CN111902074A - 用于灵敏分子分析的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明教导了一种在超声分子成像的情况下确定靶结合微泡存在的方法。该方法(本文称为动态缩放超声分子成像)依赖于表达分子成像靶标的区域内和参照区域内的时变行为造影剂。还教导了能够使用该方法的超声造影剂组合物。本发明可用于利用超声分子成像进行诊断疾病和监测治疗。

Description

用于灵敏分子分析的组合物和方法

背景技术

在现有技术中已经很好地描述了利用超声来产生诊断上有用的图像。超声成像可以以高帧率(通常可以实现高达每秒几十帧)进行，而不需要使用电离辐射，并且该装备相对于其他成像模式具有低成本和高便携性。这些特性使得诊断超声成像可用于评估各种疾病状态并对各种生物组织进行成像。

发明内容

根据本发明，本发明提供了一种用于通过分析以动态缩放方式获取的超声分子图像的时间序列来量化感兴趣的区域(ROI)内造影信号的幅度的方法，所述方法包括向受试者的靶组织施用靶向造影剂(诸如微泡)以对疾病的靶向分子标志物的存在进行成像；以动态、时变的方式选择代表血液池内循环的造影剂量的参照区域；对包含所选参照区域的所述靶组织进行成像；通过所述动态缩放、时变方式的程序定量地确定疾病区域的幅度，其中所述靶向造影剂被配置用于与患病区域内表达的疾病的所述分子标志物结合。

在一方面，所述动态缩放、时变方式的程序包括

a.提供描绘单个视场的图像的时间序列，

b.选择一个或多个感兴趣的区域和一个或多个相应的参照区域，

c.形成参照缩放图像和/或参照缩放信号幅度，其中在所述时间序列中的相同时刻获得所述感兴趣的区域和参照区域，

d.对所述时间序列中的两个或更多个图像执行(c)所述的缩放操作，以定量地确定所述参照缩放幅度的时间-强度关系；其中所述参照缩放信号在所述患病区域中增大并且在非患病区域中减小。

援引并入

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入本文。

附图说明

本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下详细描述和附图，可以更好地理解本发明的特征和优点，以下详细描述阐述了利用本发明的原理的说明性实施方案，在附图中：

图1A/B示出了使用非破坏性成像描绘靶向微泡行为的简化时间-强度曲线。其示出了两个感兴趣的区域：(1A)未表达成像靶标(健康组织)的一个区域和(1B)表达成像靶标(靶向组织)的一个区域。在底部曲线上注出了后期阶段成像窗口，也在底部曲线上注出了t4时的靶结合微泡信号的幅度。

图2A/B示出了使用爆裂-再填充(burst-refill)成像方法描绘靶向微泡行为的简化时间-强度曲线。其示出了两个感兴趣的区域：(2A)未表达成像靶标(健康组织)的一个区域和(2B)表达成像靶标(靶向组织)的一个区域。在t2执行破坏性爆裂。在底部图上注出了靶结合微泡信号的幅度。

图3A/B提供了根据本发明的实践进行超声分子成像的一般实例的一个实施方案。靶组织由两个区域组成：区域B(其中不存在感兴趣的疾病)和区域C(其中存在疾病)。第三区域(A)用作参照区域。底部图3B描绘了在成像过程期间的各个时间点获取的每个区域的代表性图像。像素强度(此处用灰色阴影描绘)与造影信号幅度相对应。每个区域中的数字代表给定时间点的造影信号幅度。

图4A/B示出了与图3B的简化图示相对应的示例性时间-强度曲线。(4A)将区域B(不存在疾病)和区域A(参照区域)的造影信号幅度绘制为时间的函数。(4B)将区域C(存在疾病)和区域A(参照区域)的造影信号幅度作为时间的函数。注意在t4和t5之间的时间轴刻度发生断裂。

图5A-H示出了与图3-4的数据相对应的动态缩放曲线。(5A)和(5B)示出了图3B的造影信号幅度-时间曲线。示出了(5C)非患病区域和(5D)患病区域的参照缩放造影信号幅度随时间的变化。示出了(5E)非患病区域和(5F)患病区域的参照缩放造影信号幅度随时间变化的瞬时斜率。示出了(5G)非患病区域和(5H)患病区域的参照缩放造影信号幅度在t1和随后的时间点之间的平均斜率。

图6图示了与图3的简化图像相对应的参照缩放图像。每个区域中的数字代表给定时间点的参照缩放造影信号幅度。

图7图示了与图3的简化图像相对应的变化率图像(rate images)。每个区域中的数字代表峰值与指定时间点之间参照缩放造影信号幅度的变化率。图像用灰色阴影描绘正值和负值。根据定义，参照区域的变化率图像一律为零，此处省略。

图8A-D示出了心肌缺血-再灌注损伤的犬模型中P-选择素的示例性超声分子成像。示出了在(8A)未暴露于缺血的健康犬和(8B)暴露于LAD缺血10分钟然后再灌注90分钟的同只动物的成像实验过程中各个时间点下的代表性的超声分子成像图像。相应的时间-强度曲线描绘了(8C)LV腔室和(8D)前心肌中的造影信号幅度(以声功率为单位表达)。

图9A/B示出了从图8的图像导出的以(9A)声功率和(9B)声幅为单位表达的参照缩放造影信号幅度。

图10A-C示出了心肌缺血-再灌注的犬模型中的示例性动态缩放超声分子成像。(10A)在施用微泡后各个时间点下的缺血后(正方形)和健康(钻石)心肌中的参照缩放造影信号幅度。在施用微泡后1至3分钟之间(10B)以及施用微泡后1至5分钟之间(10C)参照缩放造影信号幅度的平均斜率。误差线代表n＝6只动物的SEM。

图11A-D示出了心肌缺血-再灌注的犬模型中的示例性动态缩放超声分子成像。图像是缺血后犬在施用P-选择素靶向微泡之前和之后在各个时间点下获取的短轴端收缩期。通过线性化造影强度得出(11A)造影强度图像和(11B)相应的造影信号幅度图像。(11C)酞菁蓝染色的代表性短轴部分描绘了缺血性风险区域(箭头)。(11D)参照缩放图像。箭头突出显示造影信号增大的区域。

图12A-C示出了心肌缺血-再灌注的犬模型中的示例性动态缩放超声分子成像。图像是缺血后犬在施用阴性对照微泡之前和之后在各个时间点下获取的短轴端收缩期。A)造影强度图像B)酞菁蓝染色的代表性短轴部分描绘了缺血性风险区域(箭头)。C)参照缩放图像。

图13提供了靶向微泡的说明性图解。描述了三个壳形成组分：壳形成表面活性剂、由疏水性锚和亲水性部分组成的第二表面活性剂，以及由靶向配体、亲水性部分和疏水性锚组成的靶向构造体。

图14A-C图示了按照实施例6制备的示例性P-选择素靶向微泡。通过电区感应获得的代表性的尺寸分布显示在14A低端和14B全范围内。图14C示出了对于三个代表性批次的P-选择素靶向微泡获得的尺寸信息。

图15A-C示出了心肌缺血-再灌注损伤的犬模型中P-选择素的示例性超声分子成像。在犬心脏缺血后90分钟获得的代表性的超声分子成像图像。在施用(15A)使用实施例8的制剂制备的P-选择素靶向微泡、(15B)如实施例6制备、然后如实施例8所述尺寸增大的P-选择素微泡以及(15C)如实施例6制备的最佳直径的P-选择素靶向微泡约1分钟后获得图像。箭头描绘造影信号丢失的区域。

图16提供了人心肌中缺血性损伤的超声分子成像的实例的某一实施方案。该实例中的靶组织是心肌，假设其包含两个区域：区域B(其中心肌未曾先前暴露于缺血)和区域C(其先前经历过缺血)。LV腔室(A)用作参照区域。底部图描绘了在成像过程期间的各个时间点获取的代表性图像。像素强度(此处用灰色阴影描绘)与造影信号幅度相对应。每个区域中的数字代表给定时间点的造影信号幅度。

图17A-E图示了与图16的数据相对应的动态缩放曲线。(17A)造影信号幅度-时间曲线(17B)参照缩放造影信号幅度随时间的变化，以及(17C)参照缩放造影信号幅度在t＝60s与90、180和300s之间的平均斜率。(17D)示出了参照缩放图像且(17E)示出了相对应的变化率图像。

图18A-E提供了通过动态缩放超声分子成像来重新监测对治疗的反应的方法的又一实施方案。针对(18A)表现出阳性治疗反应的患者和(18B)表现出阴性反应的患者的肌肉区域(靶区域)和相邻动脉区域(参照区域)内的简化造影信号幅度图像的时间序列。最右侧示出了每个患者的与造影信号幅度序列相对应的变化率图像。通过在治疗期间的不同日期对(18C)表现出强反应的患者、(18D)表现出中等反应的患者，以及(18E)表现出弱反应的患者进行的动态缩放超声分子成像获得的变化率图像。

图19示出了动态缩放、时变方式的程序的示例性流程图。

具体实施方式

造影剂(微泡和相关组合物)的使用扩展了超声成像的实用性。广泛使用两类超声造影剂：1)非靶向超声造影剂，其主要用于血流成像和边界监测，以及2)靶向超声造影剂，其通常用于分子成像。在这两种情况下，生物相容性气体用作造影产生物质。气相通常被壳包封，壳稳定气体并提供所需的药代动力学和药效学特性。在靶向造影剂的情况下，壳用能够介导造影剂滞留到特定分子或细胞类型的物质配制。例如表1的参考文献中描述了代表性的非靶向微泡。例如US08/958,993(Klaveness等人)和US14/639,055(Rychak等人)中描述了代表性的靶向微泡。这些参考文献和所有其他参考专利、申请和出版物均通过引用以其整体并入本文。

表1用于本领域的超声造影剂的物理特性。

在本发明的上下文中，需要考虑几个造影剂特性。微泡通常是多分散的，具有大约1至20um的直径。在一些情况下中，宽的尺寸分布是有利的，因为这有助于在宽范围的成像频率和组织深度上成像。据报道，微泡产生超声造影信号的有效功效随尺寸而缩放，而小的(直径2.0um及以下)微泡通常不利于超声成像(Sontum等人，1999；Gorce等人，2000)。基本上所有商业上可获得的人用微泡产品都具有大于2um的平均直径。

已经在文献中报道了基本上单分散的微泡，例如Feshiten等人(2009)。此类制剂在小生境应用中可能具有优势，例如在小动物中的超高频成像，但是由于所需的低成像频率，通常不希望用于临床应用。

对于靶向微泡，靶向配体与壳的共轭是高度相关的。靶向配体需要具有生物相容性，并介导微泡特异性地和牢靠地附着至靶分子或细胞。抗体、融合蛋白、肽、核酸、碳水化合物和聚合物已经用作靶向配体。

靶向微泡通常通过静脉团注施用。在一些情况下，可以采用动脉内施用。

超声造影成像

微泡可用于形成造影增强的超声图像的机制已经被很好地描述(例如参见Vannan和Kuersten，2000)。简言之，首先用由超声换能器产生的入射超声能量刺激成像体积内的微泡。该刺激导致微泡的机械活化，通常称为振荡。该活化转而生成第二声信号，称为回声。回声信号的幅度与成像体积内活化微泡的浓度成比例。超声换能器接收回声，将其转化成电信号然后对其进行处理以生成图像。

超声获得的信号在作为图像显示给用户之前经仪器修饰。这些修饰包括动态范围压缩(例如″log压缩″)，其是将接收到的宽范围声信号适配到能够在视频显示监测器中呈现的像素值范围内所必需的。这些修饰用于生成视觉上吸引人的展示，同时突出显示显著的图像特征；然而，它们改变了微泡浓度和显示的像素强度之间的关系。

在本发明的上下文中，术语″造影强度″用于指显示给用户的信号(即，压缩和后处理之后)。术语″造影信号幅度″用于指压缩和后处理之前的相同信号。应当指明，本文所用的造影信号幅度与微泡的浓度成正比，而该关系对于造影强度可能改变。

微泡产生的回声的振幅和相位基本上与组织或其他生物材料产生的回声的幅度和相位不同。这使得能够分离这两种信号，并生成由造影剂产生的回声所导出的图像(造影图像)。本领域已知几种能够检测微泡造影剂的成像技术。本发明特别感兴趣的是在低机械指数(MI)下操作的方法，使得微泡在成像过程中不被过度破坏。Porter等人(2014)概述了高MI与低MI成像技术之间的区别。示例性的非破坏性造影成像方法是能量反向脉冲和对比脉冲序列(CPS)。在许多情况下，造影图像可以与仅从组织导出的图像(例如，B模式图像)基本上同时创建，从而使得能够进行两个图像的共配准。与组织图像的颜色图不同，可以将造影图像方便地呈现为在颜色图中编码的覆盖图。此外，造影信号可以用线性化单位呈现，如US12/084934(Frinking等人)所教导。这用于保持微泡浓度和显示的信号强度之间的比例，其通过压缩和后处理而改变。

靶结合微泡的检测

使用靶向微泡进行超声分子成像的一个挑战是由靶结合微泡产生的造影信号与穿过感兴趣的成像区域的微泡产生的造影信号不易区分。也就是说，当在典型的造影超声图像上显示时，由静止微泡产生的造影信号幅度与由移动微泡产生的造影信号幅度基本上相同。靶结合微泡产生的信号包括分子成像研究中感兴趣的信号，因此靶结合微泡的识别非常重要。

识别靶结合微泡的问题对于稀疏表达的分子靶而言更加严重。在该情况下，靶结合微泡的数量可能显著低于循环微泡的数量。预期靶向微泡的数量极低的示例性疾病状态包括动脉粥样硬化斑块，其表示微泡可结合的有限区域。以低拷贝数表达的靶分子(诸如CD62)也有望促进极低靶微泡结合。

需要一种通过其明确地识别在感兴趣的成像区域中靶结合微泡的存在的方法。这种方法应当是可靠的，并且经得起检验地用于广泛的组织类型，包括具有低靶表达或高度运动的那些。已经提出了几种解决方案，虽然从后面的讨论中将显而易见，但所有这些解决方案都具有显著的缺陷，使得在临床实践中广泛采用是不切实际的。

已经描述了三种用于区分靶向微泡与循环微泡的方法：1.后期阶段成像，2.爆裂-再填充成像，以及3.时间过滤方法。将依次考虑每种方法的功能。从以下讨论中可以清楚地看出，本领域中提供的方法具有显著的缺点，妨碍了它们在许多临床成像背景中广泛使用的适用性。

后期阶段成像

后期阶段成像可能是最简单的方法，并且其主要由等待从施用造影剂使得循环(非靶结合)剂从ROI中清除的足够长的时间过去组成(所谓的″后期阶段″)。当在后期阶段获取图像时，假设大部分或全部观察到的造影信号都是由于靶结合造影剂产生的。该方法已经在例如Smeege等人(2017)中实现。

以下实例说明了该方法的使用及其限制。可以以造影信号幅度与时间的关系图(通常称为时间-强度曲线)的形式来理解感兴趣的区域内靶向微泡的行为。图1是表达成像靶标(患病组织)和不表达成像靶标(非患病组织)的假象组织中的简化时间强度曲线的图示。基线(造影前)造影信号幅度用虚线表示。

图1中的时间-强度曲线可以分成三个阶段，其将在下文进一步讨论。1)早期阶段，发生在t0与t1之间；2)中期阶段，发生在t1与t3之间；以及3)后期阶段，发生在t3与t5之间。

团注施用微泡后不久，在早期阶段观察到造影信号幅度急剧增加。这是因为微泡通过血流进入感兴趣的区域。早期阶段观察到的造影信号主要由循环微泡主导，任何靶结合微泡均占ROI内微泡总数的一小部分。因此，患病组织和非患病组织在早期阶段的时间强度曲线看上去相似。

在中期阶段，由于微泡从血液池中清除，造影信号幅度减小。在任何时刻观察到的造影信号幅度均是由于靶向微泡和循环微泡的组合。微泡从血液池中清除的速率取决于微泡剂量、施用途径、心脏状态(心率、收缩力)、通风状态(氧饱和度、补充医用氧气的使用)和其他患者的特定因素。

后期阶段定义为大多数至基本上所有循环微泡已经从血液池中清除的时期，在感兴趣的区域内任何观察到的造影信号主要是由于靶结合微泡的存在造成的。因此，理论上，后期阶段构成了用于评估靶向微泡存在的感兴趣的区域的方便时间成像窗口。

在实践中，靶结合微泡的造影信号幅度在后期阶段降低，最终会恢复到造影前的水平。信号的这种损失是由于通过气体交换和其他机制(独立于超声诱导的微泡破坏)破坏了靶结合微泡造成的，这些机制损害微泡的完整性以致无法产生造影信号。靶结合信号发生衰减的速率不是先验可知的，其取决于许多因素，包括微泡组成、感兴趣的区域的位置、局部血气组成、靶结合微泡的密度和微循环条件。在实践中，后期阶段信号的衰减通常慢于中期阶段信号的衰减，尽管这两种方式之间的差异很小。这使得难以甚至不可能从时间-强度曲线区分两个阶段，并且当使用此方法时会带来不确定性。

以上讨论说明了将后期阶段成像窗口作为推断靶结合微泡存在的手段的至少一个风险：造影信号幅度随时间减小，并且存在″丢失″成像窗口以及错误地得出不存在疾病的结论。在稀疏表达的成像靶标(其中后期阶段信号可能非常接近造影前的基线)的情况下，该问题更加严重。

更重要的是，中期阶段微泡从血液池中清除的速率不是先验可知的，使得在实践中难以估计何时开始成像以便捕获后期阶段。表2总结了使用VEGFR2作为分子靶标的一些临床和动物研究中使用的后期阶段成像窗口。注意研究之间存在实质性差异。

在研究环境中，通过使用阴性对照实验来克服此问题。例如，向受试者施用阴性对照微泡(不会发生有意义的靶特异性滞留)，造影信号幅度恢复到造影前水平的时间点可用于定义给定实验环境下的后期阶段的开始。

在实践环境中，使用阴性对照通常是不可能的。配制与靶向试剂一起使用的阴性对照成像剂会带来不期望的成本和监管障碍。此外，在急性护理环境中，大多数患者不太可能获得基线扫描(在没有疾病的情况下进行)。另外，等待后期阶段的出现会给超声检查带来潜在的不期望的工作流程障碍。

表2靶向微泡累积的后期阶段成像的示例性时间标度。

从以上讨论中可以清楚地看出，在分子成像的背景下，仅简单的后期阶段成像并不是识别靶结合微泡的合适方法，并且其对低浓度的靶结合微泡不敏感。根据本发明的实践，本领域技术人员将容易认识到使用合适的微泡。

爆裂-再填充成像

爆裂-再填充方法可以在施用后的中期或后期阶段区分靶结合微泡与循环微泡。该方法需要应用短时(约1s)高功率(通常MI＞0.3)超声序列以″爆裂″视场内的微泡。这导致造影信号几乎瞬时消除。然后恢复非破坏性成像，并假定观察到的任何造影信号均来自进入视场的循环微泡。通过从爆裂前减去爆裂后造影信号的幅度，可以得出仅由于靶结合微泡产生的信号的幅度。该减法过程可以在使用数字图像处理的图像上执行。

该方法总结于图2示出的时间-强度曲线中。在该情况下，爆裂序列在中期阶段期间(在t2处)实施，尽管其可以在后期阶段期间(例如，在t3处)实施以达到相似的效果。

例如，Lindner等人(Circulation，2001)和Rychak等人(Mol Imaging，2007)中已经实施了该方法。

该方法的关键困难在于，它需要使用高功率超声波来破坏微泡，这可能会引入不期望的生物效应。已经观察到由高功率超声引起的微泡破环与心脏室性早搏(van DerWouw等人，2000)、微血管流改变(Hu等人，2013)和邻近细胞的短暂穿孔(Miller等人，2008)有关。因此，从安全角度考虑，优选无需破坏微泡的成像方法。

基于运动和过滤器的方法

已经提出了多种旨在基于时间或频率分量来识别靶结合微泡的技术。这些方法可以有利地用于施用微泡后的中期阶段，并且可以在进行超声扫描时基本实时地操作。

Willmann等人(2017)描述了通过对视频序列进行简单的视觉评估来区分运动微泡与静止微泡。显而易见的是，在循环微泡的浓度高的情况下，在适度组织运动存在的情况下，该方法难以实施并且需要用户方面的专业知识。不依赖用户专业知识的定量方法更适合广泛使用。

已经记载过基于计算机的过滤方法。例如，US12/084933(Frinking等人)公开了一种算法，通过该算法可以在时域中对造影信号进行过滤从而将靶结合微泡与自由循环微泡分离。在US12/520839(Frinking等人)中教导了该方法的改进以使得能够检测分离的微泡。Hu等人(Am J.Nucl Med Mol Imaging，2013)报道了一种处理RF数据的帧间平均方法。US11/237221(Phillips等人)和US11/805，151(Guracar)公开了通过实时追踪造影剂的相对运动来识别靶结合微泡的方法。

例如US11/237221(Phillips等人)、US11/885723(Gaud等人)以及Dayton等人(2003IEEE超声研讨会)已经公开了基于其各自的回声的光谱含量来区分循环微泡与靶结合微泡的方法。

上述方法的关键困难在于，它们需要多个连续成像帧的空间共配准，这在组织运动存在的情况下可能是困难的。在大浓度循环微泡存在的情况下，基于过滤器的方法也可能对低浓度的靶结合微泡不敏感。

尽管对医学具有广泛的潜在益处，靶向微泡产品还没有被商业化用于临床使用。类似地，与靶向微泡一起使用的分析软件包还没有被商业化用于临床使用。

本发明包括一种用于可靠地量化各个时间点下感兴趣的区域(ROI)内造影信号的幅度的方法，称为动态缩放超声分子成像。使用特定的微泡造影剂组合物可以最有效地利用该方法。在一些实施方案中，该方法使用适当配制的微泡用于对疾病的靶向分子标志物的存在进行成像。本发明向用户提供了一种可靠的方法，通过该方法确定造影信号如何随时间变化，从而减少了现有技术中存在的不确定性。

在一些实施方案中，本发明的方法利用参照区域的概念。如本文所用，参照区域是指与患者内的成像位置相对应的图像区域，在该区域中瞬时造影信号代表了血液池内循环的造影材料的量。参照区域内造影信号随时间的变化率受可能特异于特定患者和成像条件的许多因素影响，诸如微泡剂量、施用途径、疾病状态(例如，诸如心率和泵浦效率等心脏状态)、通风状态(氧饱和度和补充氧气的使用)。这些变量可能会对成像数据的解释造成混淆。本申请中所讨论的参照区域的用途除了其用作动态缩放因素之外，还提供了用于在成像受试者和环境之间进行比较的基础。

如本发明的上下文中所用，参照区域还定义为其中微泡的累积可以忽略甚至没有发生微泡的累积的区域。因此，应当小心地选择参照区域以便确保其满足该标准。此外，微泡应当被配制成使得不表达成像靶标的区域内的不期望的累积最小化。

包含充满血液并经受循环流动的腔的感兴趣的区域广泛适合用作参照区域。示例性的参照区域是左室腔。在一些实施方案中，参照区域包括主动脉、腔静脉、股动脉、颈动脉、肾动脉、肾静脉等的腔。在其他实施方案中，参照区域是指表现出空间均匀微循环的任何血管化良好的组织，诸如远离病变或与不受病理影响的骨骼肌。在一些实施方案中，血管化差的组织(诸如脂肪组织)或表现出紊乱脉管系统的组织(诸如实体瘤)不用作参照区域。

在一些实施方案中，已知在没有疾病的情况下在其中累积微泡(造影剂)的组织(诸如脾和肝和先天免疫细胞高度集中的其他部位)不适合用作本发明上下文中的参照区域。

在本发明的上下文中，参照区域相对靶组织的取向是无关的。也就是说，尽管可以纯粹出于方便的原因而选择这样的参照区域，但是参照区域不必是靶组织的供养血管。

为了简单起见，优选在与靶组织相同的成像视场中获取参照区域。选择与靶组织相邻的参照区域提供了处理与成像环境、深度相关效应的相关变量的能力；然而，使用与靶区域相邻的参照区域不是必需的。例如，想到使用来自两个换能器或一个多维换能器的两个或更多个成对视场进行成像，其中一个对参照区域进行成像，另一个对远程靶组织进行成像。具体实施例9-14提供了与具体靶组织相关的参照区域的实例。

可以用单个数字代表参照区域内任何时刻的造影信号幅度，本文中称为瞬时参照强度I_参照(t)。瞬时参照造影信号幅度可以最简单地定义为参照区域内所有像素的平均强度(算术平均值)；其他数学表示形式诸如中位数、截断平均值或均方根(二次平均值)可用于定义I_参照(t)，只要它们能产生可再现的造影信号幅度的表示。

如以下所述，在本发明中使用参照区域使得能够鉴定独特的时变行为，当使用靶向微泡时，该行为有助于疾病诊断。

动态缩放

参照区域内的瞬时造影信号幅度可用于对相同时刻靶区域内的造影信号幅度进行缩放。该程序(本文称为动态缩放)产生有助于超声分子成像数据的可靠评估的意外行为。

本发明中教导的动态缩放概念可应用于超声图像或者以时间-强度曲线的形式图形化地应用。

首先一般性地描述，然后在实际实验的上下文中描述该方法的细节。

图3A图示了本发明的一般实践。活体患者的组织(靶组织)疑似患有疾病。期望使用超声分子成像来确定疾病是否存在，并且如果存在则识别其一个或多个位置。假设用于本实例的靶向微泡被配制使得在疾病存在的区域中发生特异性粘附(即，选择靶向构造体以便与患病区域内表达的合适分子靶标结合)并且在没有疾病的区域中发生较低粘附甚至基本上不发生粘附。

为了简单起见，假设待成像的靶组织包含两个子区域：一个实际上不存在疾病的区域(区域B)，以及一个实际上存在疾病的区域(区域C)。出于当前实例的目的，两个子区域不必是连续的。第三个感兴趣的区域(区域A)用作参照区域。假设区域A满足用作上文所讨论的参照区域的标准。注意靶组织和参照区域不必位于相同的成像视场内。然而，从每个区域获得的成像数据必须在时间上共配准。

图3B中的图像描绘了在施用靶向微泡之后来自三个区域中的每个区域的一系列简化造影超声图像。造影信号的幅度以0.01-4000(任意单位)刻度的灰度水平示出。在施用微泡之前(造影前)，所有区域中的造影信号一致较低。可以在每个区域中执行增益(gain)调整以在所有感兴趣的区域内产生相似水平的造影前信号，尽管这不是必需的。优选地设置增益使得造影前信号处于动态范围的低端，但不是零。

团注施用微泡剂后，参照区域中的造影信号幅度迅速增大。然后达到峰值，峰值之后由于微泡从血液池中清除(中期阶段)，造影信号逐渐减小。后期阶段(定义为循环微泡已经基本上完全从参照区域清除的点)的造影信号与造影前的信号基本上相同。

在两个靶向区域的早期阶段发现类似的洗入行为：造影信号迅速增大达到峰值。在图3B的实例中，参照区域(区域A)中造影信号幅度的峰值高于两个靶组织区域(区域B和C)中造影信号幅度的峰值，尽管这不是使用的动态缩放方法的必要要求。然后靶向区域中的造影信号在中期阶段衰减；该衰减主要是由于微泡从血液池中清除导致的。如以上所讨论的，造影信号衰减的速率取决于许多变量，并且可能因患者而异。

可以看出，靶向患病区域(区域C)内的造影信号幅度比非患病区域(区域B)或参照区域(区域A)内的造影信号幅度衰减得更慢。这是由于在患病区域内靶标表达的部位存在累积的微泡。这些微泡无法通过血液池清除机制从成像组织中移除。利用本领域认可的合适微泡在非患病区域未发现靶标，微泡自由地穿过该区域而不会累积。根据参照区域的定义，微泡不在参照区域内滞留。

随着成像研究从洗入峰进展到后期阶段，患病和非患病区域之间的造影信号幅度的差异变得更加显著。如先前所述的，由靶结合微泡的存在而产生的造影信号将由于微泡被物理力(诸如由于微泡壳内气体交换引起的放气)破坏而衰减。这种衰减比循环微泡从血液池中的清除更慢，尽管所有区域中的造影信号的幅度都随时间趋向造影前基线(非常后期阶段)。

图像中描绘的时变行为可以用所谓的″时间-强度曲线″(TIC)的形式说明，TIC中将给定区域内的造影强度或造影信号幅度绘制成时间的函数。图4A/B示出了非患病区域(图4A)和患病区域(图4B)的时间-强度曲线；参照区域覆盖在每个时间-强度曲线上(虚线)。如图3所示，指示造影剂洗入和洗出阶段的具体时间点标注在x轴上：t-1(造影前基线)、t0(施用造影剂)、t1(峰值信号)、t2(中期阶段的代表性时间点)、t4(后期阶段的代表性时间点)以及t5(非常后期)。注意，t5在此处定义为造影信号由于靶结合微泡而完全消除的时间。

每个区域的时间-强度曲线在洗入阶段显示出相似的行为：造影信号从施用造影剂时开始上升并累积至峰值造影信号幅度(t1)。然后信号幅度在t1与t3之间衰减。微泡从血液池的清除在t3时完成，并且在该时间点参照区域内的造影信号已恢复至基线。类似地，在该实例中，非患病区域内的造影信号在t4时达到造影前基线。然而，患病区域(图4B)内的造影信号尚未达到基线。随后该区域中的造影信号以比清除阶段期间(t1-t3)更低的速率衰减(t3-t5)。足够长的时间后，该区域内的造影信号也达到基线(t5)。

本发明包括使用参照区域内的瞬时造影信号对同一时间点感兴趣的靶向区域内的造影信号进行缩放。这可以最简单地通过将感兴趣的靶向区域内的造影信号幅度除以同一时间点的参照区域的造影信号幅度来实现。在图3所示的实例中，区域A用作参照区域，并且区域B和区域C是疑似存在疾病的靶向区域。

在图5A-F中描绘并进一步处理了对图4A-B的时间强度曲线示例应用动态缩放过程的相应结果。由于在非患病区域(区域B，图5A)内没有微泡累积的事实并且微泡在t1和t4之间从该区域清除，该区域的曲线随时间而减小。

感兴趣的患病区域(区域C，图5B)中的参照缩放造影信号幅度显示出完全不同的行为。缩放信号在t1和t4之间增大。

图5C和图5D注出了曲线的三个显著特征。第一，患病曲线与非患病曲线的两极差异是显而易见的。参照缩放信号在患病区域中增大，在非患病区域中减小。图5E和5F示出了参照缩放造影信号幅度的瞬时斜率，并且示出了非患病区域(图5E)的(略微)负或零斜率和患病区域(图5F)的正斜率。

第二，在参照区域的峰值信号与完全洗出之间(t1与t4之间)可以检测到两区域的差异。也就是说，动态缩放方法提供了可用于在宽的时间窗口(不仅是后期阶段)上确定感兴趣的患病与非患病区域中的造影信号差异的信息。

第三，在患病区域(例如，心肌)，参照区域的峰值信号(t1)与t1和t4之间任意时间点之间的缩放造影信号的平均斜率均为正。在非患病区域中，相同点之间的平均斜率(在本实例中)均小于零。图5G和5H绘制了t1与直至t4的各个时间点之间的平均斜率。可以看出，只要所述范围从t1开始，则非患病区域的平均斜率(图5G)为负，而与计算平均值的时间段无关。患病区域(图5H)则相反，其中平均斜率处处为正。

这些特性提供了一种用于确定在任何给定的感兴趣的靶向区域中观察到的造影是由于靶结合微泡而产生还是由于相反的循环微泡而产生的可靠、简单的方法。

在本方法的一个实施方案中，在参照区域内的峰值信号与清除之间的几个时间点计算一个或多个靶区域内参照缩放造影信号幅度。然后对每个区域绘制这些值，并评估曲线的形状，以确定每个区域的信号是来自靶结合微泡还是来自非结合微泡。在如此绘制的曲线呈上升趋势的情况下，得出结论是存在靶结合微泡。在如此绘制的曲线呈下降趋势或主要呈水平的情况下，得出结论是不存在靶结合微泡。在一些实施方案中，在该方法中评估两个、三个、四个、五个或六个或更多个时间点。在某些实施方案中，在该方法中评估五个时间点。

在一些实施方案中，该方法提供：在峰值信号和随后的感兴趣的时间点计算参照缩放造影信号幅度，并且计算两点之间的平均斜率。在差值大于零的情况下，得出结论是观察到的信号是由于靶结合微泡产生的，并由此得出结论存在所讨论的疾病。在所得差值为零或负数的情况下，得出结论在感兴趣的区域内不存在靶向微泡摄取。

在达到峰值信号之后，可以在多于一个时间点重复该过程，以便增加诊断结论的置信度。例如，可以在峰值信号之后1、3和5分钟计算差值并将结果平均。

本文所述的动态缩放方法可以以半自动或全自动的方式执行。该过程也可以在超声检查期间使用在超声扫描仪上运行的软件执行，或者也可以在之后使用在计算机工作站上运行的软件执行。

从图5G和5H应该清楚地看出，假设在任意点与随后点处于参照区域的峰值信号与微泡从参照区域完全清除之间，则两点之间的参照缩放造影信号幅度的差值对于患病组织为正并且对于非患病组织为负(或零)。因此，本方法尤其可用于确定中期阶段靶向微泡的存在(或不存在)。

假设成像时间点保持一致，则该动态缩放方法还适用于区分靶向微泡累积的不同幅度。例如，在相同的成像窗口，平均参照缩放斜率为4将代表比参照缩放斜率为2更大程度的靶向微泡累积。因此，该方法不仅可用于疾病检测(通过确定靶向微泡存在还是不存在)，还可用于评估疾病的严重程度。在一些情况下，在纵向跟踪一个或一组患者对治疗的反应时，或者在治疗前根据疾病严重程度对患者进行分层时，该属性是有用的。

参照缩放图像的形成

本发明还包括一种用于创建图像的方法，该图像使用户能够有效地确定靶结合微泡的存在。这可以通过对图像应用动态缩放的概念来实现。在一些实施方案中，这是在单个像素水平或像素组水平上完成的。

参照缩放图像的形成可用于评估靶向微泡累积的空间关系和变异性。例如，当认为感兴趣的靶向区域内靶向微泡信号的异质性传达重要信息时，这可能会有用。此外，参照缩放图像的形成可有助于辅助定量分析(时间-强度曲线和平均斜率)的解释。

该参照缩放造影图像的概念将首先在图3的简化二维图像集上进行演示。图6中对该集的每个图像进行再处理，使得新像素值代表参照缩放造影信号幅度。显示了两个靶区域的重新缩放图像，括号中的数字代表缩放后的造影信号幅度。可以看出，非患病区域(区域B)的缩放信号较低并且在峰值信号与晚期阶段之间减小。与之相反，在同一时间段内患病区域(区域A)增加。非患病与患病区域之间的差异在后期阶段最大，尽管该差异在峰值信号与后期阶段之间的所有时间是明显的。

下面针对二维图像的时间序列描述生成参照缩放图像的程序。此处，像素通过x和y空间维度以及一个时间维度上的坐标来识别。令I_a，b(t)代表在时间t时位于位置a，b处的像素的造影信号幅度。此外，令I参照(t)在时间t时参照区域的造影信号幅度。对于成像视场内的每个像素，参照缩放造影信号幅度I*_a，b(t)计算为

I*_a，b(t)＝I_a，b(t)/I_参照(t)

通过对图像中的每个像素用I*_a，b(t)代替I_a，b(t)来创建缩放图像。可以在参照区域的峰值信号与靶区域内的造影信号完全损耗之间的一个或每个瞬间t进行此过程。

缩放图像可用于以可再现的独立于可能使解释混乱的患者特异性变量的方式代表造影信号幅度。因此，其可用于比较例如评估治疗前后患者的反应。它还可用于改善靶向微泡累积(其幅度可能较低)的可视化。在该背景下，缩放图像可以方便地表现为时间序列(如图6所示)。发生靶向微泡累积的图像区域呈现出随时间增大的信号(I*_a，b(t))，而不发生靶向微泡累积的区域呈现出减小的信号。

在本发明中需要使用与I_a，b(t)相同时刻(例如，在相同的成像帧内)计算的I_参照(t)执行缩放程序。

在实践中，仅在一个或多个感兴趣的区域内而不是在整个成像视场上应用参照缩放可能是方便的。例如，仅对参照区域和与疑似病变相对应的感兴趣的区域应用缩放操作。缩放图像可以方便地呈现为造影强度图像或亮度(B模式)图像上的覆盖图。可以以颜色图的方式呈现覆盖图，旨在使突出的细节更为明显。例如，可以选择颜色映射功能以便呈现不同颜色间的小差异，以助于在低靶标密度的情况下可视化微泡滞留率的差异。

可以对缩放图像进行附加处理，以减少不相关信息的显著性或突出图像中的重要特征。例如，可以在空间域内对图像进行低通滤波。例如，可以通过常数乘法器(例如，增益因子)对图像进行缩放。例如，可以对图像进行归一化以便利用整个范围的像素显示值。

在实践中，一些实施方案中，峰值信号(t1)发生在团注施用微泡造影剂后1秒至30秒之间。在实践中，在一些实施方案中，完全的造影消除(t5)发生在3分钟至60分钟之间。

在实践中，在给定的图像数据集中仅在某些时间点而不是每一帧形成缩放图像可能是方便的。例如，可以在10秒、1分钟和5分钟处形成代表性缩放图像，并在各个靶区域中观察参照缩放造影信号幅度的趋势，以便评估靶向微泡滞留的存在。

应该清楚的是，可以利用相同的程序对三维图像执行动态缩放程序。在该情况下，要缩放的单元是由空间三坐标(a，b，c)和时间维度(t)定义的体素。

图19示出了动态缩放、时变方式的程序的示例性流程图，该程序使用参照缩放图像或幅度来确定靶组织中感兴趣的分子标志物的水平。

在一些实施方案中，动态缩放、时变方式的程序包括随时间捕获靶组织的一系列图像，在图像内选择具有靶向造影剂信号的感兴趣的区域，在图像内选择不具有靶向造影剂信号但具有循环造影剂信号的参照区域，在每个时间点使用参照区域的信号强度对来自靶向区域的信号幅度进行缩放，在不同的时间点创建靶组织的参照缩放图像或幅度，以及使用参照缩放图像或幅度来确定靶组织中感兴趣的分子标志物的水平。

在某些实施方案中，以线性化声功率为单位执行动态缩放、时变方式的程序。在某些实施方案中，以线性化声幅为单位执行该程序。在某些实施方案中，动态缩放、时变方式的程序还包括对动态缩放图像或从动态缩放图像的变化率导出的变化率图像进行颜色编码。在某些实施方案中，动态缩放、时变方式的程序还包括通过低通滤波对动态缩放图像进行平滑处理。在某些实施方案中，动态缩放、时变方式的程序还包括对动态缩放图像进行非线性压缩。在某些实施方案中，在参照区域的峰值信号与清除之间的几个时间点计算一个或多个靶区域内参照缩放信号幅度。在某些实施方案中，在峰值信号和随后的感兴趣时间点计算参照缩放信号幅度，并且计算两点之间的平均斜率。

变化率图像的形成

本发明还包括一种用于形成第二类缩放图像(本文中称为变化率图像)的方法。在该情况下，每个像素的值代表缩放造影信号幅度在限定时间段内的变化率。

变化率图像传递参照缩放造影信号的变化率信息，并且在一些应用中可能比一系列缩放图像更方便。例如，当评估多个患者之间的相对差异时，比较每个患者的单个变化率图像可能优于比较每个患者的一系列缩放图像。或者，在一些应用中，与参照缩放图像相比，变化率图像可能是用于传达所需信息的更敏感参数。

图7描绘了图3所示的成像数据集的变化率图像。此处，以蓝色和红色阴影对图像进行颜色编码，分别代表负比率和正比率。可以看出，非患病区域(区域B)随时间逐渐变得更蓝，表明参照缩放造影信号幅度的渐增负值变化率。与之相反，患病区域(区域C)随时间逐渐变得更红。变化率缩放图像(特别是在后期阶段拍摄的图像)呈现了用于描绘给定空间区域内是否存在靶向微泡累积的简单且方便的方法。

在时间t＝t2时的变化率I**_a，b(t)计算为：

I**_a，b(t)＝[I*_a，b(t2)-I*_a，b(t1)]/[t2-t1]

I*_a，b(t)是时间t时像素(a，b)的缩放造影信号幅度；t1是参照区域达到峰值信号的时间；并且t2是t1至造影从感兴趣的区域消除之间的任意时间。

变化率图像可用于识别缩放造影信号幅度随时间增大的图像区域(指示靶结合微泡信号的区域)。这在低靶标表达的情况下特别有用，在该情况下由于靶结合微泡产生的造影信号幅度可能较小。

在缩放图像的上下文中讨论的注意事项也适用于变化率图像。例如，变化率图像可以方便地显示为覆盖图，其中变化率的正值、零值和负值分别以不同的颜料映射(例如，正值为红色、零值为黑色并且负值为蓝色)。

在实践中，可以方便地形成t1与t3之间任意两点之间的参数变化率图像，其中t1定义为参照区域内峰值信号的时间，并且t3是参照区域内的造影信号幅度恢复至造影前基线的时间。

在一个实施方案中，使用从参照区域的峰值信号与完全洗出之间任意两时间点获得的图像形成变化率图像。在更优选的实施方案中，使用在参照区域的峰值信号和参照区域的完全洗出之前的任意随后时间点获得的图像形成变化率图像。

实验

在犬短暂心肌缺血模型中评估了动态缩放方法改善靶向微泡可视化增强的实用性。利用冠状动脉左前降支的暂时结扎来模拟短期缺血，然后完全再灌注心肌。这种损伤会诱导整个风险区域内CD62的快速表达，表明其可用作对急性缺血后损伤进行成像的分子成像靶标。已知CD62相对于其他细胞粘附分子以低拷贝数表达(McEver，2001)，因此本实验代表低成像靶标密度的一个实例。实施例7提供了本实验的附加细节。

按照实施例6的方法制备靶向P-选择素的微泡。与P-选择素结合的IgG融合蛋白用作靶向配体，并在体外证实了其对人、小鼠和犬P-选择素的功能。

麻醉动物，然后通过结扎冠状动脉左前降支近端进行开胸缺血。缺血10分钟后，松开结扎并使心肌再灌注。再灌注30分钟和90分钟之后使用动态缩放方法进行分子成像。作为阴性对照，在缺血诱导前也对开胸动物进行成像。在一些动物中，施用以无关IgG融合蛋白作为靶向配体配制的阴性对照微泡。

微泡通过静脉团注施用。以1分钟的间隔在低MI下进行成像。获取左心室的短轴图像，同时在整个5分钟的成像期间保持相同的视场。

对成像数据进行离线分析。绘制包括前心肌(包含通过灌注成像划定的风险区域)和LV腔室(参照区域)的ROI。以声幅或声功率的线性化单位计算每个ROI内的平均造影信号幅度。

成像完成之后，重新拉紧LAD缝合线，并通过心脏穿刺施用酞菁蓝溶液以便划定风险区域。然后通过过量麻醉剂处死动物，并且将心脏切除、清洗并切成约1厘米的切片以用于拍照。

在缺血后和健康对照动物中，在施用微泡后的早期阶段观察到类似的造影增强模式。造影增强在施用微泡10秒内在LV腔室内是可见的，随后在几次心跳内在心肌内被检测到(图8A、8B)。在3和5分钟时，相对于健康对照，在缺血后动物中观察到稍微更大的心肌内造影增强。在5分钟时，造影信号在LV腔室内是可见的(图8C)。

时间-强度分析揭示，缺血后动物在给药后3和5分钟时(图8D)呈现持续水平的造影增强，而健康动物中造影信号幅度在3分钟时恢复至接近造影前基线。

利用LV腔室作为参照区域以及心肌作为靶区域，对图像的时间序列执行本发明的动态缩放程序。如图9A/B所示，在缺血后动物的成像期间(施用微泡后1-5分钟)观察到参照缩放信号的增大。在对照动物中，参照缩放信号在相同的时间段略微下降。当以声功率(图9A)和声幅(图9B)的线性化单位进行分析时发现相似的结果。

在另外5只动物中重复该实验。发现在施用造影剂后1至5分钟之间，平均参照缩放信号在缺血后心脏中一致增大，在健康心脏中一致减小(图10A)。计算1至3分钟之间(图10B)和1至5分钟之间(图10C)的参照缩放信号的平均斜率。在这两种情况下，缺血后心肌的斜率均为正值并且非患病心肌的斜率均为负值。

线性化

在优选的实施方案中，对线性化造影信号而不是显示在视频监测器上的压缩造影强度执行动态缩放程序。如此处所定义的，利用线性化信号维持了局部微泡浓度与造影信号幅度之间的比例关系。

造影强度图像的线性化可以通过反转压缩函数以及在造影强度图像的形成中应用的任何其他后处理来实现。

在一些实施方案中，提供了一种根据本文所述用于量化感兴趣的区域内造影信号幅度的方法来检测受试者疾病的方法，包括对受试者的视场进行1-10分钟的成像并将该一系列图像存储在可读计算机介质中；对所获得的图像时间序列执行动态缩放、时变方式的程序；将缩放图像序列或缩放信号图(诸如时间-强度曲线)呈现给用户；以及基于缩放信号的变化率确定疾病。在一些实施方案中，视场包括心脏、肾、肝、乳房、肿瘤、前列腺等。在一些实施方案中，视场包括心脏。在某些实施方案中，LV腔室是参照区域并且心肌是靶区域。在某些实施方案中，对线性化造影信号执行动态缩放程序。

如上所述，图11和12描绘了在缺血-再灌注后90分钟在活体犬中进行的成像研究。通过离体(ex vivo)染色测定缺血区域，描绘损伤位置(以及靶向微泡累积的预期位置)的代表性短轴切片示于图11C。该情况下的靶标是CD62，其在检查条件下以相对较低的拷贝数表达。

图11中的顶行(11A)描绘了在施用CD62靶向微泡(实施例6提供了靶向微泡的细节)之前以及施用CD62靶向微泡之后的三个时间点的代表性的收缩末期短轴造影强度图像的时间序列。该图像集的像素值代表经压缩和后处理后接收到的回声，并且是利用现有超声成像实践显示给用户的信号。可以看出，心肌和LV腔室中的造影信号随时间减小，并且无法确定观察到的信号是由于靶结合微泡还是循环微泡产生的。

图11B描绘了信号线性化之后的相同图像。该图像中的像素值代表如本发明中所定义的造影信号幅度，并且与局部微泡浓度成比例。在此图像集中可以明显看出心肌内和LV腔内信号之间的幅度差异较大。由于该区域中的信号较低，线性化图像不能使用户评估心肌内靶结合微泡的存在。因此，尽管线性化图像使得能够将局部微泡浓度直接可视化，但是它不适用于在此环境下识别靶结合微泡的存在。

图11D描绘了对线性化图像进行动态缩放之后的相同图像。在施用微泡后1分钟时，LV腔室内识别到信号，但心肌内的信号较低甚至基本上没有。在3分钟时，患病区域内的前心肌内识别到较小信号，5分钟时观察到显著信号。该系列图像呈现出缩放造影信号的递增趋势，指示靶向微泡的存在。动态缩放的图像序列提供了用于识别由于靶结合微泡产生的造影信号存在的可靠和相对简单的实现方式。

使用阴性对照微泡(例如，使用不能使微泡滞留到CD62的靶向配体配制)在相同的动物中重复该实验。图12A中显示的造影强度图像与图11A中的造影强度图像的相似之处在于LV和心肌内的信号随时间减小。

图12C描绘了经线性化和动态缩放之后的相同图像序列。在所有的时间点，LV内均识别到信号。在心肌内观察到可忽略的信号，并且在任何区域都未观察到时间依赖性的增大。动态缩放的表示使得能够可靠地确定靶结合微泡不存在。

7.成像条件

本发明使用非破坏性成像技术。非破坏性成像的特征在于，由于超声波束对微泡的破坏而导致造影信号的变化为10％或更小。

根据本发明的实践，参照区域内的信号在所有时间点都是非零的。这最方便地通过将超声扫描仪上的增益设置在使得在造影前图像中存在的噪声处于动态范围的低端的水平来实现。优选地设置增益，使得参照区域内的造影前的信号幅度在全部的动态范围的0.01％和5％之间。

在一些实施方案中，本发明提供了时间序列中的每个图像独立于先前的图像。这是通过放弃时间过滤(例如持久性)来实现的。例如，在US12/084933(Frinking等人)中公开了时间过滤方法；这些方法不适合与本发明一起使用。

在一些实施方案中，本发明提供了一致成像视场的维持。这对于参数化图像的形成非常重要。至少需要两个一致的视场，第一视场优选地在峰值信号处或在峰值信号之后不久，第二视场在造影剂从参照区域清除时或在造影剂从参照区域清除之前不久。在优选的实施方案中，在每个时间点获取多个图像，并选择最佳对齐帧。

在一些实施方案中，本发明提供在造影图像中很少甚至基本上没有像素是饱和的。在优选的实施方案中，在感兴趣的区域或参照区域内少于5％的像素是饱和的。在更优选的实施方案中，在所述位置中少于1％的像素是饱和的。在最优选的实施方案中，在所述位置中没有像素是饱和的。这优选地通过利用如本发明中所讨论的那样配制的微泡并遵循用于设置超声系统增益的标准实践来实现。

在一些实施方案中，本发明提供在没有靶向分子的情况下，微泡发生较低的累积甚至基本上不发生累积(即，非特异性结合低)。在优选的实施方案中，所有粘附微泡的少于5％被非特异性机制保留。在更优选的实施方案中，所有粘附微泡的少于1％被非特异性地保留。这优选地通过利用如本发明中所讨论的那样配制的微泡来实现。

获取超声图像的速率(帧率)与本发明的应用有关。不需要高的帧率(在每秒10、30或更高帧数的范围内)，以便使用本发明检测靶结合微泡的存在；事实上，当使用如以下第8节所述配制的微泡时，由于微泡破坏的可能性，高帧率不是优选的。在本发明的上下文中，期望小于每秒10帧的帧率。

在一些情况下，可能需要设置帧率以促进生理触发(例如，当对心脏进行成像时对ECG进行门控)。在一些情况下，可以将帧率设置为每分钟获取一帧(0.016Hz)。在一些情况下，为了平均的目的，在1分钟的间隔获取两个、三个或五个图像可能是方便的。

优选地，使用对微泡造影剂具有高灵敏度并且对组织信号具有高排斥性的造影特异性成像模式来获取图像。示例性的成像模式包括对比脉冲序列和能量反向脉冲，两者均可在低机械指数(对于微泡呈非破坏性)下操作。

8.造影剂(例如微泡)制剂注意事项

本发明的动态缩放分子成像方法最有利地用配制为表现某些特定特性的微泡来实践。微泡尺寸分布具有高度相关性，特别是大微泡的存在。此外，微泡的药效学是重要的，必须最大限度地避免非特异性积累。可以选择微泡组合物，以使微泡产物表现出用于动态缩放分子成像的期望性质。基于本发明对本文所述方法的实践，本领域技术人员将容易想到任何合适的造影剂。

例如，该方法需要在超声成像中获得参照区域内微泡浓度的准确表示。此外，这应当使用非破坏性成像来完成，优选地在低机械指数下进行。超声穿透组织的能力可能在降低的机械指数下受到限制，从而阻止深层组织的可视化。微泡(无论是循环微泡还是靶结合微泡)对深层结构的遮蔽是不期望的。在一些实施方案中，这在心脏成像的情况下尤其相关，其中LV腔室中的高浓度循环微泡可能有效地遮蔽下壁。已经发现，可以通过将微泡产品配制成具有较小的直径来改善该问题。在一些实施方案中，建议将平均直径按数值计为0.1至2.0um、0.2至2.0um、0.3至2.0um、0.4至2.0um、0.5至2.0um、0.6至2.0um或0.7至2.0um的微泡用于动态缩放方法。此外，配方中大微泡和小微泡的浓度应当较低。在优选的实施方案中，直径大于10um的微泡的数量浓度小于1％。在更优选的实施方案中，直径大于8um的微泡的数量浓度小于1％。在最优选的实施方案中，直径大于5um的微泡的数量浓度小于1％。

由三个组分组成的微泡壳对于实现用于本发明所需的尺寸特性是必需的。第一组分是壳形成表面活性剂，其用于在微泡的气芯周围产生包封屏障。第二组分是第二表面活性剂，它的存在用于调节微泡尺寸。第三组分是靶向构造体，其用于将靶向配体固定在微泡壳的外表面。微泡组分中的每一个也可以调节微泡的药代动力学行为。缺少这三种壳形成组分中的任何一种的微泡均不适合用于本发明的情况中。图13图示了适合用于本发明的代表性的三个壳组分的微泡。在一些实施方案中，所述靶向造影剂是包含壳形成表面活性剂、第二表面活性剂和靶向构造体的微泡。

壳形成表面活性剂可以是能够使包封的气体稳定并提供足够的柔韧性以在受到低MI超声刺激时允许微泡进行非破坏性振荡的任何两亲性、生物相容性的物质。在实践中，一些二酰基磷脂提供这些特性。具体地，具有饱和的二酰基尾的长度在16至20个碳之间的磷脂酰胆碱特别有用。

由蛋白质或合成聚合物组成的壳形成表面活性剂往往提供坚硬的外壳，因此在本发明的上下文中是不需要的。类似地，具有长酰基链尾(特别是大于20个)的磷脂也不期望用于本发明。

在本发明的上下文中，不优选已知能促进非特异性微泡滞留至免疫细胞的壳形成表面活性剂，诸如磷脂酰丝氨酸(phosphatidyleserine)。

优选不带净电荷的壳形成表面活性剂。磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺，特别是二硬脂酰磷脂酰胆碱(disteroylphosphatidylcholine)在该方面是有用的。带电磷脂和脂肪酸不适合用作本发明上下文中的壳形成脂质。不适合用于本发明的示例性材料包括1，2-二油酰基-3-三甲胺丙烷(1，2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，DOTAP)、2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸

(2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphserine，DPPS)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-rac-甘油)

(1，2-distearoyl-sn-glycero-3-phospho-(1’-rac-glycerol)，DSPG)和1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸盐(1，2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphate，DSPA)。

第二表面活性剂的存在用于优选地稳定在本发明的上下文中期望的小直径微泡。能够牢固地锚定在微泡壳中并具有亲水性聚合物基团的两亲性物质适合作为第二表面活性剂。头基接枝的PEG脂质表现出这些性质，并且在该方面是有用的。具体地，优选带有平均分子量为500至5000的头基接枝的PEG的二酰基饱和的磷脂酰乙醇胺(长度为16至20个碳)。不用第二表面活性剂配制的微泡在本发明的上下文中是不期望的。

锚定有单链脂肪酸的第二表面活性剂(诸如PEG的脂肪酸酯(PEG40硬脂酸酯))弱锚定在微泡壳中，因此不适合用于本发明。

适合用于本发明的靶向构造体包括用于插入脂质壳的疏水性锚、用作配体与微泡之间的间隔物的亲水性部分以及用于使微泡结合至预定分子靶标的靶向配体。可以在合成微泡时将靶向构造体掺入壳中，或者可以在制备之后将靶向构造体插入完整的微泡中。

优选其中亲水性部分包含柔性高分子链的靶向构造体。在优选的实施方案中，聚合物链是聚乙二醇(PEG)。在一个实施方案中，PEG的平均分子量在500-5,000之间。在更优选的实施方案中，PEG的平均分子量是2,000。

适合用于靶向构造体的锚的疏水性部分的实例包括有支链和无支链的烷基链、环状化合物、芳香族残基以及稠环芳香体系和非芳香环体系。在一些情况下，疏水性部分将由类固醇(诸如胆固醇)或相关化合物组成。优选的物质包括脂质、类固醇和疏水性聚氨基酸。在最优选的实施方案中，锚是具有饱和二酰基尾的长度为16至20个碳原子的磷脂酰乙醇胺。

适合用于本发明的靶向配体是能够将微泡牢固且特异性地滞留至成像受试者中表达预定分子靶标的位点的生物或合成物质。许多生物分子(包括抗体、糖复合物、肽、融合重组蛋白、碳水化合物、核酸和小分子)广泛地适合用作本发明上下文中的靶向配体。在一些实施方案中，可能期望合成具有适于与靶向构造体的亲水性间隔物缀合的部分的靶向配体。例如，重组蛋白可以用末端半胱氨酸表达。在一些实施方案中，可能期望利用化学交联剂将靶向配体缀合至亲水性间隔物。

微泡从血管腔隙外渗(extravisation)可能导致不期望的非特异性滞留，因此在本发明的上下文中是不期望的。应当小心地控制微泡尺寸分布的下限，以减少微泡外渗的可能性。在优选的实施方案中，少于10％的回声微泡的直径小于0.7um。

可以改变微泡壳的组成以实现任何特定应用所期望的微泡尺寸、药代动力学和粘附性质。如上文所讨论的，本发明期望的是平均直径在0.7至2.0之间，按数量计少于1％的颗粒的直径大于5um并且少于10％的回声颗粒的直径小于0.7um的微泡。可以通过以下注意事项来配制这样的微泡。

靶向构造体的密度(按摩尔数计)应在0.1至5％之间。锚分子的最佳密度与靶向配体对分子靶标的亲和性有关。在配体亲和性低的情况下，优选密度处于范围高端的靶向构造体。在配体亲和性高的情况下，可以接受低密度的靶向构造体。

第二表面活性剂的密度(按摩尔数计)应在5至25％之间。第二表面活性剂的最佳密度与亲水性部分的尺寸有关。一般而言，使用具有较大亲水性部分(例如，DSPE-mPEG-5000)的第二表面活性剂，在所提供范围的低端上的密度可能适于产生所期望的尺寸范围内的微泡。在第二表面活性剂具有较小亲水性部分(例如，DSPE-mPEG-500)的情况下，可能需要更高的密度。

壳形成表面活性剂的密度(按摩尔数计)不应小于75％。

在某些实施方案中，微泡气芯由生理温度下呈气态的全氟化碳组成。在特别优选的实施方案中，C3F8用作气芯。

在一些实施方案中，提供了一种用于通过分析以动态缩放方式获取的超声分子图像的时间序列来量化感兴趣的区域(ROI)内造影信号的幅度的方法，所述方法包括向受试者的靶组织施用靶向造影剂(诸如微泡)以对疾病的靶向分子标志物的存在进行成像；以动态、时变的方式选择代表血液池内循环的造影剂量的参照区域；对包含所选参照区域的所述靶组织进行成像；通过所述动态缩放、时变方式的程序定量地确定疾病区域的幅度，其中所述靶向造影剂被配置用于与患病区域内表达的疾病的所述分子标志物结合。在某些实施方案中，参照区域定义为其中微泡的累积可以忽略甚至没有的区域。在一些实施方案中，所述靶向造影剂是平均直径按数值计为0.1至2.0um、0.2至2.0um、0.3至2.0um、0.4至2.0um、0.5至2.0um、0.6至2.0um或0.7至2.0um的微泡。在一些实施方案中，所述靶向造影剂是平均直径按数值计为0.7至2.0um的微泡。在一些实施方案中，所述靶向造影剂是微泡。在某些实施方案中，所述靶向造影剂是选自表2中的靶向微泡等的微泡。

在一些实施方案中，提供了动态缩放、时变方式的程序，包括a.提供描绘单个视场的图像的时间序列，b.选择一个或多个感兴趣的区域和一个或多个相应的参照区域，c.形成参照缩放图像和/或参照缩放信号幅度，其中在时间序列中的相同时刻获得感兴趣的区域和参照区域，d.对时间序列中的两个或更多个图像执行(c)的缩放操作，以定量地确定参照缩放信号幅度的时间-强度关系；其中参照缩放信号在患病区域中增大并且在非患病区域中减小。在某些实施方案中，获得参照区域和感兴趣的区域的分别的时间同步的图像序列。在某些实施方案中，动态缩放、时变方式的程序包括将动态缩放图像内每个像素的值按常数缩放。在某些实施方案中，以线性化声功率为单位执行动态缩放、时变方式的程序。在某些实施方案中，以线性化声幅为单位执行该程序。在某些实施方案中，动态缩放、时变方式的程序还包括对动态缩放图像或从动态缩放图像的变化率导出的变化率图像进行颜色编码。在某些实施方案中，动态缩放、时变方式的程序还包括通过低通滤波对动态缩放图像进行平滑处理。在某些实施方案中，动态缩放、时变方式的程序还包括对动态缩放图像进行非线性压缩。在某些实施方案中，在参照区域的峰值信号与清除之间的几个时间点计算一个或多个靶区域内参照缩放造影信号幅度。在某些实施方案中，在峰值信号和随后的感兴趣时间点计算参照缩放造影信号幅度，并且计算两点之间的平均斜率。

定义

″微泡″是指经生物相容性壳稳定的气体包封球，其适合用作超声造影剂。这样的试剂在本领域已知有许多名称，包括微球、纳米泡和微囊。术语微泡的使用是指其中包封的气态组分的存在负责产生超声造影信号的任何此类颗粒。

″靶向配体″或″配体″是指可以促进本发明的组合物在体内或体外靶向到组织、细胞、受体和/或标志物基团的任何材料或物质。如本文所用的术语″靶″和″靶向″是指靶向配体和包含靶向配体的组合物与组织、细胞和/或受体结合或者指向组织、细胞和/或受体的能力。靶向配体可以是合成、半合成或天然存在的。可用作靶向配体的材料或物质包括例如蛋白质(包括抗体、糖蛋白和凝集素)、肽、多肽、糖类(包括单糖和多糖)、维生素、类固醇、类固醇类似物、激素、辅因子、生物活性剂、遗传物质(核苷、核苷酸和多核苷酸)。

″成像靶标″或″靶标受体″或″分子靶标″是指细胞内或细胞表面上与疾病的存在与否或其他医学上重要的病况相关的分子结构。在本发明的上下文中，微泡造影剂可接近成像靶标。成像靶标的示例性类别包括肽类激素的细胞表面受体、神经递质、抗原、补体片段、类固醇激素的免疫球蛋白和细胞质受体以及激酶受体。

″动物模型″定义为用于实验研究的非人类生物。动物模型包括但不限于小鼠、大鼠、青蛙、斑马鱼、非人灵长类动物、马、犬、猫、猪和昆虫。

″非破坏性成像″定义为旨在使微泡造影剂可视化而不会导致所述造影剂破坏的超声成像。这通常通过使用低(小于约0.30)机械指数来实现。Porter等人(2014)概述了破坏性与非破坏性成像技术之间的区别。示例性的非破坏性造影成像方法是能量反向脉冲和对比脉冲序列(CPS)。

″感兴趣的区域(ROI)″：将通过成像方法评估是否存在疾病的超声图像内的空间限定区域。实例是心肌、肾皮质或动脉斑块。

″靶组织″定义为疑似存在疾病并且打算使用超声分子成像来评估疾病存在和位置范围的解剖区域。靶组织可以包括疾病(患病组织)区域和正常组织区域。

″患病组织″或″患病区域″定义为存在感兴趣的疾病并且其中成像靶标的靶标密度比非患病区域中更大的生物组织或器官。

″正常组织″或″非患病组织″定义为不存在感兴趣的疾病并且其中成像靶标不存在或者靶标密度比患病区域中显著更低的生物组织或器官。

″参照区域″定义为其中已知微泡不会通过特异性或非特异性机制发生任何显著程度上的滞留的空间限定区域。参照区域在空间上与靶组织不同。

″缩放图像″或″参照缩放图像″定义为其中所显示的像素值代表相同时间点造影信号幅度与合适参照区域的造影信号幅度的商的超声图像。缩放图像可以乘以常数值或者经受其他处理步骤(例如，低通空间滤波)。

″变化率图像″定义为其中所显示的像素值代表缩放造影信号幅度在规定时间段的变化率的超声图像。变化率图像可以乘以常数值或者经受其他处理步骤(例如，低通空间滤波)。

″靶标密度″或″靶标表达水平″定义为施用的超声造影剂可接近的靶分子的有效浓度。

″造影信号幅度″定义为从感兴趣的区域内的造影剂得出的回声信号的幅度。虽然不希望受任何特定操作理论的约束，造影信号幅度可以以回声功率、回声振幅、均方根振幅(RMS squared amplitude)或可能与在现有成像条件下感兴趣的区域内的造影剂浓度成正比的任何其他量来表示。

″造影强度″或″视频强度″定义为经处理以显示在视频显示器上之后从感兴趣的区域内的造影剂得出的回声信号的幅度。所述处理可以包括动态范围压缩、颜色映射以及使得图像在诊断上有用的其他后处理调整。

如本文关于制剂、组合物或成分所用的术语″可接受的″是指对所治疗的受试者的总体健康没有持续的有害影响。

如本文所用的术语″载体″是指促进化合物掺入细胞或组织的相对无毒的化合物或试剂。

术语″稀释剂″是指用于在递送前稀释感兴趣的化合物的化合物。稀释剂也可用于稳定化合物，因为它们可以提供更稳定的环境。溶解在缓冲溶液中的盐(缓冲溶液也可以控制pH值或维持pH值)在本领域用作稀释剂，包括但不限于磷酸盐缓冲盐溶液。

术语″受试者″或″患者″包括哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于哺乳动物纲的任何成员：人类、非人灵长类(诸如黑猩猩)以及其他猿类和猴种；农场动物，诸如牛、马、绵羊、山羊、猪)；家养动物，诸如兔子、狗和猫；实验室动物，诸如大鼠、小鼠和豚鼠等。在一个实施方案中，哺乳动物是人类。

在某些实施方案中，本发明的水性悬浮液可以包括一种或多种聚合物作为悬浮剂。聚合物包括水溶性聚合物(诸如纤维素类聚合物，例如羟丙基甲基纤维素)和水不溶性聚合物(诸如交联的含羧基的聚合物)。本文所述的某些药物组合物包括粘膜粘附性聚合物，选自例如羧甲基纤维素、卡波姆(丙烯酸聚合物)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚丙烯酰胺、聚卡波非、丙烯酸/丙烯酸丁酯共聚物、海藻酸钠和葡聚糖。

本文所述的所有各种实施例或选项可以以任何和所有变型进行组合。以下实施例仅用于说明本发明，而不以任何方式解释为限制本发明。

实施例

实施例1.脂质乳剂的制备

如下制备包含微泡壳形成组分的乳剂。将50mL的0.9％注射级NaCl(生理盐水；Baxter)置于去热原玻璃小瓶中并水浴加热至70摄氏度。向生理盐水加入100mg的二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、65mg的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-PEG(2000)(DSPE-mPEG(2000))和5mg的DSPE-PEG(2000)-PDP(均为粉末形式且购自Avanti Polar Lipids)。通过低功率超声处理20分钟将脂质溶解(使用CP-505超声仪，Cole-Parmer，9W)。在超声处理过程期间，观察到分散体从不透明过渡到半透明，不存在可见的固体。

在形成微泡之前，将乳剂在无空气条件下存储最高达6小时。

对于本领域技术人员显而易见的是，其他乳化方法将适合于本方法的上下文。

对于本领域技术人员显而易见的是，可以根据上文第8节中讨论的注意事项修改上述方法以使得能够掺入多种磷脂和PEG-脂质物种。

实施例2.示例性微泡的超声制备

由实施例1的乳剂制备包含被磷脂壳包封的八氟丙烷(C3F8)气芯的微泡。首先将50毫升的乳剂加热至70℃，然后通过高功率超声处理(以40W超声处理30s)形成微泡，同时喷注C3F8气体(99％纯；Fluoromed)。此程序导致形成十氟丁烷的脂质稳定化微泡的多分散、右偏分散体，浓度约为4E9/ml。然后将所得微泡分散体冷却至室温。通过在C3F8气体顶空的100mL密封玻璃小瓶中以1000XG、15℃(Allegra 6R斗式离心机；Beckman-Coulter)对分散体进行10分钟的离心来除去未掺入微泡的壳形成材料，并用细针收集下清液(infranatant)。然后将微泡以2-4E9/mL的浓度重新悬浮在含有300g/L甘油、300g/L丙二醇的生理盐水(pH5-6.5)的缓冲液(盐水/甘油/丙二醇缓冲液)中。

用该方法制备四个批次的微泡。通过电区感应(Beckman-Coulter MultisizerIV)评估每个批次的尺寸分布。数量加权平均数和中位数见表3。

表3如实施例2所制备的微泡的尺寸性质

实施例3.示例性微泡的振荡制备

用于制备微泡的其他方法包括通过手动振荡或高速机械搅拌在填充C3F8并密封的小瓶中以脂质混合物的主相变温度附近的温度搅拌实施例1的乳剂的方法。高速机械搅拌的方法是有利的，因为其可以有效地控制微泡的尺寸和尺寸分布。在该实施方案中以4550rpm使用机械搅拌器，其使得可以通过调节搅拌时间为10-60秒控制微泡具有0.8-2um的平均直径。

实施例4.示例性靶向微泡的一步法制备

首先通过在室温无空气条件下令硫醇化环状RGD五肽(Peptides International)与等摩尔DSPE-PEG(5000)-马来酰亚胺(Avanti)反应6小时来制备靶向构造体。随后通过尺寸排阻色谱法将肽-PEG-脂质靶向构造体从反应物中纯化出来。

通过实施例1的方法从由2.0mg/mL DSPC、1.0mg/mL DSPE-mPEG(1000)和1.0mg/mL的肽-PEG-DSPE靶向构造体组成的共混物制备脂质乳剂。如实施例2所示，将分散体加热并通过超声处理形成微泡。

对于本领域技术人员显而易见的是，可以使用多种靶向配体制备类似的靶向构造体。例如，可以将对人VEGFR2有特异性的二聚肽与PEG-脂质锚缀合，如Smeeg等人(2017)所述，并且随后在实施例1所述的乳化步骤期间将脂质-PEG-肽与剩余的壳形成组分结合。

实施例5.示例性靶向微泡的两步法制备

将对VCAM-1具有特异性的人源化单克隆抗体在0.1M乙酸钠缓冲液(pH 5)中浓缩至5mg/mL，然后在室温下与10mM高碘酸钠反应30分钟。然后将抗体交换到新鲜的乙酸盐缓冲液中，并在室温下用异型双功能交联剂PDPH(吡啶二硫醇-酰肼)(5mM)温育1小时。然后通过凝胶过滤(Zeba柱)将抗体纯化到含有10mM EDTA的DPBS(pH 7.4)中。该程序导致具有优先结合至Fc区的受保护巯基的抗体的衍生化。

通过实施例1的方法从由2.0mg/mL DSPC、1.0mg/mL DSPE-mPEG(1000)和0.2mg/mL的DSPE-PEG(2000)-PDP组成的共混物制备脂质乳剂。如实施例2所示的，将分散体加热并通过超声处理形成微泡。将微泡用1mM的三(2-羧乙基)膦基还原剂(TCEP；Pierce)温育以将稳定的PDP残基转化成反应性巯基形式。通过在DPBS/甘油/丙二醇缓冲液中以15摄氏度洗涤微泡三次来除去还原剂和还原副产物。然后在1.0mL的最终容积中将微泡浓缩至2E11μm²/mL。向浓缩微泡分散体加入5.0mg的PDPH缀合抗体，并在C3F8顶空的密封玻璃小瓶中以4摄氏度温和的端对端旋转使其反应16小时。通过将微泡以1000XG离心10分钟来除去未反应的抗体。然后将微泡重新浓缩至2E9/mL并储存在C3F8气体顶空的3.0mL玻璃小瓶中。

通过流式细胞术验证抗体与微泡表面的成功缀合。将5毫升的微泡分散体用FITC缀合的抗人IgG在室温下温育20分钟。通过流式细胞术分析微泡与同型对照温育的微泡中FITC的存在。

对于本领域技术人员显而易见的是，可以使用本文所述的方法将很多种靶向配体缀合至微泡表面。例如，可以通过硫醚键缀合单链人VEGF蛋白来实现对VEGFR2的靶向，如Anderson等人(2010)所述。

实施例6.示例性的P-选择素靶向微泡的制备

如下制备适于通过动态缩放分子成像使P-选择素成像的微泡。如实施例1所述，通过超声处理2.0mg/mL的18：0 DSPC(Avanti Polar Lipids，#850365)、1.3mg/mL DSPE-mPEG(2000)(Avanti，#880120)和0.5mg/mL DSPE-PEG(2000)-PDP(Avanti#880127)制备乳剂。如实施例2所述，在C3F8气体存在的情况下对分散体进行加热并超声处理以生成微泡，随后进行清洗。此程序导致形成C3F8的脂质稳定化微泡的多分散分散体，浓度为2-4E9/ml。然后将微泡在4.0mM三(2-羧乙基)膦(Thermo#777720)中在室温下温育30分钟以将PDP转化成反应性巯基，然后清洗三次以去除还原剂。然后将微泡与5摩尔当量的选择素结合靶向配体在室温下温育4小时，接着在4摄氏度下温育12小时。此处使用的靶向配体是由与内源性人P-选择素结合糖蛋白的细胞外部分融合的人IgG1 Fc结构域组成的重组蛋白。用反应性马来酰亚胺基团(SMCC；Thermo#22360)制备靶向配体，以使其能够通过硫醚键与微泡表面缀合。缀合之后，将微泡清洗三次以去除游离的配体，并在C3F8气体顶空下以4摄氏度储存最高达3个月。制备三个该批次并按照下文所述进行分析。

通过反相HPLC评估壳组成。壳形成表面活性剂(DSPC)占87.7％(按摩尔数计)，第二表面活性剂(DSPE-mPEG(2000))占8.2％，并且靶向构造体(DSPE-PEG(2000)-配体)占4.0％。通过电区感应评估尺寸分布。微泡表现出按数值计分别为1.4um的1.2um的平均直径和中位数直径。所有微泡中0.3％的微泡直径大于5um，而7.3％的微泡直径小于0.7um。图14示出了代表性的尺寸分布。

通过静态粘附试验评估微泡对犬P-选择素的特异性粘附。令原代犬内皮细胞(CnAEC；Cell Applications)在96或24孔板中生长至接近融合。在实验当天，通过用LPS(最终浓度100ng/mL)温育3小时来刺激细胞表达P-选择素。将微泡稀释至1x10⁷微泡/mL的浓度，向每个孔加入40uL等分试样。将板倒置5分钟，使微泡与细胞接触，然后用100uL培养基冲洗三次。通过透照显微术(Zeiss Axioskop，x200)在每个孔的10个视场中测定保持结合到细胞单层的微泡数量，并且每个条件测量n＝4个孔。作为阴性对照，用20ug/mL的重组人PSGL-1对孔进行预处理以阻断选择素介导的结合。，观察到结合在LPS刺激的单层细胞上的微泡(每个视场＞30)比未刺激细胞或用P-选择素阻断剂预处理的经刺激细胞(每个视场2-3个微泡)多大约10倍以上。

从以上描述中可以清楚地看出，如此制备的微泡满足用于动态参照缩放分子成像的标准。

本实施例中制备的微泡用于犬心肌急性再灌注损伤的成像，如实施例7所讨论的。

实施例7：犬心肌中P-选择素的成像

在犬短暂心肌缺血模型中评估了动态缩放方法改善靶向微泡可视化增强的实用性。利用冠状动脉左前降支的暂时结扎来模拟短期缺血。这种损伤会诱导整个风险区域内CD62的快速表达，表明其用作分子成像靶标。已知CD62相对于其他细胞粘附分子以低拷贝数表达(McEver，2001)，因此本实验代表低成像靶标密度的一个实例。

如实施例6所述制备靶向P-选择素的微泡。制备三个批次的微泡并将其用于本实施例的体内成像实验中。

六只成年雄性比格犬用于体内成像实验。麻醉动物，然后通过结扎冠状动脉左前降支近端进行开胸缺血。通过用非靶向微泡(Targestar-P；Targeson)进行心肌灌注成像来评估缺血区域。缺血10分钟后，松开结扎并使心肌再灌注。在再灌注30和90分钟时，用被配制用于靶向P-选择素的微泡进行分子成像。作为阴性对照，在缺血诱导前也对开胸动物进行成像。在一些动物中，施用作为靶向配体的无关IgG融合蛋白配制的阴性对照微泡。

在Sequoia c512(Siemens Medical Solutions)上进行超声成像，并使用以2.0MHz中心频率运行的4V1c探头。动态范围设定为60dB，后处理设定为S1/0/0/7，且机械指数在0.17至0.23之间。使用Cadence CPS进行造影成像。

以4E7个微泡/kg的团注施用(每剂约300uL)微泡，然后用10mL盐水冲洗。在5分钟的持续时间内以1分钟的间隔在低MI下进行成像。获取短轴图像，同时在整个5分钟的成像期间保持相同的视场。

对成像数据进行离线分析。绘制包括前心肌(包含通过灌注成像划定的风险区域)、侧壁(远离风险区域)和LV腔室的ROI。以声幅或声功率的线性化单位计算每个ROI内的平均造影信号幅度。每个数据点取4个收缩末期帧的平均值。

成像完成之后，重新拉紧LAD缝合线，并通过心脏穿刺施用酞菁蓝溶液以便划定风险区域。然后通过过量麻醉剂处死动物，并且将心脏切除、清洗并切成约1厘米的切片以用于拍照。

在缺血后和健康对照动物中，在施用微泡后的早期阶段观察到类似的造影增强模式。造影增强在施用微泡10秒内在LV腔室内是可见的，随后在几次心跳内在心肌内被检测到(图8A/B)。在3和5分钟时，相对于健康对照，在缺血后动物中观察到稍微更大的心肌内造影增强。在5分钟时，造影信号在LV腔室内是可见的(图8C)。

时间-强度分析揭示，缺血后动物在给药后3和5分钟时(图8D)呈现持续水平的造影增强，而健康动物中造影信号幅度在3分钟时恢复至接近造影前基线。

利用LV腔室作为参照区域以及心肌作为靶区域，对图像的时间序列执行本发明的动态缩放程序(图9)。在缺血后动物的成像期间(施用微泡后1-5分钟)观察到参照缩放信号的增大。在对照动物中，参照缩放信号在相同的时间段略微下降。当以声功率(图9A)和声幅(图9B)的线性化单位进行分析时发现相似的结果。

在n＝5只动物中重复该实验。发现在施用造影剂后1至5分钟之间，平均参照缩放信号在缺血后心脏中一致增大，在健康心脏中一致减小(图10A)。计算1至3分钟之间(图10B)和1至5分钟之间(图10C)的参照缩放信号的平均斜率。在这两种情况下，缺血后心肌的斜率均为正值并且非患病心肌的斜率均为负值。

实施例8：示例性微泡的制备

如下制备由被磷脂壳包封的八氟丙烷气芯组成的微泡。根据实施例1的方法由100mg的脂质DSPC(Avanti)、50mg的PEG-40硬脂酸酯(Sigma)和1mg的(DSPE-PEG(2k)-PDP；Avanti)制备乳剂。然后在C3F8气体存在的情况下通过超声处理制备微泡。通过HPLC评估的壳组成为75％DSPC(第一表面活性剂)、24％PEG40(第二表面活性剂)和1％DSPE-PEG(2000)-PDP(靶向构造体)。然后将微泡与识别P-选择素的重组蛋白缀合，如实施例5所述。此配方导致形成如通过电区感应所评估的多分散、右偏分散体。数量加权的平均直径和中位数直径分别是2.7um和2.6um。2.7％的微泡直径大于5um。

在第二实验中，使用实施例6的组合物制备由磷脂壳包封的八氟丙烷气芯组成的微泡。然后将微泡在含有PBS的小瓶中沉淀3分钟，将底部50％的分散体去除并丢弃。用新鲜的PBS重新填满小瓶容积，然后再重复该程序三次。此程序去除了大部分的小直径微泡，从而留下富含大微泡的制剂。富集分散体的平均直径和中位数直径分别是2.3um和2.1um。2.16％的微泡直径大于5um。

本实施例中制备的两种微泡制剂用于犬心肌急性再灌注损伤的成像，如实施例7所述。发现两种制剂均导致在施用后至少第一分钟后的后心肌出现明显的阴影(图15A-C)。此外，由于阴影的存在，LV腔室的内部不均匀。由于靶区域(后心肌)无法可视化并且参照区域(LV腔室)由于阴影而表现出信号丢失，因此无法使用动态缩放方法。与之相反，发现实施例6配制的微泡适合用于动态缩放分子成像(实施例7)。

实施例9：人心肌的急性缺血-再灌注损伤成像

本发明的动态缩放分子成像方法可用于检测患有冠状动脉疾病的患者常发生的急性缺血-再灌注损伤。在该情况下，在该条件下在微血管内皮中上调(Jones等人，2000；Thomas等人，2010)的P-选择素(CD62)可以用作分子成像靶标。使用特异性地结合至CD62的靶向配体配制微泡。具体实施例6中公开了合适的微泡。

在本实施例中为了简单起见，使用左心的简化短轴示意图。如图16所示，将心脏分成三个区域：A)左室腔，B)远离缺血且其中CD62不上调的心肌区域，以及C)暴露于暂时性缺血且其中CD62上调的心肌区域。

图16的底部图描绘了施用P-选择素靶向的微泡制剂之后的一系列造影超声图像。每个区域中的数字代表用灰色水平表示的造影信号幅度。在施用微泡之前(造影前)，所有区域中的造影信号一致较低。施用微泡之后，所有成像区域中的造影信号增大并达到峰值；LV腔室内的峰值信号显著高于周围心肌中的峰值信号，因为该区域中的血液密度更大(并且因此造影材料密度更大)。然后，随着微泡从血液池中清除，造影信号衰减。

心肌的靶向患病区域内的造影信号幅度比非患病区域或LV腔室内的造影信号幅度衰减得更慢。这是由于在患病区域内P-选择素表达的部位存在累积的微泡的缘故。在非患病区域未发现靶标，并且假设已按照第7节所讨论的注意事项配制了微泡，则微泡自由地穿过该区域而不累积。类似地，微泡不会在LV腔室内滞留。可以清楚地看出，在本成像研究中，LV腔室的内部可以用作本发明上下文中所用的参照区域。

图17A-E描绘了本实施例导出的时间-强度曲线。图17A绘制了造影信号幅度(线性标度)，心肌缺血后和非缺血区域之间的最小差异是显而易见的。图17B绘制了参照缩放信号，并且两个心肌区域之间的差异很容易看到。图17C绘制了t＝60s与t＝90s、t＝180s和t＝300s之间的参照缩放信号的平均斜率。可以看出，缺血后区域内的平均斜率随时间增大，而非缺血区域的平均斜率保持为零或略微为负。

图17D描绘了参照缩放图像。三个区域中的每个区域中的数字代表参照缩放造影信号幅度。每个区域的颜色都已重新编码，现在代表缩放造影信号幅度。可以看出，缺血后区域内的缩放造影信号幅度随时间增大，并且其他区域中的缩放造影信号幅度保持不变或略微下降。

图17E描绘了变化率图像。此处，每个区域中的数字代表峰值强度与当前时间点之间参照缩放造影信号幅度的变化率。可以看出，在靶向微泡发生累积的区域内所有时间点的变化率为正值，并且在其他区域中变化率为负值。此外，患病区域与非患病区域之间的差异随时间增大。

实施例10：人缺血后肾损伤的检测

本发明的方法可用于检测如在肾移植的情况下可能发生的肾缺血-再灌注损伤。在该情况下，内皮细胞粘附分子VCAM-1可以用作疾病的分子标志物(Hoyt等人，2015)。缺血后损伤不是局部的而是涉及整个肾，预计VCAM-1在整个肾皮质中上调。因此肾皮质在本实施例中用作靶区域，并且肾静脉可以用作参照区域。

将VCAM-1靶向微泡(使用具体实施例4和5所述的方法制备)静脉施用至疑似患有缺血后肾损伤的患者。在施用微泡后0-15分钟使用非破坏性超声造影成像对肾进行成像。在整个成像过程中获取并维持包含肾实质和肾主静脉的代表性部分的单个视场。

在成像期间以1分钟的间隔选择造影模式图像。将图像线性化，并计算每个图像的肾静脉管腔内的平均造影信号幅度。在每个图像中将肾实质(包括肾皮质)内的像素按参照缩放信号幅度进行缩放，以形成参照缩放造影信号幅度图像的时间序列。

浏览图像序列并评估靶区域内缩放信号的趋势。靶区域内的增大趋势构成缺血后损伤的阳性研究结果，而负趋势或零趋势构成阴性研究结果。

实施例11：人不稳定动脉粥样硬化斑块的检测

本发明的方法可用于检测不稳定动脉粥样硬化疾病的情况下可能发生的斑块内炎症。在该情况下，细胞粘附分子JAM-A可以用作疾病的分子标志物(Zhang等人，2016)。在本实施例中，在颈动脉内发现的动脉粥样硬化斑块的主体是靶区域，并且斑块远侧的颈动脉管腔可以用作参照区域。

将JAM-A靶向微泡(通过具体实施例4和5的方法使用人源化JAM-A结合抗体制备)静脉施用至疑似患有不稳定动脉粥样硬化的患者。在施用微泡后0-15分钟使用非破坏性造影超声成像对一段颈动脉进行成像。在整个成像过程中获取并维持包含斑块以及一部分无斑块血管的单个视场。

在成像期间以3分钟的间隔选择收缩末期造影模式图像。将图像线性化，并计算每个图像的参照区域和靶区域内的平均造影信号幅度。在每个时间点测定三个收缩末期图像的平均造影信号幅度，并将结果进行平均，对于每个时间点，将靶区域的平均造影信号幅度除以参照区域的平均造影信号幅度，并将商绘制成时间的函数。

浏览参照缩放时间-强度曲线系列，并评估靶区域内缩放信号的趋势。靶区域内的增大趋势构成缺血后损伤的阳性研究结果，而负趋势或零趋势构成阴性研究结果。

实施例12：卵巢乳腺病变的鉴定

本发明的方法可用于评估疑似恶性肿瘤的卵巢病变。在该情况下，促血管生成受体酪氨酸激酶VEGFR2可以用作疾病的分子标志物(Willmann等人，2017)。在本实施例中，通过B模式超声鉴定卵巢内的病变位置，并将其用作靶向区域。大腿的骨骼肌体积用作参照区域。

将VEGFR2靶向微泡(使用具体实施例4和5所述的方法制备)静脉施用至疑似患有卵巢恶性肿瘤的患者。在施用微泡后0-10分钟使用非破坏性造影超声成像对卵巢含有病变的区域进行成像。此外，类似地在相同的时间段使用第二超声换能器对大腿上的骨骼肌部分进行成像。

在施用微泡后1分钟和10分钟，分别从卵巢和肌肉中选择收缩末期造影模式图像。将图像线性化，并计算每个图像的参照区域和靶区域内的平均造影信号幅度。在两个时间点中的每个时间点将靶区域的平均造影信号幅度除以参照区域的平均造影信号幅度，并计算平均斜率。

浏览参照缩放造影信号幅度的平均斜率，并将其用于评估卵巢病变内靶向微泡摄取的存在。正值斜率被认为是阳性微泡累积的证据，并且因此病变可能是恶性的。零值或负值斜率则是无微泡累积的证据。

实施例13：人乳腺恶性病变的鉴定

本发明的方法可用于评估疑似恶性肿瘤的乳腺病变。在该情况下，促血管生成受体酪氨酸激酶VEGFR2可以用作疾病的分子标志物(Willmann等人，2017)。在本实施例中，通过B模式超声鉴定乳腺内的病变，并将其用作靶向区域。左心室的内部用作参照区域。

将VEGFR2靶向微泡(使用具体实施例4和5所述的方法制备)静脉施用至疑似患有乳腺恶性肿瘤的患者。在施用微泡后0-18分钟使用非破坏性造影超声成像对乳腺含有病变的区域进行成像。此外，类似地在相同的时间段使用第二超声换能器对LV腔室进行成像。

在施用微泡后1分钟和10分钟，分别从乳腺和LV腔室中选择收缩末期造影模式图像。将图像线性化，并计算每个图像的参照区域和靶区域内的平均造影信号幅度。在两个时间点中的每个时间点将靶区域的平均造影信号幅度除以参照区域的平均造影信号幅度，然后计算平均斜率。

浏览参照缩放造影信号幅度的平均斜率，并将其用于评估乳腺病变内靶向微泡摄取的存在。正值斜率被认为是阳性微泡累积的证据，并且因此病变可能是恶性的。零值或负值斜率则是无微泡累积的证据。

在如本文所述计算的斜率被判定为非诊断性的情况下(例如，相对于在其他恶性肿瘤患者中观察到的斜率幅度而言，它仅略微为正)，利用稍后的时间点重复该过程。在该情况下，利用在1和15分钟获取的图像计算平均参照缩放斜率。

实施例14：评估人对血管生成治疗的反应

本发明的方法可用于评估患者对促血管生成治疗(例如外周血管疾病的治疗)的反应。在该情况下，整合素alphav-beta5可以用作阳性血管生成反应的分子标志物(Leong-Poi等人，2005)。期望的血管生成反应发生在微循环水平，因此小腿骨骼肌的代表性部分可以用作靶区域。股动脉的管腔可以用作参照区域。

在使用促血管生成治疗剂的治疗过程中，将Alphav-beta 5整合素靶向微泡(使用具体实施例4和5所述的方法用肽靶向配体制备)静脉施用至患有外周动脉疾病的患者。在施用微泡后0-6分钟使用非破坏性超声造影成像对小腿进行成像。在整个成像过程中获取并维持包含小腿骨骼肌和股主动脉的代表性部分的单个视场。

在施用微泡后1分钟和6分钟分别选择造影模式图像。将图像线性化，并计算1至6分钟之间参照缩放造影信号幅度的斜率。该数据用于形成变化率图像，对变化率图像中骨骼肌区域内的像素进行重新染色以代表参照缩放造影信号幅度斜率的幅度。

在治疗过程中定期重复成像程序，例如在第-5天(开始治疗之前)、第5天、第15天、第30天、第60天和第120天。

检查在治疗过程中获得的一系列变化率图像，以便确定治疗方案对患者的有效性。在治疗期间变化率增大的趋势，同时表现正值变化率的靶区域的面积增大，被认为是治疗效果的阳性研究结果。在治疗期间的任何时间均不存在增大的趋势，或者均不存在表现出正值变化率的任何骨骼肌的有意义区域，被认为是治疗失败的证据并且提示有必要改变治疗方案。

图18A-E示出了对患者对于血管生成治疗的反应进行成像的简化示例。将靶区域(肌肉)和参照区域(相邻动脉的管腔)分别描绘为方形和圆形。图18A和B描绘了表现出成功的血管生成反应(A)和无血管生成反应(B)的患者的造影信号幅度图像和相应的变化率图像。在变化率图像中，将所有的负值变化率赋值为零并将颜色映射为黑色。将正值变化率映射为由灰色到白色的渐增阴影。

图18C、D和E描绘了在促血管生成治疗过程期间的不同天数获得的一系列变化率图像。图像代表预期对治疗表现出强反应(C)、中等反应(D)和弱反应(E)的患者的研究结果。

尽管已经在本文中示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这样的实施方案仅通过示例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。应当理解，本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。旨在通过所附权利要求限定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (28)

1.一种用于量化感兴趣的区域(ROI)内造影信号的幅度的方法，所述方法包括向受试者的靶组织施用靶向造影剂以对疾病的一个或多个靶向分子标志物的存在进行成像；以动态、时变的方式选择代表血液池内循环的造影剂量的参照区域；对包含所选参照区域的所述靶组织进行成像；通过所述动态缩放、时变方式的程序定量地确定疾病区域的幅度，其中所述靶向造影剂被配置用于与患病区域内表达的疾病的所述一个或多个分子标志物结合。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述动态缩放、时变方式的程序包括

a.提供描绘单个视场的图像的时间序列，

b.选择一个或多个感兴趣的区域和一个或多个相应的参照区域，

c.形成参照缩放图像和/或参照缩放信号幅度，其中在所述时间序列中的相同时刻获得所述感兴趣的区域和参照区域，

d.对所述时间序列中的两个或更多个图像执行(c)所述的缩放操作，以定量地确定所述参照缩放信号幅度的时间-强度关系；其中所述参照缩放信号在所述患病区域中增大并且在非患病区域中减小。

3.如权利要求2所述的方法，其中获得所述参照区域和感兴趣的区域的分别的时间同步的图像序列。

4.如权利要求2所述的方法，包括按常数对动态缩放图像内的每个像素的值进行缩放。

5.如权利要求2所述的方法，其中以线性化声功率为单位执行所述程序。

6.如权利要求2所述的方法，其中以线性化声幅为单位执行所述程序。

7.如权利要求2所述的方法，还包括对所述动态缩放图像或从所述动态缩放图像的变化率导出的变化率图像进行颜色编码。

8.如权利要求2所述的方法，还包括通过低通滤波对所述动态缩放图像进行平滑处理。

9.如权利要求2所述的方法，还包括对所述动态缩放图像进行非线性压缩。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述参照区域定义为其中微泡的累积可以忽略甚至没有的区域。

11.如权利要求2所述的方法，其中在所述参照区域内的峰值信号与清除之间的几个时间点计算一个或多个靶区域内的所述参照缩放造影信号幅度。

12.如权利要求2所述的方法，其中在峰值信号和随后的感兴趣时间点计算所述参照缩放造影信号幅度，并且计算所述两点之间的平均斜率。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述靶向造影剂是平均直径按数值计为0.1至2.0um、0.2至2.0um、0.3至2.0um、0.4至2.0um、0.5至2.0um、0.6至2.0um或0.7至2.0um的微泡。

14.如权利要求1所述的方法，其中所述靶向造影剂是平均直径按数值计为0.7至2.0um的微泡。

15.如权利要求1所述的方法，其中所述靶向造影剂是微泡。

16.一种按照权利要求1检测受试者疾病的方法，包括对所述受试者的视场进行1-10分钟的成像并将该一系列图像存储在可读计算机介质中；对所获得的图像时间序列执行权利要求2所述的方法；将缩放图像序列或缩放信号图诸如时间-强度曲线呈现给用户；以及基于所述缩放信号的变化率确定疾病。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述视场包括心脏、肾、肝、乳房、肿瘤、前列腺等。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述视场包括心脏。

19.如权利要求17所述的方法，其中LV腔室是参照区域并且心肌是靶区域。

20.如权利要求19所述的方法，其中对线性化造影信号执行动态缩放程序。

21.一种用于确定靶组织中感兴趣的生物标志物水平的动态缩放、时变方式的程序，包括：

a.随时间捕获靶组织的一系列图像，

b.在所述图像内选择具有靶向造影剂信号的感兴趣的区域，

c.在所述图像内选择不具有靶向造影剂信号但具有循环造影剂信号的参照区域，

d.在每个时间点使用所述参照区域的信号强度对来自所述靶向区域的信号幅度进行缩放；

e.在不同的时间点创建所述靶组织的参照缩放图像或幅度，以及

f.使用所述参照缩放图像或幅度来确定所述靶组织中所述感兴趣的分子标志物的水平。

22.如权利要求21所述的程序，其中以线性化声功率为单位执行所述程序。

23.如权利要求21所述的程序，其中以线性化声幅为单位执行所述程序。

24.如权利要求21所述的程序，还包括对所述动态缩放图像或从所述动态缩放图像的变化率导出的变化率图像进行颜色编码。

25.如权利要求21所述的程序，还包括通过低通滤波对所述动态缩放图像进行平滑处理。

26.如权利要求21所述的程序，还包括对所述动态缩放图像进行非线性压缩。

27.如权利要求21所述的程序，其中在所述参照区域内的峰值信号与清除之间的几个时间点计算一个或多个靶区域内的所述参照缩放造影信号幅度。

28.如权利要求21所述的程序，其中在峰值信号和随后的感兴趣的时间点计算所述参照缩放信号幅度，并且计算所述两点之间的平均斜率。

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