CN117538239A - 一种肺泡灌洗液的细胞分类方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肺泡灌洗液的细胞分类方法。所述方法包括在Sysmex XN‑V动物血液分析仪中调用特定的设门参数分析待测样本，所述待测样本为支气管肺泡灌洗液样本。本方法可以通过仪器自动计数的方式对BALF细胞成分进行准确分类计数，与传统人工镜检计数相比，无需长周期人员技术培训，且快速、简便、高通量，可以满足临床前安全性评价中大量大鼠样本BALF有核细胞的分类计数需求。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肺泡灌洗液的细胞分类方法。
背景技术
支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)是通过纤维支气管镜对支气管以下肺段、亚肺段水平用无菌生理盐水反复灌洗，回收获取的肺泡表面衬液样本。其操作简单、创伤小，作为评价肺部疾病的重要手段已被广泛应用。BALF的有核细胞分类计数检查在呼吸系统疾病，尤其是下呼吸道疾病的诊断、疗效观察、预后判断及发病机制研究等方面有着重要的意义。
目前对于临床前阶段大鼠样本的BALF细胞分类计数检查鲜有报道，且主要检测方法只有传统的显微镜检查，即制片、染色后显微镜下观察，得出各类细胞的数量及相应比例。这种传统的显微镜检查是细胞分类的金标准，但该过程对技术人员专业能力要求高，人员培训周期长，且费时、繁琐，不适用大量样本检测的情况。因此建立一种快速、简便、高通量的BALF细胞分类计数方法具有重要意义。
全自动血液分析仪采用流式细胞技术及核酸荧光染色检测原理，根据不同细胞的形态特点对各类细胞进行分类计数。该类仪器一般带有体液检测模式，可用于胸腹水、脑脊液等体液样本的自动分类计数检测。与其它体液样本不同的是，BALF是通过用无菌生理盐水反复灌洗支气管以下肺段、亚肺段得到的肺泡表面衬液样本，一方面BALF中含有大量粘液易造成仪器样本针堵塞，另一方面BALF中有核细胞成分主要为巨噬细胞，与主要以中性粒细胞、淋巴细胞为主的体液样本不同，因此仪器的体液模式检测参数难以准确识别巨噬细胞。因此我们探索性采用全自动血液分析仪的低白细胞模式(LW模式)对BALF进行检测，以期建立一种快速、简便、高通量的BALF细胞自动分类计数的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有仪器Sysmex XN-V动物血液分析仪使用说明书中缺少BALF检测功能，提供一种肺泡灌洗液的细胞分类方法，通过调整各项检测参数实现仪器对大鼠BALF样本自动准确识别各类细胞，并对有核细胞进行分类计数。
发明人根据Sysmex XN-V动物血液分析仪的流式细胞技术及核酸荧光染色检测原理，结合大鼠BALF样本中常见细胞如巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞的形态学特点，采用仪器低白细胞模式(LW模式)，通过调整各项检测参数，实现仪器对大鼠BALF样本的自动分类计数。
本发明通过以下技术方案解决上述问题：
本发明的第一方面提供一种肺泡灌洗液的细胞分类方法，所述方法包括在SysmexXN-V动物血液分析仪中调用以下设门参数分析待测样本：
对于单核细胞和巨噬细胞，侧向散射光(SSC)的相对强度与侧向荧光(SFL)的相对强度为(54,191)、(55,255)、(236,255)、(237,255)、(255,255)、(255,85)；
对于淋巴细胞，侧向散射光(SSC)的相对强度与侧向荧光(SFL)的相对强度为(105,65)、(120,160)、(55,190)、(55,55)、(85,50)；
对于中性粒细胞，侧向散射光(SSC)的相对强度与侧向荧光(SFL)的相对强度为(84,49)、(106,64)、(118,35)；
对于嗜酸性粒细胞，侧向散射光(SSC)的相对强度与侧向荧光(SFL)的相对强度为(120,35)、(150,70)、(255,85)、(255,45)；
对于嗜碱性粒细胞，侧向散射光(SSC)的相对强度与侧向荧光(SFL)的相对强度为(166,255)；
所述待测样本为支气管肺泡灌洗液样本。
本发明一些实施方案中，所述待测样本为来自大鼠的样本。
本发明的第二方面提供一种对支气管肺泡灌洗液进行有核细胞分类计数的方法，所述方法包括将待测样本用Sysmex XN-V动物血液分析仪分析的步骤；
所述分析调用以下设门参数：
对于单核细胞和巨噬细胞，侧向散射光(SSC)的相对强度与侧向荧光(SFL)的相对强度为(54,191)、(55,255)、(236,255)、(237,255)、(255,255)、(255,85)；
对于淋巴细胞，侧向散射光(SSC)的相对强度与侧向荧光(SFL)的相对强度为(105,65)、(120,160)、(55,190)、(55,55)、(85,50)；
对于中性粒细胞，侧向散射光(SSC)的相对强度与侧向荧光(SFL)的相对强度为(84,49)、(106,64)、(118,35)；
对于嗜酸性粒细胞，侧向散射光(SSC)的相对强度与侧向荧光(SFL)的相对强度为(120,35)、(150,70)、(255,85)、(255,45)；
对于嗜碱性粒细胞，侧向散射光(SSC)的相对强度与侧向荧光(SFL)的相对强度为(166,255)。
本发明一些实施方案中，所述待测样本为来自大鼠的样本。
本发明一些实施方案中，所述方法还包括将所述分析的结果与待测样本的镜检结果进行比对的步骤。
本发明的第三方面提供一种肺泡灌洗液的细胞分类的系统，所述系统包括分析模块和判断模块；所述分析模块调用以下设门参数对待测样本的有核细胞进行分类计数，所述判断模块根据分析模块获得的有核细胞分类结果判断各类型的有核细胞在待测样本的细胞中的占比；
对于单核细胞和巨噬细胞，侧向散射光(SSC)的相对强度与侧向荧光(SFL)的相对强度为(54,191)、(55,255)、(236,255)、(237,255)、(255,255)、(255,85)；
对于淋巴细胞，侧向散射光(SSC)的相对强度与侧向荧光(SFL)的相对强度为(105,65)、(120,160)、(55,190)、(55,55)、(85,50)；
对于中性粒细胞，侧向散射光(SSC)的相对强度与侧向荧光(SFL)的相对强度为(84,49)、(106,64)、(118,35)；
对于嗜酸性粒细胞，侧向散射光(SSC)的相对强度与侧向荧光(SFL)的相对强度为(120,35)、(150,70)、(255,85)、(255,45)；
对于嗜碱性粒细胞，侧向散射光(SSC)的相对强度与侧向荧光(SFL)的相对强度为(166,255)；
所述待测样本为支气管肺泡灌洗液样本。
本发明一些实施方案中，所述分析模块为Sysmex XN-V。
本发明一些实施方案中，所述待测样本为来自大鼠的样本。
本发明的第四方面提供一种计算机可读存储介质，其存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时，可实现如第一方面或第二方面所述的方法的步骤，或者如第三方面所述的系统的功能。
本发明的第五方面提供一种电子设备，其包括存储器和处理器，所述存储器存储有计算机程序，所述处理器用于执行所述计算机程序以实现如第一方面或第二方面所述的方法的步骤，或者如第三方面所述的系统的功能。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明与传统人工镜检计数相比，无需长周期人员技术培训，通过快速、简便、高通量检测大鼠BALF样本，建立了BALF有核细胞分类计数的自动化检测方法，为临床前阶段动物样本检测提供了新思路，为新药研发单位提供多方位的服务，推动国内相关领域学科发展。
附图说明
图1为BALF样本涂片显微镜检图。
图2为EO(嗜酸性粒细胞)的WDF散点图的设门方案图。
图3为NEUT(中性粒细胞)的WDF散点图的设门方案图。
图4为LYMPH(淋巴细胞)的WDF散点图的设门方案图。
图5为MONO(单核、巨噬细胞)的WDF散点图的设门方案图。
图6为BOSO(嗜碱性粒细胞)的WDF散点图的设门方案图。
图7为对比例的WDF散点图设门方案。
图8为对比例的WNR散点图设门方案。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
本实施例中，发明人通过BALF涂片形态学镜检得出有核细胞实际分类计数，通过现有仪器参数检测得出初步结果，再结合大鼠BALF样本中常见细胞的形态学特点与镜检结果，通过调整各项检测参数，实现仪器对大鼠BALF样本的自动分类计数。具体步骤如下：
1、采集SD大鼠BALF样本(BALF样本由支气管肺泡灌洗术获得)，800g、10min离心，去上清，用200μL生理盐水重悬沉淀，取少量混悬液制备涂片用于显微镜检，剩余混悬液用于上机检测。
2、BALF样本涂片结果(如图1)显示存在大量巨噬细胞，各有核细胞具体分类为：巨噬96％、中性粒细胞2％、淋巴2％。
选择Sysmex XN-V动物血液分析仪的LW模式，进行BALF样本检测，分类结果显示：中性粒细胞90％、单核细胞10％。
由此可见，目前低白细胞模式检测的结果不能真实反映大鼠BALF的有核细胞情况，需根据涂片结果重新调整设门。
3、选择仪器“再分析”功能——Munual Analysis(手动分析)，在仪器软件WDF散点图中对检测的细胞群进行手动重新设门，分为五类细胞：MONO(单核、巨噬细胞)、LYMPH(淋巴细胞)、NEUT(中性粒细胞)、EO(嗜酸性粒细胞)、BOSO(嗜碱性粒细胞)。图2-图6为WDF散点图的设门方案，及大鼠BALF各类有核细胞分群的设门坐标参数，具体如下表1所示。
表1设门参数
4、将上述手动设门参数保存为大鼠BALF有核细胞分析模板，然后调用BALF分析模板再分析所有检测的BALF样本数据，仪器界面中就可以查看到再分析的结果，显示巨噬96％、中性粒细胞2％、淋巴2％，与镜检结果一致。
对比例1
采用实施例1建立的BALF有核细胞分析模板对其他SD大鼠BALF样本测试，结果见表2，经比对，与镜检结果一致，证实本发明的模板可用于SD大鼠BALF样本自动分类计数。
表2
对比例2：对小鼠支气管肺泡灌洗液的分析检测
1)收集BALF样本；
2)离心处理，离心条件：4℃、800g、10min；
3)得到的细胞沉淀物用PBS重悬；
4)选择Sysmex XN-V动物血液分析仪的低白细胞模式(LW模式)；
使用“再分析”功能——Munual Analysis(手动分析)。在仪器软件WDF散点图、WNR散点图中，可以对特定的细胞群进行手动重新设门，并将手动设门区域保存为BALF分析模板，然后调用BALF分析模板再分析所有检测的BALF样本数据，仪器界面中就可以查看到再分析的结果。图7和表3为WDF散点图的设门方案，图8为WNR散点图的设门方案。
表3
5)选择BALF模板进行检测
采用该小鼠BALF检测方法对大鼠BALF进行检测，结果见表4，与实际镜检结果完全不符，故现有报道方法不适用大鼠BALF检测。
表4
。
Claims (10)
1.一种肺泡灌洗液的细胞分类方法，其特征在于，所述方法包括在Sysmex XN-V动物血液分析仪中调用以下设门参数分析待测样本：
对于单核细胞和巨噬细胞，侧向散射光(SSC)的相对强度与侧向荧光(SFL)的相对强度为(54,191)、(55,255)、(236,255)、(237,255)、(255,255)、(255,85)；
对于淋巴细胞，侧向散射光(SSC)的相对强度与侧向荧光(SFL)的相对强度为(105,65)、(120,160)、(55,190)、(55,55)、(85,50)；
对于中性粒细胞，侧向散射光(SSC)的相对强度与侧向荧光(SFL)的相对强度为(84,49)、(106,64)、(118,35)；
对于嗜酸性粒细胞，侧向散射光(SSC)的相对强度与侧向荧光(SFL)的相对强度为(120,35)、(150,70)、(255,85)、(255,45)；
对于嗜碱性粒细胞，侧向散射光(SSC)的相对强度与侧向荧光(SFL)的相对强度为(166,255)；
所述待测样本为支气管肺泡灌洗液样本。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样本为来自大鼠的样本。
3.一种对支气管肺泡灌洗液进行有核细胞分类计数的方法，其特征在于，所述方法包括将待测样本用Sysmex XN-V动物血液分析仪分析的步骤；
所述分析调用以下设门参数：
对于单核细胞和巨噬细胞，侧向散射光(SSC)的相对强度与侧向荧光(SFL)的相对强度为(54,191)、(55,255)、(236,255)、(237,255)、(255,255)、(255,85)；
对于淋巴细胞，侧向散射光(SSC)的相对强度与侧向荧光(SFL)的相对强度为(105,65)、(120,160)、(55,190)、(55,55)、(85,50)；
对于中性粒细胞，侧向散射光(SSC)的相对强度与侧向荧光(SFL)的相对强度为(84,49)、(106,64)、(118,35)；
对于嗜酸性粒细胞，侧向散射光(SSC)的相对强度与侧向荧光(SFL)的相对强度为(120,35)、(150,70)、(255,85)、(255,45)；
对于嗜碱性粒细胞，侧向散射光(SSC)的相对强度与侧向荧光(SFL)的相对强度为(166,255)。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述待测样本为来自大鼠的样本。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述分析的结果与待测样本的镜检结果进行比对的步骤。
6.一种肺泡灌洗液的细胞分类的系统，其特征在于，所述系统包括分析模块和判断模块；所述分析模块调用以下设门参数对待测样本的有核细胞进行分类计数，所述判断模块根据分析模块获得的有核细胞分类结果判断各类型的有核细胞在待测样本的细胞中的占比；
对于单核细胞和巨噬细胞，侧向散射光(SSC)的相对强度与侧向荧光(SFL)的相对强度为(54,191)、(55,255)、(236,255)、(237,255)、(255,255)、(255,85)；
对于淋巴细胞，侧向散射光(SSC)的相对强度与侧向荧光(SFL)的相对强度为(105,65)、(120,160)、(55,190)、(55,55)、(85,50)；
对于中性粒细胞，侧向散射光(SSC)的相对强度与侧向荧光(SFL)的相对强度为(84,49)、(106,64)、(118,35)；
对于嗜酸性粒细胞，侧向散射光(SSC)的相对强度与侧向荧光(SFL)的相对强度为(120,35)、(150,70)、(255,85)、(255,45)；
对于嗜碱性粒细胞，侧向散射光(SSC)的相对强度与侧向荧光(SFL)的相对强度为(166,255)；
所述待测样本为支气管肺泡灌洗液样本。
7.如权利要求6所述的系统，其特征在于，所述分析模块为Sysmex XN-V。
8.如权利要求6所述的系统，其特征在于，所述待测样本为来自大鼠的样本。
9.一种计算机可读存储介质，其存储有计算机程序，其特征在于，所述计算机程序被处理器执行时，可实现如权利要求1-5任一项所述的方法的步骤，或者如权利要求6-8任一项所述的系统的功能。
10.一种电子设备，其包括存储器和处理器，所述存储器存储有计算机程序，其特征在于，所述处理器用于执行所述计算机程序以实现如权利要求1-5任一项所述的方法的步骤，或者如权利要求6-8任一项所述的系统的功能。
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2023
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