CN111868739A - 用于无标记地确定白细胞的细胞类型的体外方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于无标记地确定生物样品中的白细胞的细胞类型的体外方法，其中，显微镜装置成像细胞并且从细胞的成像中借助于自动图像分析测定细胞的物理参数，其中，根据物理参数并且根据主成分分析参数(PCA参数)确定白细胞的细胞类型，其中，主成分分析参数包括物理参数的至少一部分的线性组合。
Description
技术领域
本发明公开了一种用于在应用显微镜装置的情况下无标记地确定生物样品中的白细胞的细胞类型的体外方法。
背景技术
在细胞学中，细胞的确定以及将其与细胞类型的关联具有重要的意义。在血液学检查实例中，就是确定和量化细胞的血液成分，即红细胞、血小板和白细胞。对于全面的诊断，白细胞数目的测定(“White Blood Count”，白细胞计数，简称WBC)应当能够区分白细胞的主要群体。白细胞被区分为粒状细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)和非粒状细胞(淋巴细胞、单核白细胞)。除了粒度之外，细胞也在细胞核的片段化(没有片段化：单核细胞、即淋巴细胞和单核白细胞；多核细胞：嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜中性粒细胞)和细胞大小方面进行划分。对于粒状的细胞、特别是嗜酸性和嗜碱性粒细胞的区分，而采用染色。细胞群体的评估通常通过全自动化的血液分析仪或通过显微术进行。全自动化的分析仪必须(借助于例如阻抗、散射光和吸收测量)根据确定的算法来分析群体。然而，这经常导致，例如在病理样品中显示错误消息。在接下来的步骤中，通常进行显微术作为用于通过血液分析仪错误地确定的细胞的验证方法。该步骤是复杂且昂贵的，因此除了样品制备、显微术和另外的可人工执行的工作之外，还要求进行人工评估。
血细胞计数的改变是多种病的伴随现象，并且这些改变因此作出了重要的鉴别诊断上的贡献。小型血细胞计数是最常见的实验室检查之一，并且另外包括确定血红蛋白和测定红细胞、白细胞和血小板的细胞数量。大型血细胞计数还包含血细胞分类计数，其包括白细胞分化。
特别地，由于所应用的方法(例如米氏散射)，对于白细胞的分析需要复杂的样品制备(细胞被染色或者部分裂解)。然而，在病理性血液样品的情况下，样品制备(例如裂解)经常仅仅不充分地进行，并且因此需要通过例如涂片和染色人工地检查血细胞。然而，该方法仅是定性的并且由于所计算的细胞的数量较少(每个载玻片大约100至200个细胞)，对于稀少的白细胞只能受限地应用。然而，对于病理样品(例如白血病)的初始诊断，当前具有随后染色的血细胞的血涂片是标准方法。
全血中的机械化的白细胞区分可以例如借助于电阻测量、电导测量、激光散射测量、流式细胞术或细胞化学的过氧化物酶反应来进行。在此，首先裂解红细胞，再将流动细胞中的白细胞分离。
为了例如实施定量的血细胞诊断，可以放弃血液分析仪并且作为替换利用显微术每个单独的细胞。这允许，独立于设定的评估算法和标志，定量地确定血细胞计数。然而，这样的方式的缺点在于，比在血液分析仪中更小的样品通过量和如前述将细胞固定在玻片上并且染色的花销。此外，这种染色仅具有受限的再现性并且显示出与空气湿度、染色持续时间、温度以及更多因素的高度相关性。与在血液分析仪中使用的流式细胞计数仪相比，单纯的显微术的缺点在于对细胞总数的量化。
为了建立人工血液计数，应用了基于全血分析的特定染色技术、例如瑞氏-吉姆萨染色。为此，将全血涂抹在玻片上并且为了建立血液分类计数而计数例如大约100个白细胞，在困难的情况下可能大约3倍100个细胞。
对于病理样品的初始诊断，具有随后染色血细胞的血涂片是标准方法。在白血病的情况中，因此基于血液分类计数，通过特征性发生的细胞群体能够划分为下面的类型：“急性髓性白血病(AML)”、“急性淋巴细胞白血病(ALL)”、“慢性髓性白血病(CML)”和“慢性淋巴细胞白血病(CLL)”。
由于在血涂片中统计量小(每个玻片大约100至200个细胞)，为了确认诊断以及为了准确地确定白血病的亚型，通常应用流式血细胞计数。在此，利用特殊的(荧光)抗体来标记白细胞并且通过在散射图像中反映的特征性散射图样实施分化。附加地，能够在复杂的情况下为准确的诊断要求骨髓穿刺。另外，在复杂的情况下，可能需要骨髓穿刺来进行准确诊断。
在1860年代，已经开发出将染料用于在不同(血液)细胞之间进行分化的用途。古斯塔夫吉姆萨开发了在依他命名的染色方法，最初用于使疟疾寄生虫可见并且随后被修改用于染色苍白密螺旋体(梅毒的触发剂)。目前使用的赖特吉姆萨染色允许区分白细胞，并且因此代表白血病疾病的初始诊断。
为了准确地确定白血病免疫表型，使用流式细胞术(荧光激活细胞分选，FACS)作为标准。在此，使用多种不同的(荧光)抗体；外周血和骨髓样品都用作样品。借助于用于分析FACS数据的特定程序(例如，Kaluza)实施评估。在此，有可能通过在先前设置的区域(也被称为“门(Gate)”)中存在数据点来区分不同的临床图片。迄今为止尚不知道通过使用纯显微方法区分四种上述形式的无染色/标记的白血病。
US 8406498已经披露了一种成像流式细胞仪，借助于该成像流式细胞仪可以直接确定白细胞的分化。然而，在这种情况下还使用染色，特别是为了在嗜酸性粒细胞与嗜碱性粒细胞之间进行区分。因此，在此也出现了上述缺点。
发明内容
因此，本发明的目的在于，提供一种用于区分白细胞的有效并且稳定的方法，在该方法中，尤其不需要染色和/或标记血细胞。
该目的通过根据本发明的方法、根据本发明的细胞分析装置和根据独立权利要求的显微镜装置来实现。本发明的有利发展由从属权利要求指定。
根据本发明的用于确定生物样品中血细胞的细胞类型而不用标记的体外方法是借助于显微镜装置和细胞分析装置进行的。在此，显微镜装置是一种利用其能够在大幅放大的情况下观察非常小的物体的器具，并且包括例如光学显微镜、电子扫描显微镜、相衬显微镜、数字全息显微镜或具有超声传感器的显微镜(例如，声学显微镜)。在此，显微镜设备对细胞进行成像。借助于自动化的图像分析由细胞的成像来确定细胞的物理参数。
细胞分析装置(即，适合于电子数据处理并且被配置成用于通过自动化图像分析从该细胞的图像表示确定该细胞的物理参数的器具或器具部件)实施如在下面更详细描述的根据本发明的方法。
本发明的主题涉及一种用于以不进行标记的方式确定生物样品中的白细胞的细胞类型的体外方法，其中，显微设备对细胞进行成像，并且借助于自动的图像分析从细胞的成像中确定该细胞的物理参数，其中，基于物理参数和基于主成分分析参数(PCA参数)来确定该白细胞的细胞类型，其中，该主成分分析参数包括物理参数的至少一部分的线性组合。
优选地，基于关于物理参数和主成分分析参数(PCA参数)方面的预定标准来确定白细胞的细胞类型，其中，如果满足相应的预定标准，则存在相应的细胞类型。
术语“预定标准”涉及基于一个或多个物理和/或主成分分析参数(PCA参数)而确定的一个或多个标准。在此，优选地，基于待区分的各种白细胞类型的相应成像之间的比较来确定相应的标准。
由于省去了染色方法，该方法允许高样品通过量和细胞的定性和/或定量测定。这实现了具有高样本通过量的显微术，并且可以省去传统的血液学分析器。
优选地，所确定的白细胞的细胞类型是来自包括单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞的组的白细胞的主要类型之一。
在根据本发明的方法的另一个优选实施例中，所确定的细胞类型是来自如下的组的白细胞主要类型之一和/或白细胞的亚型，该组包括中幼粒细胞、晚幼粒细胞、早幼粒细胞、母细胞、巨核细胞、浆细胞、非典型淋巴细胞以及赛塞利(Sezary)细胞。
在另一个优选的实施方式中，借助于样品中多个白细胞各个的细胞类型的测定，来表征各个的细胞群体，并且基于存在的细胞群体来确定在样品来源的患者是否具有急性髓性白血病(AML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性髓性白血病(CML)或慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。
优选地，细胞的物理参数包括来自以下组的参数，该组包括细胞的覆盖面积(cellarea(细胞面积))、细胞的周长(perimeter)，细胞的宽度(width)，细胞的高度(height)，细胞的宽度与高度的比率(aspectRatio)，细胞的几何形状与圆的相似性(circularity，(圆度))，细胞的平均半径(radiusMean)，细胞半径方差(radiusVariance)，细胞的覆盖度(solidity)，对应于细胞覆盖面积的等效(equivalentDiameter)，细胞的光学体积(opticalVolume)，细胞的最大光学高度(opticalHeightMaximum)，细胞的最小光学高度(opticalHeightMinimum)，细胞的平均光学高度(opticalHeightMean)，细胞的光学高度方差(opticalHeightVariance)，细胞的双凹度(biconcavity)，细胞的球度(sphericity)，细胞的质心的偏移(massCenterShift)，细胞的对比度(contrast)，细胞的不相似性(dissimilarity)，细胞的均匀性(homogenity)，电池的能量(energy)，细胞的熵(entropy)。
优选地，细胞的物理参数如下定义。
有关对比度定义和从灰度共生矩阵中提取的5个特征的详细信息参见卡尔加里大学网页上的“GLCMTexture：A Tutorial v.3.0March 2017”http://www.fp.ucalgary.ca/mhallbey/tutorial.htm(Uri http://hdl.handle.net/1880/51900)。
在另一个优选的实施方式中，能够获取根据显微镜方法附加可用的附加信息。例如能够附加地使用强度分布、偏振或荧光反差，以便能够实现更好的区分。
优选地，主成分分析参数(PCA参数)包括参数的一个、两个、三个、四个或五个不同的线性组合。
优选地，主成分分析参数(PCA参数)包括下述参数的线性组合。
至少一个PCA参数优选地包括以下参数的线性组合：细胞面积、周长、宽度、高度、宽高比、圆度、半径平均值、半径差异、覆盖度、等价直径、光学体积、光学高度最大值、光学高度最小值、光学高度平均值、光学高度方差、双凹形、球度、质心偏移、对比度、不相似性、均匀性、能量、熵。
特别地，PCA参数包括总共六个PCA参数，其中，每个PCA参数分别优选地包括以下参数的线性组合：细胞面积、周长、宽度、高度、宽高比、圆度、半径平均值、半径差异、覆盖度、等价直径、光学体积、光学高度最大值、光学高度最小值、光学高度平均值、光学高度方差、双凹形、球度、质心偏移、对比度、不相似性、均匀性、能量、熵。
优选地，主成分分析参数(PCA参数)包括下述参数Val1至Val6。
Val1＝-0.2514235930087*((细胞.细胞面积-(42.9755016744))/10.5788867263146)+-0.249974748498971*((细胞.周长-(24.576753500494))/3.20109088487221)+-0.237593744589169*((细胞.宽度-(7.35723468359436))/1.00790834623485)+-0.241385243730167*((细胞.高度-(7.28724864632538))/1.00167379952967)+0.0500690750767191*((细胞.宽高比-(1.0727084035923))/0.0503940328943091)+-0.0325934362800635*((细胞.圆度-(0.879203898319695))/0.0171374141190303)+-0.251748682215606*((细胞.平均半径-(3.67481430203961))/0.47807494523509)+-0.0358686373697572*((细胞.半径方差-(0.534334347573423))/0.135861132157575)+-0.0713429028935052*((细胞.覆盖度-(0.973653367948167))/0.00642977966295229)+-0.251801959117612*((细胞.等效直径-(7.33498993492049))/0.957125629695256)+-0.271859966910455*((细胞.光量-(10.9434893272532))/4.39789306763487)+-0.264893256207984*((细胞.最大光学高度-(4.0508608252182))/1.13386516864492)+-0.019499726282544*((细胞.最小光学高度-(0.917628988325119))/0.00943812184922224)+-0.263403666244868*((细胞.平均光学高度-(2.56913326007255))/0.578640046049587)+-0.264398202286343*((细胞.光学高度方差-(0.891494679587935))/0.319599313085186)+0.0683113521964872*((细胞.双凹度-(-0.1590427888386))/0.0878662330982137)+0.0532706264409643*((细胞.球形-(0.952179340809924))/0.0556215659482945)+-0.135017569551957*((细胞.质心偏移-(0.321787377964238))/0.279787203971966)+-0.23775558906941*((细胞.对比度-(5.99415440523299))/3.28737834908757)+-0.245223436384692*((细胞.不相似性-(1.8261947255628))/0.524533027046986)+0.241198017846531*((细胞.均匀性-(0.421196396914475))/0.0787508131258171)+0.258958179846163*((细胞.能量-(0.106234099933335))/0.0303777835437848)+-0.267352762571249*((细胞.熵-(4.85017551257248))/0.552270252441689)+0；
Val2＝-0.168670616411677*((细胞.细胞面积-(42.9755016744))/10.5788867263146)+-0.205776175336618*((细胞.周长-(24.576753500494))/3.20109088487221)+-0.186558934231474*((细胞.宽度-(7.35723468359436))/1.00790834623485)+-0.183141003655306*((细胞.高度-(7.28724864632538))/1.00167379952967)+-0.0928942621464152*((细胞.宽高比-(1.0727084035923))/0.0503940328943091)+0.505899790631485*((细胞.圆度-(0.879203898319695))/0.0171374141190303)+-0.169985535864666*((细胞.平均半径-(3.67481430203961))/0.47807494523509)+-0.377167185427535*((细胞.半径方差-(0.534334347573423))/0.135861132157575)+0.416007969970529*((细胞.覆盖度-(0.973653367948167))/0.00642977966295229)+-0.166991998607427*((细胞.等效直径-(7.33498993492049))/0.957125629695256)+-0.00731744872935898*((细胞.光量-(10.9434893272532))/4.39789306763487)+0.106456651440064*((细胞.最大光学高度-(4.0508608252182))/1.13386516864492)+0.20085391219078*((细胞.最小光学高度-(0.917628988325119))/0.00943812184922224)+0.122345079558179*((细胞.平均光学高度-(2.56913326007255))/0.578640046049587)+0.101062869417052*((细胞.光学高度方差-(0.891494679587935))/0.319599313085186)+0.217089205338001*((细胞.双凹性-(-0.1590427888386))/0.0878662330982137)+-0.0619295694253695*((细胞.球形-(0.952179340809924))/0.0556215659482945)+0.0156956887744252*((细胞.质心偏移-(0.321787377964238))/0.279787203971966)+0.198114038338057*((细胞.对比度-(5.99415440523299))/3.28737834908757)+0.180425506176449*((细胞.不相似性-(1.8261947255628))/0.524533027046986)+-0.135400526577736*((细胞.均匀性-(0.421196396914475))/0.0787508131258171)+-0.0267942709719767*((细胞.能量-(0.106234099933335))/0.0303777835437848)+0.0722804026404807*((细胞.熵-(4.85017551257248))/0.552270252441689)+0；
Val3＝-0.152245658793807*((细胞.细胞面积-(42.9755016744))/10.5788867263146)+-0.137744345235438*((细胞.周长-(24.576753500494))/3.20109088487221)+-0.139046382561896*((细胞.宽度-(7.35723468359436))/1.00790834623485)+-0.136640064377995*((细胞.高度-(7.28724864632538))/1.00167379952967)+0.143071973661924*((细胞.宽高比-(1.0727084035923))/0.0503940328943091)+-0.311832846414789*((细胞.圆度-(0.879203898319695))/0.0171374141190303)+-0.158405722299146*((细胞.平均半径-(3.67481430203961))/0.47807494523509)+0.2147365796495*((细胞.半径方差-(0.534334347573423))/0.135861132157575)+-0.290348831318269*((细胞.覆盖度-(0.973653367948167))/0.00642977966295229)+-0.160436060932553*((细胞.等效直径-(7.33498993492049))/0.957125629695256)+-0.0283231756746574*((细胞.光量-(10.9434893272532))/4.39789306763487)+0.108904826169979*((细胞.最大光学高度-(4.0508608252182))/1.13386516864492)+-0.0541041915771913*((细胞.最小光学高度-(0.917628988325119))/0.00943812184922224)+0.0482898928982701*((细胞.平均光学高度-(2.56913326007255))/0.578640046049587)+0.0740565216581285*((细胞.光学高度方差-(0.891494679587935))/0.319599313085186)+0.33268062359036*((细胞.双凹性-(-0.1590427888386))/0.0878662330982137)+-0.486496428597712*((细胞.球度-(0.952179340809924))/0.0556215659482945)+0.404071847572092*((细胞.质心偏移-(0.321787377964238))/0.279787203971966)+0.200214346124148*((细胞.对比度-(5.99415440523299))/3.28737834908757)+0.168546834749071*((细胞.不相似性-(1.8261947255628))/0.524533027046986)+-0.114748435539571*((细胞.均匀性-(0.421196396914475))/0.0787508131258171)+-0.0143576741936659*((细胞.能量-(0.106234099933335))/0.0303777835437848)+0.070606562249387*((细胞.熵-(4.85017551257248))/0.552270252441689)+0；
Val4＝-0.261610677611746*((细胞.细胞面积-(29.4395201580311))/5.11005121908855)+-0.261094203446583*((细胞.周长-(20.4714469010994))/1.73763119886254)+-0.222861676546857*((细胞.宽度-(6.12959751130435))/0.59548518687133)+-0.229916753106545*((细胞.高度-(6.05150421944159))/0.591609173525849)+0.011807520590896*((细胞.宽高比-(1.0869912949338))/0.0546526376570488)+0.0262225683553752*((细胞.圆度-(0.876941946272043))/0.0179521439605036)+-0.261160667395425*((细胞.平均半径-(3.05876819557268))/0.255900843697689)+-0.0941868494695694*((细胞.半径方差-(0.516064433989357))/0.111459058693624)+-0.0110718002570505*((细胞.覆盖度-(0.971597800798176))/0.00720404258117219)+-0.260831711849364*((细胞.等效直径-(6.10101233363755))/0.511139800830794)+-0.283417789826245*((细胞.光量-(5.49637143295321))/1.39356683120867)+-0.28041071625337*((细胞.最大光学高度-(2.78997632108204))/0.357459556742829)+0.00345191681990364*((细胞.最小光学高度-(0.916982544759395))/0.0114607243403515)+-0.267687084654929*((细胞.平均光学高度-(1.90610826785609))/0.176319079561605)+-0.279755464234688*((细胞.光学高度方差-(0.531938907690763))/0.107019179729975)+0.121035300134979*((细胞.双凹性-(-0.11874291555068))/0.0878957408234967)+-0.0161513556541555*((细胞.球度-(0.955634909899621))/0.04264168644697)+-0.107830413342139*((细胞.质心偏移-(0.205413097350611))/0.143266493406051)+-0.216912000881217*((细胞.对比度-(2.94739193186445))/0.852979848483421)+-0.233161325461211*((细胞.不相似性-(1.31231869619681))/0.185666125635144)+0.222121616068744*((细胞.均匀性-(0.499177299392145))/0.043929343763229)+0.237462579736086*((cell.能量-(0.141919956703913))/0.0213959679195142)+-0.268766115142943*((细胞.熵-(4.20317134129727))/0.263391471017291)+0；
Val5＝0.277185206648515*((细胞.细胞面积-(29.4395201580311))/5.11005121908855)+0.289025861167001*((细胞.周长-(20.4714469010994))/1.73763119886254)+0.27869771372156*((细胞.宽度-(6.12959751130435))/0.59548518687133)+0.226791977731385*((细胞.高度-(6.05150421944159))/0.591609173525849)+-0.0154016557869195*((细胞.宽高比-(1.0869912949338))/0.0546526376570488)+-0.104962015198417*((细胞.圆度-(0.876941946272043))/0.0179521439605036)+0.280118171306254*((细胞.平均半径-(3.05876819557268))/0.255900843697689)+0.122071737825644*((细胞.半径方差-(0.516064433989357))/0.111459058693624)+-0.0757806415365649*((细胞.覆盖度-(0.971597800798176))/0.00720404258117219)+0.279776181994244*((细胞.等效直径-(6.10101233363755))/0.511139800830794)+0.127079667257615*((细胞.光量-(5.49637143295321))/1.39356683120867)+-0.166674686515488*((细胞.最大光学高度-(2.78997632108204))/0.357459556742829)+-0.0801206102287044*((细胞.最小光学高度-(0.916982544759395))/0.0114607243403515)+-0.13904585273397*((细胞.平均光学高度-(1.90610826785609))/0.176319079561605)+-0.157320201651437*((细胞.光学高度方差-(0.531938907690763))/0.107019179729975)+-0.0137496049824385*((细胞.双凹性-(-0.11874291555068))/0.0878957408234967)+-0.0124754663656207*((细胞.球度-(0.955634909899621))/0.04264168644697)+-0.00354707655665248*((细胞.质心偏移-(0.205413097350611))/0.143266493406051)+-0.337317104471527*((细胞.-对比度-(2.94739193186445))/0.852979848483421)+-0.351605489070963*((细胞.不相似性-(1.31231869619681))/0.185666125635144)+0.324115001671015*((细胞.均匀性-(0.499177299392145))/0.043929343763229)+0.20286086484872*((细胞.能量-(0.141919956703913))/0.0213959679195142)+-0.208528317348662*((细胞.熵-(4.20317134129727))/0.263391471017291)+0；
Val6＝-0.0822117013411024*((细胞.细胞面积-(29.4395201580311))/5.11005121908855)+-0.0136983441801879*((细胞.周长-(20.4714469010994))/1.73763119886254)+-0.0421965767155267*((细胞.宽度-(6.12959751130435))/0.59548518687133)+-0.0105097694602176*((细胞.高度-(6.05150421944159))/0.591609173525849)+0.0829553453256781*((细胞.宽高比-(1.0869912949338))/0.0546526376570488)+-0.601802580015178*((细胞.圆度-(0.876941946272043))/0.0179521439605036)+-0.0832961277585592*((细胞.平均半径-(3.05876819557268))/0.255900843697689)+0.312125036264253*((细胞.半径方差-(0.516064433989357))/0.111459058693624)+-0.548644911166917*((细胞.覆盖度-(0.971597800798176))/0.00720404258117219)+-0.0887226111099722*((细胞.等效直径-(6.10101233363755))/0.511139800830794)+-0.065558074724381*((细胞.光量-(5.49637143295321))/1.39356683120867)+0.00635200779277076*((细胞.最大光学高度-(2.78997632108204))/0.357459556742829)+-0.208242751746043*((细胞.最小光学高度-(0.916982544759395))/0.0114607243403515)+-0.052855467177894*((细胞.平均光学高度-(1.90610826785609))/0.176319079561605)+0.0139425503541623*((细胞.光学高度方差-(0.531938907690763))/0.107019179729975)+0.0212708260463394*((细胞.双凹性-(-0.11874291555068))/0.0878957408234967)+-0.281890905467496*((细胞.球形-(0.955634909899621))/0.04264168644697)+0.258391327626016*((细胞.质心偏移-(0.205413097350611))/0.143266493406051)+0.0744517932956948*((细胞.对比度-(2.94739193186445))/0.852979848483421)+0.0587637354201565*((细胞.不相似性-(l.31231869619681))/0.185666125635144)+-0.0404667518409852*((细胞.均匀性-(0.499177299392145))/0.043929343763229)+-0.0159289744001*((细胞.能量-(0.141919956703913))/0.0213959679195142)+0.0247292136860108*((细胞.熵-(4.20317134129727))/0.263391471017291)+0；
优选地，细胞的成像包括：将物体波与参考波重叠、记录造成的干涉图和/或计算机执行的数学重建。
在此，特别有利的是数字全息的显微术的应用，因为其允许定量地检测物体的相位信息。因此，根据本发明的方法的另一个实施方式，白细胞的成像借助于数字全息显微术、干扰相位显微术和/或定量相位显微术的显微镜测定。该显微术方法能够实现特别高的轴向的解析度，即在显微镜的光轴的方向上。数字全息显微术能够实现z方向上直到1nm的解析度。其对应的精度比其它已知的光显微术的方法(例如共焦的显微镜)高100-1000倍。因此，由于高度轮廓的精确的测定能够实现细胞类型的更准确的确定。
因此优选地，显微镜装置是用于实施数字全息显微术(DHM)、干扰相位显微术或定量相位显微术的显微镜。
优选地，流动室中的白细胞由显微镜装置成像，其中，流动室优选地包括具有矩形或正方形的横截面的通道。
优选地，白细胞借助于层状的鞘流、优选借助于四个层状的鞘流来聚焦。
优选地，在白细胞借助于显微镜装置成像之前借助于选择性的细胞裂解从样品中去除红细胞。
另外有利的是，该方法利用一个或多个未染色和/或未干燥的细胞来执行。因为细胞的活力通过根据本发明的方法未受到影响，所以通过该方法确定的细胞能够在确定方法结束后继续用于接下来的分析。
根据另一个实施例，根据本发明的方法包括利用标记将细胞显形和/或表达预先确定的受体以用于进一步分配细胞。其能够实现确定的细胞的尽可能分子生物的检查。
根据本发明的方法特别重要的是，根据另一个实施方式其根据全血样品实施和/或生物样品包含血细胞、单核白细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和/或淋巴细胞。其最初在确定血液中的血细胞计数之前应用。
本发明的另一个方面是细胞分析装置，例如包括显微镜或微控制器，其设置为，实施根据本发明的方法的上述实施方式中的一个或多个。
本发明的另一个内容是用于无标记地确定生物样品的细胞的细胞类型的显微镜装置，包括根据本发明的细胞分析装置。
优选地，显微镜装置包括数字全息显微镜。
根据本发明的方法的另一个实施方式，包细胞的确定能够包括确定细胞的细胞阶段、特别是用于区分细胞年龄、细胞的生物或形态状态或细胞的行为状态。其能够实现记录例如细胞的行为过程的连续画面。
数字全息显微术(DHM)、也被称为干扰相位显微术的特征在于，其不仅能够检测强度、还有定量的在记录中检测物体的相位。对此不是像通常在显微术中那样地记录强度分布，其通过光在物体上的吸收和散射所得到，而是记录波正面，其从物体和参考波的重叠得出。由此能够借助于计算机重建物体的强度和相位信息。
该显微术方法适用于生物样品的检查，因为其在没有另外的样品准备的情况下对于可见光基本上是透明的，并且因此在常规的显微镜中具有较小的对比度。通过记录相位信息能够实现的是，非常精确地检测细胞的形态并且借助于该信息进行细胞的区分。
相对于通常通过在物体中的相位环和冷凝器中的环形挡板实现的传统的相衬显微镜，DHM的优点在于，能够定量地确定相位。相应地还有定量的相衬显微镜。仅通过相位的量化能够实现物体的高度轮廓的能再现的重建并且仅由此能够实现细胞类型的自动化的确定。
对此指出的是，确定光从光学路径长度通过物体的相位偏移，即不经物体的几何厚度、还有折射率在此不起作用。为了从相位信息中得到实际的几何高度轮廓必须已知样品的折射率。然而，在细胞的显微术的优选的应用情况中从尽可能稳定和已知的折射率出发，由此能够将相位信息直接换算到高度轮廓。可替换地，相位信息能够在各种波长接收并且由此计算出折射率的影响。
此外考虑的是，相位信息仅在360°的相位角度上明确地能够。测量的例如10°的相位偏移能够在实际中对应370°、730°等的相位偏移。相应地，明确性范围限制在光的波长上。该限制在所选的应用情况中在细胞的显微镜的观察中同样是能忽略的，因为生物细胞不具有陡峭的边沿并且因此不提供相邻的像素的相位值作为连接条件。
通过根据本发明的方法能够无标记地实施目前应用的用于建立鉴别血液计数的方式。示例性的用于建立鉴别血液计数的方式例如包括测定细胞大小、细胞的成熟状态、即细胞的年龄、细胞核血浆比例、检测细胞质嵌入和检测染色质结构。
干扰相位显微术、也被称为数字全息显微术(DHM)的特征在于，其不仅能够检测强度、还有定量的在记录中检测物体的相位。对此不是像通常在显微术中那样地检测物体的成像，而是检测波正面，其从物体和参考波的重叠得出。由此能够借助于例如计算机的细胞分析装置重建物体的强度和相位信息。
该显微术方法适用于生物样品的检查，因为其在没有另外的样品准备的情况下对于可见光基本上是透明的，并且因此在常规的显微镜中具有较小的对比度。通过记录相位信息能够实现的是，非常精确地检测细胞的形态并且借助于该信息进行细胞的区分。
能够实施例如白细胞的基于例如多个细胞的重建的相位信息的鉴别，而不必染色细胞并且由此能够利用新鲜的未干燥的细胞来实施。由此避免不必要的人工制品，其通过样品的不同的处理在干燥和染色期间出现。在此，成像是能重建的并且能容易地通过自动的装配计算机的图像加工系统区分。过程步骤的数量最小化。由此节省成本和时间并且能够实现可靠和快速的诊断。
因此在预分析中针对血液分析仪放弃采用例如圆形缓冲(即极薄的SDS缓存溶液)。这样导致了细胞的聚拢，其甚至适用于流式细胞仪中的散射光测量，然而同时导致人工制品。
附图说明
根据附图再一次通过具体的实施例详细阐述本发明。所示实例代表了本发明的优选的实施方式。在此示出：
图1是AML样品的概览图，
图2是CML样品的概览图，
图3是ALL样品的概览图，
图4是CLL样品的概览图，
图5是OMF样品的概览图，
图6是健康样品的概览图，
分别录入了PCA参数。
继续示出：
图7是反应AML样品的原始粒细胞门和原始淋巴细胞门特征性散射模式，
图8是反应CML样品的原始粒细胞门和原始淋巴细胞门特征性散射图样，
图9是反应ALL样品的原始粒细胞门和原始淋巴细胞门特征性散射图样，
图10是反应CLL样品的原始粒细胞门和原始淋巴细胞门特征性散射图样，
图11是反应OMF样品的原始粒细胞门和原始淋巴细胞门特征性散射图样，
图12是反应健康样品的原始粒细胞门和原始淋巴细胞门特征性散射图样，
另外根据限定的区域(“门”)中的特征性散射图样示出：
图13是单核细胞的区别，
图14是嗜中性粒细胞，
嗜酸性粒细胞，
图15是嗜碱性粒细胞，
淋巴细胞，
图16是嗜酸性粒细胞，
早幼粒细胞，
胚细胞，
巨核细胞，
图17是晚幼粒细胞。
分别录入了PCA参数(Val-X)或者物理参数和PCA参数的组合。
具体实施方式
借助于根据本发明的体外的方法能够进行生物样品中的白细胞的细胞类型的无标记方式的确定。无标记意味着，细胞不必通过例如荧光色素或放射性颗粒标记。在此，生物样品能够例如包括动物或人类的血细胞。在此优选地涉及全血样品，其例如包括血细胞10、例如白细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞。
在第一实验性实例中根据相应的特征性散射图样进行AML、CML、ALL、CLL和OMF的区分。
图1至图6示出了AML(图1)、CML(图2)、ALL(图3)、CLL(图4)、OMF(图5)和健康样品(图6)的特征性散射图样。“OMF”表示骨髓纤维瘤、骨髓增生性肿瘤(MPN)组的亚型。为了进行区分，应用了PCA参数Val4和Val5(相应的线性组合见上)。
用于具有各种白血病中的一种的病人或健康的受检者的样品的区分标准如下进行。
健康的受检者的样品：三个明确分开的数据范围：
1.范围：Val4＝400-600，Val5＝200-500，
2.范围：Val4＝600-750，Val5＝400-600，
3.范围：Val4＝700-850，Val5＝250-400。
具有AML的病人的样品：仅一个连续的数据范围：
Val4＝600-900，Val5＝300-600。
具有CML的病人的样品：能够分为3个范围的连续的数据范围：
1.范围：小部分群体在范围Val4＝400-550，Val5＝200-500中，
2.范围：占大多数的主要群体在范围Val4＝500-700，Val5＝200-500中，
3.范围：小部分群体在范围Val4＝700-850，Val5＝250-400中。
具有ALL的病人的样品：具有2个小的子群体的大的主群体：
1.范围：占大多数的主要群体在范围Val4＝700-850，Val5＝300-500中，
2.范围：小部分群体在范围Val4＝550-700，Val5＝300-450中，
3.范围：小部分群体在范围Val4＝500-700，Val5＝450-600中。
具有CLL的病人的样品：具有一个小的副群体的大的主群体：
1.范围：占大多数的主要群体在范围Val4＝650-900，Val5＝300-500中，
2.范围：小部分群体在范围Val4＝400-600，Val5＝300-500中。
具有OMF的病人的样品：能够分为4个区域的连续的数据范围：
1.范围：Val4＝700-900，Val5＝200-400，
2.范围：Val4＝600-750，Val5＝400-550，
3.范围：Val4＝500-600，Val5＝250-450。
4.范围：小部分群体在范围Val4＝400-650，Val5＝450-700中。
在第二实验性实例中根据相应的特征性散射图样进行AML、CML、ALL、CLL和OMF的区分。
图7至图12示出了AML(图7)、CML(图8)、ALL(图9)、CLL(图10)、OMF(图11)和健康样品(图12)的特征性散射图样。为区分应用PCA参数Val3和Val4(相应的线性组合参见上文)。限定了两个大的范围：
1.范围：Val4＝235-920，Val5＝576-816(＝门“原始粒细胞”(2))，
2.范围：Val4＝235-920，Val5＝816-1015(＝门“原始淋巴细胞”(1))。
用于具有各种白血病中的一种的病人或健康的受检者的样品的区分标准如下进行。
健康的受检者的样品：没有或仅有非常少数量的数据点在这两个门中。
具有AML的病人的样品：主要的群体在1.范围中：
>90％的所有的数据点在1.范围中，
<10％的所有的数据点在2.范围中。
具有CML的病人的样品：较少数量的数据点在1.范围中：
>90％的所有的数据点在1.范围中，
<10％的所有的数据点在2.范围中。
具有ALL的病人的样品：主要的群体延伸经过1.和2.范围：
<90％的所有的数据点在1.范围中，
>10％的所有的数据点在2.范围中。
具有CLL的病人的样品：主要的群体在2.范围中：
<10％的所有的数据点在1.范围中，
>90％的所有的数据点在2.范围中。
具有OMF的病人的样品：较少数量的数据点在1.和2.范围中：
>80％的所有的数据点在1.范围中，
<20％的所有的数据点在2.范围中。
在第三实验性的实例中进行白细胞的5种主类型以及另外的亚型的无标记的区分。
图13至17示出了白细胞的5种主类型以及另外的亚型根据在限定范围(“门”)中的特征性散射图样的无标记的区分。缩写“E&N&IG”(12)用于嗜酸的、嗜碱的和未成熟的粒细胞(见图13)。未成熟的粒细胞(“immature granulocytes”)在该情况下是晚幼粒细胞和中幼粒细胞。下面的范围限定用于区分细胞类型(给定的分别是所应用的参数和限定的范围(门)的X/Y坐标)：
1.范围＝门“单核白细胞”(3)：细胞类型单核白细胞如下在Val4和Val5的基础上区分。
| Val4 | Val5 |
| 606 | 483 |
| 636 | 522 |
| 664 | 538 |
| 697 | 527 |
| 727 | 496 |
| 746 | 435 |
| 650 | 361 |
| 622 | 438 |
2.范围＝门“嗜中细胞”(4)：细胞类型嗜中细胞如下在Val4和Val5的基础上区分。
3.范围＝门“嗜酸性粒细胞”(5)：细胞类型嗜酸性粒细胞如下在Val4和熵的基础上区分。
4.范围＝门“嗜碱细胞”(6)：细胞类型嗜碱细胞如下在Val4和Val5的基础上区分。
| Val4 | Val5 |
| 732 | 422 |
| 717 | 347 |
| 699 | 222 |
| 643 | 254 |
| 645 | 384 |
| 683 | 415 |
5.范围＝门“淋巴细胞”(7)：细胞类型淋巴细胞如下在Val4和Val5的基础上区分。
| Val4 | Val5 |
| 781 | 438 |
| 826 | 436 |
| 936 | 426 |
| 937 | 223 |
| 861 | 223 |
| 801 | 218 |
| 698 | 212 |
| 717 | 347 |
| 731 | 424 |
6.范围＝门“巨核细胞”(8)：细胞类型巨核细胞如下在Val3和熵的基础上区分。
| Val3 | 熵 |
| 33 | 233 |
| 332 | 805 |
7.范围＝门“早幼粒细胞”(9)：细胞类型早幼粒细胞如下在Val3和熵的基础上区分。
| Val3 | 熵 |
| 233 | 846 |
| 642 | 805 |
8.范围＝门“幼粒细胞”(10)：细胞类型幼粒细胞如下在等效直径和均匀性的基础上区分。
| 等效直径 | 均匀性 |
| 333 | 534 |
| 304 | 534 |
| 304 | 493 |
| 304 | 436 |
| 304 | 272 |
| 367 | 273 |
| 429 | 274 |
| 427 | 408 |
| 427 | 470 |
| 418 | 524 |
| 400 | 532 |
| 377 | 534 |
| 356 | 534 |
9.范围＝门“晚幼粒细胞”(11)：细胞类型晚幼粒细胞如下在等效直径和均匀性的基础上区分。
| 等效直径 | 均匀性 |
| 304 | 534 |
| 301 | 907 |
| 680 | 900 |
| 684 | 273 |
| 428 | 273 |
| 426 | 372 |
| 426 | 468 |
| 420 | 524 |
| 402 | 532 |
| 379 | 534 |
。
Claims (15)
1.一种用于无标记地确定生物样品中的白细胞的细胞类型的体外方法，其中，显微镜装置对细胞进行成像并且从所述细胞的成像中借助于自动图像分析来测定所述细胞的物理参数，
其特征在于，
基于所述物理参数并且基于主成分分析参数(PCA参数)来确定所述白细胞的细胞类型，其中，所述主成分分析参数包括所述物理参数的至少一部分的线性组合。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所确定的白细胞的细胞类型是来自包括下列各项的组中的白细胞的主要类型之一：单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所确定的细胞类型是白细胞的主要类型之一和/或来自包括下列各项的组中的白细胞的亚型：中幼粒细胞、晚幼粒细胞、早幼粒细胞、母细胞、巨核细胞、浆细胞、非典型淋巴细胞和赛塞利细胞。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，基于样品中的多种白细胞各自的细胞类型的确定来表征各个细胞群体，并且基于当前的细胞群体来确定，在所述样品所来源的患者体内是否存在急性髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性髓性白血病(CML)或慢性淋巴细胞白血病(CLL)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，细胞的所述物理参数包括来自以下组的参数，所述组包括：细胞的覆盖面积、细胞的周长、细胞的宽度、细胞的高度、细胞的宽高比、细胞的几何形状与圆的相似性、细胞的平均半径、细胞的半径的方差、细胞的覆盖度、对应细胞的覆盖面积的等效直径、细胞的光学体积、细胞的最大光学高度、细胞的最小光学高度、细胞的平均光学高度、细胞的光学高度的方差、细胞的双凹性、细胞的球度、细胞的质心偏移、细胞的对比度、细胞的不相似性、细胞的均匀性、细胞的能量、细胞的熵。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述细胞的所述成像包括：将物体波与参考波重叠、记录造成的干涉图和/或计算机执行的数学重建。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述显微镜装置是用于执行数字全息显微术(DHM)、干扰相位显微术或定量相位显微术的显微镜。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，由所述显微镜装置对流动室中的白细胞进行成像，其中，所述流动室优选包括具有矩形或正方形的横截面的通道。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述白细胞借助于层状鞘流、优选借助于四个层状鞘流来聚焦。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在借助于所述显微镜装置对所述白细胞进行成像之前，借助于选择性的细胞裂解从所述样品中去除红细胞。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法利用未染色和/或未干燥的细胞执行。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括以下步骤：
-利用标记对细胞进行表型分型，和/或
-表达预先确定的受体以用于进一步分配细胞。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法利用全血样品执行和/或所述生物样品包含血细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和/或淋巴细胞。
14.一种细胞分析装置，所述细胞分析装置设置用于实施根据权利要求1至13中任一项所述的方法。
15.一种用于无标记地确定生物样品的细胞的细胞类型的显微镜装置，包括根据权利要求14所述的细胞分析装置。
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