CN111918864A - 通过akr1c3活化的前药化合物及其治疗过度增殖性失调的用途 - Google Patents

通过akr1c3活化的前药化合物及其治疗过度增殖性失调的用途 Download PDF

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Abstract

式(I)的AKR1C3活化的前药、包含式(I)的前药的药物组合物及其在治疗过度增殖性疾病例如癌症和用于细胞消融中的用途。本发明的化合物能够穿透赘生组织并通过与在赘生物中发现的AKR1C3酶接触而选择性地被还原成活性(细胞毒性)形式。因此，该活性形式能够消融赘生物的表达AKR1C3的靶细胞，因此在治疗癌症和其他过度增殖性失调中具有特殊的功用。
Figure DDA0002708073150000011

Description

通过AKR1C3活化的前药化合物及其治疗过度增殖性失调的 用途
技术领域
本发明涉及用作靶向的细胞毒性剂的化合物、包含它们的药物组合物以及使用它们的方法。特别地，本发明涉及硝基芳族芥(nitroaromatic mustard)和硝基芳族芥磺酰胺(nitroaromatic mustard sulfonamide)以及其作为用于治疗包括癌症的过度增殖性失调的治疗剂的用途。
背景技术
二硝基苯甲酰胺芥(Dinitrobenzamide mustard，DNBM)前药最初被认为是低氧选择性细胞毒素(Denny,W.A.和Wilson,W.R.药物化学杂志(Journal of MedicinalChemistry),1986,29,879-887)。需要通过人单电子还原酶进行硝基还原来活化潜在的氮芥部分。硝基还原最初会导致生成中间的硝基自由基阴离子代谢物。在低氧细胞中，该中间体可进一步经历非酶促还原反应而被还原为细胞毒性羟胺和胺类物质，或者在存在分子氧的情况下，可以在无用的氧化还原循环中将该中间体反氧化为母体化合物，这是该类的低氧选择性的基础(如方案1中PR-104A所示)(Helsby等人,毒理学中的化学研究(ChemicalResearch in Toxicology),2003,16,469-478；Palmer等人,药物化学杂志(Journal ofMedicinal Chemistry),1992,35,3214-3222)。
PR-104是一种磷酸酯“预-前药(pre-prodrug)”，其在体内水解为相应的醇DNBM前药PR-104A，最初被设计和优化为低氧选择性细胞毒素(Patterson等人,临床癌症研究(Clinical Cancer Research),2007,13,3922-3932)。PR-104是2-((2-溴乙基)(2,4-二硝基-6-((2-(膦酰氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)-氨基)乙基甲磺酸酯。PR-104A是2-((2-溴乙基)(2-((2-羟乙基)-氨基甲酰基)-4,6-二硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯。PR-104A随后被还原为其细胞毒性代谢物，羟胺(PR-104H)和胺(PR-104M)。这些产物可以形成与DNA的链间交联物，在有丝分裂时导致复制叉的破坏，这是最可能的细胞毒性机制(方案1)(Gu等人,分子癌症治疗学(Molecular Cancer Therapeutics),2009,8,1714-1723；Patterson等人,临床癌症研究,2007,13,3922-3932；Singleton等人,癌症研究(Cancer Research),2009,69,3884-3891)。
Figure BDA0002708073130000021
方案1
PR-104A除了具有靶向人肿瘤异种移植物中的低氧细胞的能力外，使用利用切除测定和生长延迟端点的体内测定，PR-104A还显示出大量的单药治疗活性(Patterson等人.,临床癌症研究,2007,13,3922-3932；Singleton等人,癌症研究,2009,69,3884-3891)。由于这样的异种移植物中只有一小部分细胞是低氧的，因此PR-104A的这种显著的单药治疗活性提示了“旁观者效应”(细胞毒性代谢物扩散到相邻的未被靶向的细胞中)和/或通过2-电子还原酶对PR-104A的有氧(非氧依赖)活化的作用(Hicks等人,国际放射肿瘤学、生物学和物理学杂志(International Journal of Radiation Oncology,Biology,Physics),2007,69,560-571)。在一组23种人癌细胞系中对基因表达的微阵列分析谱确定了属于AKR超家族的5个基因(除其他外)的独特的簇，这些基因显示与PR-104A的有氧活化正相关(Guise等人,癌症研究,2010,70,1573-1584)。过表达这些候选还原酶基因的HCT116细胞确认了人醛酮还原酶1C3(AKR1C3)是真正的氧不敏感的PR-104A还原酶，其能够在体外活化PR-104A成为其细胞毒性代谢物(Guise等人,癌症研究,2010,70,1573-1584)。相对于AKR1C3阴性的肿瘤异种移植物，当用PR-104A处理时，在AKR1C3表达上不同的两对同基因的人肿瘤异种移植物展示了表达AKR1C3的异种移植物的持续生长延迟。
虽然AKR1C3对PR-104A的氧不敏感活化代表了一种“脱靶”的活化机制，但它也展现了利用大量表达AKR1C3的表达AKR1C3的赘生物的机会。典型地，这些赘生物中AKR1C3的相对表达高于健康正常组织中AKR1C3的内源表达水平。据报道具有大量AKR1C3表达水平的赘生性疾病包括急性髓性白血病(AML)(Birtwistle等人,2009,Mutat Res 662:67-74)、T细胞谱系急性淋巴细胞性白血病(T-ALL)(Benito等人,2011,PLoS ONE,6:e23108)、慢性髓性白血病(CML)(Graham等人,2007,Stem Cells,25:3111-20)、肝细胞癌、非肌肉浸润性(浅表性)膀胱癌、局部浸润性膀胱癌、转移性膀胱癌、胃癌、宫颈癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、食道癌、头颈部癌、卵巢癌、成胶质细胞瘤、肉瘤、子宫内膜癌、前列腺癌、肾癌和肺癌(Guise等人,Can Res,2010；70:1573-84；Clin Can Res,13:1322-32)。
虽然PR-104A是由AKR1C3代谢的硝基苯甲酰胺芥前药的第一个实例，但它并非如此设计，因此它具有对于优选的AKR1C3活化的前药而言并非最佳的许多特征。这些特征是：1)PR-104A作为针对AKR1C3阳性细胞的微摩尔细胞毒素而仅具有中度活性(Guise等，Cancer Research，2010，70，1573-1584)，2)PR-104A代谢物具备显著的旁观者杀伤特性(Hicks等人,IJROBP,2007,69:560-71)，因此可能消融可能不表达靶酶的邻近细胞，3)PR-104A针对低氧活化而优化，以及4)PR-104A由于快速和广泛的葡萄糖醛酸化而具有不良药代动力学特性(Gu等人,J Pharm Exp Ther,337:692-71)。因此，提供替代的AKR1C3活化的前药或与PR-104A相比具有优选特性的前药将是有用的。
已知PR-104A的二硝基苯芥前药类似物作为AKR1C3活化的前药(WO2010/044686)。但是，几乎没有提供数据表明这些衍生物解决了PR-104A作为AKR1C3活化的前药的任何局限性。
已经报道了通过AKR1C3代谢的硝基苯甲酰胺芥前药的其他实例(Silva,S.奥克兰大学图书馆,理学硕士学位,2012)。实例包括SN33539、SN34947、SN34951、SN34118、SN33540、SN35028和SN34454。据报道这些实例具有对于优选的AKR1C3活化的前药而言并非最佳的许多特征，包括：1)相对于PR-104，仅适度地改善了AKR1C3阳性细胞的AKR1C3依赖性细胞毒性，2)如PR-104A那样，代谢物具备显著的旁观者杀伤特性，因此可以消融可能不表达靶酶的邻近细胞，以及3)对AKR1C3活性位点的高结合亲和力，导致在高前药浓度下抑制前药代谢。因此，与SN33539、SN34947、SN34951、SN34118、SN33540、SN35028和SN34454相比，提供替代的AKR1C3活化的前药或具有优选特性的前药将是有用的。
Figure BDA0002708073130000041
方案2
因此，本发明的目的是提供用于治疗过度增殖性疾病如癌症的新的AKR1C3活化的前药，或至少提供其他治疗剂的有用替代物。
发明内容
在本发明的第一方面，提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002708073130000042
其中：
A为H、C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6炔基、CFH2、CF2H、CF3、F、Cl、Br、I、OCF3、COR或CON(R)2；
E为SO或SO2；
X为Cl、Br、I或OSO2R；
Y为Cl、Br、I或OSO2R；
每个R独立地为H或C1-C6烷基；
G是选自包括式(B)-(AA)的组中的自由基：
Figure BDA0002708073130000051
其中：
R1为H、C1-C6烷基、CH2(CH2)nOH、CH2CH(OH)CH2OH、苯基、吡啶基、苄基或吡啶基甲基，条件是当R1为苯基、吡啶基、苄基或吡啶基甲基时，R1任选地在任何可用位置处被C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6炔基、OR6、N(R6)(R7)、CFH2、CF2H、CF3、F、Cl、Br、I、OCF3、COR6、CON(R6)(R7)、SOR6、SON(R6)(R7)、SO2R6、SO2N(R6)(R7)、CN或NO2取代；
R2和R3各自独立地为H、C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6炔基、OR6、N(R6)(R7)、CFH2、CF2H、CF3、F、Cl、Br、I、OCF3、COR6、CON(R6)(R7)、SOR6、SON(R6)(R7)、SO2R6、SO2N(R6)(R7)、CN或NO2；
R4为N(R6)(R7)、OH、OCH2(CH2)nN(R6)(R7)或CH2(CH2)nN(R6)(R7)；
R5为H或C1-C6烷基基团；
R6和R7各自独立地为H或C1-6烷基，或者R6和R7一起形成取代或未被取代的5元或6元杂环；
Z为CH或N；
W为CH2、O、S、SO或SO2；
n为0至6；
*表示与式(I)的连接点。
在本发明的一些实施方式中：
A为H、C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6炔基、CFH2、CF2H、CF3或OCF3；
E为SO或SO2；
X为Br或OSO2R；
Y为Br或OSO2R；
每个R独立地为H或C1-C6烷基；
G为选自包括式(B)、(C)、(D)、(O)和(P)的组中的自由基：
Figure BDA0002708073130000061
其中
R1为H、C1-C6烷基、CH2(CH2)nOH、CH2CH(OH)CH2OH；
R4为N(R6)(R7)、OCH2(CH2)nN(R6)(R7)或CH2(CH2)nN(R6)(R7)；
R5为H或C1-C6烷基；
R6和R7各自独立地为H或C1-6烷基，或者R6和R7一起形成取代或未被取代的5元或6元杂环；
N为0至6；
*表示与式I的连接点；
或其药学上可接受的盐。
在本发明的一些实施方式中：
A为H、C1-C6炔基、CFH2、CF2H或CF3；
E为SO2；
X为Br或OSO2R；
Y为Br或OSO2R；
每个R独立地为H或C1-C6烷基；
G为选自包括式(B)、(C)、(D)、(O)和(P)的组中的自由基：
Figure BDA0002708073130000071
其中
R1为H、C1-C6烷基、CH2(CH2)nOH、CH2CH(OH)CH2OH；
R4为N(R6)(R7)、OCH2(CH2)nN(R6)(R7)或CH2(CH2)nN(R6)(R7)；
R5为H或C1-C6烷基；
R6和R7各自独立地为H或C1-6烷基，或者R6和R7一起形成取代或未被取代的5元或6元杂环；
n表示0至6；
*表示与式I的连接点；
或其药学上可接受的盐。
在本发明的一些实施方式中，A为H。
在本发明的一些实施方式中，化合物具有下式：
Figure BDA0002708073130000072
在本发明的一些实施方式中，化合物具有下式：
Figure BDA0002708073130000073
在本发明的一些实施方式中，药学上可接受的盐是甲磺酸盐。
在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，其包含本发明的化合物以及药学上可接受的载体。
在优选的实施方式中，本发明的化合物为：
Figure BDA0002708073130000081
本发明的另一方面，提供了一种治疗过度增殖性失调的方法，该方法包括将本发明的化合物施用至人。在优选的实施方式中，本发明的化合物为：
Figure BDA0002708073130000082
在本发明的一些实施方式中，过度增殖性失调是癌症。优选地，过度增殖性失调的特征在于与表达可检测量的AKR1C3的赘生物的形成有关。
在本发明的一些实施方式中，癌症是急性髓性白血病、T细胞谱系急性淋巴细胞性白血病(T-ALL)、慢性髓性白血病(CML)、肝细胞癌、非肌肉浸润性(浅表性)膀胱癌、局部浸润性膀胱癌、转移性膀胱癌、胃癌、宫颈癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、食道癌、头颈部癌、卵巢癌、成胶质细胞瘤、肉瘤、子宫内膜癌、前列腺癌、肾癌或肺癌。
在本发明的另一方面，提供了一种细胞消融方法，包括以下步骤：
a.用至少一种AKR1C3酶活化本发明的化合物以产生能够消融靶细胞的细胞毒性代谢物；和
b.使靶细胞与细胞毒性代谢物接触以消融细胞。
在本发明的另一方面，提供了本发明的化合物在制备用于治疗过度增殖性失调的药物中的用途。
在本发明的又一方面，提供了一种包含本发明的化合物的药物组合物用于治疗过度增殖性失调的用途。
与本发明的第一方面结合的上文提及的所有实施方式也是本发明的上述后续方面的实施方式。
附图说明
图1显示了与通过重组AKR1C3代谢化合物641的速率随药物浓度的变化相比，通过重组AKR1C3代谢现有技术化合物SN34947、SN34951和SN35028的速率随药物浓度的变化。化合物SN34947、SN34951和SN35028展示在浓度>20μM时通过AKR1C3的代谢被抑制，这种不利的特性在化合物641中没有观察到。
图2显示了在施用(腹膜内)耐受良好的3剂量计划(q4dx3)的现有技术前药SN34454(剂量为237μmol/kg)相比于化合物602(剂量为178μmol/kg)和641(剂量为178μmol/kg))的NIH-III小鼠中H460肺癌异种移植物的平均肿瘤体积(mm3)。所有化合物均显示出抗肿瘤功效。尽管化合物602和641以各自剂量的75％施用，但化合物602和641比现有技术化合物SN34454具有显著更高的活性。
图3显示了在施用(腹膜内)单剂量的化合物641.Ms的NIH-III小鼠中H460肺癌异种移植物的平均肿瘤体积(mm3)。使用的剂量为237、422、562、750和1000μmol/kg。所有剂量的化合物641.Ms均显示出显著的抗肿瘤功效。
图4显示了在施用(腹膜内)4剂量计划(q4dx4)的化合物641.Ms的NIH-III小鼠中H460肺癌异种移植物的平均肿瘤体积(mm3)。使用的剂量是10、25、50、100和150mg/kg。所有剂量的化合物641.Ms均显示出显著的抗肿瘤功效，并且耐受良好，如通过体重平均百分比变化所确定，其中没有剂量队列超过-10％。
图5显示了在施用(腹膜内)耐受良好的4剂量计划(q4dx4)的化合物641.Ms(剂量为114mg/kg)的NIH-III小鼠中PLC/PRF/5肝细胞癌异种移植物的平均肿瘤体积(mm3)。化合物641.Ms显示显著的抗肿瘤活性。
图6显示了在施用(腹膜内)耐受良好的6剂量计划(q4dx6)的化合物641.Ms(剂量为50mg/kg)的NIH-III小鼠中SW780膀胱癌异种移植物的平均肿瘤体积(mm3)。化合物641.Ms显示显著的抗肿瘤活性。
图7显示了在施用(腹膜内)耐受良好的4剂量计划(q4dx4)的化合物641.Ms(剂量为50mg/kg)的NIH-III小鼠中SNU-398WT(野生型)和SNU-398AKR1C3(AKR1C3过表达)同基因肝细胞癌异种移植物的平均肿瘤体积(mm3)。在被工程化为过表达AKR1C3的SNU-398AKR1C3异种移植模型中，仅化合物641.Ms显示显著的抗肿瘤活性。在已知AKR1C3的表达可忽略不计的SNU-398WT异种移植模型中化合物641.Ms无活性。
图8显示了在含有5％过表达AKR1C3的细胞的混合HCT116结肠癌MCL中针对化合物641进行高细胞密度多细胞层(MCL)测定的结果，以确定旁观者效应效率。化合物641在以高于1.2μM.h暴露时显示中度旁观者效应，而在以<1.2μM.h暴露时不显示旁观者效应，提供了5个对数的对混合3D细胞培养物中AKR1C3阳性细胞选择性的克隆源性细胞杀伤。
具体实施方式
定义
术语“烷基”是指任何饱和烃自由基，并且旨在包括直链和支链烷基基团。烷基基团的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-乙基丙基、正己基和1-甲基-2-乙基丙基。术语“C1-C6烷基”是指具有至多6个碳原子的任何烷基自由基。
术语“烯基”是指具有至少一个双键的任何烃自由基，并且旨在包括直链和支链烯基基团。烯基基团的实例包括但不限于乙烯基、正丙烯基、异丙烯基、正丁烯基、异丁烯基、仲丁烯基、叔丁烯基、正戊烯基、1,1-二甲基丙烯基、1,2-二甲基丙烯基、2,2-二甲基丙烯基、1-乙基丙烯基、2-乙基丙烯基、正己烯基和1-甲基-2-乙基丙烯基。
术语“炔基”是指具有至少一个三键的任何烃自由基，并且旨在包括直链和支链炔基基团。炔基基团的实例包括但不限于乙炔基、正丙炔基、异丙炔基、正丁炔基、异丁炔基、仲丁炔基、叔丁炔基、正戊炔基、1,1-二甲基丙炔基、1,2-二甲基丙炔基、2,2-二甲基丙炔基、1-乙基丙炔基、2-乙基丙炔基、正己炔基和1-甲基-2-乙基丙炔基。
术语“亚烷基”是指对应于烷基的双自由基。亚烷基的实例包括但不限于亚甲基和亚乙基。
术语“环烷基”是指饱和或部分饱和的非芳族碳环基团，该基团具有优选3至8个环碳原子。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。
术语“吡啶基”包括所有可能的吡啶异构体，包括吡啶-2-基、吡啶-3-基和吡啶-4-基。
术语“吡啶基甲基”包括所有可能的吡啶基甲基异构体，包括(吡啶-2-基)甲基、(吡啶-3-基)甲基和(吡啶-4-基)甲基。
术语“前药”是指一旦被活化就转化为反应性细胞毒性代谢物的非活性化合物。优选地，通过还原硝基基团，在局部肿瘤微环境内的靶细胞内或治疗上接近于靶细胞而发生活化。本发明的前药可以通过不依赖于组织氧浓度(即在有氧或低氧的组织中)的AKR1C3酶还原而活化，。
关于前药的术语“活化”和“代谢”是指前药与酶接触后可能经历的催化还原过程。前药可以被活化/代谢以产生替代的化合物，例如可能具有用于治疗应用的有益活性的细胞毒性代谢物。
术语“消融”应在其最广泛的语境中考虑，是指被消融的靶标的功能完全停止，并且还旨在涵盖对靶标的功能的任何程度的抑制或压抑，其中靶标包括但不限于细胞。
术语“细胞”指专门执行一种或多种特定功能的生物亚单位。为了本发明的目的，术语“细胞”还涵盖在其中发现细胞的培养基。例如，这可以是指体内或体外支持细胞的肿瘤或细胞基质的低氧区域。
术语“细胞毒性”是指化合物影响靶细胞消融的程度。细胞毒性可以通过任何已知的方法来测量，包括例如使用如实施例中所述的HCT116细胞系的IC50半抑制浓度(halfmaximal inhibitory concentration)测定。可以通过测量化合物抑制赘生性细胞系增殖的能力或通过测量化合物防止赘生性细胞系的克隆源性存活的能力来确定在这样的测定中的细胞毒性。
术语“催化效率”是指人AKR1C3酶代谢不同的前药底物的相对容易性，其通过比较底物对酶的亲和力和酶的代谢率而确定。
术语“内源的”是指在生物体、组织或细胞内天然发生、起源或产生的。例如，哺乳动物中的内源酶是哺乳动物细胞中天然存在的酶。
术语“低氧”、“低氧组织”等是指显著低于健康的良好供血(well-perfused)的组织中正常生理氧浓度的组织中的氧浓度。特别地，氧张力低于约1％(百万分之10,000氧；7.6mmHg)应被认为是低氧的。
术语“对由低氧组织活化实质上不敏感”和类似术语表明化合物不被低氧组织代谢，并因此在该组织中不提供低氧依赖性细胞毒性。当在有氧和缺氧条件下在癌细胞系中进行体外测试时，这样化合物不会使低氧细胞毒性比大于5。
术语“旁观者效应”是指通过用前药处理表达靶AKR1C3酶的细胞而触发的效应，并且指对靶细胞的局部微环境中的细胞或组织的继发消融作用。不希望受到理论的束缚，据信旁观者效应是由细胞毒性前药代谢物(活化的前药)从产生部位扩散而影响到与靶细胞分开的不表达AKR1C3酶的细胞所引起的。旁观者效应可以通过任何已知方法来定量，包括根据Wilson等人.,2002,Cancer Res.62:1425-1432描述的方法，通过采用3D多细胞层(MCL)进行，所述3D多细胞层由与多数(约95至99％)的亲本(野生型)“靶”细胞混合的少数(大约1％至5％)表达AKR1C3酶的“活化剂”细胞组成。可以针对在没有活化剂的情况下生长的靶细胞(野生型细胞)(T)、共培养物中的靶标(TC)和共培养物中的活化剂(表达AKR1C3的细胞)(AC)的存活率为10％而确定前药的浓度(C10)。通过旁观者效应效率来测量测试前药的旁观者效应，旁观者效应效率可以使用算法((LogC10T-LogC10TC)/(LogC10T-Log C10AC))来计算。小于约35％的BEE值被认为是“实质上很小”。
术语“治疗”应在其最广泛的语境中考虑。该术语不必须暗示对受试者进行治疗直至完全康复。因此，“治疗”广泛地包括，例如预防、改善或控制失调的一种或多种症状、一种或多种症状的严重性和预防或以其他方式减少发展继发性并发症的风险。
术语疾病的“预防”不应被认为暗示疾病发展被完全预防，而是包括疾病发展的延迟。
术语“硝基芳族芥”是指具有被硝基和苯胺芥官能团取代的芳环的任何化合物。
术语“硝基芳族芥磺酰胺”是指具有被硝基和苯胺芥子官能团取代的芳环的任何化合物，其中另外的取代基还包含磺酰胺部分。
术语“AKR1C3酶”是指人的酶醛酮还原酶1C3。醛酮还原酶(AKR)是参与从各种内源性和外源性底物将醛和酮分别还原成它们相对应的伯醇和仲醇的细胞溶质酶的超家族(Jez等人,生物化学杂志(The Biochemical Journal),1997,326,625-636)。AKR需要辅因子NADPH的存在以催化羰基的还原(Schlegel等人,生物化学(Biochemistry),1998,37,3538-3548)。人AKR被分为三个家族(AKR1、AKR6和AKR7)，其中AKR1在结构和功能方面表征得最好(Penning,T.M.和Drury,J.E.生物化学与生物物理学集刊(Archives ofBiochemistry and Biophysics),2007,464,241-250)。AKR1C亚家族包括AKR1C1至AKR1C4，所有四种酶均具有羟基类固醇脱氢酶(HSD)活性(Penning等人,生物化学杂志,2000,351,67-77)。编码AKR1C1至AKR1C4的基因具有大于86％的氨基酸序列同一性，并且显示底物的差异和被代谢的部位的区域专一性(Penning,T.M.和Byrns,M.C.纽约科学院年鉴(Annalsof the New York Academy of Sciences),2009,1155,33-42)。AKR1C3是负责减少人前列腺素D2(PGD2)的酶。
术语“AKR1C3活化的前药”是指易于被人AKR1C3代谢的化合物。可以通过将测试化合物和NADPH辅因子与重组AKR1C3蛋白一起温育并对NADPH辅因子的损失进行测定来展示AKR1C3的代谢，其中辅因子的损失表明化合物的酶促代谢。
术语“药学上可接受的”是指可用于制备通常是安全无毒且在生物学和其他方面均值得期望的药物组合物的实体，包括对于兽医以及人药物用途可接受的那些。
术语“药学上可接受的盐”是指药学上可接受的化合物的盐，并且所述盐具备该化合物的所需的药理活性。这样的盐包括：
·与无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等形成的酸加成盐；或与有机酸如乙酸、甲磺酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、对甲苯磺酸、羟乙磺酸等形成的酸加成盐；
·酸性质子被金属离子(例如碱金属离子、碱土离子或铝离子)替代；或与有机或无机碱配合时形成的盐。可接受的有机碱包括乙醇胺、二乙醇胺、N-甲基葡糖胺、三乙醇胺等。可接受的无机碱包括氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠和氢氧化钠；
·包含选自氯离子、溴离子、硫酸根、硝酸根、磷酸根、乙酸根、甲磺酸根、马来酸根、酒石酸根、柠檬酸根、甲磺酸根、甲苯磺酸根、羟乙磺酸根等的离子的盐；和
·包括钠、钙、钾盐的磷酸盐和羧酸盐。
将理解的是，术语“甲磺酸盐/甲基磺酸盐(mesylate/methanesulfonate)”是可互换的并且是指相同的实体。
本文所用的术语“药物组合物”是指一种或多种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或其水合物与其他化学组分如生理学上可接受的载体和赋形剂的混合物。药物组合物的目的是促进将化合物施用至生物体。
术语“施用(administered/administration)”等在用于提及将化合物施用至靶细胞时，旨在涵盖所有引入的方法，例如静脉内、肌内、皮下和口服，并且不旨在于受限于直接给药到肿瘤细胞的部位。该术语还旨在涵盖将化合物引入到靶细胞的间接方法，例如膀胱内灌注和经导管动脉化疗栓塞(transcatheter arterial chemoembolisation)。
术语“治疗有效量”是指具有引起治疗效果潜力的化合物的量。在前药的情况下，将理解的是，这仅在该前药活化/代谢后才事实上引起治疗效果。
关于旁观者效应，术语“治疗上接近”是指细胞与能够活化前药的酶表达细胞足够接近，使得该细胞接受治疗有效浓度的活性/细胞毒性前药代谢物。这典型地在酶表达细胞的1至10个细胞直径内。
术语“表达增加”和类似术语当用于与AKR1C3酶有关时应广义地理解为包括任何的蛋白质产量的增加或编码相同蛋白质的一种或多种核酸的表达的增加。不应认为该蛋白(或核酸)以任何特定水平表达。测量AKR1C3表达的方法将是本领域技术人员已知的，但是示例性方法包括(i)使用可单独使用或组合使用的各种技术(例如基于聚合酶链式反应(PCR)的分析、序列分析和电泳分析)，进行核酸序列(无论是否扩增)的基因分型；(ii)使用杂交技术(例如Northern分析和狭缝印迹杂交)或通过进行逆转录酶(RT)-PCR扩增然后凝胶电泳，确定转录基因表达谱；(iii)检测表达的蛋白质的存在或水平，以确定蛋白质表达谱。例如，可以使用免疫测定分析蛋白质生物标志物。也可以使用电泳，例如蛋白质印迹，评估蛋白质表达谱。任何合适的免疫测定可用于确定样品中的一种或多种蛋白质生物标志物的存在或水平。合适的免疫测定技术包括酶免疫测定(EIA)，例如酶放大免疫测定技术(EMIT)，酶联免疫吸附测定(ELISA)，IgM抗体捕获ELISA(MAC ELISA)和微粒酶免疫测定(MEIA)；毛细管电泳免疫测定(CEIA)；放射免疫测定(RIA)；免疫放射测定(IRMA)；荧光偏振免疫测定(FPIA)；和化学发光测定(CL)；(iv)定量蛋白质印迹，以检测或确定样品中蛋白质生物标志物的水平。蛋白质印迹可以通过熟知的方法进行定量，例如扫描光密度法或磷光成像；(v)免疫组织化学(IHC)，以确定样品中蛋白质生物标志物的水平。
术语“免疫组织化学”或“IHC”涵盖利用使用荧光显微镜或光学显微镜来可视化检测偶联(即缀合)至与生物标志物反应的抗体的荧光染料或酶的技术。
关于赘生物，术语“大量表达AKR1C3”是指该赘生物以足以通过任何已知方法检测到的量表达AKR1C3，并提供选择性代谢，并因此相对于表现出可忽略的AKR1C3表达的赘生物，提供AKR1C3活化的前药的细胞毒性。
术语“过度增殖性失调”和类似术语是指与细胞不受控制的生长(增殖)有关或由细胞不受控制的生长(增殖)引起的医学失调，包括癌症，例如急性髓性白血病(AML)、T细胞谱系急性淋巴细胞性白血病(T-ALL)、慢性髓性白血病(CML)、肝细胞癌、非肌肉浸润性(浅表性)膀胱癌、局部浸润性膀胱癌、转移性膀胱癌、胃癌、宫颈癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、食道癌、头颈部癌、卵巢癌、成胶质细胞瘤、肉瘤、子宫内膜癌、前列腺癌、肾癌和肺癌。
术语“赘生物”和类似术语表示由于细胞异常生长或分裂而导致的组织异常肿块。
除非上下文清楚地另有要求，否则在整个说明书和权利要求书中，词语“包括/包含(comprise/comprising)”等应被理解为包括性含义，而不是排他性或穷举性含义，也就是说，以“包括但不限于”的意义来理解。
本发明的化合物
本发明的化合物根据上式(I)定义。本发明人发现了被AKR1C3酶活化以产生细胞毒性代谢物的数种前药化合物，可用于靶向治疗包括癌症在内的过度增殖性失调。这些化合物对于治疗形成大量表达AKR1C3的赘生物的过度增殖性失调特别有用。AKR1C3在这样的赘生物中的表达水平使得能够在赘生物形成部位处靶向地选择性活化这些前药。这种选择性可能是期望的，以减少在正常健康组织中发生前药的非靶向活化时而发生的副作用。选择性还可以减少所需的治疗有效剂量，这具有包括降低成本和减少潜在副作用的优点。
本发明的化合物能够穿透赘生物组织并通过与赘生物中发现的AKR1C3酶接触而选择性地还原成活性(细胞毒性)形式。因此，该活性形式能够消融赘生物的表达AKR1C3的靶细胞，因此在治疗癌症和其他过度增殖性失调中具有特殊的攻用。
本发明人已经发现，本发明的化合物的甲磺酸盐形式显示使其适于临床施用的特定优点。特别地，甲磺酸盐形式表现出比游离碱形式更高的溶解度(见实施例13)。预期甲磺酸盐形式比其他盐形式(如HCl盐和HBr盐)更稳定。不受理论的束缚，据信甲磺酸盐的稳定性是改善的，因为甲磺酸(用于产生甲磺酸盐)不是足够强到置换芥的X和Y离去基团的亲核试剂。相反，使用HBr或HCl产生盐形式将导致这些盐形式的Cl-或Br-置换芥的X和Y离去基团中的一个或两个。这会降低稳定性。例如，如果使用HBr产生双甲磺酸盐芥的氢溴酸盐，则可能会形成溴甲磺酸盐和二溴芥杂质，这会降低活性药物成分的总体纯度规格。
因此，本发明还提供了式(I)的化合物的甲磺酸盐。优选地，甲磺酸盐是化合物641。
Figure BDA0002708073130000161
AKR1C3诱导的细胞毒性
实施例9(表2)通过相对于不存在AKR1C3的情况，在存在AKR1C3的情况下HCT-116细胞生长抑制的增加，说明本发明的化合物的细胞毒性增加。实施例10(表3)展示对SNU398肝细胞癌细胞生长的AKR1C3依赖性抑制。表达AKR1C3的细胞的生长表现出比不表达AKR1C3的细胞的生长小高达5150倍。相反，当存在AKR1C3时，PR-104A表现出灵敏度仅增加77倍。
实施例11(表4)进一步展示本发明的化合物在H460肺癌细胞和PLC/PRF/5肝细胞癌细胞中抑制AKR1C3选择性细胞的生长。
实施例14和图2至7显示本发明的化合物的体内作用，该体内作用极大地降低癌症肿瘤的生长。这表明通过H460、PLC/PRF/5和SW780肿瘤异种移植物中内源表达的AKR1C3和SNU-398肿瘤异种移植物中AKR1C3的遗传改造的过表达进行前药代谢。
相对于不存在AKR1C3的情况下的相同化合物，AKR1C3活化的化合物的细胞毒性表现出增加了至少10倍、至少13倍、至少20倍、至少28倍、至少29倍、至少36倍、至少38倍、至少50倍、至少57倍、至少91倍、至少100倍、至少116倍、至少144倍、至少145倍、至少150倍、至少167倍、至少200倍、至少250倍、至少300倍、至少469倍、至少500倍、至少597倍、至少687倍、至少816倍、至少978倍、至少1000倍、至少1500倍、至少1632倍、至少1930倍、至少2000倍、至少2955倍、至少3000倍、至少3340倍、至少4000倍、至少4260倍。
已知PR-104A被AKR1C3代谢，但PR-104A表现出对于有效前药而言并非最佳的特性。本发明的化合物提供了PR-104A的替代物。已经发现这些新化合物表现出用于治疗过度增殖性疾病的期望特性。
特别地，在存在AKR1C3的情况下，相对于PR-104A、SN27686、SN33539、SN35028、SN34947、SN34951和SN34118的细胞毒性，本发明的AKR1C3活化的化合物表现出细胞毒性的增加。实施例9至11显示，本发明的数种化合物的细胞毒性是已知参考化合物的细胞毒性的许多倍。
改善酶动力学
本发明的化合物在通过AKR1C3代谢方面表现出令人惊讶的高催化效率。相对于AKR1C3催化PR-104A的效率，它们还表现出增加的AKR1C3催化效率。催化效率的增加使前药的活化变得更加有效，因此在给定时间内生成更多的细胞毒性代谢产物。这提高了快速彻底消融赘生物的可能性，从而导致了更有效的治疗选择。
PR-104A表现出256,206M-1s-1的催化效率值(kcat/Km)。本发明的化合物表现出至少1,645,614、至少1,922,414、至少2,084,888和至少2,370,091M-1s-1的AKR1C3催化效率。
实施例8(表1)通过分析代表性化合物的酶动力学与化合物PR-104A相比，说明本发明的化合物的催化效率增加。
缺乏低氧活化
本发明人惊奇地发现，相对于许多本发明的化合物在有氧组织中的活化，它们在低氧组织中表现出最小或零活化。由于PR-104A是低氧活化的，因此对低氧的不敏感性特别令人意外。因此，本发明的特定化合物将被AKR1C3选择性活化，但对在低氧组织中的活化实质上不敏感。在某些情况下，此特性具有优势，因为低氧活化可能被认为是偏离机制行为(off-mechanism behaviour)，并可能导致不期望和不受控制的后果。因此，本发明还提供了对通过组织低氧活化实质上不敏感的化合物。
对低氧活化的不敏感性通常发生在3位上未取代的单硝基化合物中。不希望受到理论的束缚，据信这是因为它们具备的对于硝基的单电子还原电势(E[1])通常对于低氧活化来说太低。在该3位上需要相当强的吸电子基团(例如NO2、CN、MeSO2或CF3)来充分提高5-硝基取代基的E[1]以观察到低氧选择性还原。
已知PR-104A在低氧组织中被活化，尽管这种特性在一些情况下具有优势，但上述化合物提供了在低氧活化是不期望的情况下进行治疗的选择。本发明的低氧不敏感性化合物在低氧组织中的细胞毒性相比于该化合物在有氧组织中的细胞毒性为小于25倍、小于22倍、小于21倍、小于20倍、小于15倍、小于10倍、小于5倍、小于4倍、小于3倍，或者它们的细胞毒性在有氧组织与低氧组织之间基本不变。
相对于有氧组织，PR-104A表现出在低氧组织中的细胞毒性大幅提高(20倍)。因此，本发明还提供了如上所述的治疗过度增殖性失调的方法，其中相对于PR-104A所表现出的有氧组织与低氧组织之间的细胞毒性差异，AKR1C3活化的化合物表现出有氧组织与低氧组织之间的细胞毒性差异降低。
缺乏旁观者效应
本发明的某些AKR1C3活化的化合物还表现出实质上最小或为零的旁观者效应。在某些情况下，实质性的旁观者效应是期望的，以消融与活化前药的组织相邻的组织。但是，这种作用可能会降低治疗的特异性，并可能消融非赘生性健康组织。因此，具有实质上最小或为零的旁观者效应的本发明的化合物避免了该缺点，并选择性地消融表达AKR1C3酶的细胞。
SN27686是PR-104A的近似类似物，据报道在仅表达1％的活化还原酶大肠杆菌(E.coli)NfsB的混合MCL中具有48％的实质性的旁观者效应(Singleton等人,Cancer GeneTherapy,14,953-967,2007)。实施例8和图4展示，本发明的化合物641在混合MCL中表现出低得多的约28％的旁观者效应效率，所述混合MCL表达活化还原酶的比例提高至5倍(5％的AKR1C3)，从而使AKR1C3阴性细胞的消融最小化。因此，本发明提供了表现出的旁观者效应实质上小于SN27686的旁观者效应的AKR1C3活化的化合物。
示例性化合物
以下提供了本发明的式(I)的示例性化合物。该列表并非旨在穷举，并且应当理解，其他化合物也包括在要求保护的本发明的范围内。
N,N-双(2-溴乙基)-4-硝基-2-(哌嗪-1-基磺酰基)苯胺(562)
N,N-双(2-溴乙基)-2-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯胺(563)
N,N-双(2-溴乙基)-2-((4-乙基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯胺(564)
2-(4-((2-(双(2-溴乙基)氨基)-5-硝基苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)乙醇(565)
3-(4-((2-(双(2-溴乙基)氨基)-5-硝基苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)丙烷-1,2-二醇(566)
N,N-双(2-溴乙基)-2-((4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)磺酰基)-4-硝基苯胺(584)
N,N-双(2-溴乙基)-2-((5-甲基-1,5-二氮杂环辛烷-1-基)磺酰基)-4-硝基苯胺(585)
N,N-双(2-溴乙基)-2-((1-甲基哌啶-4-基)磺酰基)-4-硝基苯胺(586)
1-((2-(双(2-溴乙基)氨基)-5-硝基苯基)磺酰基)哌啶-4-胺(587)
1-((2-(双(2-溴乙基)氨基)-5-硝基苯基)磺酰基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺(588)
N,N-双(2-溴乙基)-2-((1-甲基氮杂环庚烷-4-基)磺酰基)-4-硝基苯胺(589)
N,N-双(2-溴乙基)-2-((1-甲基氮杂环辛烷-5-基)磺酰基)-4-硝基苯胺(590)
N,N-双(2-溴乙基)-2-(吗啉代磺酰基)-4-硝基苯胺(591)
2-(双(2-溴乙基)氨基)-N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-硝基苯磺酰胺(592)
2-(双(2-溴乙基)氨基)-N-(2-(二甲基氨基)乙基)-N-甲基-5-硝基苯磺酰胺(593)
2-(双(2-溴乙基)氨基)-N-(2-吗啉代乙基)-5-硝基苯磺酰胺(594)
2-(双(2-溴乙基)氨基)-N-甲基-N-(2-吗啉代乙基)-5-硝基苯磺酰胺(595)
2-((2-溴乙基)(4-硝基-2-(哌嗪-1-基磺酰基)苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(601)
2-((2-溴乙基)(2-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(602)
2-((2-溴乙基)(2-((4-乙基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(603)
2-((2-溴乙基)(2-((4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(604)
2-((2-溴乙基)(2-((4-(2,3-二羟基丙基)哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(605)
2-((2-溴乙基)(2-((4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(623)
2-((2-溴乙基)(2-((5-甲基-1,5-二氮杂环辛烷-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(624)
2-((2-溴乙基)(2-((1-甲基哌啶-4-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(625)
2-((2-((4-氨基哌啶-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)(2-溴乙基)氨基)乙基甲磺酸酯(626)
2-((2-溴乙基)(2-((4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(627)
2-((2-溴乙基)(2-((1-甲基氮杂环庚烷-4-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(628)
2-((2-溴乙基)(2-((1-甲基氮杂环辛烷-5-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(629)
2-((2-溴乙基)(2-(吗啉代磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(630)
2-((2-溴乙基)(2-(N-(2-(二甲基氨基)乙基)胺磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(631)
2-((2-溴乙基)(2-(N-(2-(二甲基氨基)乙基)-N-甲基胺磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(632)
2-((2-溴乙基)(2-(N-(2-吗啉代乙基)胺磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(633)
2-((2-溴乙基)(2-(N-甲基-N-(2-吗啉代乙基)胺磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(634)
((4-硝基-2-(哌嗪-1-基磺酰基)苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(640)
((2-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(641)
((2-((4-乙基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(642)
((2-((4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(643)
((2-((4-(2,3-二羟基丙基)哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(644)
((2-((4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(662)
((2-((5-甲基-1,5-二氮杂环辛烷-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(663)
((2-((1-甲基哌啶-4-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(664)
((2-((4-氨基哌啶-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(665)
((2-((4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(666)
((2-((1-甲基氮杂环庚烷-4-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(667)
((2-((1-甲基氮杂环辛烷-5-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(668)
((2-(吗啉代磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(669)
((2-(N-(2-(二甲基氨基)乙基)胺磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(670)
((2-(N-(2-(二甲基氨基)乙基)-N-甲基胺磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(671)
((2-(N-(2-吗啉代乙基)胺磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(672)
((2-(N-甲基-N-(2-吗啉代乙基)胺磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(673)
N,N-双(2-溴乙基)-2-甲基-4-硝基-6-(哌嗪-1-基磺酰基)苯胺(679)
N,N-双(2-溴乙基)-2-甲基-6-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯胺(680)
N,N-双(2-溴乙基)-2-((4-乙基哌嗪-1-基)磺酰基)-6-甲基-4-硝基苯胺(681)
3-(4-((2-(双(2-溴乙基)氨基)-3-甲基-5-硝基苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)丙烷-1,2-二醇(683)
N,N-双(2-溴乙基)-2-甲基-6-((4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)磺酰基)-4-硝基苯胺(701)
N,N-双(2-溴乙基)-2-甲基-6-((5-甲基-1,5-二氮杂环辛烷-1-基)磺酰基)-4-硝基苯胺(702)
N,N-双(2-溴乙基)-2-甲基-6-((1-甲基哌啶-4-基)磺酰基)-4-硝基苯胺(703)
1-((2-(双(2-溴乙基)氨基)-3-甲基-5-硝基苯基)磺酰基)哌啶-4-胺(704)
1-((2-(双(2-溴乙基)氨基)-3-甲基-5-硝基苯基)磺酰基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺(705)
2-((2-溴乙基)(2-甲基-4-硝基-6-(哌嗪-1-基磺酰基)苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(718)
2-((2-溴乙基)(2-甲基-6-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(719)
2-((2-溴乙基)(2-((4-乙基哌嗪-1-基)磺酰基)-6-甲基-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(720)
2-((2-溴乙基)(2-((4-(2,3-二羟基丙基)哌嗪-1-基)磺酰基)-6-甲基-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(722)
2-((2-溴乙基)(2-甲基-6-((4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(740)
2-((2-溴乙基)(2-甲基-6-((5-甲基-1,5-二氮杂环辛烷-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(741)
2-((2-溴乙基)(2-甲基-6-((1-甲基哌啶-4-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(742)
2-((2-((4-氨基哌啶-1-基)磺酰基)-6-甲基-4-硝基苯基)(2-溴乙基)氨基)乙基甲磺酸酯(743)
2-((2-溴乙基)(2-((4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)磺酰基)-6-甲基-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(744)
((2-甲基-4-硝基-6-(哌嗪-1-基磺酰基)苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(757)
((2-甲基-6-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(758)
((2-((4-乙基哌嗪-1-基)磺酰基)-6-甲基-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(759)
((2-((4-(2,3-二羟基丙基)哌嗪-1-基)磺酰基)-6-甲基-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(761)
((2-甲基-6-((4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(779)
((2-甲基-6-((5-甲基-1,5-二氮杂环辛烷-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(780)
((2-甲基-6-((1-甲基哌啶-4-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(781)
((2-((4-氨基哌啶-1-基)磺酰基)-6-甲基-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(782)
((2-((4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)磺酰基)-6-甲基-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(783)
2-((2-溴乙基)(2,4-二硝基-6-(哌嗪-1-基磺酰基)苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(835)
2-((2-溴乙基)(2-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4,6-二硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(836)
2-((2-溴乙基)(2-((4-乙基哌嗪-1-基)磺酰基)-4,6-二硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(837)
2-((2-溴乙基)(2-((4-(2,3-二羟基丙基)哌嗪-1-基)磺酰基)-4,6-二硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(839)
2-((2-溴乙基)(2-((4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)磺酰基)-4,6-二硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(857)
2-((2-溴乙基)(2-((5-甲基-1,5-二氮杂环辛烷-1-基)磺酰基)-4,6-二硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(858)
2-((2-((4-氨基哌啶-1-基)磺酰基)-4,6-二硝基苯基)(2-溴乙基)氨基)乙基甲磺酸酯(860)
2-((2-溴乙基)(2-((4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)磺酰基)-4,6-二硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(861)
((2,4-二硝基-6-(哌嗪-1-基磺酰基)苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(874)
((2-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4,6-二硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(875)
((2-((4-乙基哌嗪-1-基)磺酰基)-4,6-二硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(876)
((2-((4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)磺酰基)-4,6-二硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(896)
((2-((5-甲基-1,5-二氮杂环辛烷-1-基)磺酰基)-4,6-二硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(897)
((2-((4-氨基哌啶-1-基)磺酰基)-4,6-二硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(899)
((2-((4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)磺酰基)-4,6-二硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(900)
2-((2-溴乙基)(4-硝基-2-(哌嗪-1-基磺酰基)-6-(三氟甲基)苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(952)
2-((2-溴乙基)(2-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基-6-(三氟甲基)苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(953)
2-((2-溴乙基)(2-((4-乙基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基-6-(三氟甲基)苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(954)
2-((2-溴乙基)(2-((4-(2,3-二羟基丙基)哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基-6-(三氟甲基)苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(956)
2-((2-溴乙基)(2-((4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)磺酰基)-4-硝基-6-(三氟甲基)苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(974)
2-((2-溴乙基)(2-((5-甲基-1,5-二氮杂环辛烷-1-基)磺酰基)-4-硝基-6-(三氟甲基)苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(975)
2-((2-((4-氨基哌啶-1-基)磺酰基)-4-硝基-6-(三氟甲基)苯基)(2-溴乙基)氨基)乙基甲磺酸酯(977)
2-((2-溴乙基)(2-((4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)磺酰基)-4-硝基-6-(三氟甲基)苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(978)
((4-硝基-2-(哌嗪-1-基磺酰基)-6-(三氟甲基)苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(991)
((2-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基-6-(三氟甲基)苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(992)
((2-((4-乙基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基-6-(三氟甲基)苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(993)
((2-((4-(2,3-二羟基丙基)哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基-6-(三氟甲基)苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(995)
((2-((4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)磺酰基)-4-硝基-6-(三氟甲基)苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(1013)
((2-((5-甲基-1,5-二氮杂环辛烷-1-基)磺酰基)-4-硝基-6-(三氟甲基)苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(1014)
((2-((4-氨基哌啶-1-基)磺酰基)-4-硝基-6-(三氟甲基)苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(1016)
((2-((4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)磺酰基)-4-硝基-6-(三氟甲基)苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(1017)
2-((2-溴乙基)(2-乙炔基-4-硝基-6-(哌嗪-1-基磺酰基)苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(1069)
2-((2-溴乙基)(2-乙炔基-6-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(1070)
2-((2-溴乙基)(2-((4-乙基哌嗪-1-基)磺酰基)-6-乙炔基-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(1071)
((2-乙炔基-4-硝基-6-(哌嗪-1-基磺酰基)苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(1108)
((2-乙炔基-6-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(1109)
((2-((4-乙基哌嗪-1-基)磺酰基)-6-乙炔基-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(1110)
4-((2-(双(2-((甲基磺酰基)氧基)乙基)氨基)-5-硝基苯基)磺酰基)哌嗪-1-
Figure BDA0002708073130000261
甲磺酸酯(640.Ms)
4-((2-(双(2-((甲基磺酰基)氧基)乙基)氨基)-5-硝基苯基)磺酰基)-1-甲基哌嗪-1-
Figure BDA0002708073130000262
甲磺酸酯(641.Ms)
4-((2-(双(2-((甲基磺酰基)氧基)乙基)氨基)-5-硝基苯基)磺酰基)-1-乙基哌嗪-1-
Figure BDA0002708073130000263
甲磺酸酯(642.Ms)
4-((2-(双(2-((甲基磺酰基)氧基)乙基)氨基)-5-硝基苯基)磺酰基)-1-(2-羟乙基)哌嗪-1-
Figure BDA0002708073130000264
甲磺酸酯(643.Ms)
4-((2-(双(2-((甲基磺酰基)氧基)乙基)氨基)-5-硝基苯基)磺酰基)-1-(2,3-二羟基丙基)哌嗪-1-
Figure BDA0002708073130000265
甲磺酸酯(644.Ms)
4-((2-(双(2-((甲基磺酰基)氧基)乙基)氨基)-3-甲基-5-硝基苯基)磺酰基)哌嗪-1-
Figure BDA0002708073130000272
甲磺酸酯(757.Ms)
4-((2-(双(2-((甲基磺酰基)氧基)乙基)氨基)-3-甲基-5-硝基苯基)磺酰基)-1-甲基哌嗪-1-
Figure BDA0002708073130000273
甲磺酸酯(758.Ms)
4-((2-(双(2-((甲基磺酰基)氧基)乙基)氨基)-5-硝基-3-(三氟甲基)苯基)磺酰基)哌嗪-1-
Figure BDA0002708073130000274
甲磺酸酯(991.Ms)
4-((2-(双(2-((甲基磺酰基)氧基)乙基)氨基)-5-硝基-3-(三氟甲基)苯基)磺酰基)-1-甲基哌嗪-1-
Figure BDA0002708073130000275
甲磺酸酯(992.Ms)
4-((2-(双(2-((甲基磺酰基)氧基)乙基)氨基)-3-乙炔基-5-硝基苯基)磺酰基)哌嗪-1-
Figure BDA0002708073130000276
甲磺酸酯(1108.Ms)
4-((2-(双(2-((甲基磺酰基)氧基)乙基)氨基)-3-乙炔基-5-硝基苯基)磺酰基)-1-甲基哌嗪-1-
Figure BDA0002708073130000277
甲磺酸酯(1109.Ms)
以下是本发明的一些示例性化合物的化学结构。
5-硝基苯磺酰胺二溴、溴甲磺酸盐和双甲磺酸盐芥(562-674)：
Figure BDA0002708073130000271
Figure BDA0002708073130000281
Figure BDA0002708073130000291
Figure BDA0002708073130000301
3-甲基-5-硝基苯磺酰胺二溴、溴甲磺酸盐和双甲磺酸盐芥(679-791)：
Figure BDA0002708073130000302
Figure BDA0002708073130000311
Figure BDA0002708073130000321
Figure BDA0002708073130000331
3-三氟甲基-5-硝基苯磺酰胺二溴、溴甲磺酸盐和双甲磺酸盐芥(913-1025)：
Figure BDA0002708073130000332
Figure BDA0002708073130000341
Figure BDA0002708073130000351
Figure BDA0002708073130000361
3-乙炔基-5-硝基苯磺酰胺二溴、溴甲磺酸盐和双甲磺酸盐芥(1030-1142)：
Figure BDA0002708073130000362
Figure BDA0002708073130000371
Figure BDA0002708073130000381
Figure BDA0002708073130000391
5-硝基苯磺酰胺双甲磺酸盐芥的甲磺酸盐(640.Ms-644.Ms、757.Ms、758.Ms、991.Ms、992.Ms、1108.Ms和1109.Ms)：
Figure BDA0002708073130000392
化合物的合成
应当理解，本发明的化合物可以通过任何方法制备。本发明人已经根据以下方案4合成了化合物。另外，提供方案3以教导技术人员如何生产其中所参考的化合物。
在特别的实施方式中，本发明的在3位未被取代或在3位被一系列取代基取代的硝基苯磺酰胺前药可以由2-氟-5-硝基苯-1-磺酰氯(V；A＝H)或3-取代的2-氟-5-硝基苯-1-磺酰氯(V)，分别通过与适当的伯胺或仲胺(HG)偶联，得到磺酰胺(VI)来制备。随后与在二甲基亚砜/二氯甲烷中的二乙醇胺反应，得到二醇(VII)。在碱性条件下，这些与适当的在二氯甲烷中的烷基磺酰氯或烷基磺酸酐反应，得到期望的式Ia的双烷基磺酸盐前药。与单当量的卤化锂进一步反应提供了式Ib的不对称卤代/烷基磺酸盐前药，而与过量的卤化锂的反应得到式Ic的对称二卤代前药(方案3)。
Figure BDA0002708073130000401
方案3
药物组合物
本发明还提供了药物组合物，其包含治疗有效量的式(I)的化合物和药学上可接受的赋形剂、佐剂、载体、缓冲剂或稳定剂。该组合物可以是片剂、胶囊剂、粉剂或液体的形式。该组合物可以配制成用于肠胃外施用，优选通过静脉内输注。该组合物优选可溶于水溶液。
本发明的化合物的浓度将取决于所用化合物的性质以及一旦活化时要达到治疗效果所需的量。然而，将理解的是，施用的化合物的量将由医师根据相关情况来确定，所述相关情况包括要治疗的病症、选择的施用途径、施用的化合物、个体患者的年龄、体重和响应、患者症状的严重程度以及所需的治疗。在某些实施方式中，组合物包含至少一种本发明的化合物，所述化合物是其药学上可接受的盐、其水合物或前述的任一种的溶剂化物形式。
该组合物可以包含前述的任一种的药学上可接受的稀释剂、载体、缓冲剂、稳定剂、赋形剂和/或佐剂。稀释剂、载体、缓冲剂、稳定剂、赋形剂和/或佐剂的选择除其他因素外，还取决于所期望的施用模式。合适的赋形剂的一些实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆和甲基纤维素。该组合物可以另外包含润滑剂(如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油)、润湿剂、乳化和悬浮剂、防腐剂(例如苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯)、甜味剂、pH调节和缓冲剂、毒性调节剂、调味剂等。通过采用本领域已知的方法，可以配制组合物以在施用至患者后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。可以将组合物配制成单位剂型，每剂包含适合作为人和其他哺乳动物的单一剂的物理离散单位，每个单位包含经计算可产生所期望的治疗效果的预定量的活性物质以及合适的药物赋形剂、稀释剂、载体和/或佐剂。
存在将AKR1C3活化的前药非全身性施用至患者的机会，从而允许相对于正常组织将相对较大剂量的前药递送至肿瘤组织。例如，通过导管将本发明的化合物直接膀胱内滴注到患者的膀胱中以治疗AKR1C3阳性非肌肉浸润性膀胱癌，以及将经导管动脉化疗栓塞(TACE)疗法用于肝细胞癌，其中可以将负载有化合物的栓塞颗粒通过肝动脉选择性地引入肝肿瘤，或者可以将所述化合物通过肝动脉选择性地引入肝肿瘤，随后通过肝动脉施用栓塞剂。
治疗方法
如上所述的本发明的化合物已在体外和体内展示了消融表达AKR1C3的细胞的功效。因此，本发明提供了一种治疗过度增殖性失调的方法，该方法包括将式(I)的化合物施用至受试者。优选地，过度增殖性失调的特征在于形成大量表达AKR1C3的赘生物。
WO 2010/044686描述了从来自患者的样品中确定AKR1C3谱的方法，其通过引用并入本文。本领域技术人员将容易理解并能够确定AKR1C3水平高于正常健康组织的那些肿瘤。然而，举例来说，也可以使用WO 2010/044686中描述的方法，如基因型分析、基因表达谱和蛋白质表达谱。
应当理解，某些患者或患者组可以对治疗化合物表现出不同的敏感性。WO 2010/044686描述了确定患者的药物敏感性以允许鉴定有助于治疗疾病和失调的个性化患者谱的方法和程序。特别地，WO 2010/044686提供了将促进针对每例患者的疗法的个性化的预后和预测标志物，从而准确地预测患者对治疗(如本发明的那些)的响应。
尽管PR-104A和相关的二硝基苯甲酰胺和硝基苯甲酰胺类似物(例如SN33539、SN34947、SN34951、SN34118、SN33540、SN35028和SN34454)已显示被AKR1C3活化，但没有已显示表现出这样的AKR1C3依赖性活化的硝基苯磺酰胺前药。另外，当与PR-104A和相关的二硝基苯甲酰胺和硝基苯甲酰胺类似物相比时，本发明的化合物表现出许多有利的特性。因此，本发明的化合物提供了可替代的或改善的治疗途径来治疗特征在于形成大量表达AKR1C3的赘生物的过度增殖性失调。这样的过度增殖性失调可选自急性髓性白血病(AML)、T细胞谱系急性淋巴细胞性白血病(T-ALL)、慢性髓性白血病(CML)、肝细胞癌、非肌肉浸润性(浅表性)膀胱癌、局部浸润性膀胱癌、转移性膀胱癌、胃癌、宫颈癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、食道癌、头颈部癌、卵巢癌、成胶质细胞瘤、肉瘤、子宫内膜癌、前列腺癌、肾癌和肺癌。
本发明还提供式(I)的化合物在制备用于治疗过度增殖性失调的组合物中的用途。优选地，过度增殖性失调以形成大量表达AKR1C3的赘生物为特征。
本发明还提供式(I)的化合物用于治疗过度增殖性失调中的用途。优选地，过度增殖性失调的特征在于形成大量表达AKR1C3的赘生物。
虽然本发明的化合物通常将用于人受试者的治疗，但是它们可以用于靶向细胞以在具有会代谢这样的前药的AKR1C3形式的其他温血动物受试者(例如，其他灵长类动物)中消融。
细胞消融的方法
在通过AKR1C3酶代谢/活化本发明的化合物之后，产生细胞毒性代谢物。这种细胞毒性代谢产物具有消融表达AKR1C3酶的细胞的能力。因此，本发明提供了一种细胞消融的方法，包括以下步骤：
a.用至少一种AKR1C3酶活化式(I)的化合物以产生能够消融靶细胞的细胞毒性代谢物；和
b.使靶细胞与细胞毒性代谢物接触以消融细胞。
AKR1C3前药可用于在骨髓干细胞移植之前净化骨髓。例如，这可以用于治疗白血病或用于涉及移植遗传改造的干细胞以纠正单基因失调的移植物的基因疗法。
当前的骨髓净化(杀死并清除骨髓，使移植物具有更好的接受机会，因此有更好的治疗成功机会)典型地使用两种有毒化学疗法(例如环磷酰胺和白消安)的组合。这些化学疗法具有剂量限制的严重副作用。因此，大约30％的患者没有充分消融其骨髓，也无法从干细胞移植中获得全部治疗益处。
AKR1C3前药可替代一种细胞毒素，并以较小的全身毒性提供更广泛的骨髓消融。这是因为已知CD34阳性骨髓祖细胞表达AKR1C3。
实施例
普通化学实验信息
所有试剂和溶剂均获得自商业来源。使用硅胶(300目)进行快速色谱。所有反应均通过TLC使用具有荧光F254和UV光可视化的硅胶板来监测。在400MHz的Brucker AV-400光谱仪或125MHz的Brucker AV-500光谱仪上记录1H NMR。在125MHz的Brucker AV-500光谱仪上记录13C NMR光谱。耦合常数(J)以赫兹(Hz)表示。化学位移(δ)以百万分率(ppm)报告。ESI-MS的高分辨率在Applied Biosystems Q-STAR Elite ESI-LC-MS/MS质谱仪上记录。使用反相HPLC分析确定化合物的纯度超过95％。HPLC仪器：Dionex Summit HPLC(色谱柱：Diamonsil C18，5.0mm，4.6×250mm(Agilent Technologies)；检测器：PDA-100光电二极管阵列；进样器：ASI-100自动进样器；泵：p-680A)。流速为1.0mL/分钟，流动相为含0.1％改性剂(氨水v/v)的MeOH在H2O中的溶液。
实施例1：((2-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(641)
方案4概述了制备本发明的5-硝基苯磺酰胺前药(562-564、566-568、601-603、605-607、640-642、644-646)的合成路线。2-氟-5-硝基苯-1-磺酰氯(2031)与1-甲基哌嗪、1-乙基哌嗪、1-烯丙基哌嗪、1-苯基哌嗪或1-苄基哌嗪偶联，分别得到所期望的磺酰胺2033-2037。使得到的这些化合物与在二甲基亚砜/二氯甲烷中的二乙醇胺反应，分别得到二醇2039-2043。在碱性条件下与在二氯甲烷(DCM)中的甲磺酰氯或甲磺酸酐反应，分别得到双甲磺酸酯前药641、642、2045、645和646。双甲磺酸酯前药640的制备方法是，通过使磺酰氯2031与哌嗪-1-甲酸叔丁酯反应，得到磺酰胺2032，然后与二乙醇胺缩合，得到二醇2038，进行二甲磺酰化，得到2044，随后用甲磺酸脱保护。四氧化锇介导的烯丙基哌嗪2045的二羟基化得到所期望的双甲磺酸酯前药644。在室温下，前药640-642和644-646与在丙酮中的单当量溴化锂进一步反应，分别得到不对称的溴/甲磺酸酯前药601-603和605-607。前药640-642和644-646与在丙酮中的过量溴化锂在室温至50℃下反应，分别得到对称二溴前药562-564和566-568。
Figure BDA0002708073130000441
方案4
1-((2-氟-5-硝基苯基)磺酰基)-4-甲基哌嗪(2033)
在0℃下，通过逐滴添加1-甲基哌嗪(920mg，9.18mmol)处理在CH2Cl2(10mL)中的2-氟-5-硝基苯磺酰氯(2031)(1.10g，4.59mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌30分钟，然后用CH2Cl2稀释并用水洗涤。将有机相用Na2SO4干燥并在减压下浓缩。使粗产物通过硅胶快速柱色谱法纯化，用CH2Cl2/MeOH(15:1)洗脱，得到1-((2-氟-5-硝基苯基)磺酰基)-4-甲基哌嗪(2033)(1.17g，84％)，为黄色油状物。1H NMR[(CD3)2SO]δ8.61(ddd,J＝9.0,4.0,2.9Hz,1H),8.45(dd,J＝5.9,2.9Hz,1H),7.81(d,J＝9.3Hz,1H),3.16-3.14(m,4H),2.37-2.35(m,4H),2.16(s,3H).HRMS(ESI)，理论值：C11H15FN3O4S(MH+)m/z 304.0762,实际值:304.0760。
2,2’-((2-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙-1-醇)(2039)
用二乙醇胺(616mg，5.86mmol)处理1-((2-氟-5-硝基苯基)磺酰基)-4-甲基哌嗪(2033)(888mg，2.93mmol)在DMSO(2mL)和CH2Cl2(1mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌4小时，然后倒入冰水烧杯中，用氯化钠处理以提供饱和溶液，并用EtOAc(x4)萃取。将合并的有机相用Na2SO4干燥并在减压下蒸发至干。使黄色胶状物通过硅胶快速柱色谱法纯化，用CH2Cl2/MeOH(13:1)洗脱，得到2,2’-((2-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙-1-醇)(2039)(849mg，75％)，为黄色胶状物。1H NMR[(CD3)2SO]δ8.49(d,J＝2.8Hz,1H),8.28(dd,J＝9.2,2.9Hz,1H),7.53(d,J＝9.2Hz,1H),4.57(t,J＝4.9Hz,2H),3.56-3.49(m,8H),3.07-3.05(m,4H),2.34-2.32(m,4H),2.16(s,3H).LRMS(APCI)，理论值：C15H25N4O6S(MH+)m/z 389.4,实际值:389.8。
((2-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(641)
方法1：使用甲烷磺酰氯(MsCl)甲磺酰化
用Et3N(1.02mL，7.32mmol)和在0℃下逐滴添加MsCl(486μL，6.28mmol)处理2,2’-((2-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙-1-醇)(2039)(813mg，2.09mmol)在CH2Cl2(27mL)中的溶液。将反应混合物在0℃下搅拌20分钟，然后用CH2Cl2稀释，用NaHCO3饱和溶液洗涤，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩。使残余物通过硅胶快速柱色谱纯化，用CH2Cl2/Et2O/MeOH(13:10:2)洗脱，得到((2-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(641)(836mg，73％)，为黄色固体，熔点为137-140℃；1H NMR[(CD3)2SO]δ8.48(d,J＝2.8Hz,1H),8.37(dd,J＝9.0,2.8Hz,1H),7.66(d,J＝9.1Hz,1H),4.33(t,J＝5.3Hz,4H),3.77(t,J＝5.3Hz,4H),3.14(s,6H),3.05-3.03(m,4H),2.35-2.33(m,4H),2.15(s,3H).HRMS(ESI)，理论值：C17H28N4NaO10S3(MNa+)m/z567.0860,实际值:567.0845。
方法2：使用甲烷磺酸酐(MS2O)甲磺酰化
用吡啶(463μL，5.72mmol)、DMAP(20mg，0.16mmol)和在0℃下逐滴添加MS2O(854mg，4.90mmol)处理2,2’-((2-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙-1-醇)(2039)(635mg，1.63mmol)的溶液。将反应混合物在0℃下搅拌20分钟，然后温热至室温，用CH2Cl2稀释，用NaHCO3饱和溶液洗涤，用Na2SO4干燥并在减压下浓缩。使残余物通过氧化铝快速柱色谱纯化，用EtOAc/MeOH(200:1)洗脱，得到((2-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(641)(768mg，86％)，为黄色固体。
实施例2：N,N-双(2-溴乙基)-2-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯胺(563)
根据方案4中概述的合成路线制备化合物563。
1H NMR[(CD3)2SO]δ8.49(d,J＝2.8Hz,1H),8.35(dd,J＝9.1,2.8Hz,1H),7.67(d,J＝9.1Hz,1H),3.84(t,J＝7.1Hz,4H),3.59(t,J＝7.1Hz,4H),3.13-3.11(m,4H),2.37-2.35(m,4H),2.17(s,3H).HRMS(ESI)，理论值：C15H23Br2N4O4S(MH+)m/z 512.9801,实际值:512.9798。
实施例3：3-(4-((2-(双(2-溴乙基)氨基)-5-硝基苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)丙烷-1,2-二醇(566)
根据方案4中概述的合成路线制备化合物566。
1H NMR[(CD3)2SO]δ8.48(d,J＝2.8Hz,1H),8.34(dd,J＝9.1,2.8Hz,1H),7.67(d,J＝9.1Hz,1H),4.47(t,J＝5.4Hz,1H),4.40(d,J＝4.6Hz,1H),3.84(t,J＝7.0Hz,4H),3.60(t,J＝7.0Hz,4H),3.57-3.54(m,1H),3.28-3.26(m,2H),3.12-3.10(m,4H),2.47-2.44(m,4H),2.41-2.37(m,1H),2.26-2.21(m,1H).HRMS(ESI)，理论值：C17H26Br2N4NaO6S(MNa+)m/z594.9832,实际值:594.9804。
实施例4：2-((2-溴乙基)(2-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(602)
根据方案4中概述的合成路线制备化合物602。
1H NMR[(CD3)2SO]δ8.48(d,J＝2.8Hz,1H),8.36(dd,J＝9.0,2.8Hz,1H),7.66(d,J＝9.1Hz,1H),4.32(t,J＝5.3Hz,2H),3.83(t,J＝7.1Hz,2H),3.78(t,J＝5.3Hz,2H),3.61(t,J＝7.1Hz,2H),3.14(s,3H),3.09-3.07(m,4H),2.36-2.34(m,4H),2.16(s,3H).HRMS(ESI)，理论值：C16H26BrN4O7S2(MH+)m/z529.0421,实际值:529.0414。
实施例5：((2-((4-乙基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(642)
根据方案4中概述的合成路线制备化合物642。
1H NMR[(CD3)2SO]δ8.47(d,J＝2.8Hz,1H),8.37(dd,J＝9.0,2.8Hz,1H),7.66(d,J＝9.1Hz,1H),4.34(t,J＝5.3Hz,4H),3.78(t,J＝5.2Hz,4H),3.14(s,6H),3.05-3.02(m,4H),2.40-2.38(m,4H),2.31(q,J＝7.2Hz,2H),0.94(t,J＝7.2Hz,3H).HRMS(ESI)，理论值：C18H31N4O10S3(MH+)m/z 559.1197,实际值:559.1212。
实施例6：4-((2-(双(2-((甲基磺酰基)氧基)乙基)氨基)-5-硝基苯基)磺酰基)-1-甲基哌嗪-1-
Figure BDA0002708073130000471
甲磺酸酯(641.Ms)
将在CH2Cl2(35mL)和甲醇(70mL)中的((2-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(641)(1.81g，3.32mmol)用甲烷磺酸(259μL，3.99mmol)处理。在室温下搅拌1.5小时后，通过蒸发除去溶剂至一半体积，并通过过滤收集黄色固体，从而提供4-((2-(双(2-((甲基磺酰基)氧基)乙基)氨基)-5-硝基苯基)磺酰基)-1-甲基哌嗪-1-
Figure BDA0002708073130000472
甲磺酸酯(641.Ms)(2.05g，96％)，为黄色固体，熔点为146-148℃；1H NMR[(CD3)2SO]δ9.50(br,s,1H),8.47(d,J＝2.8Hz,1H),8.43(dd,J＝9.0,2.8Hz,1H),7.73(d,J＝9.1Hz,1H),4.36(t,J＝5.3Hz,4H),3.84-3.81(m,2H),3.76(t,J＝5.2Hz,4H),3.43-3.37(m,2H),3.15(s,6H),3.11-3.09(m,2H),2.82(s,3H),2.80-2.77(m,2H),2.30(s,3H).Anal.(C18H32N4O13S4)，计算值:C,33.74；H,5.03；N,8.74；实际值:C,33.54；H,4.92；N,8.51。
实施例7：4-((2-(双(2-((甲基磺酰基)氧基)乙基)氨基)-5-硝基苯基)磺酰基)哌嗪-1-
Figure BDA0002708073130000481
甲磺酸酯(640.Ms)
根据针对化合物641.Ms所述的方法制备化合物640.Ms。
熔点为147-149℃；1H NMR[(CD3)2SO]δ8.57(br,s,2H),8.47(d,J＝2.8Hz,1H),8.43(dd,J＝9.0,2.8Hz,1H),7.72(d,J＝9.0Hz,1H),4.36(t,J＝5.2Hz,4H),3.76(t,J＝5.1Hz,4H),3.24-3.22(m,4H),3.17-3.15(m,4H),3.15(s,6H),2.29(s,3H).Anal.(C17H30N4O13S4)，计算值:C,32.58；H,4.82；N,8.94；实际值:C,32.60；H,4.75；N,8.76。
实施例8：本发明的前药通过重组人AKR1C3的代谢
相对于阳性对照化合物PR-104A(方案1)、SN33539、SN35028、SN34947、SN34951、SN34118和SN34454(方案2)，确定了重组人AKR1C3对本发明前药的代谢。
材料和方法
重组AKR1C3酶的纯化
产生了表达带有C端六组氨酸(His6)标签和组成型启动子的pET22b-AKR1C3构建体的大肠杆菌BL21(DE3)细胞。使这些转化的大肠杆菌细胞的菌落在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基中生长。第二天挑出单菌落，并在37℃下在以400mL分批的含有氨苄青霉素(100μg/mL)的细菌培养基中生长，并以200rpm连续振荡过夜。通过离心(4000×g，15分钟)沉淀细菌培养物，然后将细菌培养物重悬于裂解缓冲液(10mL/400mL培养物)中。通过超声处理(超声波仪3000，Misonix)破坏细胞并以14,000rpm离心30分钟(在4℃下)。将澄清的裂解液在孔径为1.20μm、0.8μm和0.2μm的连续过滤器中过滤，然后负载到
Figure BDA0002708073130000482
系统上的镍-琼脂糖亲和色谱柱上。用20mL的裂解缓冲液洗涤柱，并且用补充有500mM咪唑的裂解缓冲液洗脱带His6标签的AKR1C3蛋白。通过液相色谱凝胶过滤柱(Superdex200HR16/60)使用裂解缓冲液(补充有5％v/v甘油)和1mM DTT(pH 7.0)以0.3mL/分钟的流速进一步纯化蛋白质。通过在280nm处的吸光度监测蛋白质，并通过SDS-PAGE评估级分(1mL)的纯度。合并含有纯化蛋白的活性级分，并通过在Vivaspin浓缩器(MWCO 10,000截止；GE Healthcare)上离心(3,000×g，4℃)浓缩。向含蛋白质的溶液中补充甘油(至终浓度为15％，v/v)，并添加NADP+至终浓度为2mM。
动力学测定
以96孔板形式确定本发明的化合物的动力学参数。该测定中使用的100mM磷酸钾缓冲液由以下试剂制成，pH值为7.4：
0.5M K2HPO4–8.2mL
0.5M KH2PO4–1.8mL
BSA粉末–25mg
Milli Q水–40mL
为了进行测定，在预热(37℃)的Molecular Devices SpectraMax M2酶标仪的板室中将2μL各种底物浓度与94μL磷酸钾缓冲液和2μL 5mM NADP温育5分钟。使用Eppendorf电子多通道移液器将纯化的AKR1C3酶(2μL)添加到每个孔中至终浓度为100μM。添加酶后，立即在5分钟内记录400nm波长处的吸光度测量值。将每种化合物浓度的吸光度变化相对于时间作图，获得5分钟内的吸光度变化速率。然后将吸光度变化速率相对于化合物浓度作图，并在GraphPadPrism(Windows版本5.00，GraphPad Software，美国加州圣迭戈)上进行非线性回归分析和米氏曲线(Michaelis-Menten curve)拟合，以确定化合物的动力学参数。
结果
与PR-104A相比，本发明的化合物显示为AKR1C3的优良底物。该化合物展示了与PR-104A相比对AKR1C3改善的亲和力，与PR-104A相比，Km降低到1/2至1/4。所有化合物均展示了可接受的催化转化率，其中kcat的范围为28.1s-1至78.5s-1。所有化合物均展示了与PR-104A相比改善的催化效率，这是由关键动力学参数kcat/Km确定的，该参数提高至6.4到9.3倍(表1)。通过增加的kcat/Km可以确定，虽然发现已知的化合物SN33539、SN35028、SN34947、SN34951、SN34118和SN34454的催化效率也比PR-104A改善，但令人惊讶地发现，选择的实例(SN35028、SN34947和SN34951)展示在浓度高于20μM时抑制AKR1C3的代谢(图1)。这是对这些化合物比PR-104A和本发明的化合物对AKR1C3的结合亲和力显著增加的预期结果。SN33539、SN35028、SN34947、SN34951、SN34118和SN34454均具备Km<10μM。对于浓度高达300μM的化合物641，在高底物浓度下未观察到抑制底物代谢的不利特性(图1)。这一发现对于AKR1C3活化的前药而言是令人惊讶且有利的，反映了对AKR1C3催化位点的亲和力与底物转化的最佳平衡。
表1.重组人AKR1C3代谢前药的动力学参数
化合物 K<sub>m</sub>(μM) k<sub>cat</sub>(s<sup>-1</sup>) k<sub>cat</sub>/K<sub>m</sub>(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>)
PR-104A 72.9 18.7 256,206
SN33539 6.7 28.6 4,271,612
SN35028 7.3 29.1 3,980,137
SN34947 7.8 23.8 3,059,088
SN34951 8.5 29.0 3,419,286
SN34118 9.0 18.7 2,045,579
SN34454 3.0 5.2 1,738,985
566 32.2 67.1 2,084,888
602 33.1 78.5 2,370,091
605 17.1 28.1 1,645,614
641 21.5 41.3 1,922,414
实施例9：HCT-116细胞中AKR1C3依赖性细胞毒性
在抗增殖IC50测试中，相对于针对内源性AKR1C3表达水平较低而选择的野生型对应物，在经改造而过表达人AKR1C3的同基因细胞系中可以容易地观察到化合物的AKR1C3依赖性代谢导致的本发明的化合物的细胞毒性(通过蛋白质印迹分析)。在选择的示例中，AKR1C3在化合物的代谢和细胞毒性中的直接作用通过在AKR1C3的有效的选择性小分子抑制剂SN34037的存在下重复进行抗增殖实验而得到了进一步支持(Flanagan等人,生物有机与药物化学(Bioorganic&Medicinal Chemistry)(2014),22(3),967-977)。
Figure BDA0002708073130000501
材料和方法
抗增殖IC50测定实验方法
所需溶液
40％(w/v)三氯乙酸(TCA)
TCA–500g
Milli Q水–750mL
0.4％(w/v)磺酰罗丹明B(SRB)
SRB–4g
乙酸–10mL
Milli Q水–986mL
10mM非缓冲Tris碱[三(羟甲基)氨基甲烷]
Tris-1.2g
Milli Q水–1L
将该溶液的pH调节至10.5。
细胞接种和化合物添加
在96孔板的每个孔中以100μL的体积接种400个细胞。将细胞在加湿培养箱(37℃，5％CO2)中放置2小时，以便在添加化合物之前使细胞贴附于孔的表面。所有化合物均以在DMSO中的储备液的形式制备，并储存在-80℃下。将化合物的冷冻储备液在解冻后立即添加到细胞中。每种化合物的工作溶液在α-MEM+5％FBS(v/v)中以顶部孔所需的最终浓度的3倍制成。确保α-MEM溶液中DMSO的最终浓度不超过总体积的1％。将50μL工作溶液添加到顶部孔中(一式两份)并轻轻混合。一些化合物的溶解度使在α-MEM中的工作溶液无法达到所需顶部孔浓度的3倍。因此，将这样的顶部孔的培养基除去，并用150μL工作溶液替换。从顶部孔开始，沿板进行3倍系列稀释。板上的第一列孔用作空白(包含α-MEM+FBS)，第二列用作对照孔(包含未添加化合物的细胞)。添加化合物后，将板在加湿培养箱(37℃，5％CO2)中温育4小时。
洗涤和染色板
化合物暴露4小时后，将96孔板通过用Immuno Washer(Nunc)抽吸培养基洗涤3次，每孔替换为150μL的α-MEM+5％(v/v)FBS+1％(v/v)P/S。将板放置在加湿培养箱(37℃，5％CO2)中5天，以使细胞生长。化合物暴露后第5天，通过添加50μL的40％(w/v)的三氯乙酸(TCA)溶液来固定96孔板中的细胞，使得每孔中获得的最终TCA浓度为10％。将板在冰箱(4℃)中放置1小时，然后在自来水中漂洗3次。将多余的水排干，并用50μL的0.4％(w/v)磺酰罗丹明B(SRB)将细胞染色。将带有SRB染色的板在黑暗中放置30分钟。通过在含有1％(v/v)乙酸的水中漂洗板4次，从孔中去除多余的染色。通过向每个孔中加入100μL的10mM非缓冲Tris(pH 10.5)来溶解染色，然后将板在室温下在黑暗环境中在振荡器中放置至少1小时。通过ELx 808吸光度微孔板酶标仪(Bio-Tek Instruments，Winooski，VT，美国)确定孔的吸光度值，测量滤光片的波长设置为490nm，参考滤光片的设置为450nm。测量滤光片的吸光度减去参考滤光片的吸光度，得到λ490-450nm的最终吸光度。通过KC4微孔板数据分析软件(KC4TMV3.4，Bio-Tek)来分析吸光度数据并确定IC50值。
SN34037抑制AKR1C3
如上所述地重复进行抗增殖IC50分析，其中包括添加3μM SN34037，所述SN34037是AKR1C3的选择性的有效的小分子抑制剂。
结果
HCT116结肠癌细胞展示了当细胞表达AKR1C3时，对本发明的化合物的敏感性提高到687倍至4260倍(表2)。这比在对照化合物(PR-104A、SN27686、SN33539、SN35028、SN34947、SN34951和SN34118)中观察到的敏感性增加到29倍至98倍要大得多。对已知的硝基苯甲酰胺(SN34118)和本发明的硝基苯磺酰胺(化合物563)的直接比较显示，化合物563对表达AKR1C3的HCT116细胞的细胞毒性是SN34118的43倍，这是无法轻易预测的令人惊讶的结果。本发明人已经清楚地展示了令人惊讶的发现，即尽管在空间上相似(等排体)，但是芳环上的磺酰胺和甲酰胺取代基对敏感性具有明显不同的影响。此外，对于所有研究的化合物，发现通过添加AKR1C3抑制剂(SN34037)可以完全逆转由AKR1C3表达导致的细胞毒性增加，这直接暗示了前药通过AKR1C3的代谢与观察到的细胞毒性增加有关。作为重要的对照，在用本发明的化合物处理的野生型HCT116细胞中引入SN34037没有抗增殖作用。
表2.在野生型HCT116结肠癌细胞和改造为过表达AKR1C3的HCT116结肠癌细胞中本发明的化合物的抗增殖IC50(μM)，其中针对选择的示例添加或不添加3μM的AKR1C3的选择性小分子抑制剂(SN34037)
Figure BDA0002708073130000531
实施例10：肝细胞癌细胞中的AKR1C3依赖性细胞毒性
所用的材料和方法如实施例9所述。与在野生型和过表达AKR1C3的HCT116细胞中观察到的结果相比，SNU398肝细胞癌细胞展示了当细胞表达AKR1C3时对本发明的优选化合物的敏感性提高至高达5150倍(表3)。这是一个令人惊讶的发现，并且显著大于针对PR-104A、SN33540和SN34454所观察到的敏感性分别提高至约77倍、270倍和400倍。在所有情况下，通过添加AKR1C3抑制剂(SN34037)可以大幅抵消由AKR1C3表达导致的这种细胞毒性增加，这直接暗示了前药通过AKR1C3的代谢与观察到的细胞毒性增加有关。作为重要的对照，在用本发明的化合物处理的野生型SNU398细胞中引入SN34037没有抗增殖作用。
表3.在野生型SNU398肝细胞癌细胞和改造为表达AKR1C3的SNU398肝细胞癌细胞中本发明的化合物的抗增殖IC50(μM)，其中添加或不添加3μM的AKR1C3的选择性小分子抑制剂(SN34037)
Figure BDA0002708073130000541
实施例11：肺癌和肝细胞癌细胞中的AKR1C3依赖性细胞毒性
所用的材料和方法如实施例9所述。通过蛋白质印迹分析，本发明的化合物在已知分别以高水平和中等水平内源性表达AKR1C3的野生型H460肺癌细胞和野生型PLC/PRF/5肝细胞癌细胞中展示了有效的抗增殖活性。
本发明的化合物展示了在H460肺癌细胞中3至27nM范围的IC50，在该细胞系中的细胞毒性是PR-104A(IC50＝2.7μM)的100倍至900倍。发现化合物641在H460细胞中的细胞毒性分别是SN34454、SN33540和SN34118的135倍、179倍和520倍。当将SN34118与化合物563以及将SN34454与化合物602进行比较时，可以看到本发明的已知的甲酰胺和磺酰胺的进一步直接比较。本发明的化合物在H460细胞中的细胞毒性分别是已知的直接比较物化合物的82倍和102倍。这些发现令人惊讶且无法合理地预测。在所有情况下，发现通过添加AKR1C3抑制剂(SN34037)可以减轻所展示的细胞毒性，这直接暗示了化合物通过内源AKR1C3的代谢与野生型H460细胞中观察到的细胞毒性有关(表4)。
本发明的化合物展示了在PLC/PRF/5肝细胞癌细胞中低的微摩尔IC50，在该细胞系中的细胞毒性是PR-104A(IC50＝108.4μM)的90倍。作为进一步的直接比较，发现化合物602在该细胞系中的细胞毒性是SN34454的94倍。在所有情况下，发现通过添加AKR1C3抑制剂(SN34037)可以减轻所展示的细胞毒性，这直接暗示了前药通过内源性AKR1C3的代谢与野生型PLC/PRF/5细胞中观察到的细胞毒性有关(表4)。在该细胞系中体外观察到的细胞毒性程度大大低于在HCT116-AKR1C3、SNU398-AKR1C3和野生型H460细胞中观察到的细胞毒性程度，这与在该细胞系中在体外观察到的AKR1C3内源性表达水平较低相一致。
表4.在已知分别以高水平和中等水平表达AKR1C3的野生型H460肺癌细胞和野生型PLC/PRF/5肝细胞癌细胞中本发明的化合物的抗增殖IC50(μM)，其中添加或不添加3μM的AKR1C3的选择性小分子抑制剂(SN34037)
Figure BDA0002708073130000551
实施例12：对野生型细胞系中的低氧活化的抗性
PR-104A最初被设计和优化为低氧选择性细胞毒素(Patterson等人,临床癌症研究,2007,13,3922-3932)。在AKR1C3活化的前药的情况下，该活化途径被认为是是偏离机制的，并且可能是不希望的，从而导致受试者的脱靶毒性。已经确定在野生型HCT116结肠癌细胞中本发明的优选化合物实质上对低氧依赖性活化和细胞毒性有抗性。在有氧或缺氧条件下用本发明的化合物处理HCT116细胞，然后测定其抗增殖活性的程度。
材料和方法
低氧条件下的细胞毒性评估
在缺氧条件下评估选择的化合物的细胞毒性潜力(IC50)。在带有内部37℃培养箱的Bactron缺氧室(Sheldon Manufacturing Inc)中进行与如上实施例9至11所述相同的步骤，其中钯催化剂洗涤气体(palladium catalyst scrubbed gas)(90％N2，5％H2，5％CO2)确保在整个室内严重缺氧(<0.001％O2)。通过两次真空和100％N2充气的循环，然后是单次的5％CO2和5％氢在氮气中的循环，将所有需要的材料(包括细胞)放入室中。为了去除任何痕量的残留O2，在实验所需的日期前至少三天将所有实验材料放入缺氧室中。缺氧室中用于96孔板的培养基由α-MEM+10％(v/v)FBS+1％(v/v)添加剂(1Mβ-D-葡萄糖和20mM 2'-脱氧胞苷)组成。
结果
在缺氧条件下，确定了PR-104A和SN33540对HCT116细胞的细胞毒性分别提高至20倍和25倍(分别地，低氧细胞毒性比[HCR]＝20和25)，而优选的AKR1C3活化的前药602和641在缺氧条件下具有同等毒性或展示为2的中等HCR(表5)。
表5.在有氧和缺氧条件下在野生型HCT116结肠癌细胞中本发明的化合物的抗增殖IC50(μM)
Figure BDA0002708073130000561
实施例13：前药的配制
在0℃下和室温(RT)下通过HPLC在乳酸盐缓冲液(pH 4)和水中研究作为游离碱和甲磺酸盐(641.Ms)的化合物641的溶解度和稳定性。游离碱作为在乳酸盐缓冲液中的游离碱具有可接受的溶解度(3.4mmol/L)。然而，这可以通过配制成甲磺酸盐大大改善，产生在乳酸盐缓冲液中大于100mmol/L的溶解度和在水中大于70mmol/L的溶解度。游离碱和甲磺酸盐在室温下在乳酸盐缓冲液中的溶液中具有相当的稳定性，半衰期约为24小时。通过将溶液温度降低至0℃，可以大大改善该稳定性。
表6.在0℃下和室温(RT)下在水和乳酸盐缓冲液(pH 4)中作为游离碱和甲磺酸盐的化合物641的溶解度和稳定性
Figure BDA0002708073130000571
实施例14：在表达人AKR1C3的异种移植模型中的体内功效
材料和方法
动物饲养
无特定病原体的雌性纯合NIH-III(NIH-LystbgFoxn1nuBtkxid)裸鼠由VernonJansen单位(共享饲养室(shared vivarium)，奥克兰大学)繁育。将动物在Techniplast微分隔笼中饲养，并提供标准的十二小时昼夜照明计划。动物接受标准的啮齿动物膳食(Harlan Teklad diet 2018i)和自由饮水。所有动物研究均由奥克兰大学动物伦理委员会批准。
肿瘤细胞接种
肿瘤接种时，动物重18至25g。通过接种组织培养物中生长的细胞(在100uL无血清α-MEM中的1x107个细胞)，使肿瘤在小鼠的右侧腹皮下生长。每周3次使用电子卡尺对肿瘤大小进行监测，一旦肿瘤直径达到≥7mm，即开始治疗。
生长延迟
将荷瘤小鼠随机分成适当的治疗组，并记录肿瘤大小和体重。在实验当天配制测试化合物，并将测试化合物保持在铝箔包裹的试管中，避免直接的荧光照射。如果在几天内招募动物，则将药物储备液等分到试管中，并于-80℃下冷冻一次直至需要。通过腹膜内注射用单剂量(或q4dx3或q4dx4或q4dx6)的本发明的化合物来治疗小鼠，然后每隔一天监测肿瘤的大小和体重。肿瘤体积计算为π(l×w×w)/6，其中l是主轴，w是垂直短轴。当动物达到适当的生存终点或体重减轻超过治疗前的值的20％时将该动物淘汰。
结果
SN34454和化合物602、641和641.Ms在雌性NIH-III小鼠中的H460、PLC/PRF/5、SW780和SNU-398WT(野生型)以及SNU-398AKR1C3肿瘤异种移植物中体内功效测试的结果如图2至图7所示。
将耐受良好的3剂量计划(q4dx3)SN34454(剂量为237μmol/kg)相比于化合物602(剂量为178μmol/kg)和641(剂量为178μmol/kg)施用(腹膜内)至荷有H460肺癌异种移植物的NIH-III小鼠。所有化合物均显示出抗肿瘤功效(图2)。尽管化合物602和641以各自剂量的75％施用，但化合物602和641的活性显著高于SN34454。尽管使用显著较低的施用剂量，但磺酰胺化合物602的功效相对于直接比较物甲酰胺SN34454有所改善，这令人惊讶。
将单剂量的化合物641.Ms施用(腹膜内)至荷有H460肺癌异种移植物的NIH-III小鼠。使用的剂量为237、422、562、750和1000μmol/kg。所有剂量的化合物均耐受良好，并显示出显著的抗肿瘤功效(图3)。
将4剂量计划(q4dx4)的化合物641.Ms施用(腹膜内)至荷有H460肺癌异种移植物的NIH-III小鼠。使用的剂量是10、25、50、100和150mg/kg。所有剂量的该化合物均显示出显著的抗肿瘤功效，并且所有剂量耐受良好，正如通过体重平均百分比变化所确定，其中没有剂量队列超过-10％(图4)。
将耐受良好的4剂量计划(q4dx4)的化合物641.Ms以114mg/kg的剂量施用(腹膜内)至荷有PLC/PRF/5肝细胞癌异种移植物的NIH-III小鼠。化合物641.Ms显示了显著的抗肿瘤活性(图5)。
将耐受良好的6剂量计划(q4dx6)的化合物641.Ms以50mg/kg的剂量施用(腹膜内)至荷有SW780膀胱癌异种移植物的NIH-III小鼠。化合物641.Ms显示了显著的抗肿瘤活性(图6)。
将耐受良好的4剂量计划(q4dx4)的化合物641.Ms以50mg/kg的剂量施用(腹膜内)至荷有SNU-398WT(野生型)或SNU-398AKR1C3(AKR1C3过表达)同基因肝细胞癌异种移植物的NIH-III小鼠。在被改造为过表达AKR1C3的SNU-398AKR1C3异种移植模型中，化合物641.Ms仅显示显著的抗肿瘤活性。在已知AKR1C3的表达可忽略不计的SNU-398WT异种移植模型中化合物641.Ms无活性(图7)。
总之，在已知表达AKR1C3的异种移植模型中，单次、q4dx3、q4dx4或q4dx6腹膜内给药计划后，所测试的本发明的所有化合物提供了显著的肿瘤生长延迟。值得注意的是，化合物641.Ms在SNU-398野生型异种移植物中没有活性。总体而言，数据表明通过异种移植模型中表达的AKR1C3的前药代谢引起细胞毒性代谢物的产生，从而导致抗肿瘤活性。
实施例15：旁观者细胞杀伤的确定
还在高细胞密度多细胞层(MCL)测定中评估化合物针对过表达AKR1C3的细胞的功效，所述化合物在低细胞密度抗增殖测定中显示出针对过表达AKR1C3的细胞的高功效。用于该评估的MCL模型由AKR1C3过表达(活化剂)细胞或非AKR1C3表达(靶)细胞或以5:95的比生长的这两种细胞类型的混合物组成。两种不同的细胞群的混合物使得能够确定细胞毒性代谢物从活化剂细胞转移到靶细胞群的程度。
铺板效率以形成的群落数相对于接种的细胞数的分数计算。通过内插法，可以针对在没有活化剂的情况下生长的靶细胞(T)、共培养物中的靶细胞(TC)和共培养物中的活化剂细胞(AC)的存活率为10％而确定化合物的浓度(C10)。旁观者效应效率(BEE)计算为(LogC10T-LogC10Tc)/(LogC10T-LogC10Ac)，其中BEE是细胞毒性代谢物转移的量度。与PR-104A相反，本发明的优选化合物具有最小的BEE，从而减少了由邻近的非AKR1C3表达细胞的消融引起的脱靶副作用。
材料和方法
MCL的制备
Millicell-CM膜插入件包被有III型小牛皮胶原蛋白。制备胶原蛋白溶液，该胶原蛋白溶液为溶解于无菌0.01N HCl中至浓度为3mg/mL。将胶原蛋白溶液在无菌60％乙醇中稀释(1:5)，并使用100μL的该溶液包被膜插入件，并在无菌环境中放置过夜干燥。
在添加细胞之前，将插入件在70％乙醇中灭菌，然后放置在无菌环境中通气以使乙醇蒸发。将无菌聚乙烯泡沫环放置在每个插入件周围以使其随后能够漂浮。向每个插入件中添加体积为500μL的1×106个细胞的单细胞悬液。当需要细胞混合物时，将1×106个细胞的混合细胞悬液(500μL)添加到每个插入件中。实验中使用的混合MCL类型由95％的HCT116NeoR和5％的HCT116AKR1C3细胞组成。在该混合物中使用HCT116NeoR细胞作为AKR1C3阴性细胞系，该细胞系随后可以在含有遗传霉素(G418)的选择性培养基中生长，并能够与AKR1C3阳性细胞系(可以在含有嘌呤霉素的选择性培养基中生长)区分开来。将含有细胞的插入件置于容纳有300mL的α-MEM+10％v/v FBS+1％PSG的无菌螺旋盖塑料广口瓶中，在广口瓶中最多插入6个插入件。在加湿培养箱(37℃，5％CO2)中将插入件在培养基中漂浮4小时，以使细胞贴附到胶原蛋白包被层上，然后浸没在带有无菌不锈钢网格的培养基中。通过将广口瓶置于37℃水浴中并持续磁力搅拌培养基，使细胞生长并在插入件上形成MCL，持续3天。
MCL实验程序
细胞在插入件中作为MCL生长三天后，用倒置相差显微镜观察每个插入件，以确保细胞均匀生长。将合适的MCL转移到容纳有10mL具有所需药物浓度的培养基(α-MEM+10％v/vFBS+1％PSG)的25mL玻璃容器中。玻璃容器中的每个插入件均通过连接到盖子的不锈钢环支持。将容器置于37℃水浴中。每个瓶盖上的端口能够使得用所需的气相充气。将容纳有MCL插入件和药物的玻璃容器在37℃水浴中放置5小时，同时连续充气和磁力搅拌培养基。使用的气相为5％CO2:95％O2，其中的高氧浓度用于使通过内源性单电子还原酶对生物还原性药物的活化最小化。
温育5小时后，将每个插入件在37℃下在PBS中的0.07％胰蛋白酶中胰蛋白酶消化10分钟，以将MCL分离成单细胞悬液。将分离的细胞在含有10％FBS和100μg/ml DNA酶I的α-MEM中进一步温育10分钟。然后将细胞在Z2
Figure BDA0002708073130000601
颗粒计数和尺寸分析仪上计数并在新鲜培养基中重悬。将细胞系列稀释，并以102至105个细胞/皿铺在P60皿中，以确定克隆源性存活率。为了区分克隆源性活化剂细胞(HCT116AKR1C3)与靶细胞(HCT116NeoR)，将来自混合MCL的细胞铺在两种类型的选择性培养基中；含有1μM嘌呤霉素的的培养基(其使得活化剂群落生长)，以及含有500μg/mL遗传霉素的培养基(其使得靶群落生长)。将来自含有100％的靶细胞的MCL中的细胞置于含有遗传霉素(500μg/mL)的培养基中生长。在用亚甲基蓝(2g/L在50％v/v乙醇水溶液中)染色之前，使群落在37℃，5％CO2培养箱中生长10天。含有多于50个细胞的菌落被算作克隆源性幸存者。铺板效率以形成的群落数相对于接种的细胞数的分数计算。通过内插法，可以针对在没有活化剂细胞的情况下生长的靶细胞(T)、共培养物中的靶细胞(TC)和共培养物中的活化剂细胞(AC)的存活率为10％而确定药物的浓度(C10)。旁观者效应效率(BEE)计算为(LogC10T-LogC10Tc)/(LogC10T-LogC10Ac)。
结果
图8显示了在含有5％的AKR1C3过表达细胞的混合HCT116结肠癌MCL中针对化合物641进行高细胞密度多细胞层(MCL)测定的结果。化合物641展示靶细胞C10为11.1μM(T)，共培养物中靶细胞C10为1.27μM(Tc)，共培养物中活化剂细胞C10为0.0054μM(Ac)。这些数据一起表明，在高细胞密度(T/Ac)下生长时，表达AKR1C3的细胞对化合物641的克隆源性细胞杀伤的敏感性是AKR1C3阴性细胞的2055倍，并且多细胞层中5％的AKR1C3阳性细胞群体仅对AKR1C3阴性细胞群体产生适度的通过细胞毒性代谢物转移(旁观者效应)的细胞杀伤作用，其中C10仅变化9倍(从11.1μM(T)到1.27μM(Tc))。从图8可以明显看出，至少99.9％的AKR1C3阳性HCT116细胞在0.002μM至0.2μM的化合物641浓度下被克隆源性地杀灭。尽管野生型AKR1C3阴性HCT116暴露于化合物641，同时在确保与AKR1C3阳性HCT116细胞紧密接触的多细胞组织样环境中，但野生型AKR1C3阴性HCT116中没有同时发生克隆源性细胞杀伤的情况。
在化合物暴露<1.2uM.hr(0.2μM持续5小时)时，化合物641导致AKR1C3阳性细胞的克隆源性细胞杀伤高达5个对数，同时尽管AKR1C3阴性细胞被紧密混合在高细胞密度(3D)多细胞层中，但不影响AKR1C3阴性细胞的克隆源性存活。在暴露>1.2uM.hr(0.2μM持续5小时)时，化合物641表现出28％的最小的旁观者效应效率(BEE)。与文献报道PR-104A(也称为SN27858)具有大量旁观者效应(Foehrenbacher等人,肿瘤学前沿(Frontiers inOncology),2013,3,263)相比，这一结果令人惊讶，并且据报道化合物SN27686、SN33539、SN33540和SN34118在AKR1C3混合MCL中的BEE分别为57.6％，82.1％，60％和52.7％(Silva,S.，奥克兰大学图书馆,理学硕士学位,2012)。
结论
总体而言，数据表明，与例如PR-104A的已知化合物相比，本发明的AKR1C3活化的前药是针对AKR1C3的改良底物，这借助于导致对AKR1C3酶的亲和力增加(Km较低)和AKR1C3的催化效率改善(kcat/Km增加)的结构修饰。数据进一步表明，与例如SN33539、SN35028、SN34947、SN34951、SN34118和SN34454的已知化合物相比，本发明的优选实例是改良的AKR1C3活化的前药，因为它们实现了对AKR1C3催化位点的亲和力与底物转化的最佳平衡，使得它们在高浓度下不抑制AKR1C3代谢。
本发明的前药通过AKR1C3代谢，并展示相对于野生型同基因细胞的多细胞层，被改造以过表达AKR1C3的细胞的多细胞层中克隆源性细胞杀伤增加。
在被改造以过表达人AKR1C3的野生型细胞系(HCT116、SNU398)中，本发明的AKR1C3活化的前药比现有技术具有显著更高的细胞毒性。这种细胞毒性可以通过用已知的有效和选择性AKR1C3抑制剂抑制AKR1C3而改善，直接暗示了AKR1C3表达和前药代谢与观察到的细胞毒性有关。
在内源性表达人AKR1C3的野生型细胞系(H460、PLC/PRF/5)中，本发明的AKR1C3活化的前药比现有技术具有显著更高的细胞毒性。这种细胞毒性可以通过用已知的有效和选择性AKR1C3抑制剂抑制AKR1C3而改善，直接暗示了AKR1C3表达和前药代谢与观察到的细胞毒性有关。
在荷有H460肺癌异种移植物的NIH-III小鼠中，本发明的AKR1C3活化的前药与例如SN34454的已知化合物相比展示出显著改善的抗肿瘤功效。在处于耐受良好的剂量和计划中的雌性NIH-III小鼠中的PLC/PRF/5、SW780和SNU-398AKR1C3肿瘤异种移植物中，本发明的前药进一步展示出显著的抗肿瘤活性。通过在雌性NIH-III小鼠中的AKR1C3阴性SNU-398WT(野生型)肿瘤异种移植物中缺乏活性，证实了这种抗肿瘤功效的AKR1C3依赖性。
在本说明书中对任何现有技术的引用都不是，也不应该被认为是承认或暗示该现有技术在世界上任何国家构成了该研究领域中公知常识的一部分。
也可以说本发明广泛地包括在本申请说明书中提及或指出的部分、要素和特征，其是单独的形式或共同的所述部分、元件或特征中的两个或更多个的任何或全部组合的形式。
在前文描述中已经引用了整数或具有其已知等效物的组成部分，在本文中并入那些整数，就如同单独阐述一样。
应当注意，对本文所述的当前优选实施方式的各种改变和修改对于本领域技术人员将是显而易见的。可以进行这样的改变和修改，而不脱离本发明的范围并且不减少其附带的优点。因此，这样的改变和修改旨在被包括在本发明的范围内。

Claims (17)

1.一种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0002708073120000011
其中：
A为H、C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6炔基、CFH2、CF2H、CF3、F、Cl、Br、I、OCF3、COR或CON(R)2；
E为SO或SO2；
X为Cl、Br、I或OSO2R；
Y为Cl、Br、I或OSO2R；
每个R独立地为H或C1-C6烷基；
G是选自包括式(B)-(AA)的组中的自由基：
Figure FDA0002708073120000012
其中：
R1为H、C1-C6烷基、CH2(CH2)nOH、CH2CH(OH)CH2OH、苯基、吡啶基、苄基或吡啶基甲基，条件是当R1为苯基、吡啶基、苄基或吡啶基甲基时，R1任选地在任何可用位置处被C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6炔基、OR6、N(R6)(R7)、CFH2、CF2H、CF3、F、Cl、Br、I、OCF3、COR6、CON(R6)(R7)、SOR6、SON(R6)(R7)、SO2R6、SO2N(R6)(R7)、CN或NO2取代；
R2和R3各自独立地为H、C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6炔基、OR6、N(R6)(R7)、CFH2、CF2H、CF3、F、Cl、Br、I、OCF3、COR6、CON(R6)(R7)、SOR6、SON(R6)(R7)、SO2R6、SO2N(R6)(R7)、CN或NO2；
R4为N(R6)(R7)、OH、OCH2(CH2)nN(R6)(R7)或CH2(CH2)nN(R6)(R7)；
R5为H或C1-C6烷基基团；
R6和R7各自独立地为H或C1-6烷基，或者R6和R7一起形成取代或未被取代的5元或6元杂环；
Z为CH或N；
W为CH2、O、S、SO或SO2；
n为0至6；
*表示与式(I)的连接点。
2.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
A为H、C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6炔基、CFH2、CF2H、CF3或OCF3；
E为SO或SO2；
X为Br或OSO2R；
Y为Br或OSO2R；
每个R独立地为H或C1-C6烷基；
G为选自包括式(B)、(C)、(D)、(O)和(P)的组中的自由基：
Figure FDA0002708073120000021
其中
R1为H、C1-C6烷基、CH2(CH2)nOH、CH2CH(OH)CH2OH；
R4为N(R6)(R7)、OCH2(CH2)nN(R6)(R7)或CH2(CH2)nN(R6)(R7)；
R5为H或C1-C6烷基；
R6和R7各自独立地为H或C1-6烷基，或者R6和R7一起形成取代或未被取代的5元或6元杂环；
N为0至6；
*表示与式I的连接点。
3.如权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
A为H、C1-C6炔基、CFH2、CF2H或CF3；
E为SO2；
X为Br或OSO2R；
Y为Br或OSO2R；
每个R独立地为H或C1-C6烷基；
G为选自包括式(B)、(C)、(D)、(O)和(P)的组中的自由基：
Figure FDA0002708073120000031
其中
R1为H、C1-C6烷基、CH2(CH2)nOH、CH2CH(OH)CH2OH；
R4为N(R6)(R7)、OCH2(CH2)nN(R6)(R7)或CH2(CH2)nN(R6)(R7)；
R5为H或C1-C6烷基；
R6和R7各自独立地为H或C1-6烷基，或者R6和R7一起形成取代或未被取代的5元或6元杂环；
n表示0至6；
*表示与式I的连接点。
4.如权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中，A是H。
5.如权利要求1所述的化合物，其选自包括以下的组：
N,N-双(2-溴乙基)-4-硝基-2-(哌嗪-1-基磺酰基)苯胺(562)；
N,N-双(2-溴乙基)-2-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯胺(563)；
N,N-双(2-溴乙基)-2-((4-乙基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯胺(564)；
2-(4-((2-(双(2-溴乙基)氨基)-5-硝基苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)乙醇(565)；
3-(4-((2-(双(2-溴乙基)氨基)-5-硝基苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)丙烷-1,2-二醇(566)；
N,N-双(2-溴乙基)-2-((4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)磺酰基)-4-硝基苯胺(584)；
N,N-双(2-溴乙基)-2-((5-甲基-1,5-二氮杂环辛烷-1-基)磺酰基)-4-硝基苯胺(585)；
N,N-双(2-溴乙基)-2-((1-甲基哌啶-4-基)磺酰基)-4-硝基苯胺(586)；
1-((2-(双(2-溴乙基)氨基)-5-硝基苯基)磺酰基)哌啶-4-胺(587)；
1-((2-(双(2-溴乙基)氨基)-5-硝基苯基)磺酰基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺(588)；
N,N-双(2-溴乙基)-2-((1-甲基氮杂环庚烷-4-基)磺酰基)-4-硝基苯胺(589)；
N,N-双(2-溴乙基)-2-((1-甲基氮杂环辛烷-5-基)磺酰基)-4-硝基苯胺(590)；
N,N-双(2-溴乙基)-2-(吗啉代磺酰基)-4-硝基苯胺(591)；
2-(双(2-溴乙基)氨基)-N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-硝基苯磺酰胺(592)；
2-(双(2-溴乙基)氨基)-N-(2-(二甲基氨基)乙基)-N-甲基-5-硝基苯磺酰胺(593)；
2-(双(2-溴乙基)氨基)-N-(2-吗啉代乙基)-5-硝基苯磺酰胺(594)；
2-(双(2-溴乙基)氨基)-N-甲基-N-(2-吗啉代乙基)-5-硝基苯磺酰胺(595)；
2-((2-溴乙基)(4-硝基-2-(哌嗪-1-基磺酰基)苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(601)；
2-((2-溴乙基)(2-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(602)；
2-((2-溴乙基)(2-((4-乙基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(603)；
2-((2-溴乙基)(2-((4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(604)；
2-((2-溴乙基)(2-((4-(2,3-二羟基丙基)哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(605)；
2-((2-溴乙基)(2-((4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(623)；
2-((2-溴乙基)(2-((5-甲基-1,5-二氮杂环辛烷-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(624)；
2-((2-溴乙基)(2-((1-甲基哌啶-4-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(625)；
2-((2-((4-氨基哌啶-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)(2-溴乙基)氨基)乙基甲磺酸酯(626)；
2-((2-溴乙基)(2-((4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(627)；
2-((2-溴乙基)(2-((1-甲基氮杂环庚烷-4-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(628)；
2-((2-溴乙基)(2-((1-甲基氮杂环辛烷-5-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(629)；
2-((2-溴乙基)(2-(吗啉代磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(630)；
2-((2-溴乙基)(2-(N-(2-(二甲基氨基)乙基)胺磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(631)；
2-((2-溴乙基)(2-(N-(2-(二甲基氨基)乙基)-N-甲基胺磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(632)；
2-((2-溴乙基)(2-(N-(2-吗啉代乙基)胺磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(633)；
2-((2-溴乙基)(2-(N-甲基-N-(2-吗啉代乙基)胺磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(634)；
((4-硝基-2-(哌嗪-1-基磺酰基)苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(640)；
((2-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(641)；
((2-((4-乙基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(642)；
((2-((4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(643)；
((2-((4-(2,3-二羟基丙基)哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(644)；
((2-((4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(662)；
((2-((5-甲基-1,5-二氮杂环辛烷-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(663)；
((2-((1-甲基哌啶-4-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(664)；
((2-((4-氨基哌啶-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(665)；
((2-((4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(666)；
((2-((1-甲基氮杂环庚烷-4-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(667)；
((2-((1-甲基氮杂环辛烷-5-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(668)；
((2-(吗啉代磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(669)；
((2-(N-(2-(二甲基氨基)乙基)胺磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(670)；
((2-(N-(2-(二甲基氨基)乙基)-N-甲基胺磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(671)；
((2-(N-(2-吗啉代乙基)胺磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(672)；
((2-(N-甲基-N-(2-吗啉代乙基)胺磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(673)；
N,N-双(2-溴乙基)-2-甲基-4-硝基-6-(哌嗪-1-基磺酰基)苯胺(679)；
N,N-双(2-溴乙基)-2-甲基-6-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯胺(680)；
N,N-双(2-溴乙基)-2-((4-乙基哌嗪-1-基)磺酰基)-6-甲基-4-硝基苯胺(681)；
3-(4-((2-(双(2-溴乙基)氨基)-3-甲基-5-硝基苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)丙烷-1,2-二醇(683)；
N,N-双(2-溴乙基)-2-甲基-6-((4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)磺酰基)-4-硝基苯胺(701)；
N,N-双(2-溴乙基)-2-甲基-6-((5-甲基-1,5-二氮杂环辛烷-1-基)磺酰基)-4-硝基苯胺(702)；
N,N-双(2-溴乙基)-2-甲基-6-((1-甲基哌啶-4-基)磺酰基)-4-硝基苯胺(703)；
1-((2-(双(2-溴乙基)氨基)-3-甲基-5-硝基苯基)磺酰基)哌啶-4-胺(704)；
1-((2-(双(2-溴乙基)氨基)-3-甲基-5-硝基苯基)磺酰基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺(705)；
2-((2-溴乙基)(2-甲基-4-硝基-6-(哌嗪-1-基磺酰基)苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(718)；
2-((2-溴乙基)(2-甲基-6-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(719)；
2-((2-溴乙基)(2-((4-乙基哌嗪-1-基)磺酰基)-6-甲基-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(720)；
2-((2-溴乙基)(2-((4-(2,3-二羟基丙基)哌嗪-1-基)磺酰基)-6-甲基-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(722)；
2-((2-溴乙基)(2-甲基-6-((4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(740)；
2-((2-溴乙基)(2-甲基-6-((5-甲基-1,5-二氮杂环辛烷-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(741)；
2-((2-溴乙基)(2-甲基-6-((1-甲基哌啶-4-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(742)；
2-((2-((4-氨基哌啶-1-基)磺酰基)-6-甲基-4-硝基苯基)(2-溴乙基)氨基)乙基甲磺酸酯(743)；
2-((2-溴乙基)(2-((4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)磺酰基)-6-甲基-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(744)；
((2-甲基-4-硝基-6-(哌嗪-1-基磺酰基)苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(757)；
((2-甲基-6-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(758)；
((2-((4-乙基哌嗪-1-基)磺酰基)-6-甲基-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(759)；
((2-((4-(2,3-二羟基丙基)哌嗪-1-基)磺酰基)-6-甲基-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(761)；
((2-甲基-6-((4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(779)；
((2-甲基-6-((5-甲基-1,5-二氮杂环辛烷-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(780)；
((2-甲基-6-((1-甲基哌啶-4-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(781)；
((2-((4-氨基哌啶-1-基)磺酰基)-6-甲基-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(782)；
((2-((4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)磺酰基)-6-甲基-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(783)；
2-((2-溴乙基)(2,4-二硝基-6-(哌嗪-1-基磺酰基)苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(835)；
2-((2-溴乙基)(2-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4,6-二硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(836)；
2-((2-溴乙基)(2-((4-乙基哌嗪-1-基)磺酰基)-4,6-二硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(837)；
2-((2-溴乙基)(2-((4-(2,3-二羟基丙基)哌嗪-1-基)磺酰基)-4,6-二硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(839)；
2-((2-溴乙基)(2-((4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)磺酰基)-4,6-二硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(857)；
2-((2-溴乙基)(2-((5-甲基-1,5-二氮杂环辛烷-1-基)磺酰基)-4,6-二硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(858)；
2-((2-((4-氨基哌啶-1-基)磺酰基)-4,6-二硝基苯基)(2-溴乙基)氨基)乙基甲磺酸酯(860)；
2-((2-溴乙基)(2-((4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)磺酰基)-4,6-二硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(861)；
((2,4-二硝基-6-(哌嗪-1-基磺酰基)苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(874)；
((2-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4,6-二硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(875)；
((2-((4-乙基哌嗪-1-基)磺酰基)-4,6-二硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(876)；
((2-((4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)磺酰基)-4,6-二硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(896)；
((2-((5-甲基-1,5-二氮杂环辛烷-1-基)磺酰基)-4,6-二硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(897)；
((2-((4-氨基哌啶-1-基)磺酰基)-4,6-二硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(899)；
((2-((4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)磺酰基)-4,6-二硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(900)；
2-((2-溴乙基)(4-硝基-2-(哌嗪-1-基磺酰基)-6-(三氟甲基)苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(952)；
2-((2-溴乙基)(2-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基-6-(三氟甲基)苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(953)；
2-((2-溴乙基)(2-((4-乙基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基-6-(三氟甲基)苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(954)；
2-((2-溴乙基)(2-((4-(2,3-二羟基丙基)哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基-6-(三氟甲基)苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(956)；
2-((2-溴乙基)(2-((4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)磺酰基)-4-硝基-6-(三氟甲基)苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(974)；
2-((2-溴乙基)(2-((5-甲基-1,5-二氮杂环辛烷-1-基)磺酰基)-4-硝基-6-(三氟甲基)苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(975)；
2-((2-((4-氨基哌啶-1-基)磺酰基)-4-硝基-6-(三氟甲基)苯基)(2-溴乙基)氨基)乙基甲磺酸酯(977)；
2-((2-溴乙基)(2-((4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)磺酰基)-4-硝基-6-(三氟甲基)苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(978)；
((4-硝基-2-(哌嗪-1-基磺酰基)-6-(三氟甲基)苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(991)；
((2-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基-6-(三氟甲基)苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(992)；
((2-((4-乙基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基-6-(三氟甲基)苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(993)；
((2-((4-(2,3-二羟基丙基)哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基-6-(三氟甲基)苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(995)；
((2-((4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)磺酰基)-4-硝基-6-(三氟甲基)苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(1013)；
((2-((5-甲基-1,5-二氮杂环辛烷-1-基)磺酰基)-4-硝基-6-(三氟甲基)苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(1014)；
((2-((4-氨基哌啶-1-基)磺酰基)-4-硝基-6-(三氟甲基)苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(1016)；
((2-((4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)磺酰基)-4-硝基-6-(三氟甲基)苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(1017)；
2-((2-溴乙基)(2-乙炔基-4-硝基-6-(哌嗪-1-基磺酰基)苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(1069)；
2-((2-溴乙基)(2-乙炔基-6-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(1070)；
2-((2-溴乙基)(2-((4-乙基哌嗪-1-基)磺酰基)-6-乙炔基-4-硝基苯基)氨基)乙基甲磺酸酯(1071)；
((2-乙炔基-4-硝基-6-(哌嗪-1-基磺酰基)苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(1108)；
((2-乙炔基-6-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(1109)；
((2-((4-乙基哌嗪-1-基)磺酰基)-6-乙炔基-4-硝基苯基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二甲磺酸酯(1110)；
4-((2-(双(2-((甲基磺酰基)氧基)乙基)氨基)-5-硝基苯基)磺酰基)哌嗪-1-
Figure FDA0002708073120000111
甲磺酸酯(640.Ms)；
4-((2-(双(2-((甲基磺酰基)氧基)乙基)氨基)-5-硝基苯基)磺酰基)-1-甲基哌嗪-1-
Figure FDA0002708073120000112
甲磺酸酯(641.Ms)；
4-((2-(双(2-((甲基磺酰基)氧基)乙基)氨基)-5-硝基苯基)磺酰基)-1-乙基哌嗪-1-
Figure FDA0002708073120000113
甲磺酸酯(642.Ms)；
4-((2-(双(2-((甲基磺酰基)氧基)乙基)氨基)-5-硝基苯基)磺酰基)-1-(2-羟乙基)哌嗪-1-
Figure FDA0002708073120000114
甲磺酸酯(643.Ms)；
4-((2-(双(2-((甲基磺酰基)氧基)乙基)氨基)-5-硝基苯基)磺酰基)-1-(2,3-二羟基丙基)哌嗪-1-
Figure FDA0002708073120000115
甲磺酸酯(644.Ms)；
4-((2-(双(2-((甲基磺酰基)氧基)乙基)氨基)-3-甲基-5-硝基苯基)磺酰基)哌嗪-1-
Figure FDA0002708073120000116
甲磺酸酯(757.Ms)；
4-((2-(双(2-((甲基磺酰基)氧基)乙基)氨基)-3-甲基-5-硝基苯基)磺酰基)-1-甲基哌嗪-1-
Figure FDA0002708073120000117
甲磺酸酯(758.Ms)；
4-((2-(双(2-((甲基磺酰基)氧基)乙基)氨基)-5-硝基-3-(三氟甲基)苯基)磺酰基)哌嗪-1-
Figure FDA0002708073120000118
甲磺酸酯(991.Ms)；
4-((2-(双(2-((甲基磺酰基)氧基)乙基)氨基)-5-硝基-3-(三氟甲基)苯基)磺酰基)-1-甲基哌嗪-1-
Figure FDA0002708073120000119
甲磺酸酯(992.Ms)；
4-((2-(双(2-((甲基磺酰基)氧基)乙基)氨基)-3-乙炔基-5-硝基苯基)磺酰基)哌嗪-1-
Figure FDA00027080731200001110
甲磺酸酯(1108.Ms)；和
4-((2-(双(2-((甲基磺酰基)氧基)乙基)氨基)-3-乙炔基-5-硝基苯基)磺酰基)-1-甲基哌嗪-1-
Figure FDA00027080731200001111
甲磺酸酯(1109.Ms)。
6.如权利要求1至5中任一项所述的化合物，其具有下式：
Figure FDA00027080731200001112
7.如权利要求1至5中任一项所述的化合物，其具有下式：
Figure FDA0002708073120000121
8.如权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中，所述药学上可接受的盐是甲磺酸盐。
9.一种药物组合物，包含权利要求1至8中任一项所述的化合物以及药学上可接受的载体。
10.一种治疗过度增殖性失调的方法，包括将权利要求1至8中任一项所述的化合物施用至人。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述过度增殖性失调的特征在于与表达可检测量的AKR1C3的赘生物的形成有关。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中，所述过度增殖性失调是癌症。
13.如权利要求11或12所述的方法，其中，所述癌症是急性髓性白血病(AML)、T细胞谱系急性淋巴细胞性白血病(T-ALL)、慢性髓性白血病(CML)、肝细胞癌、非肌肉浸润性(浅表性)膀胱癌、局部浸润性膀胱癌、转移性膀胱癌、胃癌、宫颈癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、食道癌、头颈部癌、卵巢癌、成胶质细胞瘤、肉瘤、子宫内膜癌、前列腺癌、肾癌或肺癌。
14.一种细胞消融的方法，包括以下步骤：
a.用至少一种AKR1C3酶活化权利要求1至8中任一项所述的化合物，以产生能够消融靶细胞的细胞毒性代谢物；和
b.使所述靶细胞与所述细胞毒性代谢物接触以消融所述细胞。
15.如权利要求10至14中任一项所述的方法，其中，所述化合物为：
Figure FDA0002708073120000122
16.如权利要求1至8中任一项所述的化合物在制备用于治疗过度增殖性失调的药物中的用途。
17.一种药物组合物，包含权利要求1至8中任一项所述的化合物，用于治疗过度增殖性失调的用途。
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