CN111920798A - 一种硝呋酚酰肼在制备药物中的应用 - Google Patents

一种硝呋酚酰肼在制备药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种硝呋酚酰肼在制备药物中的应用，属于生物医药领域。所述硝呋酚酰肼在制备保护高糖诱导的胰岛细胞的药物中的应用。本发明实施例提供的硝呋酚酰肼可以显著逆转氧化应激指数，减少高糖刺激细胞内的氧化应激水平，保护胰岛细胞的正常功能。硝呋酚酰肼治疗可以减少促凋亡蛋白的蛋白表达并增加抗凋亡蛋白的蛋白表达，从而缓解高糖诱导的细胞的凋亡，维持胰岛细胞的正常数量，使胰岛素分泌趋于正常水平。

Description

一种硝呋酚酰肼在制备药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，更具体地，涉及硝呋酚酰肼在制备药物中的应用。
背景技术
2型糖尿病(Type 2Diabetes Mellitus，T2DM)的两个主要发病机制是胰岛β细胞功能异常和胰岛素抵抗。持续升高的血糖引起的胰岛β细胞功能障碍是T2DM发展的重要决定因素。胰岛β细胞易受多种应激的影响，包括氧化应激和内质网应激，受应激影响后可导致细胞功能障碍、胰岛素分泌减少甚至胰岛β细胞的凋亡。高浓度的血糖会产生过多的活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)，并且ROS的不断积累会引起慢性氧化应激，减少胰岛素分泌并导致细胞凋亡。因此，亟需在氧化应激下保护胰岛β细胞功能的有效的药物，从而对于T2DM实现更多方面的预防和治疗。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种硝呋酚酰肼在制备药物中的应用，该应用能够在氧化应激下有效保护胰岛β细胞功能。
本发明实施例提供一种硝呋酚酰肼在制备药物中的应用，所述硝呋酚酰肼在制备保护高糖诱导的胰岛细胞的药物中的应用。
具体地，所述应用包括：所述硝呋酚酰肼在制备保护高糖诱导的胰岛β细胞的药物中的应用。
具体地，所述应用包括：所述硝呋酚酰肼在制备保护高糖诱导的胰岛细胞的胰岛素分泌的药物中的应用。
具体地，所述应用包括：所述硝呋酚酰肼在制备逆转高糖诱导的胰岛β细胞的氧化应激的药物中的应用。
具体地，所述应用包括：所述硝呋酚酰肼在制备减轻高糖诱导的胰岛β细胞的炎症反应的药物中的应用。
具体地，所述应用包括：所述硝呋酚酰肼在制备通过信号传导与转录激活因子信号通路保护高糖诱导的胰岛β细胞的胰岛素分泌的药物中的应用。
具体地，所述药物用于2型糖尿病的治疗。
具体地，所述药物用于胰岛β细胞功能异常引起的2型糖尿病的治疗。
具体地，所述应用包括：所述硝呋酚酰肼的浓度为0.625μM或1.25μM。
本发明实施例提供的硝呋酚酰肼可以显著逆转氧化应激指数，减少高糖刺激细胞内的氧化应激水平，保护胰岛细胞的正常功能。硝呋酚酰肼治疗可以减少促凋亡蛋白的蛋白表达并增加抗凋亡蛋白的蛋白表达，从而缓解高糖诱导的细胞的凋亡，维持胰岛细胞的正常数量，使胰岛素分泌趋于正常水平。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
附图说明
附图用来提供对本发明技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本发明的技术方案，并不构成对本发明技术方案的限制。
图1是本发明实施例的高糖诱导的INS-1细胞中炎性因子STAT3、IL-6和TNF-α的蛋白表达。
图2是本发明实施例图1提供的高糖诱导的INS-1细胞中炎性因子STAT3、IL-6和TNF-α的蛋白表达的对比图，其中*表示与高糖(30mM Glucose)相比。
图3是本发明实施例的不同浓度硝呋酚酰肼处理的INS-1细胞48h的细胞活力。
图4是本发明实施例的用30mM葡萄糖诱导48h后以不同浓度硝呋酚酰肼处理的INS-1细胞24h的细胞活力，其中#表示与5.5mM Glucose对照组相比。
图5是本发明实施例的不同浓度硝呋酚酰肼处理的INS-1细胞48h的细胞活力，其中#表示与5.5mM Glucose对照组相比，*表示与高糖(30mM Glucose+0μM硝呋酚酰肼)相比。
图6是本发明实施例的DCFH-DA检测高糖诱导后INS-1细胞内ROS的含量，其中#表示与5.5mM Glucose对照组相比，*表示与高糖(30mM Glucose+0μM硝呋酚酰肼)相比，且##P＜0.01，*P＜0.05，**P＜0.01。
图7是本发明实施例的高糖诱导后INS-1细胞内脂质氧化(MDA)的含量，其中*表示与高糖(30mM Glucose+0μM硝呋酚酰肼)相比。
图8是本发明实施例的高糖诱导后INS-1细胞一氧化氮(NO)的含量，其中##表示与5.5mM Glucose对照组相比，**表示与高糖(30mM Glucose+0μM硝呋酚酰肼)相比。
图9是本发明实施例的高糖(30Mm glucose)诱导后INS-1细胞的GSIS量，其中*表示与高糖(30mM Glucose+0μM硝呋酚酰肼)相比，且*P＜0.05，**P＜0.01。
图10是本发明实施例的RT-PCR检测高糖诱导后INS-1细胞Ins1的表达量，其中####表示与5.5mM Glucose对照组相比，*表示与高糖(30mM Glucose+0μM硝呋酚酰肼)相比。
图11是本发明实施例的RT-PCR检测高糖诱导后INS-1细胞Ins2的表达量，其中###表示与5.5mM Glucose对照组相比。
图12是本发明实施例的Westernblot检测胰岛素通路相关蛋白表达水平。
图13是本发明实施例图15提供的胰岛素通路相关蛋白灰度值比较，其中#表示与5.5mM Glucose对照组相比，*表示与高糖(30mM Glucose+0μM硝呋酚酰肼)相比。
图14是本发明实施例的RT-PCR检测细胞内SOD表达水平，其中###表示与5.5mMGlucose对照组相比，##表示与5.5mM Glucose对照组相比，*表示与高糖(30mM Glucose+0μM硝呋酚酰肼)相比。
图15是本发明实施例的RT-PCR检测细胞内GSH-px表达水平，其中###表示与5.5mMGlucose对照组相比。
图16是本发明实施例的RT-PCR检测细胞内CAT表达水平，其中###表示与5.5mMGlucose对照组相比，*表示与高糖(30mM Glucose+0μM硝呋酚酰肼)相比。
图17是本发明实施例的RT-PCR检测高糖诱导后INS-1细胞内IL-6基因表达水平，其中##表示与5.5mM Glucose对照组相比，**表示与高糖(30mM Glucose+0μM硝呋酚酰肼)相比。
图18是本发明实施例的RT-PCR检测高糖诱导后INS-1细胞内TNF-α基因表达水平，其中#表示与5.5mM Glucose对照组相比，*表示与高糖(30mM Glucose+0μM硝呋酚酰肼)相比，且##P＜0.01，*P＜0.05，**P＜0.01。
图19是本发明实施例的RT-PCR检测高糖诱导后INS-1细胞内MCP-1基因表达水平。
图20是本发明实施例的RT-PCR检测高糖诱导后INS-1细胞内IL-6基因表达水平，其中##表示与5.5mM Glucose对照组相比，*表示与高糖(30mM Glucose+0μM硝呋酚酰肼)相比。
图21是本发明实施例的RT-PCR检测高糖诱导后INS-1细胞内STAT3基因表达水平，其中##表示与5.5mM Glucose对照组相比，*表示与高糖(30mM Glucose+0μM硝呋酚酰肼)相比，且##P＜0.01，*P＜0.05，**P＜0.01。
图22是本发明实施例的RT-PCR检测高糖诱导后INS-1细胞内SOCS3基因表达水平，其中#表示与5.5mM Glucose对照组相比，*表示与高糖(30mM Glucose+0μM硝呋酚酰肼)相比。
图23是本发明实施例的Western blot检测INS-1细胞内胰岛素信号通路相关蛋白表达水平。
图24是本发明实施例图23提供的INS-1细胞内胰岛素信号通路相关蛋白灰度值比较，其中#表示与5.5mM Glucose对照组相比，*表示与高糖(30mM Glucose+0μM硝呋酚酰肼)相比，且##P＜0.01，*P＜0.05，**P＜0.01。
图25是本发明实施例的光镜下观察用药后四种条件下细胞状态对比图。
图26是本发明实施例的Western blot检测细胞内凋亡相关蛋白表达水平。
图27是本发明实施例图26提供的细胞内凋亡相关蛋白灰度值比较，其中#表示与5.5mM Glucose对照组相比，*表示与高糖(30mM Glucose+0μM硝呋酚酰肼)相比。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
本发明实施例提供了一种硝呋酚酰肼在制备药物中的应用，硝呋酚酰肼在制备保护高糖诱导的胰岛细胞的药物中的应用。
具体地，该应用包括：硝呋酚酰肼(Nifu)在制备保护高糖诱导的胰岛β细胞的药物中的应用。
具体地，该应用包括：硝呋酚酰肼在制备保护高糖诱导的胰岛细胞的胰岛素分泌的药物中的应用。
具体地，该应用包括：硝呋酚酰肼在制备逆转高糖诱导的胰岛β细胞的氧化应激的药物中的应用。
具体地，该应用包括：硝呋酚酰肼在制备减轻高糖诱导的胰岛β细胞的炎症反应的药物中的应用。
具体地，该应用包括：硝呋酚酰肼在制备通过信号传导与转录激活因子信号通路保护高糖诱导的胰岛β细胞的胰岛素分泌的药物中的应用。
具体地，该药物用于2型糖尿病的治疗。
具体地，该药物用于胰岛β细胞功能异常引起的2型糖尿病的治疗。
具体地，该应用包括：硝呋酚酰肼的浓度为0.625μM或1.25μM。
下面简单介绍一下该硝呋酚酰肼在制备药物中的应用的效果，具体试验如下：
细胞培养与处理：将实验室用大鼠(购买于中国协和医科大学基础医学研究所细胞资源中心)的胰岛素瘤β细胞系(INS-1)培养于RPMI(Roswell Park MemorialInstitute)1640培养基中，该RPMI 1640培养基中含有浓度为10％的胎牛血清、100单位/mL的青霉素和浓度为0.1mg/mL的链霉素，选取第16代INS-1细胞用于本实施例。
建立高糖损伤模型：将INS-1细胞用浓度为30mM的葡萄糖(购置于美国Sigma公司)预处理48h，并将经过浓度为30mM的葡萄糖预处理后的作为高糖水平，将浓度为5.5mM的葡萄糖预处理后的作为正常葡萄糖水平。将硝呋酚酰肼(购置于成都西亚试剂有限公司)10mg溶于3.63mL二甲基亚砜中配置成浓度为10mmol/L的硝呋酚酰肼溶液，使用时将硝呋酚酰肼溶液用培养基稀释成所需浓度，并分别在上述两个含有不同浓度的葡萄糖中预处理48h。
细胞存活率：待INS-1细胞培养至对数期，收集对数期细胞并制成细胞悬液，调整细胞悬液浓度，以每孔3×104个INS-1细胞接种到96孔的细胞培养板中。
在浓度为5％的CO2中于37℃过夜孵育，将细胞培养板倒置于显微镜下可观察细胞的贴壁情况。
配制浓度为0μM、0.3125μM、0.625μM、1.25μM、2.5μM和5μM的硝呋酚酰肼溶液，分别干预INS-1细胞24h、48h和72h。
终止孵育，吸去细胞培养板孔内的培养液，并用PBS洗2～3次，最后吸净残余液体。
在细胞培养板的每个孔内加入20μL已配好的MTT(噻唑蓝)溶液(浓度为5mg/mL)，置于浓度为5％的CO2中并于37℃培养4h。
小心吸去细胞培养板孔内MTT溶液，并用PBS洗1～2次，最后吸净残余液体，防止贴壁细胞脱落或被吸走。
在细胞培养板的每个孔内加入150μL二甲基亚砜，置于摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。
通过酶联免疫检测仪在OD 570nm处测量各孔的吸光值。其结果如图1至图5所示。由图1和图2可知，经高糖诱导后导致INS-1细胞内炎症因子及磷酸化STAT3蛋白表达量显著增加，炎症因子包括：STAT3、IL-6、TNF-α和β-actin。不同浓度硝呋酚酰肼溶液(0μM、0.3125μM、0.625μM、1.25μM、2.5μM和5μM)处理的INS-1细胞48h，并通过MTT法测量细胞活力，由图3可知，不同浓度的硝呋酚酰肼溶液处理48h均未观察到明显的细胞毒性。INS-1细胞用30mM葡萄糖诱导48h后，以不同浓度的硝呋酚酰肼溶液处理24h后，测定细胞活力，由图4可知，用30mM葡萄糖处理后可明显降低INS-1细胞的活力，即30mM高糖处理后INS-1细胞的活力下降至38.28％。用不同浓度的硝呋酚酰肼溶液处理24h，细胞活力未显著恢复。30mM葡萄糖诱导INS-1细胞48h后，将INS-1细胞用不同浓度的硝呋酚酰肼溶液处理48h，并通过MTT法测量细胞活力，如图5所示，用不同浓度的硝呋酚酰肼溶液处理48h后，INS-1细胞的存活率得以明显恢复。与未加入硝呋酚酰肼(0μM硝呋酚酰肼)相比，用浓度为0.625μM和1.25μM的硝呋酚酰肼溶液治疗后胰岛细胞的活力明显增加。
细胞内活性氧(ROS)；将第16代INS-1细胞培养于含有细胞培养液的共聚焦显微镜专用培养皿中，经高糖诱导48h，用浓度为0μM、0.625μM和1.25μM的硝呋酚酰肼溶液处理48h，将浓度为5.5mM的葡萄糖预处理后的作为正常葡萄糖水平。装载探针：按照1:1000的体积比用无血清培养液稀释DCFH-DA(2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐)，使DCFH-DA的终浓度为10μmol/L。去除细胞培养液和硝呋酚酰肼溶液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的DCFH-DA的体积以能充分盖住INS-1细胞为宜，通常向培养皿中加入200mL稀释好的DCFH-DA，于37℃细胞培养箱内孵育20min，用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入INS-1细胞内的DCFH-DA。活性氧阳性对照刺激细胞30min。使用488nm激发波长，于525nm发射波长检测DCF。
检测结果如图6至图9所示，通过DCFH-DA检测高糖诱导后的INS-1细胞内ROS含量，由图6可知，高糖诱导使INS-1细胞内ROS水平显著增加，且平均荧光强度为68404.4，应用两种浓度(0.625μM和1.25μM)的硝呋酚酰肼溶液治疗后INS-1细胞内ROS水平均明显降低，其平均荧光强度分别为43255.6和51906.8。
INS-1细胞内脂质氧化(MDA)检测：样品准备：收取培养于经高糖诱导后用浓度为0μM、0.625μM和1.25μM的硝呋酚酰肼溶液分别处理的INS-1细胞，将浓度为5.5mM的葡萄糖预处理后的作为正常葡萄糖水平。按每100万INS-1细胞使用0.1mL裂解液进行裂解，并于12,000g离心10min，得到上清液，取一部分上清液用于后续测定，另一部分上清液用于BCA蛋白浓度测定。
脂质氧化(MDA)检测试剂盒(购置于上海碧云天生物技术有限公司，型号为S0131)准备：TBA(硫代巴比妥酸)储存液的配制：配制最终浓度为0.37％的TBA储存液(即称取18.5mg TBA+5mLTBA配制液)。TBA配制液需完全溶解后再使用，可以加热到70℃以促进溶解。
MDA检测工作液的配置：3000μL TBA稀释液+1000μL TBA储存液+30μL抗氧化剂。
标准品的稀释：取适量标准品用蒸馏水稀释至1μM、2μM、5μM、10μM、20μM、50μM、100μM、150μM和200μM用于制作标准曲线。
样品测定：
①在离心管中加入：
空白对照 标准 样品
PBS缓冲液(mL) 0.1 - -
标准品(mL) - 0.1 -
待测样品(mL) - - 0.1
MDA检测工作液(mL) 0.2 0.2 0.2
②各离心管分别混匀后，使用加热块(Heat block)对离心管进行加热，加热温度为100℃，加热时间为15min，注意避免液体暴沸溅出，需用重物压紧离心管盖。
③水浴冷却至室温，1000g室温离心10分钟，取200μL加入新的96孔细胞培养板中，后用酶标仪在532nm测定吸光度。
检测高糖诱导后的INS-1细胞内脂质氧化(MDA)，由图7可知，30mM高糖处理后MDA水平显著增加平均浓度为3.278μmol/mg，应用浓度为0.625μM和1.25μM的硝呋酚酰肼溶液治疗后可明显降低INS-1细胞内MDA含量，其平均浓度分别为2.263μmol/mg和1.737μmol/mg。
INS-1细胞内一氧化氮(NO)检测：收取培养于经高糖诱导后用浓度为0μM、0.625μM和1.25μM的硝呋酚酰肼溶液分别处理的INS-1细胞，将浓度为5.5mM的葡萄糖预处理后的作为正常葡萄糖水平。采用一氧化氮检测试剂盒(购置于上海碧云天生物技术有限公司，型号为S0131)。具体检测方法参见该试剂盒说明书。检测结果：采用酶标仪于540nm处测定每个细胞培养板孔中INS-1细胞的OD值，具体数值如下：由图8可知，30mM高糖处理后一氧化氮含量显著增加，NO平均浓度为0.566μM，应用浓度为0.625μM和1.25μM的硝呋酚酰肼溶液治疗后可明显降低INS-1细胞内一氧化氮含量，其一氧化氮平均浓度分别为0.292μM和0.317μM，这能够逆转高糖引起的细胞氧化应激，从而恢复细胞正常功能。
葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)：
配置100mL KRBB(林二氏重碳酸盐缓冲液)溶液：NaCl 0.672g，KCl 0.035g，CaCl20.028g，KH2PO4 0.016，MgSO4 0.014g，HEPES 0.475g，NaHCO3 0.21g和浓度为0.1％的BSA(牛血清白蛋白)0.1g，全部溶解后调整pH为7.4。现用现配，过滤除菌后备用。
收集待测液：将第16代INS-1细胞于96孔细胞培养板中分别经基础水平葡萄糖(5.5mM葡萄糖)及高糖(30mM葡萄糖)诱导48h，并将高糖(30mM葡萄糖)诱导后的细胞用浓度为0μM、0.625μM和1.25μM的硝呋酚酰肼溶液分别处理48h，并将基础水平葡萄糖(5.5mM葡萄糖)作为对照组。弃去上清，用PBS洗一次，加入含有5mmol/L葡萄糖的KRBB溶液平衡30min，吸去KRBB溶液，加入含有5mmol/L葡萄糖的KRBB溶液，于37℃孵育1h，收集细胞上清液。细胞培养板每个孔内再分别加入含有浓度为25mmol/L葡萄糖的KRBB溶液，于37℃孵育1h，吸取上清液，并待测定上清液中胰岛素水平。
采用ELISA试剂盒检测上清液中胰岛素水平，具体操作按照该ELISA试剂盒进行，以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，并用MPM6软件计算每孔样品浓度数值，标准品胰岛素浓度分别为0ng/mL，0.2ng/mL，0.5ng/mL，1ng/mL，2ng/mL，5ng/mL和10ng/mL。
低糖(5mM葡萄糖)刺激时测得每个样品中胰岛素的平均浓度为：对照组的胰岛素的平均浓度为20.02ng/mL，高糖+0μM硝呋酚酰肼处理的胰岛素的平均浓度为13.11ng/mL，高糖+1.25μM硝呋酚酰肼处理的胰岛素的平均浓度为19.19ng/mL，高糖+0.625μM硝呋酚酰肼处理的胰岛素的平均浓度为20.35ng/mL。
高糖(25mM)刺激时测得每个样品中胰岛素的平均浓度为：对照组的胰岛素的平均浓度为28.80ng/mL，高糖+0μM硝呋酚酰肼处理的胰岛素的平均浓度为14.70ng/mL，高糖+1.25μM硝呋酚酰肼处理的胰岛素的平均浓度为31.78ng/mL，高糖+0.625μM硝呋酚酰肼处理的胰岛素的平均浓度为31.83ng/mL。
结合图9所示，INS-1细胞经高糖(30mM)刺激48h后，硝呋酚酰肼孵育48h，与对照组相比，高糖处理减少了用25mmol/L葡萄糖刺激的INS-1细胞的胰岛素分泌，应用硝呋酚酰肼治疗后逆转了高糖的这种损害作用，增加了胰岛素分泌。结合图10和图11所示的对胰岛素基因检测结果，高糖诱导后INS-1细胞内Ins1 mRNA和Ins2 mRNA的表达量均显著降低，利用硝呋酚酰肼改善了Ins1基因的表达。采用Western blot检测胰岛素通路相关蛋白，结果如图12和图13所示，高糖诱导使胰岛素信号通路传导受显著抑制，硝呋酚酰肼处理可显著逆转这种抑制，增强胰岛素信号的传导。以上结果说明硝呋酚酰肼增强高糖诱导INS-1细胞胰岛素分泌并增强胰岛素信号传导，从而在高糖状态下，保护胰岛细胞分泌胰岛素的正常功能。
RNA的提取与实时荧光定量PCR(Real-time PCR，RT-PCR)检测，将第16代INS-1细胞于96孔细胞培养板中经高糖(30mM葡萄糖)诱导48h作为实验组，用浓度为0μM、0.625μM和1.25μM的硝呋酚酰肼溶液分别处理实验组48h，将浓度为5.5mM的葡萄糖预处理后的作为对照组。细胞总RNA提取：采用1.5mL RNase-Free离心管分别收集处理后的INS-1细胞，离心后轻弹离心管的底部，并加入350μL裂解液RL(沉淀细胞数量小于5×106加入350μL裂解液RL)，涡旋震荡。
将离心管内所有溶液转至过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管内)，于12000rpm离心2min，收集滤液。
向滤液中加入350μL浓度为70％的乙醇，混匀，此时可能会产生沉淀，得到带有沉淀的溶液，将得到的溶液及沉淀一起转入吸附柱CR3(吸附柱CR3置于收集管内)，于12000rpm离心60s，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm离心60s，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
向吸附柱CR3中央加入80μLDNase I工作液，室温放置15min。
向吸附柱CR3中央加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm离心60s，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
向吸附柱CR3中央加入500μL漂洗液RW，室温静置2分钟，12000rpm离心60s，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中。重复此步骤1次。
12000rpm离心2min，弃废液。将吸附柱CR3置于室温放置10min彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
将吸附柱CR3转入新的RNase-Free离心管中，加入30μL RNase-Free ddH2O，室温放置2min，12000rpm离心2min，得到RNA溶液，采用NanoDrop2000超微量分光光度计检测RNA溶液的浓度，并结合检测结果反转录cDNA，RNA溶液的浓度分别为对照组(5.5mM Glucose)：31.35ng/μL，高糖(30mM Glucose)+0μM硝呋酚酰肼：42.05ng/μL，高糖(30mM Glucose)+1.25μM硝呋酚酰肼：57.1ng/μL，高糖(30mM Glucose)+0.625μM硝呋酚酰肼：26.35ng/μL。
反转录cDNA：将总RNA溶液、cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒(北京TransGen Biotech有限公司，AT301)中各试剂融化，混匀后点甩离心。加入表1中各组分。
表1为反转录cDNA所用试剂组分及用量
组分 用量
总RNA 300ng
Anchored Olligo Primer(0.5μg/μL) 1μL
2×TS Reaction Mix 10μL
TransScript RT/RI Enzyme Mix 1μL
RNase-Free ddH<sub>2</sub>O 将总体积补足至20μL
轻轻混匀后，采用微量离心机离心30s。
采用普通PCR仪于42℃反应15min，85℃加热5s，反应结束后得到cDNA，将反应产物cDNA取出并置于冰上。
RT-PCR反应：
引物：根据NCBI提供的基因序列，在线引物设计网站“NCBI Primer-BLAST”设计引物(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)，设计好的引物由博迈德有限公司合成。具体引物序列如表2所示。
表2为INS-1细胞实时定量PCR的上游引物序列和下游引物序列
基因 上游引物 下游引物
SOD gagcattccatcattggccg gggcaatcccaatcacacca
GSH-PX ccgggactacaccgaaatga ctcaccattcacctcgcact
CAT gaggaaacgcctgtgtgaga ttggcagctatgtgagagcc
Ins1 tcttctacacacccaagtcccg agtgccaaggtctgaagatccc
Ins2 atcctctgggagccccgc agagagcttccaccaag
IL-1β tcgctcagggtcacaaagaaa ccatcagaggcaaggaggaa
IL-6 ggtacatcctcgacggcatct gtgcctctttgctgctttcac
TNF-α tctcttcaagggacaaggctg atagcaaatcggctgacggt
MCP-1 ttggctcagccagatgca ccagcctactcattgggatca
STAT3 caccttggattgagagtcaagac aggaatcggctatattgctggt
SOCS3 tttaccaccgacggaacctt cgacaaagatgctggagggta
β-actin ctcaactacatggtctacatg tggcatggactgtggtcatgag
表2中引物序列如序列表中SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.24所示。
按照表3所示组分及体积加入PCR专用96孔板。
表3为RT-PCR反应所用试剂组分及用量
Figure BDA0002555926180000131
Figure BDA0002555926180000141
轻轻混匀后，采用微量离心机离心30s。
将PCR专用96孔板置于PCR仪中，按以下条件进行扩增反应：每个循环均包括：94℃5min(预变性)→94℃30s(变性)→56℃30s(退火)→72℃30s(延伸)；该扩增反应共40个循环；最后，72℃7min。
计算所有基因的mRNA的相对表达量。
(D-F)RT-PCR检测INS-1细胞内SOD、GSH-px和CAT的mRNA表达水平，由图14至图16可知，INS-1细胞长期暴露于高糖水平会导致SOD、GSH-px和CAT的mRNA表达水平均显著降低，硝呋酚酰肼可显著逆转这种情况，与高糖诱导相比，用硝呋酚酰肼后三者含量明显增加。综上所述，硝呋酚酰肼处理可以显著逆转氧化应激指数，减少高糖刺激细胞内的氧化应激水平，保护胰岛细胞的正常功能。
用RT-PCR检测炎症细胞因子等，炎症细胞因子包括白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和单核趋化蛋白1(MCP-1)的mRNA水平，结果如图17至图24所示，如图17至19所示，与对照组(5mM葡萄糖组)相比，高糖明显增加了上述炎症细胞因子的表达，在硝呋酚酰肼浓度为0.625μM和1.25μM时，IL-1β、TNF-α和MCP-1的表达量均显著降低。如图20至24所示，对炎症通路IL-6/STAT3/SOCS3(细胞因子信号转导3的磷酸化)的蛋白和mRNA表达水平的检测结果发现，与未治疗组相比，高糖诱导后炎症通路IL-6/STAT3/SOCS3途径被激活，但硝呋酚酰肼治疗显著抑制了此通路的激活。由上述结果可知，硝呋酚酰肼在高糖诱导的INS-1细胞中显著降低炎症因子的表达并抑制炎症途径的活化，从而减轻高糖诱导的炎症反应，保护胰岛细胞的正常功能。
蛋白质印迹法(Western Blot)：
样品处理：
(1)细胞裂解：向装有2mL上清液(在INS-1细胞内脂质氧化检测时制备)的圆底离心管中加入裂解液(该裂解液含有终浓度为1mmol/L的PMSF和1mmol/L的Cocktail)。按照每1×106细胞量+50μL裂解液。于冰上裂解20min，裂解期间轻柔吹打裂解液，得到裂解细胞。
(2)离心：将裂解细胞经过预冷的低温高速离心机离心，离心温度为4℃，转速为12000rpm，离心时间为30min。
(3)离心结束后将圆底离心管置于冰上，用移液器将上清液转移至新的1.5mL的离心管中，并将新的离心管置于冰上。
(4)用PBS缓冲液进行稀释，并稀释至适宜浓度(通常细胞稀释20倍)，用于BCA蛋白定量。
(5)用BCA试剂盒测定蛋白浓度：采用BCA蛋白浓度测定试剂盒(购置于上海碧云天生物技术有限公司，型号为P0010S)
①准备BCA蛋白标准品：30mg蛋白标准品+1.2mL蛋白标准配制液，充分溶解，配成浓度为25mg/mL的蛋白标准品溶液，分装后于-20℃保存。取20μL上述蛋白标准品溶液+980μL PBS稀释液，配成浓度为0.5mg/mL的蛋白标准品，备用。
②配制BCA工作液：根据需定量的样品数量，配制工作液(将BCA蛋白浓度测定试剂盒中的A液和B液按体积比例50：1进行配置，并充分混匀)。
③蛋白浓度测定：取96孔板，依次加入0、1、2、4、8、12、16和20μL浓度为0.5mg/mL的蛋白标准品，加入标准品稀释液将体积补足至20μL，则标准品浓度依次为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mg/mL。向样品孔中加入20μL样品(稀释后的裂解细胞溶液)。各孔中加入200μL BCA工作液，于37℃培养20min。当96孔板内的溶液变色后，采用酶标仪测定562nm波长的吸光度。根据标准曲线计算样品浓度。
(8)蛋白变性：将RIPA裂解液稀释后的上清液吸取至1.5mL离心管中，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液。混匀后将样品于95℃恒温水浴中加热5min。
SDS-PAGE电泳
(1)清洗玻璃板，玻璃板两面清洗干净后用蒸馏水冲洗、晾干备用。
(2)配胶：配制并灌好分离胶和浓缩胶，将梳子插入浓缩胶，等待浓缩胶凝固。
(3)将充分凝固的浓缩胶固定于电泳槽中，加入适当体积的1×电泳缓冲液，拔除梳子，完整暴露胶孔。
(4)上样：依次向胶孔内加入5μL Protein Standards预染蛋白Marker、各蛋白样品(各样品的蛋白总质量相等)，Marker孔用1×loading buffer补齐至样品相等体积，样品两侧胶孔也用样品等体积的1×loading buffer上样。
(5)电泳：初始电压为80V，待Marker分开后调节电压至120V，电泳1.5h。在目的蛋白电泳至距胶下缘1cm时结束电泳。
转膜
(1)裁取与胶大小适宜的0.45μm的PVDF膜，置于无水甲醇中浸泡15s至半透明，取出PVDF膜及滤纸，转膜缓冲液中平衡15min。
(2)戴手套取出并撬开胶板，小心刮去浓缩胶及多余的分离胶。用超纯水将胶冲洗干净，转膜缓冲液中浸洗15min，备用。
(3)湿转：将夹子打开，黑色面平置于桌面，放入海绵及三层已吸足转膜缓冲液的滤纸，依次放上凝胶、转膜缓冲液中平衡过的PVDF膜，用干净湿润的玻璃棒清除气泡，再铺三层滤纸、海绵并清除气泡，合起夹子。将夹子放入电转槽中并加入预冷的转膜缓冲液，转膜条件：低温冰浴，200mA，120min。
封闭、抗体孵育与洗涤
(1)电转槽中取出膜，用超纯水稍加漂洗，包好保鲜膜，用丽春红染膜后，切取目的条带和内参条带的膜，纯水洗净丽春红燃料，将膜置于浓度为5％的脱脂奶粉中，摇床缓慢摇荡90min。
(2)按比例稀释一抗。一抗加入湿盒中，相应条带置于湿盒中，4℃摇床过夜孵育。
(3)次日取出膜，用1×TBST浸洗3次，每次10min。
(4)在玻璃平皿中加入足量的辣根过氧化物酶标记的二抗，避光，室温轻摇孵育1h。
(5)二抗孵育结束后，取出膜，用1×TBST浸洗3次，每次10min。
化学发光显影
使用化学发光法(ElectroChemiLuminescence，ECL)，将显影液A和显影液B按体积比1：1混合。采用超纯水漂洗膜，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A和B的混合液滴上，避光条件下滴加ECL发光液，用Chemi-Doc Touch凝胶成像系统显影成像，并用BIO-RAD凝胶成像系统分析软件对图像进行灰度分析。
统计分析
使用统计软件GraphPad Prism 8.0进行统计学分析。数据以均数±标准差表示。组间数据比较进行正态性及方差齐性检验选择应用单因素方差分析或t检验，以p＜0.05为差异有显著统计学意义。
观察细胞生长发现：如图25所示，与正常糖浓度组相比，高糖预诱导后凋亡细胞数量明显增加，但用浓度为0.625μM和1.25μM的硝呋酚酰肼溶液处理48h后凋亡细胞数量明显减少。为了研究硝呋酚酰肼是否改变了STAT3介导的高糖诱导的凋亡相关蛋白的表达，通过蛋白质印迹测试了促凋亡和抗凋亡蛋白表达，如Bax(促凋亡蛋白)、Bcl2(B细胞淋巴瘤/白血病-2)和Caspase3。如图26和图27所示的蛋白印迹结果显示，与对照组(5.5mM葡萄糖组)细胞相比，在高糖处理的细胞中Bax和Caspase3的表达水平显著增加。然而，在高糖预处理的INS-1细胞中，用浓度为0.625μM和1.25μM的硝呋酚酰肼溶液处理明显降低了蛋白质表达。相反，在高糖处理的细胞中，Bcl-2的蛋白质水平显著下降。当高糖处理的细胞用浓度为0.625μM和1.25μM的硝呋酚酰溶液肼处理时，Bcl-2水平急剧增加。所有这些结果表明，硝呋酚酰肼治疗可以减少促凋亡蛋白的蛋白表达并增加抗凋亡蛋白的蛋白表达，从而缓解高糖诱导的INS-1细胞的凋亡，维持胰岛细胞的正常数量，使胰岛素分泌趋于正常水平。
本发明实施例提供的硝呋酚酰肼能够明显增加胰岛细胞的活力，同时，硝呋酚酰肼可以显著逆转氧化应激指数，减少高糖刺激细胞内的氧化应激水平，保护胰岛细胞的正常功能。硝呋酚酰肼能够增强高糖诱导胰岛素分泌并增强胰岛素信号传导，从而在高糖状态下，保护胰岛细胞分泌胰岛素的正常功能。而且，硝呋酚酰肼在高糖诱导的细胞中显著降低炎症因子的表达并抑制炎症途径的活化，从而减轻高糖诱导的炎症反应，保护胰岛细胞的正常功能。硝呋酚酰肼治疗可以减少促凋亡蛋白的蛋白表达并增加抗凋亡蛋白的蛋白表达，从而缓解高糖诱导的细胞的凋亡，维持胰岛细胞的正常数量，使胰岛素分泌趋于正常水平。
虽然本发明所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本发明而采用的实施方式，并非用以限定本发明。任何本发明所属领域内的技术人员，在不脱离本发明所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本发明的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。
序列表
<110> 首都医科大学附属北京同仁医院
<120> 一种硝呋酚酰肼在制备药物中的应用
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagcattcca tcattggccg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggcaatccc aatcacacca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgggactac accgaaatga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcaccattc acctcgcact 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaggaaacgc ctgtgtgaga 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttggcagcta tgtgagagcc 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcttctacac acccaagtcc cg 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agtgccaagg tctgaagatc cc 22
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atcctctggg agccccgc 18
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agagagcttc caccaag 17
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcgctcaggg tcacaaagaa a 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccatcagagg caaggaggaa 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggtacatcct cgacggcatc t 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gtgcctcttt gctgctttca c 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tctcttcaag ggacaaggct g 21
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atagcaaatc ggctgacggt 20
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ttggctcagc cagatgca 18
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccagcctact cattgggatc a 21
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
caccttggat tgagagtcaa gac 23
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aggaatcggc tatattgctg gt 22
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tttaccaccg acggaacctt 20
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cgacaaagat gctggagggt a 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ctcaactaca tggtctacat g 21
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tggcatggac tgtggtcatg ag 22

Claims (9)

1.一种硝呋酚酰肼在制备药物中的应用，其特征在于，所述硝呋酚酰肼在制备保护高糖诱导的胰岛细胞的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：所述硝呋酚酰肼在制备保护高糖诱导的胰岛β细胞的药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：所述硝呋酚酰肼在制备保护高糖诱导的胰岛细胞的胰岛素分泌的药物中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：所述硝呋酚酰肼在制备逆转高糖诱导的胰岛β细胞的氧化应激的药物中的应用。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：所述硝呋酚酰肼在制备减轻高糖诱导的胰岛β细胞的炎症反应的药物中的应用。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：所述硝呋酚酰肼在制备通过信号传导与转录激活因子信号通路保护高糖诱导的胰岛β细胞的胰岛素分泌的药物中的应用。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物用于2型糖尿病的治疗。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物用于胰岛β细胞功能异常引起的2型糖尿病的治疗。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述应用包括：所述硝呋酚酰肼的浓度为0.625μM或1.25μM。
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