CN111870685A - 运动相关多肽在制备防治缺血性心脏病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了运动相关多肽在制备防治缺血性心脏病药物中的应用，运动相关多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者与SEQ ID NO.1具有至少70％同源性。本发明首次将运动相关多肽用于制备治疗或/和治疗心脏病的药物，并且运动相关多肽用于控制心脏病的效果在细胞模型和动物模型上得以验证。特别是，运动相关多肽能提升缺氧状态下心肌细胞的活力、显著抑制凋亡相关蛋白的激活和活性氧的积累，同时能减少冠状动脉结扎大鼠血清中CK‑MB及cTnI含量及心肌梗死面积。并且，本发明的运动相关多肽作为药物成分时，还具有毒性低、分子量小、免疫原性小和成药性高等优势。

Description

运动相关多肽在制备防治缺血性心脏病药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，涉及一种运动相关多肽在制备防治缺血性心脏病药物中的应用。

背景技术

心脏病是一类比较常见的循环系统疾病。其中，缺血性心脏病是一类高发病率、高致死率的心血管疾病，年死亡人数近1780万，长期占据各种致死因素的榜首。我国缺血性心脏病形势更加严峻，据统计在2016年我国居民死亡总人数967万中，因缺血性心脏病死亡的人数高达172万人。在临床上，尽管介入手术能在一定程度上缓解缺血性心脏病患者的临床症状，提高缺血性心脏病患者的生存率，但是因缺血再灌注导致的心肌损伤却是目前心血管疾病防治领域的难点与前沿问题，亟待解决。因此，积极寻找缺血性心脏病治疗的有效干预策略，无疑具有较大的临床价值和社会意义。

多肽由于其毒性低、分子量小、靶向性好和易进入细胞等特点，已成为生物药物研发的一大趋势。在心血管疾病的诊断及治疗方面，有关多肽的研究已有了广泛的临床应用。如：脑利钠肽BNP已作为临床上心衰的重要诊断指标；人工合成脑利钠肽(新活素)已成为治疗心力衰竭的药物并成功上市。近年来GLP-1肽类似物利拉鲁肽在糖尿病临床治疗上的应用，更是为多肽药物的研发与转化研究注入了强心剂。

转胶蛋白(Transgelin，TAGLN)是一个相对分子质量为22000的肌动蛋白结合蛋白，是钙调蛋白家族中的一员，也是分化型血管平滑肌细胞的标志基因之一。转化生长因子β可诱导转胶蛋白基因表达。转胶蛋白通过与肌动蛋白相结合，促进G-actin聚合而形成F-actin。转胶蛋白通过抑制基质金属蛋白酶-9参与组织重塑，成为研究肺组织纤维化、肺损伤的新线索。此外，还有报道转胶蛋白可能抑制肿瘤细胞的迁移和浸润。但还未有报道运动相关多肽用于心脏病治疗。

发明内容

基于此，本发明的主要目的是提供一种运动相关多肽的新应用，主要是将运动相关多肽用于制备预防或/和治疗心脏病的药物。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

运动相关多肽在制备预防或/和治疗心脏病的药物中的应用，所述运动相关多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者所述运动相关多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO.1具有至少70％同源性。

在其中一些实施例中，所述心脏病为缺血性心脏病。

在其中一些实施例中，所述药物包含运动相关多肽以及药学上可接受的辅料。

在其中一些实施例中，所述药物的给药途径包括静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、口服给药、舌下给药、鼻腔给药或者经皮给药。

在其中一些实施例中，所述药物的剂型为片剂、颗粒剂、丸剂、粉剂或者胶囊剂。

在其中一些实施例中，所述药物的剂型为注射剂、口服液、眼用制剂或者外用制剂。

在其中一些实施例中，所述辅料选自填充剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、色香味调节剂、溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、抗氧剂、金属络合剂、惰性气体、抑菌剂、局部止痛剂、pH调节剂、等渗或等张调节剂中的至少一种。

在其中一些实施例中，所述填充剂选自淀粉类、糖类、纤维性类和无机盐类中的至少一种；或/和，所述润湿剂选自纯化水、乙醇中的至少一种；或/和，所述黏合剂选自淀粉浆、糊精、糖粉与糖浆、纤维素衍生物、明胶、聚维酮以及聚乙二醇中的至少一种；或/和，所述崩解剂选自干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、表面活性剂、泡腾崩解剂中的至少一种；或/和，所述润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、十二烷基硫酸镁、微粉硅胶以及聚乙二醇中的至少一种；或/和，所述色香味调节剂选自色素、香精、香料、甜味剂、胶浆剂以及矫臭剂中的至少一种；或/和，所述溶剂选自注射用水、注射用油、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、二甲基亚砜、液体石蜡、脂肪油以及乙酸乙酯中的至少一种；或/和，所述增溶剂选自吐温类、卖泽类、聚氧乙烯脂肪醇醚类、肥皂类、硫酸化物、磺酸化物中的至少一种；或/和，所述助溶剂选自有机酸及其盐类、酰胺及胺类化合物、无机盐、聚乙二醇、聚维酮、甘油中的至少一种；或/和，所述乳化剂选自司盘类、吐温类、卖泽类、苄泽类、甘油脂肪酸酯、高级脂肪酸盐、硫酸化物、磺酸化物、阿拉伯胶、西黄耆胶、明胶、果胶、磷脂、琼脂、海藻酸钠、氢氧化物、二氧化硅以及皂土中的至少一种；或/和，所述助悬剂选自甘油、糖浆、阿拉伯胶、西黄耆胶、琼脂、海藻酸钠、纤维素衍生物、聚维酮、卡波普、葡萄糖、聚乙烯醇、触变胶中的至少一种；或/和，所述抗氧剂选自亚硫酸盐、焦亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、抗坏血酸、没食子酸及其酯类中的至少一种；或/和，所述金属络合剂选自乙二胺四乙酸二钠以及多羧酸化合物中的一种；或/和，所述惰性气体选自氮气以及二氧化碳中的一种；或/和，所述抑菌剂选自尼泊金类、有机酸及其盐、季铵类化合物、醋酸氯己定、醇类、酚类、挥发油中的至少一种；或/和，所述局部止痛剂选自苯甲醇、三氯叔丁醇、利多卡因以及普鲁卡因中的至少一种；或/和，所述pH调节剂选择盐酸、硫酸、磷酸、枸橼酸、酒石酸、醋酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、乙二胺、葡甲胺、磷酸盐、醋酸盐以及枸橼酸盐中的至少一种；或/和，所述等渗或等张调节剂选自葡萄糖、氯化钠、枸橼酸钠、山梨醇、木糖醇中的至少一种。

在其中一些实施例中，所述运动相关多肽通过化学合成的方式或者生物合成的方式制备。

本发明的有益效果包括：

本发明首次将运动相关多肽用于制备治疗或/和治疗心脏病的药物，并且运动相关多肽用于控制心脏病的效果在细胞模型和动物模型上得以验证。特别是，运动相关多肽能提升缺氧状态下心肌细胞的活力、显著抑制凋亡相关蛋白的激活和活性氧的积累，同时能减少冠状动脉结扎大鼠血清中CK-MB及cTnI含量及心肌梗死面积。并且，本发明的运动相关多肽作为药物成分时，还具有毒性低、分子量小、免疫原性小和成药性高等优势。

附图说明

图1是实施例2对各组H9c2心肌细胞的活力测试结果；其中，图1A是物理缺氧下各组H9c2心肌细胞的活力测试结果，图1B是化学缺氧下各组H9c2心肌细胞的活力测试结果。

图2是实施例2对各组H9c2心肌细胞的乳酸脱氢酶释放水平测试结果；其中，图2A是物理缺氧下各组H9c2心肌细胞的乳酸脱氢酶测试结果，图2B是化学缺氧下各组H9c2心肌细胞的乳酸脱氢酶测试结果。

图3是实施例2对各组H9c2心肌细胞的活性氧积累情况的检测结果。

图4是实施例2对各组H9c2心肌细胞凋亡相关蛋白水平的检测结果。

图5是实施例3TAGLN多肽对各组心肌缺血再灌注损伤SD大鼠血清中肌酸激酶及肌钙蛋白的含量影响的测试结果；其中，图5A是TAGLN多肽对心肌缺血再灌注损伤SD大鼠血清中肌钙蛋白含量影响的测试结果，图5B是TAGLN多肽对心肌缺血再灌注损伤SD大鼠血清中肌酸激酶含量影响的测试结果。

图6是实施例3TAGLN多肽对各组心肌缺血再灌注损伤SD大鼠心肌梗死面积影响的测试结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明实施例所涉“多肽”，是α－氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，是蛋白质水解的中间产物。由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽，同理类推还有三肽、四肽、五肽等。通常由10-100个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽。

本发明实施例涉及运动相关多肽的新应用，具体涉及运动相关多肽在制备预防或/和治疗心脏病的药物中的应用，所述运动相关多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者所述运动相关多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO.1具有至少70％同源性。

本发明首次将运动相关多肽用于制备治疗或/和治疗心脏病的药物，并且运动相关多肽用于控制心脏病的效果在细胞模型和动物模型上得以验证。特别是，运动相关多肽能提升缺氧状态下心肌细胞的活力、显著抑制凋亡相关蛋白的激活和活性氧的积累，同时能减少冠状动脉结扎大鼠血清中CK-MB及cTnI含量及心肌梗死面积。并且，本发明的运动相关多肽作为药物成分时，还具有毒性低、分子量小、免疫原性小和成药性高等优势。

本发明内容还包括所述多肽在制备心肌保护药物上的应用。发明人发现，随所述多肽浓度的增加，缺氧条件下心肌细胞的生存率提高，并呈现剂量依赖性，在50μM可以显著提高缺氧下心肌细胞生存率。

优选地，所述心脏病为缺血性心脏病。本发明实施例所涉“缺血性心脏病”，心肌细胞存活率降低、乳酸脱氢酶的释放水平升高、活性氧积累增多、凋亡相关蛋白的水平上升。

优选地，所述药物包含运动相关多肽以及药学上可接受的辅料。

可以理解的是，本发明实施例对药物的给药途径不做特别限定，包括但不限于静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、口服给药、舌下给药、鼻腔给药、经皮给药等。

可以理解的是，本发明实施例对药物的剂型不做特别限定，包括但不限于片剂、颗粒剂、丸剂、粉剂、胶囊剂、注射剂、口服液、眼用制剂、外用制剂等。

可以理解的是，本发明实施例对辅料的种类不做特别限定，包括但不限于如下种类：填充剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、色香味调节剂、溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、抗氧剂、金属络合剂、惰性气体、抑菌剂、局部止痛剂、pH调节剂、等渗或等张调节剂等。

进一步地，所述填充剂选自淀粉类、糖类、纤维性类和无机盐类中的至少一种；或/和，所述润湿剂选自纯化水、乙醇中的至少一种；或/和，所述黏合剂选自淀粉浆、糊精、糖粉与糖浆、纤维素衍生物、明胶、聚维酮以及聚乙二醇中的至少一种；或/和，所述崩解剂选自干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、表面活性剂、泡腾崩解剂中的至少一种；或/和，所述润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、十二烷基硫酸镁、微粉硅胶以及聚乙二醇中的至少一种；或/和，所述色香味调节剂选自色素、香精、香料、甜味剂、胶浆剂以及矫臭剂中的至少一种；或/和，所述溶剂选自注射用水、注射用油、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、二甲基亚砜、液体石蜡、脂肪油以及乙酸乙酯中的至少一种；或/和，所述增溶剂选自吐温类、卖泽类、聚氧乙烯脂肪醇醚类、肥皂类、硫酸化物、磺酸化物中的至少一种；或/和，所述助溶剂选自有机酸及其盐类、酰胺及胺类化合物、无机盐、聚乙二醇、聚维酮、甘油中的至少一种；或/和，所述乳化剂选自司盘类、吐温类、卖泽类、苄泽类、甘油脂肪酸酯、高级脂肪酸盐、硫酸化物、磺酸化物、阿拉伯胶、西黄耆胶、明胶、果胶、磷脂、琼脂、海藻酸钠、氢氧化物、二氧化硅以及皂土中的至少一种；或/和，所述助悬剂选自甘油、糖浆、阿拉伯胶、西黄耆胶、琼脂、海藻酸钠、纤维素衍生物、聚维酮、卡波普、葡萄糖、聚乙烯醇、触变胶中的至少一种；或/和，所述抗氧剂选自亚硫酸盐、焦亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、抗坏血酸、没食子酸及其酯类中的至少一种；或/和，所述金属络合剂选自乙二胺四乙酸二钠以及多羧酸化合物中的一种；或/和，所述惰性气体选自氮气以及二氧化碳中的一种；或/和，所述抑菌剂选自尼泊金类、有机酸及其盐、季铵类化合物、醋酸氯己定、醇类、酚类、挥发油中的至少一种；或/和，所述局部止痛剂选自苯甲醇、三氯叔丁醇、利多卡因以及普鲁卡因中的至少一种；或/和，所述pH调节剂选择盐酸、硫酸、磷酸、枸橼酸、酒石酸、醋酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、乙二胺、葡甲胺、磷酸盐、醋酸盐以及枸橼酸盐中的至少一种；或/和，所述等渗或等张调节剂选自葡萄糖、氯化钠、枸橼酸钠、山梨醇、木糖醇中的至少一种。

可以理解的是，本发明实施例对运动相关多肽的氨基酸序列构成进行限定的基础上，对该运动相关多肽的制备方式不做特别限定，可以是通过化学合成的方式，也可以通过生物合成的方式。化学合成的方式包括但不限于：固相合成法和液相合成法以及其他多肽合成方法包括氨基酸的羧内合酸酐法(NCA)和组合化学法。生物合成的方式包括但不限于：发酵法、酶解法、基因工程法等。

本发明实施例SEQ ID NO.1：Met-Gly-Ser-Asn-Arg-Gly-Ala-Ser-Gln-Ala-Gly-Met-Thr-Gly-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Gln-Ile-Ile–Ser(MGSNRGASQAGMTGYGRPRQIIS)。

该运动相关多肽具有23个氨基酸，位于人Transgelin蛋白第179-201位氨基酸，核苷酸序列(SEQ ID NO.2)为3’-gga ctc tct gta gca gat ttg gca gag agt ata atg aagaat ctt-5’，等电点(PI)为11.71，分子质量(MW)为2395.70。半衰期为30h，不稳定系数(Instability Index)为11.70，表明该多肽较为稳定。

实施例1：TAGLN多肽(即“运动相关多肽”)序列及制备

氨基酸序列：其通式为：X-P-Y，

所述P为：Met-Gly-Ser-Asn-Arg-Gly-Ala-Ser-Gln-Ala-Gly-Met-Thr-Gly-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Gln-Ile-Ile-Ser；

X为：NH₃或任意一种氨基酸或任意两种氨基酸的组合；

Y为：OH或任意一种氨基酸或任意两种氨基酸的组合；

由上海科肽生物技术公司通过固相化学合成，纯度在95％以上。

实施例2：细胞实验

1.实验细胞：H9c2心肌细胞为大鼠心肌细胞，购自美国菌种保藏中心(ATCC,American Type Culture Collection)。

2.细胞缺氧方法

(1)物理缺氧：

1)H9c2心肌细胞培养：以六孔板接种H9c2心肌细胞，采用DMEM培养基培养至待密度达到80％。

2)H9c2心肌细胞分组处理：

A、用于缺氧组的H9c2心肌细胞换成无糖无血清的DMEM培养基，并进行如下分组：

以终浓度为50μmol/L的TAGLN多肽预处理H9c2心肌细胞，2h后，缺氧组置于缺氧箱中按条件进行缺氧8h，复氧2h，记作“H/R+TAGLN”；

以50μmol/L的Scr预处理H9c2心肌细胞，2h后，缺氧组置于缺氧箱中按条件进行缺氧8h，复氧2h，记作“H/R+Scr”。

B、用于对照组的H9c2心肌细胞换成DMEM完全培养基，并进入如下分组处理：

以50μmol/L的TAGLN多肽预处理H9c2心肌细胞，不做物理缺氧处理，常规培养12h，记作“TAGLN”；

以50μmol/L的Scr预处理H9c2心肌细胞，不做物理缺氧处理，常规培养12h，记作“Scr”。

(2)化学缺氧：

1)H9c2心肌细胞培养：以六孔板接种H9c2心肌细胞，采用DMEM培养基培养至待密度达到80％。

2)H9c2心肌细胞分组处理：

A、用于缺氧组的H9c2心肌细胞在正常培养基(DMEM培养基)培养并进行如下分组：

加入50μmol/L的TAGLN多肽预处理H9c2心肌细胞，2h后，缺氧组加入模拟物Cocl2使终浓度为800μmol/L进行24h化学缺氧，记作“Cocl2+TAGLN”。

加入50μmol/L的Scr预处理H9c2心肌细胞，2h后，缺氧组加入模拟物Cocl2使终浓度为800μmol/L进行24h化学缺氧，记作“Cocl2+Scr”。

B、用于对照组的H9c2心肌细胞在正常培养基培养并进行如下分组：

加入50μmol/L的TAGLN多肽预处理H9c2心肌细胞，不添加模拟物Cocl2进行化学缺氧处理，常规培养26h，记作“TAGLN”。

加入50μmol/L的Scr预处理H9c2心肌细胞，不添加模拟物Cocl2进行化学缺氧处理，常规培养26h，记作“Scr”。

3.实验方法

3.1H9c2心肌细胞活力检测

将H9c2心肌细胞种植于96孔板，按上述缺氧方法处理后，按照cck-8检测试剂盒步骤进行检测，96孔板中每孔加入10μl的cck-8试剂，37℃避光孵育2h后，酶标仪检测450nm的吸光度。

3.2乳酸脱氢酶的活性检测

分别吸取上述第2步所得各组H9c2心肌细胞的细胞培养基，8000rpm离心5min，取上清。96孔板每孔加入上述上清样品120μl和乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒的工作液60μl，参照试剂盒的操作要求，室温孵育30min后，酶标仪检测490nm的吸光度。

3.3H9c2心肌细胞内活性氧检测

将H9c2心肌细胞种植于6孔板，按上述物理缺氧方法处理后，弃去6孔板中培养基，每孔加入1ml稀释后的DCFH-DA荧光探针并在37℃避光孵育20min。弃去探针，并用PBS液润洗3次以去除残留的探针。使用荧光显微镜对6孔板中细胞拍照，并用Image J软件进行定量分析。

3.4凋亡相关蛋白检测

将H9c2心肌细胞种于6孔板，在H9c2心肌细胞物理缺氧处理前加入50μM TAGLN多肽，物理缺氧处理后收集蛋白。

将待测H9c2心肌细胞经PBS洗涤2次后，每孔加入100μl含有蛋白酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液，用细胞刮刮取细胞并转移到1.5ml离心管中，置于冰上裂解30分钟，4℃，12000rpm，离心30分钟，取上清。

用BCA法蛋白定量试剂盒进行蛋白定量后，同一批样品取相同蛋白量用1×Loading Buffer制样混匀，于95℃干式恒温器加热5分钟。取30μg蛋白，经SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，一抗、二抗孵育后，用ECL试剂盒显示蛋白条带，于多色荧光、化学发光凝胶成像系统(FluorChem M)显色，蛋白灰度分析通过ImageJ软件分析。

4.实验结果

4.1TAGLN多肽提高缺氧下心肌细胞的活力

通过应用cck-8检测试剂盒，检测活细胞内线粒体脱氢酶从而间接反映活细胞数目。图1是实施例1对H9c2心肌细胞的活力测试结果；其中，图1A是物理缺氧下H9c2心肌细胞的活力测试结果，图1B是化学缺氧下H9c2心肌细胞的活力测试结果。根据图1A和图1B可知：相比较对照组(“TAGLN”组、“Scr”组)，物理缺氧及化学缺氧组活细胞数显著减少(P<0.01)，而缺氧加TAGLN多肽组(“H/R+TAGLN”组、“CoCl2+TAGLN”组)的活细胞数比缺氧加Scr组(“H/R+Scr”组、“CoCl2+Scr”组)显著增加(P<0.01)。综上所述，该TAGLN多肽可以有效提高物理缺氧及化学缺氧的H9c2心肌细胞的生存率。

4.2TAGLN多肽降低H9c2心肌细胞乳酸脱氢酶的释放水平

通过应用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒，检测细胞的损伤作用。图2是实施例1对H9c2心肌细胞的乳酸脱氢酶测试结果；其中，图2A是物理缺氧下H9c2心肌细胞的乳酸脱氢酶测试结果，图2B是化学缺氧下H9c2心肌细胞的乳酸脱氢酶测试结果。根据图2A和图2B可知：LDH的释放量在物理缺氧(对应“H/R+Scr”组和“H/R+TAGLN”组)与化学缺氧(对应“CoCl2+Scr”组和“CoCl2+TAGLN”组)情况下较对照组(“TAGLN”组和“Scr”组)明显升高(P＜0.01)；而在缺氧前加入TAGLN多肽，LDH的释放量在物理缺氧与化学缺氧均明显下降(P＜0.01)。综上所述，TAGLN多肽能降低缺氧情况下LDH的释放水平，对心肌细胞起保护作用。

4.3TAGLN多肽减少活性氧的积累

缺氧条件下，H9c2心肌细胞产生大量ROS(活性氧)从而造成心肌损伤。DCFH-DA(2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐)可以自由通透进入心肌细胞并被心肌细胞内酯酶水解为DCFH，DCFH被心肌细胞内ROS氧化为DCF并发出绿色荧光。图3是对H9c2心肌细胞的活性氧积累情况检测结果，根据图3可知：与对照组(“TAGLN”组和“Scr”组)相比，物理缺氧组(对应“H/R+Scr”组和“H/R+TAGLN”组)H9c2心肌细胞内ROS明显增多(P<0.01)；而缺氧加肽组(“H/R+TAGLN”组)细胞内ROS比缺氧组(“H/R+Scr”组)明显减少(P<0.01)。综上所述，该TAGLN多肽可以减少物理缺氧引起的H9c2心肌细胞内活性氧的积累。

4.4TAGLN多肽减少凋亡相关蛋白的水平

凋亡是一种由多种分子级联作用的程序性细胞死亡，蛋白PARP、Caspase3、Bax是凋亡的效应蛋白。PARP和Caspase 3等的激活在凋亡过程中起到重要作用。

图4是对各组H9c2心肌细胞凋亡相关蛋白水平的检测结果，根据图4可知：与对照组(“TAGLN”组和“Scr”组)相比，物理缺氧组(对应“H/R+Scr”组和“H/R+TAGLN”组)蛋白PARP、Caspase 3及Bax的激活显著增加(P<0.01)；而缺氧加肽组(“H/R+TAGLN”组)蛋白PARP、Caspase 3及Bax的激活比物理缺氧组(“H/R+Scr”组)显著减少(P<0.01)。综上所述：该TAGLN多肽可以缓解物理缺氧诱导的H9c2心肌细胞凋亡。

实施例3：动物实验

1.实验动物：雄性SD大鼠，清洁级，体重：200g-220g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，饲养于南京医科大学实验动物中心。

2.实验分组：将SD大鼠随机分成四组：假手术组6只，造模组6只，假手术加TAGLN多肽组6只，造模加TAGLN多肽组6只，TAGLN多肽按5mg/Kg给药，以生理盐水为溶剂配成注射液，尾静脉注射方式给药。

3.SD大鼠冠状动脉结扎

将SD大鼠用10％的水合氯醛腹腔注射麻醉，仰卧位固定，沿左侧第五肋间切开胸壁并于胸骨左缘2mm处剪断第四、五肋肋骨，剪开心包膜，暴露心脏。

在左冠状动脉前降支下穿过0/3号缝合线进行结扎左前降支血管，将心脏放回胸腔，用手尽量排出胸内气体，迅速关闭胸腔。整个过程在30秒内完成。

大鼠冠状动脉结扎后造成心肌缺血，假手术组冠脉不接扎。冠脉结扎前30分钟经尾静脉注射给药。各组结扎冠状动脉动物40min后剪断结扎线，恢复冠脉血供，关闭胸腔。

2小时后股动脉取血3ml，常规离心取上清，测定血清肌酸激酶、肌钙蛋白水平；取心脏组织进行切片、染色，观察心肌梗死区域大小。

4.实验结果

4.1TAGLN多肽降低心肌缺血再灌注损伤大鼠血清中肌酸激酶及肌钙蛋白的含量

图5是TAGLN多肽对各组心肌缺血再灌注损伤SD大鼠血清中肌酸激酶及肌钙蛋白的含量影响的测试结果；其中，图5A是TAGLN多肽对心肌缺血再灌注损伤SD大鼠血清中肌钙蛋白含量影响的测试结果，图5B是TAGLN多肽对心肌缺血再灌注损伤SD大鼠血清中肌酸激酶含量影响的测试结果。根据图5可知：造模组SD大鼠血清CK-MB及cTnI含量明显高于假手术组(P＜0.01)，说明冠脉结扎后造成大鼠心肌缺血产生心肌损伤，从而释放CK-MB及cTnI入血；造模加多肽组的大鼠血清CK-MB及cTnI含量较造模组明显下降(P＜0.01)。综上所述，该多肽可降低心肌缺血再灌注损伤大鼠血清中CK-MB及cTnI含量。

4.2多肽减少心肌缺血再灌注损伤后大鼠心肌梗死面积

图6是TAGLN多肽对各组心肌缺血再灌注损伤SD大鼠心肌梗死面积影响的测试结果。根据图6可知：造模组大鼠心肌梗死区域明显高于假手术组(P＜0.01)，而造模加多肽组的大鼠心肌梗死区域较造模组明显减少(P＜0.01)。综上所述，该多肽可降低心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌梗死面积，对心肌缺血再灌注损伤有明显保护作用。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 上海市同仁医院

<120> 运动相关多肽在制备防治缺血性心脏病药物中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Ser Asn Arg Gly Ala Ser Gln Ala Gly Met Thr Gly Tyr Gly

1 5 10 15

Arg Pro Arg Gln Ile Ile Ser

20

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggactctctg tagcagattt ggcagagagt ataatgaaga atctt 45

Claims (10)

1.运动相关多肽在制备预防或/和治疗心脏病的药物中的应用，所述运动多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者所述运动相关多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO.1具有至少70％同源性。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述心脏病为缺血性心脏病。

3.根据权利要求1或者2所述的应用，其特征在于，所述药物包含运动相关多肽以及药学上可接受的辅料。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物的给药途径为静脉注射、口服给药、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、舌下给药、鼻腔给药或者经皮给药。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、颗粒剂、丸剂、粉剂、胶囊剂、注射剂、口服液、眼用制剂或者外用制剂。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述辅料选自填充剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、色香味调节剂、溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、抗氧剂、金属络合剂、惰性气体、抑菌剂、局部止痛剂、pH调节剂、等渗或等张调节剂中的至少一种。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述填充剂选自淀粉类、糖类、纤维性类和无机盐类中的至少一种；或/和，所述润湿剂选自纯化水、乙醇中的至少一种；或/和，所述黏合剂选自淀粉浆、糊精、糖粉与糖浆、纤维素衍生物、明胶、聚维酮以及聚乙二醇中的至少一种；或/和，所述崩解剂选自干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、表面活性剂、泡腾崩解剂中的至少一种；或/和，所述润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、十二烷基硫酸镁、微粉硅胶以及聚乙二醇中的至少一种；或/和，所述色香味调节剂选自色素、香精、香料、甜味剂、胶浆剂以及矫臭剂中的至少一种；或/和，所述溶剂选自注射用水、注射用油、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、二甲基亚砜、液体石蜡、脂肪油以及乙酸乙酯中的至少一种；或/和，所述增溶剂选自吐温类、卖泽类、聚氧乙烯脂肪醇醚类、肥皂类、硫酸化物、磺酸化物中的至少一种；或/和，所述助溶剂选自有机酸及其盐类、酰胺及胺类化合物、无机盐、聚乙二醇、聚维酮、甘油中的至少一种。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述乳化剂选自司盘类、吐温类、卖泽类、苄泽类、甘油脂肪酸酯、高级脂肪酸盐、硫酸化物、磺酸化物、阿拉伯胶、西黄耆胶、明胶、果胶、磷脂、琼脂、海藻酸钠、氢氧化物、二氧化硅以及皂土中的至少一种；或/和，所述助悬剂选自甘油、糖浆、阿拉伯胶、西黄耆胶、琼脂、海藻酸钠、纤维素衍生物、聚维酮、卡波普、葡萄糖、聚乙烯醇、触变胶中的至少一种；或/和，所述抗氧剂选自亚硫酸盐、焦亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、抗坏血酸、没食子酸及其酯类中的至少一种；或/和，所述金属络合剂选自乙二胺四乙酸二钠以及多羧酸化合物中的一种；或/和，所述惰性气体选自氮气以及二氧化碳中的一种；或/和，所述抑菌剂选自尼泊金类、有机酸及其盐、季铵类化合物、醋酸氯己定、醇类、酚类、挥发油中的至少一种；或/和，所述局部止痛剂选自苯甲醇、三氯叔丁醇、利多卡因以及普鲁卡因中的至少一种；或/和，所述pH调节剂选择盐酸、硫酸、磷酸、枸橼酸、酒石酸、醋酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、乙二胺、葡甲胺、磷酸盐、醋酸盐以及枸橼酸盐中的至少一种；或/和，所述等渗或等张调节剂选自葡萄糖、氯化钠、枸橼酸钠、山梨醇、木糖醇中的至少一种。

9.根据权利要求1、2以及4至8任一项所述的应用，其特征在于，所述运动相关多肽通过化学方法合成。

10.根据权利要求1、2以及4至8任一项所述的应用，其特征在于，所述运动相关多肽通过生物学方法合成。

Images