CN111893214A

CN111893214A - 双模板多循环g-三联体机器及其在hiv检测中的应用

Info

Publication number: CN111893214A
Application number: CN202010654637.8A
Authority: CN
Inventors: 易钢; 段秋悦; 严琪
Original assignee: Chongqing Medical University
Current assignee: Chongqing Medical University
Priority date: 2020-07-08
Filing date: 2020-07-08
Publication date: 2020-11-06
Anticipated expiration: 2040-07-08
Also published as: CN111893214B

Abstract

本发明属于生物标志物检测技术领域，具体公开了一种双模板多循环G‑三联体机器及其在HIV检测中的应用。本发明所建立的DNA纳米机器仅由两条模板链(T1，T2)和两种酶(KF聚合酶，Nb.BbvCI核酸内切酶)构成。通过将T1的输出链设计为T2的引物实现多循环扩增提高了检测灵敏度，反应的终产物为富含鸟嘌呤的片段(G3)，G3与荧光染料ThT结合后形成G‑三联体/ThT复合物作为信号输出，无需荧光标记，操作简单，降低了实验成本。同时，得益于高效多循环扩增策略的应用，本发明的酶促反应在45分钟内即可完成，缩短了反应时间。本发明所构建的多循环扩增G‑三联体机器，实现了HIV‑1基因的的超灵敏检测，检测限可达30.95fM，在50fM‑2nM检测范围内有良好的线性关系。

Description

双模板多循环G-三联体机器及其在HIV检测中的应用

技术领域

本发明涉及生物标志物检测技术领域，特别是涉及一种双模板多循环G-三联体机器及其在HIV检测中的应用。

背景技术

精确地测定生物标志物浓度对疾病的早期诊断、治疗、监测和预后评估至关重要，越来越多的研究也阐明了检测疾病相关痕量生物标志物(如：核酸、蛋白、小分子物质)的意义。然而临床样本中的生物标志物浓度可能低至皮摩尔甚至飞摩尔，为了满足准确、特异地对这些生物分子进行超灵敏检测的临床需求，研究者们采取了各种各样的检测策略，例如微阵列分析(microarray)、聚合酶链式反应(PCR)、环介导的等温扩增反应(LAMP)等。然而，这些检测方法存在着操作程序复杂，耗时长，需要昂贵仪器等不足之处，难以在基层实验室开展，目前需要一些快速简便同时具有良好的灵敏度以及特异性的检测策略来替代这些方法。

具有不同功能的DNA机器，例如DNA步行器，DNA开关，DNA机器人和DNA扩增机器等作为信号扩增策略在生物分析中显示出了良好的性能以及在生物传感领域中的良好发展前景。一般来说，在特定条件下精确、智能的控制DNA机器运行是构建DNA机器的必要条件。这意味着，DNA机器必须对目标分析物的存在做出快速而有力的响应，而决不在毫无目标物刺激的情况下运行，因此信号扩增效率对DNA机器具有重要意义。为了获得更好的性能，研究人员将几种信号扩增反应整合来构建新的传感策略以提高信号扩增效率。然而，这些整合不同信号扩增方法面临着一些问题，例如在复杂的反应混合物中更容易发生非特异性扩增导致背景信号高、多种聚合酶参与反应使得热循环复杂、反应时间延长、操作繁琐化。因此迫切需要一些通过简单操作，即可达到理想扩增效率的信号放大方法。

目前用于检测病毒抗体的免疫血清学技术(酶联免疫吸附测定法(ELISA)及化学发光免疫分析法(CLIA)是HIV-1感染的常用临床诊断方法，但其窗口期的高假阴性率是初筛实验的主要限制因素。核酸检测由于兼具敏感性高和特异性好的优点，可以在抗HIV-1抗体产生之前的时期内识别出新感染的个体，被认为是HIV早期诊断的有力手段，可以有效地缩短艾滋病检测的窗口期。而基于HIV-1核酸的分子诊断，例如定量PCR，微阵列分析需要复杂操作，高昂的成本并且依赖昂贵仪器，使其在资源有限环境中的实际应用受到了限制。因此，为了更好地进行HIV-1感染筛查，开发一种灵敏、简单、成本低的检测方法具有十分重要的意义。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种双模板多循环G-三联体机器及其在HIV检测中的应用，本发明的双模板多循环G-三联体机器基于聚合酶/核酸内切酶介导的等温指数扩增反应构建而成，灵敏度高，无需荧光标记，操作简单，反应时间短，实验成本低，可用于HIV的超灵敏检测。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种双模板多循环G-三联体机器，所述G-三联体机器包括模板链T1、模板链T2、KF聚合酶及Nb.BbvCI核酸内切酶，所述G-三联体机器以G-三联体/ThT复合物作为信号输出，所述G-三联体机器用于检测HIV基因。

进一步，所述模板链T1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，模板链T2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

进一步，当HIV基因存在时，所述HIV基因与模板链T1结合后，通过T1的延伸反应产生的输出链触发新一轮的T1延伸反应和T2的聚合/剪切反应，反应产生终产物G-三联体(G3)，所述G-三联体的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

进一步，所述G-三联体/ThT复合物由G-三联体与荧光染料ThT结合形成。

本发明第二方面提供一种采用双模板多循环G-三联体机器检测HIV的方法，包括如下步骤：配制反应体系，所述反应体系包含混合物A和混合物B，所述混合物A包含待测样品、模板链T1、模板链T2、dNTPs和NEB 2缓冲液，所述混合物B包含KF聚合酶、Nb.BbvCI核酸内切酶和NEB 2缓冲液；将混合物A和混合物B在冰盒中充分混匀后进行孵育，孵育结束后加热使酶灭活；最后加入荧光染料ThT溶液、KCl溶液及超纯水并进行荧光光谱测量。

进一步，所述反应体系中，模板链T1和T2的总浓度为100nM，模板链T1和T2的摩尔比例为1∶40-160。

进一步，所述反应体系中，KF聚合酶的使用量为0.10-0.25U。

进一步，所述反应体系中，Nb.BbvCI核酸内切酶的使用量为3-6U。

进一步，所述反应体系的孵育时间为30-50min。

进一步，所述荧光染料ThT溶液的浓度为100μM，所述KCl溶液的浓度为1M。

进一步，所述反应体系中，模板链T1和T2的摩尔比例为1∶80，KF聚合酶的使用量为0.15U，Nb.BbvCI核酸内切酶的使用量为5U，dNTPs的使用量为500μM。

进一步，所述反应体系的孵育时间为45min，所述反应体系的孵育温度为37℃。

进一步，孵育结束后在85℃加热10min使酶灭活。

进一步，所述反应体系进行孵育反应的终体积为10μl。

进一步，最后加入2.5μl ThT溶液、2.5μl KCl溶液以及超纯水至50μl并进行荧光光谱测量。

进一步，进行荧光光谱测量的波长范围为460-600nm，激发波长为442nm，激发狭缝和发射狭缝均为10nm。

进一步，所述方法对HIV基因的检测限为50fM-2nM。

本发明第三方面提供如第一方面所述的双模板多循环G-三联体机器在制备HIV检测试剂盒和/或生物传感器上的应用。

如上所述，本发明的双模板多循环G-三联体机器及其在HIV检测中的应用，具有以下有益效果：

本发明提出了一种高效的聚合酶/核酸内切酶驱动的双模板多循环G-三联体机器。本发明所建立的G-三联体机器仅由两条模板链(T1，T2)和两种酶(KF聚合酶，Nb.BbvCI核酸内切酶)构成。通过将模板链T1的输出链设计为模板链T2的引物实现多循环扩增，从而提高了检测灵敏度，反应的终产物为富含鸟嘌呤的片段(G3)，G3与荧光染料硫黄素T(ThT)结合后形成G-三联体/ThT复合物作为信号输出，无需荧光标记，操作简单，降低了实验成本。同时，得益于高效多循环扩增策略的应用，本发明的酶促反应在45分钟内即可完成，缩短了反应时间。本发明所构建的多循环扩增G-三联体机器，实现了对50fM-2 nM范围内HIV-1基因的动态响应，最低检测限可达30.95 fM；并且通过更换模板序列，所构建的传感策略也能应用于其它核酸、蛋白等目标物的检测，在痕量生物标志物分析方面具有一定的应用潜力。

附图说明

图1为本发明的双模板多循环扩增G-三联体机器应用于HIV-1 DNA检测的原理图。

图2为本发明的G-三联体的表征结果图。(A)5μM G-三联体，100μM ThT以及G三联体、ThT混合物的圆二色光谱图(含50mM KCl的25mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4))。(B)荧光分光光度计分析1μM G-三联体，5μM ThT以及G三联体、ThT混合物(含50mM KCl的25mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4))。

图3为本发明的双模板多循环G-三联体机器的可行性分析结果图。(A)聚丙烯酰胺凝胶电泳图：泳道1，20bp DNA marker；泳道2，HIV-1；泳道3，T1；泳道4，T2；泳道5，T1+T2+HIV-1+KF；泳道6，T1+T2+HIV-1+KF+Nb.BbvCI；泳道7，T1+T2+KF+Nb.BbvCI；泳道8，G3。(B)双模板多循环G-三联体机器与双循环扩增策略的荧光光谱分析比较结果图：曲线a，多循环扩增策略的背景信号；曲线b，加入1nM HIV-1 DNA后的多循环扩增策略的荧光信号；曲线c为双循环扩增策略的背景信号，曲线d为加入1nM HIV-1 DNA后的双循环扩增策略的荧光信号。

图4为本发明的双模板多循环G-三联体机器的实验条件优化结果图。(A)由1nMHIV-1触发的不同T1、T2摩尔浓度比例对信噪比的影响。(1nM HIV-1，0.15U KF，5UNb.BbvCI)。(B)反应时间对荧光信号的影响(1nM HIV-1，1∶80的比例加入T1/T2，0.15UKF，5U Nb.BbvCI)。(C)不同KF聚合酶使用量对荧光强度的影响(1nM HIV-1，1∶80的比例加入T1、T2)。(D)不同KF聚合酶使用量对信噪比的影响。(E)反应体系中不同Nb.BbvCI使用量对荧光强度的影响(1nM HIV-1，1∶80的比例加入T1、T2，0.5U KF)。(F)不同浓度Nb.BbvCI使用量对信噪比的影响。

图5为本发明双模板多循环G-三联体机器的灵敏度实验结果图。(A)双模板多循环扩增G-三联体机器对不同浓度HIV-1响应的荧光光谱：0、50fM、100fM、1pM、10pM、100pM、1nM、2nM。(B)荧光强度与目标基因HIV-1从50fM到2nM范围内浓度的线性关系图。误差棒代表三次测试的标准偏差。

图6为本发明双模板多循环G-三联体机器对不同错配目标物分析的特异性。荧光强度对应为HIV-1，单碱基错配链，双碱基错配链、三碱基错配链以及非互补链。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

本发明基于聚合酶/核酸内切酶介导的等温指数扩增反应构建了一种双模板多循环扩增G-三联体机器用于超灵敏生物分析。

聚合酶/核酸内切酶驱动的等温指数扩增反应是构建各种基于DNA机器的传感策略的理想信号放大方法。由于DNA双螺旋中四个碱基精确配对和酶的高效延伸、特异性剪切功能，由聚合酶和核酸内切酶驱动的DNA机器可以程序化地精确运行。模板链或识别探针特异性识别目标分析物后，所使用的酶就像机器的“引擎”一样，驱动DNA机器高速地运行。

本发明所构建的G-三联体机器仅由两条模板链(T1，T2)和两种酶(KF聚合酶，Nb.BbvCI)组成，以G-三联体/ThT复合物作为信号输出。考虑到艾滋病病毒(HIV)在全世界范围内的易感性、获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的高死亡率和对早期诊断、治疗和预防病毒传播的要求不断增加，本发明以HIV-1基因作为目标分析物。HIV-1与T1结合后，通过T1的延伸反应产生的输出链Y反馈性地触发了新一轮的T1延伸反应和下游的一系列T2的聚合/剪切反应。最后，大量G-三联体通过这一多循环G-三联体机器产生，并与价廉的水溶性荧光染料ThT形成G-三联体/ThT复合物。得益于这些优点，本发明构建了一种新的无标签、低背景信号的G-三联体机器，可应用于HIV的快速、超灵敏检测。

本发明的具体实施过程如下：

实施例1

1.1、试剂

本发明实施例中使用的高效液相色谱(HPLC)纯化的寡核苷酸由生工生物公司(中国上海)合成，其碱基序列在表1中进行了详细描述。将所有寡核苷酸在冰盒中完全溶解于1×TE缓冲液中(10mM Tris HCl，1mM EDTA，pH 8.0)，并储存在-20℃。1×TE缓冲液、10mM脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)、30％丙烯酰胺溶液/双溶液、过硫酸铵(APS)、N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)购自生工生物公司(中国上海)。从TaKaRa生物公司(中国大连)获得了用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的6×DNA上样缓冲液，20bp DNA Ladder(加染液)。GoldView核酸染液购自索拉博生命科学公司(中国北京)。水溶性荧光染料硫黄素T(ThT)购自西格玛奥德里奇公司(密苏里州圣路易斯)，硫黄素T用超纯水溶解成100uM的溶液用于荧光测量。本发明实施例中使用的Klenow片段(3’-5’exo-)聚合酶(KF聚合酶)和Nb.BbvCI核酸内切酶购于新英格兰实验室(中国北京)，上述购买的酶自带NEB 2缓冲液。用于溶液制备的超纯水是从密理博水净化系统(18.2MΩ·cm，Milli-Q，Millipore)获得的。

表1实验中应用的核酸序列

1.2、仪器设备

石英荧光比色皿(光程为1.0cm)，Cary Eclipse荧光分光光度计(加利福尼亚州帕洛阿尔托的安捷伦技术公司)用于实验中所有荧光光谱测量。DYY-6C电泳分析仪(中国六邑仪器公司)和Bio-Rad ChemDoc XRS(美国Bio-Rad)用于聚丙烯酰胺凝胶电泳以及凝胶成像。圆二色性分析在Chirascan圆二色光谱仪(英国应用光物理有限公司)上进行。

1.3、使用双模板多循环扩增G-三联体机器进行HIV-1基因检测

本发明所提出的多循环扩增反应以一步法进行。首先配制反应体系，反应体系包含混合物A和混合物B两个部分。混合物A由待测样品、两条模板链(T1和T2)、dNTPs和NEB 2缓冲液组成；混合物B包含(3’-5’exo-)KF聚合酶、Nb.BbvCI和NEB 2缓冲液。将混合物A和混合物B在冰盒中充分混匀，并在37℃孵育45分钟，反应体系中T1和T2加入的总浓度为100nM，摩尔比例为1∶80，KF聚合酶0.15U，Nb.BbvCI 5U，dNTPs 500μM，反应体系终体积为10μl。孵育结束后在85℃加热10min灭活酶，随后加入2.5μl 100μM ThT溶液、2.5μl 1M KCl溶液以及超纯水至50μl并进行荧光光谱测量，波长范围为460-600nm，激发波长为442nm，激发狭缝和发射狭缝均为10nm。

1.4、凝胶电泳

双模板多循环扩增策略通过12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)在120V恒定电压下，用1x TBE缓冲液(89mM Tris-硼酸，2mM EDTA，pH 8.3)分析45分钟(上样量为10ul)。随后使用Gold view进行35分钟的凝胶染色，并通过凝胶成像系统(美国Bio-Rad实验室)对染色的凝胶进行分析。泳道1为20bp DNA Marker，泳道3、泳道4中样品浓度为2μM，泳道2和泳道8中样品浓度为3μM，泳道5、泳道6和泳道7中T2浓度为1μM、T1浓度为100nM。

1.5、圆二色性分析

圆二色性分析是通过Chirascan圆二色光谱仪(英国应用光物理有限公司)在室温下用光程为1mm的石英比色皿进行测量。用下述参数对每个样品进行三次扫描：扫描范围200-500nm、带宽1nm、扫描速度200nm/min、响应时间0.5s。

2、结果与讨论

2.1、双模板多循环扩增G-三联体机器的原理

双模板多循环扩增的G-三联体机器原理如图1所示。通过聚合酶/核酸内切酶辅助的多循环指数扩增反应建立了一种一步法、免标记G-三联体机器。这一G-三联体机器由两种酶(KF聚合酶、Nb.BbvCI)和两条模板链(T1、T2)构成，其中T1、T2两条模板链具有类似的结构(X-X’-Y和Y-Y’-C)：引物识别区域、引物类似物生成区域和输出链区域，每两个区域之间有一个剪切位点。HIV-1基因存在时，HIV-1与模板T1形成双链，在KF聚合酶和核酸内切酶Nb.BbvCI的驱动下，DNA机器开始自动运行。反应过程如下所述：首先HIV-1 DNA触发第一个循环产生X’和Y，而X’能够引发第二个扩增循环产生更多Y，Y作为模板链T2的引物又能启动第三个循环产生很多Y’和G3，同时Y’能够与模板T2结合，反馈性的触发第四个扩增循环，再次产生G3。最终这一多循环扩增策略促使了大量G3的生成，G3与加入的ThT形成G-三联体/ThT复合物，荧光强度大幅度增加。

2.2、G-三联体的表征

圆二色光谱仪和荧光分光光度计用于表征G-三联体的结构和生物学功能。如图2A所示，G-三联体的圆二色光谱在265nm处存在一个正峰、240nm处存在一个负峰，这与典型的平行链排列相匹配，表明了平行G-三联体结构的形成，并且可以与在280nm处具有特征性正峰的双链DNA和单链DNA很好地区分。在加入ThT后，圆二色光谱中这两个峰保持不变，并且在425nm左右出现了一个新的负峰，表明这种嵌入性结合模式没有改变G-三联体/ThT复合物中G-三联体的平行结构。图2B表明了ThT或G三联体单独存在时，荧光信号极低，而在G三联体/ThT复合体中可以测量到大幅增强的荧光信号。

以上结果很好地证明了G三联体的形成及其增强ThT荧光强度的生物学功能。

2.3、双模板多循环扩增G-三联体机器的可行性分析

采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和荧光光谱分析对这一传感策略的可行性进行了验证。

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(12％非变性凝胶)验证双模板多循环扩增策略。电泳过程在室温下进行45分钟。图3A为非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图：泳道1，20bp DNA marker；泳道2，HIV-1；泳道3，T1；泳道4，T2；泳道5，T1+T2+HIV-1+KF；泳道6，T1+T2+HIV-1+KF+Nb.BbvCI；泳道7，T1+T2+KF+Nb.BbvCI；泳道8，G3。

泳道5、泳道6和泳道7中只有泳道6产生了与泳道8相同的终产物G3条带；泳道7无靶物质存在因而不能进行扩增反应，不能生成G3，无相应条带；泳道4未加剪切酶Nb.BbvCI，因此也未出现G3条带。所得结果与预期一致，说明了多循环扩增策略的成功建立。

为了进一步证明G-三联体机器的成功构建，对提出的扩增策略的反应产物进行了荧光光谱分析。此外，设计模板链S1，建立了一个双循环扩增信号放大策略，接着以1nMHIV-1DNA在相同反应条件下，对这一双循环扩增策略以及本发明所提出的多循环扩增策略反应产物进行了荧光强度测定。如图3B所示，空白组只有微弱荧光(曲线a、c)，而在加入1nM靶物质的多循环扩增策略反应产物中检测到很明显的荧光信号，1nM靶物质所产生的荧光强度(曲线b)和空白信号的荧光强度(曲线a)的信噪比(SNR)接近11倍。双循环扩增策略所产生的荧光强度(曲线d)远低于所提出的多循环扩增策略的荧光强度(曲线b)。以上结果表明多循环扩增G-三联体机器的构建是成功的，并且有着优异的信号放大效果。

3、实验条件的优化

为探索最佳反应条件，使传感器的性能达到最佳，对模板链T1和T2之间的摩尔浓度比例(T1/T2)、反应时间、KF聚合酶以及Nb.BbvCI核酸内切酶的使用量进行了优化。

许多聚合/剪切反应体系都面临着由于模板过量，非特异性扩增多而引起的高背景信号的问题，通过对实验前期的结果分析，我们发现模板链加入比例不恰当也导致较高的背景信号。因此首先对两条模板链加入的比例进行了优化，将两条模板的总浓度设定为100nM，接着设置了一系列T1/T2。如图4A所示，随着T1/T2从1∶10降低到1∶160，信噪比(SNR)得到了极大的提高，并且在1∶80的摩尔比下达到了最高值。当T1/T2降低至1∶160时，SNR略有下降，这可能是由于反应系统中T1减少导致信号放大效率下降。因此，将1∶80设置为最优摩尔比列，后续实验以1∶80的比例进行。

接着对反应时间进行了探索，如图4B所示，反应时间的延长使得信噪比增大，在45分钟时得到最佳信噪比，随着反应时间继续延长，信噪比迅速下降。这一结果表明，45分钟为此传感策略的最佳反应时间，后续目标物的检测以45分钟作为酶促反应时间。

KF聚合酶是DNA机器的供能部分，加入不同剂量的KF聚合酶后对传感器性能进行了分析。如图4C所示，在加入0.15U KF聚合酶时荧光信号得到了显著增强，且背景信号仍保持较低水平。而进一步增加KF聚合酶至0.2U后，背景信号迅速增强，在图4D中可以看到信噪比在0.15U时达到最高，在0.2U时有所下降。这一结果表明在KF使用量为0.15U时DNA机器的运行效果已达到最佳，0.15U为最优KF使用量。

最后，对驱动DNA机器的另一部分，核酸内切酶Nb.BbvCI的使用量进行了探索。从图4E可以看到，随着Nb.BbvCI使用量的增加，荧光信号强度增大，并且在使用量为5U时达到最高，加入6U时荧光强度开始下降，这可能是酶浓度过饱和导致。在图4F中可以看到，在加入5U Nb.BbvCI时达到最佳信噪比。因而，本实验以5U做为最佳Nb.BbvCI浓度来确保传感器的良好性能。

4、双模板多循环扩增G-三联体机器的分析性能

在最优实验条件下，从灵敏度、特异性、稳定性这几个方面对所构建的G-三联体机器进行了分析性能评估。

首先，通过分析不同浓度HIV-1基因所产生的荧光强度，对提出的双模板多循环指数扩增G-三联体机器进行了灵敏度的评估。将不同浓度的HIV-1基因加入反应体系中，随后测得不同荧光强度。如图5A所示，背景信号很低，随着目标基因由50fM增加至2nM，荧光强度逐渐增加。据此绘制了荧光信号强度与HIV-1基因浓度之间的关系曲线，如图5B所示，目标物浓度的对数值与荧光强度在50fM至2nM浓度范围内呈良好的线性关系，其回归方程为F＝209.50lg c+41.20，相关系数为0.9971。同时，根据3σ规则，计算后得到检测限(LOD)为30.95fM，优于许多已报道的基于等温指数扩增的生物传感策略(参考文献1-4)。这一多循环指数扩增检测策略的良好性能得益于G-三联体机器的多循环扩增策略的成功构建，以及酶驱动的指数扩增反应的高效性。

为了更好的评估所建立的多循环扩增G-三联体机器的分析性能，对这一传感器的特异性进行了测试。通过对相同浓度的目标分析物(HIV-1)、单碱基错配序列(DNA1)、双碱基错配序列(DNA2)、三碱基错配序列(DNA3)和任意非互补序列(rDNA)进行荧光光谱分析，如图6所示，任意非互补序列荧光响应信号很低，接近于空白信号，单碱基、双碱基以及三碱基错配序列的荧光强度也远低于目标分析物所产生的信号强度。以上结果表明本发明所提出的传感策略展现出了良好的特异性。

参考文献如下所示：

[1]Huo Xu，Dong Wu，Chen-Qiao Li，Zheng Lu，Xiao-Yun Liao，Jie Huang，Zai-Sheng Wus.2017.Label-free colorimetric detecfion of cancer related gene basedon two-step amplification of molecular machine.Biosensors&Bioelectronics，90，314-320.(10.1016/j.bios.2016.12.003)

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5、结论

本发明提出了一种新的多循环扩增G-三联体机器用于艾滋病病毒核酸检测，这一传感策略引入了多个扩增循环，缩短了反应时间，使得检测更快速，45分钟内即可完成多循环扩增反应。并且反应体系简单、无需复杂的温度循环和操作步骤，可在恒温均相中一步完成，减少了干扰因素，降低了背景信号。同时，本发明所建立的聚合酶/剪切酶驱动的G-三联体机器具有较高效率，提高了检测的灵敏度，实现了HIV-1 DNA的超灵敏检测，检测限可达30.95fM，在50fM-2nM检测范围内有良好的线性关系。并且，以G-三联体/ThT复合物作为荧光信号标签无需对核酸链进行修饰，降低了成本。通过对模板链目标物识别区域核酸序列的更换，还可以实现对其它目标物的检测，为痕量生物标志物检测提供了新思路，具有应用于临床诊断的潜力。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆医科大学

<120> 双模板多循环G-三联体机器及其在HIV检测中的应用

<130> PCQYK205547

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> T1

<400> 1

ttgtgcaaat aacccctcag cagtgtggaa aatctctagc cctcagcagt cagtgtggaa 60

aatctctagc 70

<210> 2

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> T2

<400> 2

cccgccctac ccacctcagc ttgtgcaaat cctcagcttg tgcaaataac ccctca 56

<210> 3

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> S1

<400> 3

cccgccctac ccacctcagc ttgtgcaaat cctcagcagt cagtgtggaa aatctctagc 60

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> G3

<400> 4

tgaggtgggt agggcggg 18

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> HIV-1

<400> 5

gctagagatt ttccacactg act 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> DNA1

<400> 6

gcaagagatt ttccacactg act 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> DNA2

<400> 7

gctagagatt gtccacactc act 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> DNA3

<400> 8

gcaagagatt gtccacactc act 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> rDNA

<400> 9

tggccctata cgatcatgga tca 23

Claims

1.一种双模板多循环G-三联体机器，其特征在于，所述G-三联体机器包括模板链T1、模板链T2、KF聚合酶及Nb.BbvCI核酸内切酶，所述G-三联体机器以G-三联体/ThT复合物作为信号输出，所述G-三联体机器用于检测HIV基因。

2.根据权利要求1所述的双模板多循环G-三联体机器，其特征在于：所述模板链T1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，模板链T2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.根据权利要求2所述的双模板多循环G-三联体机器，其特征在于：当HIV基因存在时，所述HIV基因与模板链T1结合后，通过T1的延伸反应产生的输出链触发新一轮的T1延伸反应和T2的聚合/剪切反应，反应产生终产物G-三联体(G3)，所述G-三联体的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

4.根据权利要求1所述的双模板多循环G-三联体机器，其特征在于：所述G-三联体/ThT复合物由G-三联体与荧光染料ThT结合形成。

5.一种采用双模板多循环G-三联体机器检测HIV的方法，其特征在于，包括如下步骤：配制反应体系，所述反应体系包含混合物A和混合物B，所述混合物A包含待测样品、模板链T1、模板链T2、dNTPs和NEB 2缓冲液，所述混合物B包含KF聚合酶、Nb.BbvCI核酸内切酶和NEB 2缓冲液；将混合物A和混合物B在冰盒中充分混匀后进行孵育，孵育结束后加热使酶灭活；最后加入荧光染料ThT溶液、KCl溶液及超纯水并进行荧光光谱测量。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述模板链T1的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，模板链T2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应体系中，模板链T1和T2的总浓度为100nM，模板链T1和T2的摩尔比例为1∶40-160；

和/或，所述反应体系中，KF聚合酶的使用量为0.10-0.25U；

和/或，所述反应体系中，Nb.BbvCI核酸内切酶的使用量为3-6U；

和/或，所述反应体系的孵育时间为30-50min；

和/或，所述荧光染料ThT溶液的浓度为100μM，所述KCl溶液的浓度为1M。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述反应体系中，模板链T1和T2的摩尔比例为1∶80，KF聚合酶的使用量为0.15U，Nb.BbvCI核酸内切酶的使用量为5U，dNTPs的使用量为500μM；

和/或，所述反应体系的孵育时间为45min，所述反应体系的孵育温度为37℃；

和/或，所述反应体系进行孵育反应的终体积为10μl；

和/或，孵育结束后在85℃加热10min使酶灭活；

和/或，最后加入2.5μl ThT溶液、2.5μl KCl溶液以及超纯水至50μl并进行荧光光谱测量；和/或，进行荧光光谱测量的波长范围为460-600nm，激发波长为442nm，激发狭缝和发射狭缝均为10nm。。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法对HIV基因的检测限为50fM-2nM。

10.根据权利要求1-4任一项所述的双模板多循环G-三联体机器在制备HIV检测试剂盒和/或生物传感器上的应用。