CN111929298A - 一种显微镜下微流体通道y,z方向同时聚焦的观测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种显微镜下微流体通道y,z方向同时聚焦的观测方法,包括:确定进行实验的微流体通道,获取微流体通道的外壁宽度;确定用于进行观测的显微镜的视野范围和显微镜的焦距;将所述微流体通道的两端与微流体实验装置连接后固定在基板上,使微流体通道的外壁与所述基板的表面呈α夹角;取两个反射面夹角为β的棱镜,对称置于所述微流体通道的两侧,调整棱镜的垂直高度与水平位置,使得棱镜的反射面下棱边分别与微流体通道两侧的棱边线性接触,并使棱镜的底面与所述基板的表面平行;开始实验时,将微流体通道置于显微镜载物台上并进行固定,然后进行观测、记录。本发明能够快速判断微粒子在微流体通道中的三维聚集情况或实时三维运动状态。
Description
技术领域
本发明涉及光学应用领域,具体涉及一种显微镜下微流体通道y,z方向同时聚焦的观测方法。
背景技术
随着科学技术的进步和发展,人们对于微纳流体、颗粒操控的研究进一步深入。近年来,因微流控技术具有快速地聚集、高效地分离、精准地捕捉等优点,已被广泛地应用于各工程,自然科学,医学相关领域的研究中。例如工业废水处理时,对污水中有害微粒的分离;药物检测时,对特定药物的提取;血液处理时,对特定细胞的筛选等。微米颗粒是指尺寸在0.1微米到100微米之间的颗粒。多种生物颗粒如细菌、病毒、高分子蛋白质分子及细胞都属于微米颗粒。基于微流控的生物和医学应用通常需要对悬浮在液体环境中的各种微米颗粒进行精准操控,如提纯、分离和聚集等。由于不同的情况有不同的操控需求,所以需要对微流控技术进行深入研究。
在研究微流控技术时,通常需要知道在理想实验条件中既定流场或力场作用下微流体通道内微粒子的运动状态。虽然可以利用光学显微镜对微流体通道不同层次和不同角度依次观测再综合判断微粒子的三维运动状态,但是这种方法需要反复调焦,如此进行一次观察判断时间较长,因此仅适用于较稳定的流场。对于稍微复杂的流场,甚至需要转动微流体通道来观察其它方向的粒子运动情况,而一旦转动微流体通道,则实验条件受到影响,无端的增加了实验中的变量。况且实验研究中往往需要多次对实验参数进行修改、调整,就很难保持流场的稳定性,显然这种方法太影响实验效率。虽然也可以利用激光共聚焦等大型仪器获得其三维运动状态,但是仪器系统对大量图片数据的处理需要些许时间,得到的实验结果和实际微粒子的运动状态有延迟,而且这类仪器太过昂贵,实验耗费巨大。
发明内容
为了使普通光学显微镜有更高的实验效率,本发明提出一种显微镜下微流体通道y,z方向同时聚焦的观测方法,以实现对微流体通道y,z方向同时聚焦,并将两个方向聚焦的视野呈现在同一个视野中,以便于快速判断微粒子的三维聚集情况或分析微粒子的实时三维运动状态。
为了实现上述任务,本发明采用以下技术方案:
一种显微镜下微流体通道y,z方向同时聚焦的观测方法,包括以下步骤:
确定进行实验的微流体通道,获取微流体通道的外壁宽度;确定用于进行观测的显微镜的视野范围和显微镜的焦距,判断所述视野范围、焦距是否满足最小视野范围以及最小焦距,如同时满足,则进行实验,否则调整显微镜;
进行实验前,将所述微流体通道的两端与微流体实验装置连接后固定在表面为水平面的基板上,使微流体通道的外壁与所述基板的表面呈α夹角,且微流体通道的轴向为沿基板的长度方向;
取两个反射面夹角为β的棱镜,对称置于所述微流体通道的两侧,调整所述棱镜的垂直高度与水平位置,使得棱镜的反射面下棱边分别与所述微流体通道两侧的棱边线性接触,并使棱镜的底面与所述基板的表面平行;
开始实验,将放置固定好微流体通道、棱镜的基板放置于显微镜载物台上并进行固定,通过微流体实验装置向微流体通道内通入目标颗粒,并调节显微镜,使显微镜聚焦到微流体通道中,则通过显微镜可同时观察到微流体通道y,z方向聚焦图像;其中,微流体通道的x方向为沿微流体通道的轴线方向,y方向、z方向分别为垂直于微流体通道位于上方的两个外壁且并指向微流体通道外部的方向。
进一步地,所述微流体通道的y,z方向观测面是两个具有等宽度的外壁,且这两个外壁之间互成90°夹角;所述α的取值为45°,β的取值为67.5°。
当所述微流体通道采用等腰三角形或其他形状管道时,同理可得α和β的值与最小视野范围和最小焦距。
进一步地,通过调整棱镜的垂直高度和水平位置,使得棱镜的反射面下棱边分别与所述微流体通道两侧的棱边线性接触。
进一步地,通过结合显微镜放大倍数,在所选倍数目镜下进行物镜焦距的查询计算,以判断显微镜的视野范围、焦距是否满足最小视野范围以及最小焦距。
与现有技术相比,本发明具有以下技术特点:
1.本发明通过对进入显微镜物镜之前的光路进行巧妙设计,以实现对微流体通道y,z方向同时聚焦,使得在实验中观察两个不同方向视野时,一次调焦到目标焦距位置,则可在一个显微镜视野中同时显示两个不同观测视角的观测内容,无需转动微流体通道以切换观测视角,既可以保证实验条件的一致性,又可以提高实验观测效率。本发明能够实现将微流体通道y,z方向的视野同时显示在一个视野中,从而对不同方向视野中微粒子的运动状态进行实时对比,以便于判断微粒子在微流体通道中的实时三维运动状态。
2.应用本发明提出的观测方法对微流体通道中受力后的微粒子进行了观测,同时结合了其余两种观测方法,并对其结果进行了比较。结果表明,直接观测法不能直接判断粒子在管中的三维聚集情况或实时运动状态,必须转动微流体通道切换视角观察。而单棱镜法则必须调节焦距到不同视角,才能判断粒子在管中的三维位置。但是双棱镜法却能同时显示两个视野的粒子,便可直接判断粒子在管中的三维聚集情况或实时运动状态,无需再次调焦,更无需转动微流体通道以切换观测视角。
附图说明
图1为本发明观测方法在采用外方内圆的微流体通道时的光路原理示意图;
图2为本发明观测方法在采用外方内圆的微流体通道时的应用结构示意图;
图3为直接观测法、单棱镜法和本发明方法分别观测外方内圆微流体通道的试验结果比较图。其中,图(a)~(d)表示外方内圆微流体通道中聚苯乙烯颗粒受力聚集后,用三种不同方法观测记录的结果。微流体通道直径0.9mm,微粒子直径6μm,图中虚线表示管壁,白色亮斑代表微粒子。图(a)是通过显微镜直接观察到的。图(b)和(c)是通过45°单棱镜法观察到的,xy通道是直接观测视角的通道,xz通道是棱镜中反射的通道。图(b)显微镜聚焦在棱镜中的微流体通道,而图(c)则聚焦在实际微流体通道中。图(d)是通过67.5°双棱镜法观察到的,xy与xz通道均为棱镜反射的实验结果。
图中标号说明:1微流体通道,2棱镜,3基板,4垫片,5微流体实验装置。
具体实施方式
本方案以微流体通道为外方内圆管为例进行说明,该技术方案采用的思路也同样适用于外方内方管、等腰三角管或其他形状的微流体管道。
参见图1和图2,本发明的实施例提供了一种显微镜下微流体通道y,z方向同时聚焦的观测方法,包括以下步骤:
确定进行实验的微流体通道,获取微流体通道的外壁宽度;确定用于进行观测的显微镜的视野范围和显微镜的焦距,判断所述视野范围、焦距是否满足最小视野范围以及最小焦距,如同时满足,则进行实验,否则调整显微镜。在该实施例中,所述微流体通道为外方内圆管,微流体通道具有四个等宽度的外壁,相邻外壁之间互成90°夹角;微流体通道的横截面中,外轮廓为正方形,内部通道为圆形结构。记所述微流体通道的外壁宽度为a,则所述最小视野范围为最小焦距为f0=3.414a。
进行实验前,将所述微流体通道的两端与微流体实验装置连接后固定在表面为水平面的基板上,使微流体通道的外壁与所述基板的表面呈α=45°夹角,且微流体通道的轴向为沿基板的长度方向。
取两个反射面为β=67.5°的棱镜,对称置于所述微流体通道的两侧,调整所述棱镜的水平高度与水平位置,通过选择合适厚度的垫片并置于所述棱镜的底部,使得棱镜的反射面下棱边分别与所述微流体通道两侧的棱边线性接触,并使棱镜的底面与所述基板的表面平行。
开始实验,将放置固定好微流体通道、棱镜的基板放置于显微镜载物台上并进行固定,通过微流体实验装置向微流体通道内通入目标颗粒,并调节显微镜,使显微镜聚焦到微流体通道中,则通过显微镜可同时观察到微流体通道y,z方向聚焦图像,然后进行观察记录;其中,微流体通道的x方向为沿微流体通道的轴线方向,y方向、z方向分别为垂直于微流体通道位于上方的两个外壁(即位于所述两个棱镜之间的两个外壁)且并指向微流体通道外部的方向。
本发明方法的设计原理如下:
参见图1,本发明通过对进入显微镜物镜之前的光路进行巧妙设计,以实现对微流体通道y,z方向同时聚焦。根据光的传播规律,要想使得两个不同方向的光路汇集成一个方向,则需要借助平面反射镜。而要实现同时聚焦,那么要求微粒在两个方向传播的光路一样长,所以本发明中进行观测的光路部分需为对称结构。结合光线进入显微镜物镜的方向,设计装置的光路设计原理图如图1所示。
原理图以外方内圆微流体通道为例,要实现对微流体通道y,z方向同时聚焦,则光路部分需对称设计,加上y,x方向光线均应垂直通道外表面传出,所以将微流体通道沿轴线旋转45°放置,从而使微流体通道的外壁相对于水平面的夹角为45°。由于显微镜物镜处于微流体通道正上方,光线需垂直射入,所以在微流体通道两侧对称放置反射棱镜,将45°入射光线反射成垂直90°反射光线。由此可得,入射光线与反射光线的夹角为135°,那么入射角和反射角均为67.5°,所以入射光线与镜面的夹角为22.5°,由此算得,棱镜与水平方向的夹角为67.5°,即使用反射面为67.5°的棱镜。
然后计算可以使用的视野范围。微流体通道中的微粒图像除了沿y,z方向垂直于通道外壁传出之外,还有直接垂直传入显微镜物镜中的,其光路要短。在实验观测中,需要的是y,z方向传出的光线,自然也会聚焦到棱镜中y,z方向(参见图1中的标示)的微粒图像上,而直接传入的微粒图像则无聚焦。但是由于装置结构设计原因,这道无聚焦的部分将占据视野中间,而两侧则是y,z方向的成像,即目标所在。所以想要在显微镜视野中观察到目标,其视野范围必须够大。而要观察清晰,自然又不能太大。假设微流体通道外边长为a,那么由图1可得,显微镜视野范围应不小于即不小于3.414a。
类似,可以计算出该观测法使用时显微镜所要满足的焦距。此处计算焦距是因为67.5°棱镜倾斜度比较大,需要反射的区域越宽,则棱镜的高度就越高。所以在实验前知道这个指标,就能判断是否能使用这种观测方法。由图1可见,微流体通道在棱镜中反射点的最高处,即显微镜物镜所能到达的最低处。由此,可以根据微流体通道虚像和67.5°直角三角形解出最小焦距。仍设微流体通道外壁宽为a,显微镜物镜所能到达的最低处高度h,解67.5°直角三角形得:h=a·tan67.5°=2.414a。为了看到微流体通道最深处,则最小焦距f0=h+a=3.414a。综上,只有当测试目标同时满足视野和焦距条件时,方可应用此种方法进行观测记录。
实施例:
在本发明的一个具体实施例中,选用外方内圆的毛细玻璃管作为微流体通道,其内径是0.9mm,外壁宽a为1.5mm,所用的目标颗粒是直径为6μm的聚苯乙烯微球,溶剂是去离子水。根据上述过程求得显微镜视野范围下限3.414a=5.12mm,显微镜最小焦距f0=3.414a=5.12mm。结合显微镜放大倍数,十倍目镜下选择四倍物镜,同时查询选择的四倍镜焦距,恰好均能满足以上条件,可以进行实验。
微流体实验装置与微流体通道两端相连,并将微流体通道固定在夹持装置的基板上,使得微流体通道外壁与基板面成45°夹角,轴向与基板长度方向平行,然后将两个67.5°棱镜水平对称放置在微流体通道两侧,同时调整棱镜的水平高度与水平位置,使得67.5°角的下棱边与微流体通道直角棱重合,如图2所示。
将将放置固定好微流体通道、棱镜的基板放置于显微镜载物台上并进行固定,通过微流体实验装置往微流体通道通入目标颗粒,并调节显微镜,使其聚焦到微流体通道中。该实施例中微流体实验装置采用超声波操控微流体通道中的粒子,因此接通事先安置的超声换能器,观察外方内圆微流体通道中目标微粒的运动状态,并记录。
在此67.5°双棱镜观测法之外,本发明的实施例中对外方内圆管实验还分别用直接观测法和45°单棱镜观测法观测,并将这三种观测方法的结果进行对比,如图3中(a)~(d)所示。直接观测法是将微流体通道水平固定在夹具上,直接用显微镜观察,因此显微镜只能看到垂直视角的微流体通道中一个水平面的成像。45°单棱镜观测法是在直接观测法的基础上,沿微流体通道放置一个45°棱镜,45°棱与方形毛细管底面棱紧贴,其45°反射面为反射面,将水平方向视野反射为垂直方向。所以在显微镜视野中既有垂直视野的微流体通道,也有水平视野的。但是由于两个方向的光路距离不一样,直接传入的光路短,反射的光路长,所以两个方向不能同时聚焦。但是它能实现在不转动微流体通道的情况下,实现的垂直方向和水平方向的逐一聚焦,即能看到一个水平面或者一个垂直面的成像。而67.5°双棱镜观测法则对45°单棱镜观测法做了进一步改进,使得在同一个视野中同时看到微流体通道中一个水平面和一个垂直面的成像。
图3中(a)~(d)表示外方内圆微流体通道中聚苯乙烯颗粒受力聚集后,分别用直接观测法、45°单棱镜观测法和67.5°双棱镜观测法观测记录的结果。微流体通道直径0.9mm,微粒子直径6μm,图中虚线表示管壁,白色亮斑代表微粒子。图(a)是通过直接观测法观察到的实验结果,结果显示粒子聚集在微流体通道的正中间垂直面,但是粒子在该垂直面内的分布情况就无法直接判断了,可能随机均匀分布,也可能聚集成线。(b)和(c)是通过45°单棱镜法观察到的实验结果,其中xy通道是垂直视角观测结果,xz通道是棱镜中反射的水平视角观测结果。图(b)显微镜聚焦在棱镜中的微流体通道,而图(c)则聚焦在实际微流体通道中。由图(b)可知,在水平视野中,粒子在微流体通道正中间聚集,即粒子聚集在微流体通道的正中间水平面。同理可由图(c)得,粒子又聚集在微流体通道的正中间垂直面。结合(b)和(c)的结论可得,粒子聚集在微流体通道中心轴线处。图(d)是通过67.5°双棱镜法观察到的实验结果,xy与xz通道均为棱镜反射的实验结果。与单棱镜法类似,粒子聚集于两个相互垂直视野下的微流体通道正中间,则可直接断定粒子聚集在微流体通道中心轴线处。至于图(d)中xy与xz通道中间的白色亮条可由图1解释,微流体通道中粒子的像除了通过双棱镜反射传入显微镜,还可以直接传入,只不过直接传入的光路较短,双棱镜反射光路要长。而棱镜中的视野正是所需要的,所以聚焦到棱镜中的粒子上,而实际通道则被虚化成亮条。这一部分不是目标所在,但也不能在视野中去除,故观看时应将其忽略。
通过对比可以发现,利用本发明方法进行观测时,既不需要进行多次调焦切换粒子聚集平面,也不必转动微流体通道切换视角,只需根据y,z两个方向视角的对比,即可判断微粒的运动状态和聚集结果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种显微镜下微流体通道y,z方向同时聚焦的观测方法,其特征在于,包括以下步骤:
确定进行实验的微流体通道,获取微流体通道的外壁宽度;确定用于进行观测的显微镜的视野范围和显微镜的焦距,判断所述视野范围、焦距是否满足最小视野范围以及最小焦距,如同时满足,则进行实验,否则调整显微镜;
进行实验前,将所述微流体通道的两端与微流体实验装置连接后固定在表面为水平面的基板上,使微流体通道的外壁与所述基板的表面呈α夹角,且微流体通道的轴向为沿基板的长度方向;
取两个反射面夹角为β的棱镜,对称置于所述微流体通道的两侧,调整所述棱镜的垂直高度与水平位置,使得棱镜的反射面下棱边分别与所述微流体通道两侧的棱边线性接触,并使棱镜的底面与所述基板的表面平行;
开始实验,将放置固定好微流体通道、棱镜的基板放置于显微镜载物台上并进行固定,通过微流体实验装置向微流体通道内通入目标颗粒,并调节显微镜,使显微镜聚焦到微流体通道中,则通过显微镜可同时观察到微流体通道y,z方向聚焦图像;其中,微流体通道的x方向为沿微流体通道的轴线方向,y方向、z方向分别为垂直于微流体通道位于上方的两个外壁且并指向微流体通道外部的方向。
2.根据权利要求1所述的显微镜下微流体通道y,z方向同时聚焦的观测方法,其特征在于,所述微流体通道的y,z方向观测面是两个具有等宽度的外壁,且这两个外壁之间互成90°夹角;所述α的取值为45°,β的取值为67.5°。
4.根据权利要求1所述的显微镜下微流体通道y,z方向同时聚焦的观测方法,其特征在于,通过调整棱镜的垂直高度和水平位置,使得棱镜的反射面下棱边分别与所述微流体通道两侧的棱边线性接触。
5.根据权利要求1所述的显微镜下微流体通道y,z方向同时聚焦的观测方法,其特征在于,通过结合显微镜放大倍数,在所选倍数目镜下进行物镜焦距的查询计算,以判断显微镜的视野范围、焦距是否满足最小视野范围以及最小焦距。
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