显关系(表1)。

表1 ABHD4与非小细胞肺癌患者临床病理参数间的关系

根据对282例肺癌患者生存率的随访资料，建立Cox生存回归模型。如表2所示，在单因素分析中，ABHD4的低表达(HR，0.574，95％CI，0.442-0.779；P＜0.001)、淋巴结转移情况(HR，1.387，95％CI，1.172-1.640；P＜0.001)及TNM分期(HR，1.325，95％CI，1.128-1.556；P＝0.001)与肺癌的生存率密切相关。在多因素分析中，ABHD4蛋白的低表达(HR，0.689，95％CI，0.519-0.915；P＝0.010)及TNM分期(HR，1.252，95％CI，1.061-1.478；P＝0.008)是影响NSCLC预后的独立因素。

表2非小细胞肺癌患者预后的单因素和多因素分析

图2展示了两张肺癌与癌旁组织的典型的免疫组化染色图，直观的说明ABHD4在癌组织中的蛋白表达明细较癌旁组织低。ABHD4表达与肺癌患者的预后关系分析采用Kaplan-Meier生存曲线分析(图3)，结果显示ABHD4高表达组较ABHD4低表达组生存率高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

以上实施例证实，ABHD4基因可用于制备肺癌诊断及其预后评估中使用的生物标记物及试剂盒。

Claims (8)

1.ABHD4基因在制备用于肺癌诊断的试剂盒中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肺癌是非小细胞肺癌。

3.据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒通过测定样本中ABHD4基因表达产物的水平来诊断肺癌及评估患者预后。

4.ABHD4基因在制备用于肺癌患者预后判断的试剂盒中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肺癌是非小细胞肺癌。

6.据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒通过测定样本中ABHD4基因表达产物的水平来诊断肺癌及评估患者预后。

7.用于肺癌诊断的生物标记物，其特征在于：为ABHD4基因。

8.用于肺癌患者预后判断的生物标记物，其特征在于：为ABHD4基因。

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