CN111888341A - 一种姜黄素纳米颗粒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种姜黄素纳米颗粒及其制备方法。本发明用碱和/或醇提取的BSG蛋白提取物作为姜黄素的载体，制备了BSG蛋白提取物与卵磷脂复合的姜黄素纳米粒子。本发明制备得到的姜黄素纳米颗粒成球形、均匀、分散性好，PDI值窄，包封效率高。姜黄素被包裹在BSG蛋白提取物疏水核内，被包裹的姜黄素的溶解度、热稳定性和紫外辐照稳定性显著提高；而且被包裹后的姜黄素具有比游离姜黄素更高的DPPH自由基清除活性。

Description

一种姜黄素纳米颗粒及其制备方法
技术领域
本发明具体涉及一种姜黄素纳米颗粒及其制备方法。
背景技术
近几十年来，利用胶体给药系统来包裹和保护植物化学物质、精油、多肽等生物活性物质，以改善其理化性质或控制其在人体胃肠道(GI)的释放受到越来越多的关注。天然存在的食品生物大分子，如蛋白质，由于其具有生物相容性/可生物降解性，与其他合成聚合物或表面活性剂相比，具有较低的毒性，因此被认为是一种理想的包封/包裹材料。
姜黄素是从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的一种化学成分，其中，姜黄约含3％～6％，是植物界很稀少的具有二酮的色素，为二酮类化合物。姜黄素为橙黄色结晶粉末，味稍苦，不溶于水。医学研究表明，姜黄素具有降血脂、抗肿瘤、抗炎、利胆、抗氧化等作用。科学家新发现姜黄素有助治疗耐药结核病。
从动物中提取的蛋白质，如牛奶酪蛋白、胶原蛋白和明胶，作为姜黄素等亲脂性生物活性物质的载体已被广泛研究。尽管动物源蛋白作为包封材料的潜力巨大，但成本的增加、疾病传播的风险(疯牛病)和饮食限制引起了越来越多的关注。相比之下，植物源蛋白(如玉米、大豆和小麦)通常作为淀粉、食用油或其他食品加工的副产品产生，由于对自然资源的消耗较少，相对廉价、丰富且更环保。特别是植物源醇溶蛋白或类醇溶蛋白被作为最有前途的包封材料之一，通过与亲脂性生物活性物质形成强的分子间结合，获得更好的保护和缓释效果。例如，玉米醇溶蛋白由于其独特的疏水性、球形结构和水相自组装特性，被广泛研究作为药物和营养物质的载体。
啤酒糟(BSG)或大麦酿造后残留的固体，占酿酒工业副产品总量的85％，全球年产量达3000万吨。由于含有有益成分，将其用作食品配料已引起极大兴趣。它们主要由不溶于水的醇溶蛋白和谷蛋白的混合物组成。之前，有研究者通过酶水解降低蛋白质的疏水性，从而提高蛋白质的可提取性和溶解性。目前还没有使用非水溶性的BSG蛋白质作为传递材料或者包封材料的研究。此外，萃取溶剂对蛋白质的结构和功能有很大影响。因此，研究不同溶剂分离的BSG蛋白的包封特性具有重要意义。然而，由于其易受环境影响(如pH值、离子强度和胃蛋白酶)，具有不稳定性以及水溶性低等问题。此外，喷雾/冷冻干燥后，裸蛋白纳米粒的再分散性变差，进一步阻碍了其广泛应用。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种姜黄素纳米颗粒及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种姜黄素纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)在室温下，将1.5-2.5g BSG蛋白提取物与姜黄素加入100mL水中，混合；混合液中姜黄素的浓度为0.5-2mg/mL；
(2)将步骤(1)得到的混合液的pH值调到11.5-12.0，然后以600-1000rpm的速度进行磁力搅拌，使各组分均匀分散；
(3)孵育10-30分钟后，将10mL步骤(2)得到的分散液逐滴加入40mL0.15-0.25％(w/v)的卵磷脂溶液中，并以8000-10000rpm的速度均质1-5分钟；
(4)将步骤(3)得到的分散液中和至pH6.5-7.2，并在2000-3000g下离心5-10分钟，除去聚集物和游离姜黄素，得到姜黄素纳米颗粒。
进一步地，步骤(1)中，所述的BSG蛋白提取物为采用碱法或/和醇法从啤酒糟中提取的蛋白质组分。
进一步地，步骤(1)中，所述的BSG蛋白提取物为采用醇法从啤酒糟中提取的蛋白质组分，具体的提取步骤为：
1)研磨干燥后的BSG至粒径小于1mm；
2)将步骤1)研磨后的BSG直接浸入含有0.5％(v/v)2-巯基乙醇的pH值为10.5-11.0的水中，BSG与溶剂的质量比为0.5-1.5:10；
3)将步骤2)得到的BSG碱性悬浮液密封，并在40℃恒温水浴中进行磁力搅拌，然后在10℃，8000-10000g离心10-30min，后收集上清液；
4)将步骤3)得到的上清液用HCl调节pH＝4.5-5.5或旋转蒸发，然后冻干，得到BSG蛋白组分F1。
进一步地，步骤(1)中，所述的BSG蛋白提取物为采用醇法从啤酒糟中提取的蛋白质组分，具体的提取步骤为：
1)研磨干燥后的BSG至粒径小于1mm；
2)用40-60％(v/v)乙醇水溶液处理BSG粉，在40℃搅拌1h；离心后收集上清液；
3)将步骤2)得到的上清液用HCl调节pH＝4.5-5.5或旋转蒸发，然后冻干，得到BSG蛋白组分F2。
进一步地，步骤(1)中，所述的BSG蛋白提取物为从啤酒糟中提取的蛋白质组分，具体的提取步骤为：
1)研磨干燥后的BSG至粒径小于1mm；
2)用40-60％(v/v)乙醇水溶液处理BSG粉，在40℃搅拌1h，离心后收集不溶性残渣；
3)用含0.5％(v/v)2-ME的pH 11.0的碱性溶液处理步骤2)得到的不溶性残渣，离心后收集上清液；
4)将步骤3)得到的上清液用HCl调节pH＝4.5-5.5或旋转蒸发，然后冻干，得到BSG蛋白组分F3。
一种姜黄素纳米颗粒，采用以上所述的制备方法制备得到。
本发明的有益效果是：
(1)本发明用碱和/或醇提取的BSG蛋白提取物作为姜黄素的载体，制备了BSG蛋白提取物与卵磷脂复合的姜黄素纳米粒子。本发明制备的姜黄素纳米颗粒成球形、均匀、分散性好，PDI值窄，包封效率高。姜黄素被包裹在BSG蛋白提取物疏水核内，被包裹的姜黄素的溶解度、热稳定性和紫外辐照稳定性显著提高；而且被包裹后的姜黄素具有比游离姜黄素更高的DPPH自由基清除活性。
(2)本发明采用的卵磷脂是一种工业上从大豆和菜籽等含油种子中获得的磷脂，是公认的安全乳化剂，被广泛应用于食品/化妆品和医药应用中；从啤酒糟(BSG)中提取的蛋白，作为递送材料或者包封材料，比较环保，廉价，属于对生产副产物的可持续性再利用；利用卵磷脂与BSG蛋白提取物形成复合型纳米粒子，可作为包封性能好的给药配方，应用于开发其他复合给药系统，拥有极强的专用性。
附图说明
图1是BSG蛋白提取步骤示意图。
图2是对BSG蛋白组分进行SDS-PAGE分析结果示意图，其中，组分1(F1，通道1)，组分2(F2，通道2)，组分3(F3，通道3)和标准标记(通道M)。
图3是实施例与对比例中制得的姜黄素纳米颗粒的检测结果，其中(A)为粒径检测结果、(B)是PDI检测结果和(C)ζ电位检测结果。
图4是实施例制得的卵磷脂稳定的被BSG蛋白提取物包裹的姜黄素纳米颗粒的包封效率(EE用立柱表示)和载药量(LC用曲线表示)；在姜黄素浓度相同的情况下，立柱上不同的上标字母表示差异显著(P<0.05)。
图5是采用不同蛋白质组分制备的姜黄素纳米颗粒的扫描电镜图像，其中，A1、B1、C1分别代表对比例1，2，3，制备过程中均不含姜黄素；A2、B2、C2分别代表实施例1，4，7，制备过程中均含有姜黄素。
图6是姜黄素保留率检测结果；其中，(A)是在不同温度下热处理之后，姜黄素在游离和被包裹的姜黄素纳米颗粒中的保留率检测结果，(B)是在不同时间的紫外照射后，姜黄素在游离和被包裹的姜黄素纳米颗粒中的保留率检测结果。
图7是浓度为0-10μg/mL的游离姜黄素和被包裹的姜黄素纳米颗粒的DPPH自由基清除活性示意图。
图8是将0-45μM的姜黄素分别滴到含有F1(A)、F2(B)和F3(C)的水(pH 12.0)中，BSG蛋白提取物的荧光发射光谱图(自上而下，姜黄素的浓度依次增大)。
图9是pH诱导姜黄素纳米颗粒的形成机理示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，应当指出的是，具体实施方式只是对本发明的详细说明，不应视为对本发明的限定。以下实施例中，所采用的试剂或者仪器等均能够通过商业途径购得。其中1M＝1mol/L，姜黄素(～99.5％)和大豆卵磷脂购自Fisher Scientific(美国宾夕法尼亚州匹兹堡市)。蛋白质分子量标记、Laemmli样品缓冲液(4×)和聚丙烯酰胺预制凝胶(12％)均从Bio Rad Laboratories，Inc.(Hercules，CA，USA)获得。BSG(78.2％水分，5.6％蛋白质，氮转换因子×6.25，湿重基准)由恩皮利亚酿酒公司Empyrean Brewing Co.(美国东北部林肯市)大量供应，真空包装并在-20℃下储存在聚丙烯袋中直到使用。BSG源自的大麦是2列麦芽大麦。所有其他化学品均来自FisherScientific(美国宾夕法尼亚州匹兹堡市)，除非另有规定，否则均为分析级。在整个研究过程中使用去离子水(以下简称水)。
实施例1
一种姜黄素纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)在室温(21℃)下，将两克BSG蛋白提取物与姜黄素加入100mL水中，混合；本实施例中姜黄素的浓度为0.5mg/mL；
(2)使用3M NaOH将步骤(1)得到的混合液的pH值调节到12.0，然后以600rpm的速度进行磁力搅拌，使各组分均匀分散；
(3)孵育30分钟后，将10毫升步骤(2)得到的分散液逐滴加入40mL 0.2％(w/v)的卵磷脂溶液中，并使用Ultra Turrax T25均质机以8000rpm的速度均质3分钟；所述的0.2％(w/v)的卵磷脂溶液的配制方法为：将0.2g卵磷脂溶于100mL的水中。
(4)将步骤(3)得到的分散液中和至pH7.0，并在2000g下离心10分钟，弃去下层沉淀(即除去聚集物和游离姜黄素)，得到姜黄素纳米颗粒。
(5)将步骤(4)制备的姜黄素纳米颗粒储存在冰箱(4℃)中或冷冻干燥(-50℃、0.012mbar)进行进一步表征。
在一些优选的方式中，所述的BSG蛋白提取物为采用碱法或/和醇法从啤酒糟中提取的蛋白质组分。
本实施例中，步骤(1)中，所述的BSG蛋白提取物为采用醇法从啤酒糟中提取的蛋白质组分，具体的提取步骤为：
1)将BSG在4℃下解冻过夜，然后在50℃的烘箱中风干至恒重，研磨干燥后的BSG使用装有1mm筛网的旋风式样品磨机进行研磨至粒径小于1mm；
2)将步骤1)研磨后的BSG直接浸入含有0.5％(v/v)2-巯基乙醇(2-ME)的pH值为11.0的水中，BSG粉与溶剂的质量比为1:10；此处溶剂指的是：含有0.5％(v/v)2-巯基乙醇(2-ME)的pH值为11.0的水。
3)将步骤2)得到的BSG碱性悬浮液密封，以避免溶剂蒸发，并在40℃恒温水浴中以100rpm的速度进行磁力搅拌1h，然后在10℃，10000g离心15min，后收集上清液，丢弃不溶性固体；
4)将步骤3)得到的上清液用1M HCl调节pH＝5.0或在40℃下旋转蒸发，然后在-50℃，0.012mbar下冻干36h，得到BSG蛋白组分F1。
实施例2
本实施例中，姜黄素的浓度为1mg/mL；
本实施例中其他实施方式与实施例1相同。
实施例3
本实施例中，姜黄素的浓度为2mg/mL；
本实施例中其他实施方式与实施例1相同。
实施例4
本实施例中，步骤(1)中，所述的BSG蛋白提取物为采用醇法从啤酒糟中提取的蛋白质组分，具体的提取步骤为：
1)将BSG在4℃下解冻过夜，然后在50℃的烘箱中风干至恒重，研磨干燥后的BSG使用装有1mm筛网的旋风式样品磨机进行研磨至粒径小于1mm；
2)用55％(v/v)乙醇水溶液处理BSG粉，在40℃搅拌1h；10000g，离心15min，离心后收集上清液得到BSG蛋白组分F2；
3)将步骤2)得到的上清液用1M HCl调节pH＝5.0或在40℃下旋转蒸发，然后在-50℃，0.012mbar下冻干36h，得到BSG蛋白组分F2。
本实施例中，姜黄素的浓度为0.5mg/mL；
本实施例中的其他实施步骤与实施例1相同。
实施例5
本实施例中，姜黄素的浓度为1mg/mL；
本实施例中其他实施方式与实施例4相同。
实施例6
本实施例中，姜黄素的浓度为2mg/mL；
本实施例中其他实施方式与实施例4相同。
实施例7
本实施例中，步骤(1)中，所述的BSG蛋白提取物为从啤酒糟中提取的蛋白质组分，具体的提取步骤为：
1)将BSG在4℃下解冻过夜，然后在50℃的烘箱中风干至恒重，研磨干燥后的BSG使用装有1mm筛网的旋风式样品磨机进行研磨至粒径小于1mm；
2)用55％(v/v)乙醇水溶液处理BSG粉，在40℃搅拌1h，离心后收集不溶性残渣；
3)用含0.5％(v/v)2-ME的pH 11.0的水溶液处理步骤2)得到的不溶性残渣，10000g，离心15min，离心后收集上清液；
4)将步骤3)得到的上清液用1M HCl调节pH＝5.0或在40℃下旋转蒸发，然后在-50℃，0.012mbar下冻干36h，得到BSG蛋白组分F3。
本实施例中，姜黄素的浓度为0.5mg/mL；
本实施例中其他实施方式与实施例1相同。
实施例8
本实施例中，姜黄素的浓度为1mg/mL；
本实施例中其他实施方式与实施例7相同。
实施例9
本实施例中，姜黄素的浓度为2mg/mL；
本实施例中其他实施方式与实施例7相同。
对比例1
本实施例，不加姜黄素，即姜黄素的浓度为0mg/mL。
本实施例中其他实施方式与实施例1相同。
对比例2
本实施例，不加姜黄素，即姜黄素的浓度为0mg/mL。
本实施例中其他实施方式与实施例4相同。
对比例3
本实施例，不加姜黄素，即姜黄素的浓度为0mg/mL。
本实施例中其他实施方式与实施例7相同。
对BSG蛋白组分F1、F2、F3进行鉴定表征。
(1)利用燃烧法(Leco氮分析仪FP-428，Joseph，MI，USA，使用的氮转化系数为6.25。)测定组分F1、F2和F3的蛋白质含量分别为85.3±2.8％、81.8±2.3％和76.9±3.5％。
(2)采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白质组分的分布。还原条件下，采用垂直Bio-Rad微型凝胶电泳装置，恒定的操作电压为200V。
将溶解在水中的200μL，4mg/mL蛋白质溶液(pH＝12.0)与含有2-ME的600μLLaemmli样品缓冲液(4×Bio-Rad)混合。将所得混合物进行剧烈涡旋振荡，然后在沸水中加热10分钟，然后在3000g离心10分钟，以除去任何不溶成分。冷却至室温后，将10μL上清液装载到凝胶孔中。凝胶被考马斯亮蓝R-250染色，然后在拍摄图像前在水中放置一夜。
一般，BSG中的蛋白质主要由醇溶蛋白和一些谷蛋白组成，醇溶蛋白主要采用醇法或碱法提取，谷蛋白主要采用碱法提取。因此，组分F1应该包含所有蛋白质，而醇溶蛋白和谷蛋白分别在组分F2和组分F3中更丰富。三种BSG蛋白组分的SDS-PAGE图谱如图2所示，组分F2和组分F3中观察到的几乎所有条带都出现在组分F1中，这表明碱溶液的强度足以从BSG中提取出醇溶蛋白和谷蛋白组分。分子量为37-60kda的酶带先前被鉴定为hordein亚基，F2中的这些条带的强度比F3更高，这表明F2中富含更多的醇溶蛋白。然而，F3在分馏后仍含有一些醇溶蛋白。此外，F3在可视区域的带强度低于F1和F2，这表明F3可能含有更多的低分子量蛋白质(例如，分子量<10kDa)。
对实施例1-9及对比例1-3中制得的姜黄素纳米颗粒进行性能鉴定。
(1)粒径、多分散性指数(PDI)和ζ电位
将制得的姜黄素纳米颗粒，适当稀释后，使用Zetasizer Nano ZS(英国伍斯特郡马尔文仪器有限公司)通过动态光散射(DLS)测定纳米粒子的粒径(体积加权平均值d4,3)、PDI和ζ电位。所有测量均在25℃下进行，一式三份。d4,3根据Mie理论使用公式(1)计算：
Figure BDA0002619939580000081
式中，ni是DLS直接确定的流体动力学直径di的粒子数。
(2)封装效率(EE)和负载能力(LC)
在黑暗(4℃)条件下，在磁力搅拌下将20毫克姜黄素纳米颗粒冻干粉分散在10毫升二甲基亚砜(DMSO)中。孵育2小时后，将分散液以5000rpm离心10分钟(Minipin plus，Eppendorf，Hamburg，Germany)，以除去不溶性成分。使用二甲基亚砜稀释淡黄色上清液，然后通过Evolution 201UV-Vis分光光度计(Thermo Scientific，Rochester，NY，USA)在425nm处定量。用0-10μg/mL的二甲基亚砜中游离的姜黄素(R2＝0.999)建立校准曲线。姜黄素的EE和LC分别由式(2)和(3)计算：
EE(％)＝(纳米颗粒中姜黄素的质量)/(姜黄素总添加质量)×100％(2)
LC(％)＝(纳米颗粒中姜黄素的质量)/(纳米颗粒中蛋白质的质量)×100％(3)
场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)
采用FE-SEM(日立S-4700，加利福尼亚州普莱森顿，美国)对颗粒形貌进行了研究。用水适当稀释纳米颗粒悬浮液，然后滴入孔径为200nm的聚碳酸酯膜过滤器(Sterlitech公司，美国华盛顿州)，然后在21℃真空(3kPa)下干燥。样品表面被溅射镀上导电金层(<0.5nm)，并在5.0kV的加速电压下以30000×放大倍数获得图像。
姜黄素纳米粒子的热稳定性
将20ml新制备的姜黄素纳米颗粒样品转移到玻璃瓶中，然后在35℃、50℃、65℃和80℃水浴中孵育30min。用二甲基亚砜稀释后，在425nm处用分光光度法分析姜黄素残留浓度，如EE测量所述。
姜黄素纳米粒子的光稳定性
在连续搅拌下，使用Gel Doc 1000微型透照仪(Bio Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)将20mL新制备的姜黄素纳米粒子暴露于紫外线(350nm)下60min。每隔10min取一次样品，在425nm处用分光光度法对姜黄素浓度进行定量。
DPPH自由基清除活性。
测定游离姜黄素和包封姜黄素的DPPH清除能力。具体地，用水将包封的姜黄素或乙醇溶解的姜黄素稀释到2-10μg/mL。将2ml DPPH(100μM)乙醇溶液与等量的包封姜黄素或乙醇溶解的姜黄素完全涡旋振荡。对照组为：不含姜黄素的DPPH乙醇溶液。将混合物置于25℃黑暗中进行反应。孵育30分钟后，使用上述分光光度计在517nm处读取溶液的吸光度。DPPH清除活性由式(4)计算：
DPPH清除活性(％)＝(A对照-A样品)/A对照×100％
荧光光谱学
用荧光光度计(LS55，Perkin Elmer，Norwalk，CT，USA)研究了BSG蛋白质组分在pH12.0下的荧光光谱。
将姜黄素粉末溶解在pH值为12.0的水中，制成储备溶液(2mM)。然后将姜黄素添加到0.1％(w/v)BSG蛋白质分散液中，在pH 12.0下获得最终姜黄素浓度为0-45μM。在295nm处激发蛋白质的固有荧光，并记录320至480nm的发射光谱。激发和发射的狭缝宽度均设置为10nm。以不含蛋白质的游离姜黄素溶液为对照，减去姜黄素自身产生的背景荧光、拉曼峰和其他散射伪影。
统计分析
除非另有说明，否则所有测量均一式三份。结果以标准差的平均值表示，并使用SAS9.4(SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA)通过Tukey检验进行方差分析。在统计学上有显著意义的P值设定为0.05。
鉴定结果如下：
粒径、PDI和ζ电位是评价生物聚合物纳米颗粒质量和稳定性的关键参数。采用不同姜黄素含量(0-2mg/mL)制备得到的纳米颗粒的平均粒径如图3A所示。对于对比例(不含姜黄素)，其中对比例2中纳米颗粒的尺寸最小(173.8nm)，其次是对比例1中纳米颗粒的尺寸(209.1nm)，而对比例3中纳米颗粒的粒径最大(233.5nm)。对于所有样品，制备后都没有观察到沉淀，这表明在pH循环处理后产生了一个新的亲水界面，以保护这些疏水蛋白在中性pH下不聚集。当姜黄素被包裹或者包封时，对于所有姜黄素浓度(0-2mg/mL)，采用F1和F2制备的纳米颗粒的平均尺寸仍小于由F3制备的纳米颗粒。此外，当姜黄素浓度从0.5增加到2mg/mL时，只有采用F3制备的纳米颗粒的粒径(245.9～306.9nm)显著增加(P<0.05)。在姜黄素含量较高的情况下，许多游离姜黄素分子，可能无法迁移到纳米粒子内部，而是倾向于吸附在颗粒的外层。
不同姜黄素浓度对姜黄素纳米粒子PDI的影响如图3B所示。PDI的总体趋势与粒径相似，即在所有测试姜黄素浓度下(0-2mg/mL)，由F3制得的纳米粒子的PDI值显著大于由F1、F2制备的纳米颗粒(P<0.05)。较小的粒径和较窄的PDI表明制备的姜黄素纳米颗粒的稳定性较高。粒径和PDI测量均证实，由F2制备的纳米颗粒(实施例4-6)表现出比其他两个部分(实施例1-3,7-9)更好的稳定性能。
如图3C所示，发现所有样品(所有实施例与对比例)的ζ电位均为负，范围为-32.5至-34.8mv。随着姜黄素浓度的增加，ζ电位无明显差异。
姜黄素纳米粒子的包封率(EE)和负载量(LC)
通过测定不同蛋白质组分制备的纳米颗粒的EE(采用立柱表示)和LC(采用虚线表示)，确定姜黄素的最大负载量。如图4所示，随着姜黄素浓度的增加，纳米粒子的EE值逐渐降低，实施例1-3中，由F1制备的纳米粒子的EE值为73.6％～61.0％，实施例4-7中，由F2制备的纳米粒子的EE值为83.8％～73.6％，实施例4-7中，由F3制备的纳米粒子的EE值为58.9％～23.7％。这表明，较高的姜黄素浓度会导致更多的姜黄素沉淀在纳米颗粒外，而不是被包裹在由蛋白质形成的聚合物基质中。未被包封的姜黄素可能导致形成大的聚集体，这进一步被逐渐增大的粒径所证实(图3A)。在三种姜黄素浓度下，由F3制备的纳米粒子的EE值最低，由F2制备的纳米粒子的EE值最高。除实施例7-9(由F3制备的纳米粒子)外，实施例1-6中，LC随着姜黄素比例的增加而逐渐增加。实施例4-6中，由F2制备的纳米粒子的EE和LC最高(83.8％和7.36g姜黄素/100g F2蛋白质，P<0.05)。也就是说，BSG蛋白组分F2使姜黄素的溶解度达到1.472mg/mL，远高于室温下游离姜黄素(11ng/mL)的溶解度。这些结果表明，卵磷脂稳定的BSG蛋白提取物包裹的姜黄素纳米颗粒可显著提高姜黄素的水溶性，从而拓宽姜黄素的工业应用范围。与F1和F2相比，F3的包封能力较差，这可能是由于SDS-PAGE中观察到的低分子量蛋白质组分较多(图2)。在以下的研究中，使用姜黄素浓度为0.5mg/mL制备的姜黄素纳米颗粒(实施例1,4,7)，因为此纳米颗粒具有最高EE值，而且制备过程中未观察到姜黄素沉淀。
形态学
使用FE-SEM研究了不同蛋白质组分制备的纳米颗粒形态，如图5所示，图5中，A1、B1、C1分别代表对比例1，2，3，制备过程中均不含姜黄素；A2、B2、C2分别代表实施例1，4，7，制备过程中均含有姜黄素。由图5可知，实施例4中，由F2制备的姜黄素纳米颗粒呈典型的球形，表面光滑。此外，它的粒径分布比其他两种(实施例4,7)更均匀，更小，这与DLS测量结果一致。相比之下，实施例7中，由F3制备的纳米颗粒为更大和更不均匀的聚集颗粒，形状不规则，这种现象也可以在实施例1中发现。这与DLS技术测量的较大PDI值和平均粒径一致(如图3所示)。所有的样品(对比例1-3，实施例1,4,7)都有一些相互连接的颗粒，可能是由于卵磷脂的存在。
姜黄素纳米颗粒的热稳定性和紫外辐照稳定性
姜黄素在暴露于某些环境压力(包括氧气、热处理和紫外线辐射)时易受伤害，因此其生物利用度受到限制。然而，巴氏杀菌和辐射灭菌是食品应用中常见的处理方法，可能导致姜黄素降解。为了评估纳米颗粒制剂的保护效果，我们评估了被包裹的姜黄素纳米颗粒与游离姜黄素的热稳定性和紫外辐照稳定性。如图6A所示，在65℃和80℃加热后，游离姜黄素的保留率分别下降到33.9％和20.3％。在相同的热处理条件下，实施例中，被包裹的姜黄素纳米颗粒的稳定性较好(P<0.01)。80℃孵育30min后，实施例1(F1)和实施例7(F3)中，姜黄素含量分别为47.1％和35.4％，而实施例4(F2)中仍有57.3％的姜黄素残留，实施例1(F1)的保护效果明显好于实施例7(F3)。
游离姜黄素和被包封或者包裹的姜黄素在暴露于紫外线不同时间刺激下的光稳定性也被测定。在紫外线处理60分钟后，游离姜黄素的保留率降低到只有28.7％(图6B)。经F1、F2和F3包封后，姜黄素对紫外线刺激的保留率分别提高到61.5％、70.6％和52.1％，均显著高于游离姜黄素(P<0.05)。这可能是由于姜黄素在生物聚合物基质中聚集，被蛋白质F1、F2和F3包封后的姜黄素不容易被紫外线氧化。同时，紫外线可被蛋白质中的双键和芳香侧基吸收，进一步屏蔽紫外线辐射。与F1和F3相比，F2为姜黄素提供了更好的保护。总的来说，包封后姜黄素的稳定性大大提高。
抗氧化活性
姜黄素通过提供不稳定的氢原子而具有抗氧化活性，从而清除自由基。通过DPPH清除试验(图7)评估包封对姜黄素抗氧化活性的影响。以不含姜黄素的纳米颗粒为对照，对其抗氧化活性进行了分析。显然，三种剂型中的姜黄素具有比游离姜黄素更高的DPPH自由基清除活性。这可能是由于BSG蛋白提取物中存在抗氧化成分。不同BSG蛋白组分制备的姜黄素纳米颗粒无显著差异。
BSG蛋白提取物与姜黄素的结合亲和力及其复合纳米粒子的形成机理
BSG蛋白提取物中含有近1.4g/kg色氨酸(Trp)，这可能有助于蛋白质在295nm激发下发射荧光。如图8所示，三个组分的最大荧光峰都在360nm左右，F2的荧光强度比F1或F3强。这表明三种样品中色氨酸Trp的浓度存在差异，这与SDS-PAGE的结果一致。将姜黄素滴到蛋白质样品中，蛋白质荧光逐渐熄灭，荧光发射峰蓝移，这表明蛋白质与姜黄素的相互作用使Trp残基的环境发生了很大的变化。与F1和F3相比，随着姜黄素浓度的增加，F2荧光强度下降更为明显。采用Stern-Volmer方程进一步分析了详细的淬火机理，如下所示：
Figure BDA0002619939580000131
其中，F0和F分别是在295nm激发下姜黄素存在和不存在时的蛋白质的荧光强度，kq是生物分子猝灭速率常数，τ0是没有姜黄素的荧光基团的平均寿命，等于10-8s，Ksv是Stern-Volmer猝灭常数，通过计算F0/F与姜黄素浓度[C]曲线的斜率，进而得到Ksv的数值。
如图8右上角的插图所示，F0/F与姜黄素浓度[C]的曲线图被确定为线性回归。计算出斜率(kq)分别为3.63×1012,4.21×1012和3.01×1012M-1·s-1，分别对应于图(A)、图(B)、图(C)。显然，三种情况下的kq均比最大动态猝灭常数(2×1010M-1·s-1)高两个数量级。
结果表明，姜黄素与BSG蛋白分子相互作用的主要机制是静态猝灭(由非发光基态络合物的形成引起)，而不是扩散受限的动态猝灭。与F1和F3相比，F2具有更高的KSV和kq值，表明与姜黄素的结合亲和力更强。姜黄素与F2的较强结合亲和力也有助于解释观察到的微观结构，姜黄素-F2纳米颗粒显示出更紧密的结构(图5B)，粒径更小(图3A)，因此能够更好的保护姜黄素，防止其降解(图6)。
卵磷脂包覆BSG蛋白质复合纳米粒子的形成机理如图9所示。在pH值为12.0时，姜黄素分子被脱质子化，并溶解，而BSG蛋白提取物带负电，可能会解离成一个更开放的结构，就像玉米醇溶蛋白一样。在这种情况下，允许姜黄素扩散到更疏水的区域，形成静态结合(图8)。在中性pH条件下，将碱性溶液滴入卵磷脂溶液中，姜黄素质子化，而BSG蛋白提取物中的疏水区由于中性pH下疏水相互作用的增加而迅速向内卷曲，与疏水区结合的姜黄素分子可以被包裹在BSG蛋白提取物的疏水核内，从而形成胶体颗粒。同时，两亲性卵磷脂的烷基链可以通过疏水吸引嵌入到BSG蛋白提取物的疏水区，卵磷脂分子可以沉积在BSG蛋白提取物表面，提供粒子间的静电斥力。F2的包封性能优于其它两个蛋白组分，说明醇溶蛋白在BSG蛋白提取物中起主要的包封作用。
显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

Claims (6)

1.一种姜黄素纳米颗粒的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)在室温下，将1.5-2.5g BSG蛋白提取物与姜黄素加入100mL水中，混合；混合液中姜黄素的浓度为0.5-2mg/mL；
(2)将步骤(1)得到的混合液的pH值调到11.5-12.0，然后以600-1000rpm的速度进行磁力搅拌，使各组分均匀分散；
(3)孵育10-30分钟后，将10mL步骤(2)得到的分散液逐滴加入40mL 0.15-0.25％(w/v)的卵磷脂溶液中，并以8000-10000rpm的速度均质1-5分钟；
(4)将步骤(3)得到的分散液中和至pH6.5-7.2，并在2000-3000g下离心5-10分钟，除去聚集物和游离姜黄素，得到姜黄素纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的一种姜黄素纳米颗粒的制备方法，其特征是，步骤(1)中，所述的BSG蛋白提取物为采用碱法或/和醇法从啤酒糟中提取的蛋白质组分。
3.根据权利要求2所述的一种姜黄素纳米颗粒的制备方法，其特征是，步骤(1)中，所述的BSG蛋白提取物为采用醇法从啤酒糟中提取的蛋白质组分，具体的提取步骤为：
1)研磨干燥后的BSG至粒径小于1mm；
2)将步骤1)研磨后的BSG直接浸入含有体积分数为0.5％的2-巯基乙醇的pH值为10.5-11.0的水中，BSG与2-巯基乙醇水溶液的质量比为0.5-1.5:10；
3)将步骤2)得到的BSG碱性悬浮液密封，并在40℃恒温水浴中进行搅拌，然后在10℃，8000-10000g离心10-30min，后收集上清液；
4)将步骤3)得到的上清液用HCl调节pH＝4.5-5.5或旋转蒸发，然后冻干，得到BSG蛋白组分F1。
4.根据权利要求2所述的一种姜黄素纳米颗粒的制备方法，其特征是，步骤(1)中，所述的BSG蛋白提取物为采用醇法从啤酒糟中提取的蛋白质组分，具体的提取步骤为：
1)研磨干燥后的BSG至粒径小于1mm；
2)用体积分数40-60％的乙醇水溶液处理BSG粉，在40℃搅拌0.5-1.5h；离心后收集上清液；
3)将步骤2)得到的上清液用HCl调节pH＝4.5-5.5或旋转蒸发，然后冻干，得到BSG蛋白组分F2。
5.根据权利要求2所述的一种姜黄素纳米颗粒的制备方法，其特征是，步骤(1)中，所述的BSG蛋白提取物为从啤酒糟中提取的蛋白质组分，具体的提取步骤为：
1)研磨干燥后的BSG至粒径小于1mm；
2)用体积分数为40-60％乙醇水溶液处理BSG粉，在40℃搅拌0.5-1.5h，离心后收集不溶性残渣；
3)用含体积分数为0.5％的2-ME的pH 11.0的碱性溶液处理步骤2)得到的不溶性残渣，离心后收集上清液；
4)将步骤3)得到的上清液用HCl调节pH＝4.5-5.5或旋转蒸发，然后冻干，得到BSG蛋白组分F3。
6.一种姜黄素纳米颗粒，其特征是，采用权利要求1-5中任意一项所述的制备方法制备得到。
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