CN111856011A - 一种检测丝氨酸羟甲基转移酶活性的试剂盒以及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测丝氨酸羟甲基转移酶活性的试剂盒，具有检测液，强碱溶液以及苯甲酸免疫胶体金检测试纸条；其中检测液包括DL‑苯基丝氨酸溶液、磷酸吡哆醛和磷酸钾缓冲液；所述检测液的pH值为8.0。本发明还公开了该试剂盒在用于非治疗目的的丝氨酸羟甲基转移酶活性半定量检测方法中的应用。利用本发明试剂盒对丝氨酸羟甲基转移酶活性进行检测，方法简单、直观，操作简便、快速（5‑7分钟即可得到结果）、灵敏度高（0.156μg/mL），特异性强，无需采用实验室大型设备，肉眼即可判定结果，适用于现场筛选和快速检测，对临床疾病研究及诊断意义非凡，且具有广泛的商业开发应用前景。

Description

一种检测丝氨酸羟甲基转移酶活性的试剂盒以及检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域，尤其是涉及一种检测丝氨酸羟甲基转移酶活性的试剂盒，本发明还涉及该试剂盒在用于非治疗目的的丝氨酸羟甲基转移酶活性半定量检测方法中的应用。

背景技术

丝氨酸羟甲基转移酶（Serine Hydroxymethltransferase，SHMT）是一种含磷酸吡哆醛的酶，该酶基因位于17号染色体上的Smith-Magenis syndrom区域。在人体中存在两种亚型：丝氨酸羟甲基转移酶1（SHMT 1）和丝氨酸羟甲基转移酶2（SHMT 2）。胞质中以丝氨酸羟甲基转移酶1（SHMT 1）为主，线粒体中以丝氨酸羟甲基转移酶2（SHMT 2）为主。丝氨酸羟甲基转移酶是丝氨酸合成中的关键酶，包括催化丝氨酸和四氢叶酸盐可逆转化为甘氨酸和5 , 10 -亚甲基四氢叶酸盐。该反应为细胞质中蛋氨酸、胸腺嘧啶和嘌呤的合成提供了一个碳基。

近年来的研究已确认，与丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）相关的疾病包括：吡哆醇缺乏症和弯曲杆菌病等。同时也有报道丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）的表达及活性与多种肿瘤的发生发展存在显著相关性。故丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）活性的有效检测在癌症诊断和治疗中具有巨大价值。

菌源性丝氨酸羟甲基转移酶逆向酶活测定法已被认为是检测丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）活性的金标准方法。使用丝氨酸羟甲基转移酶逆向酶活测定法的原理如下：丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）可以水解 DL-苯基丝氨酸生成甘氨酸和苯甲醛，后者在 279 nm 处有特征性的强烈吸收。用多功能酶标仪测定苯甲醛A279 值，根据 A279 -苯甲醛浓度回归方程确定反应液中苯甲醛浓度。

尽管这个最常见的方法灵敏度高，但仍有许多缺点，如费时，检测时需要复杂的优化，易产生假阳性，需要有多功能酶标仪等大型实验室设备，且需要建立苯甲醛标准曲线，并且检测对象为纯化的菌源性丝氨酸羟甲基转移酶。因此寻找到一种更加便捷、灵敏度高的方法将对丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）的研究起到推动作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测丝氨酸羟甲基转移酶活性的试剂盒，利用本发明试剂盒对丝氨酸羟甲基转移酶活性进行检测，方法简单、直观，本发明还提供该试剂盒在用于非治疗目的的丝氨酸羟甲基转移酶活性半定量检测方法中的应用。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述检测丝氨酸羟甲基转移酶活性的试剂盒，具有检测液，强碱溶液以及苯甲酸免疫胶体金检测试纸条。

所述检测液包括DL-苯基丝氨酸溶液、磷酸吡哆醛和磷酸钾缓冲液；所述检测液的pH值 为 8.0。

优选的，所述检测液中DL-苯基丝氨酸的浓度为20mmol﹒L^-1，磷酸吡哆醛的浓度为20μmol﹒L^-1，磷酸钾缓冲液的浓度为20mmol﹒L^-1。

所述强碱溶液为氢氧化钠（NaOH）溶液，其浓度为0.005~1mol﹒L^-1。进一步优选，氢氧化钠溶液浓度为40mmol﹒L^-1。

所述苯甲酸免疫胶体金检测试纸条包括金标抗体垫，带有检测线和质控线的包被膜；所述金标抗体垫上标记有苯甲酸金标抗体，所述检测线上包被有苯甲酸抗原，所述质控线上包被有羊抗兔二抗。

所述胶体金采用柠檬酸三钠还原法制备而得，其颗粒直径为17nm。

一种用于非治疗目的的丝氨酸羟甲基转移酶活性半定量检测方法，包括下述步骤：

第一步，获取含丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）的蛋白样品；

第二步，向该丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）的蛋白样品中加入DL-苯基丝氨酸、磷酸吡哆醛、磷酸钾缓冲液，于37 ℃ 震荡反应60分钟，形成丝氨酸羟甲基转移酶延伸反应产物；

第三步，向第二步得到的反应产物中加入强碱氢氧化钠溶液进行反应；

第四步，将反应后的混合体系使用苯甲酸免疫胶体金检测试纸条进行反应，肉眼观察显色结果。

本发明基于传统的丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）的逆向酶活性测定原理，利用丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）可以水解苯基丝氨酸生成甘氨酸和苯甲醛，而苯甲醛又在强碱条件下自身发生氧化还原反应，产生苯甲酸和苯甲醇的特性，结合胶体金免疫层析法，通过反应后的混合体系与苯甲酸胶体金免疫层析快速检测试纸条进行反应来测定苯甲酸，根据反应前后的显色情况半定量的确定丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT1/2）的酶活。该方法操作简便、快速（5-7分钟即可得到结果）、灵敏度高（0.156μg/mL），特异性强，无需采用实验室大型设备，肉眼即可判定结果，适用于现场筛选和快速检测，对临床疾病研究及诊断意义非凡，且具有广泛的商业开发应用前景。

附图说明

图1是本发明试剂盒中试纸条的结构。

图2是图2的俯视图。

图3是本发明试剂盒的检测步骤图。

图4、图5是本发明试剂盒的灵敏度测试结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明。应当理解的是，有关描述仅出于对本发明进行说明的目的，并不以任何方式限制本发明。

如无特殊说明，本发明中所用的化学试剂盒仪器均可市售获得，本发明中使用的方法也为本领域常规方法。

实施例1 制备检测丝氨酸羟甲基转移酶活性的试剂盒

1、配制检测液和强碱溶液

配制DL-苯基丝氨酸溶液、磷酸吡哆醛溶液、磷酸钾缓冲液三种检测试剂，为实际使用的方便，将三种检测试剂装入一个试剂瓶中，其中检测液中DL-苯基丝氨酸的浓度为20mmol﹒L^-1，磷酸吡哆醛的浓度为20μmol﹒L^-1，磷酸钾缓冲液的浓度为20mmol﹒L^-1。

将浓度40mmol﹒L^-1的氢氧化钠溶液装在一个试剂瓶中。

2、制备苯甲酸免疫胶体金检测试纸条

a、制备金标抗体

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金：将100mL 0.01%的HAUCl₄溶液恒温磁力搅拌加热至沸腾，保持煮沸1min，不断搅拌的同时迅速加入2.0mL质量分数为1%的柠檬酸三钠溶液，待溶液颜色变成澄清透明、鲜红的胶体金溶液并不再变化即可；冷却后加入NaN ₃至终浓度为0.02%，4℃冰箱保存，做紫外扫描及电镜透射质量鉴定。

b、制备试纸条

通过实验优化确定最佳金标抗体稀释浓度（2μg/mL）、最佳包被抗原（苯甲酸）浓度（1mg/mL）和二抗包被浓度（1.0mg/mL）。

将胶体金探针灌注到已处理好的玻璃纤维膜上，真空冻干4h后备用；在NC膜（60mm×300mm）上用喷膜机将包被抗原和包被二抗喷成两条线，至37℃真空恒温干燥箱中干燥4h以上。将17mm吸水纸1、25mmNC膜2（T为检测线，C为质控线）、6mm玻璃纤维膜3和18mm加样纸4由顶部依次粘贴于PVC板5上，裁成细条，得到苯甲酸免疫胶体金检测试纸条。试纸条成品如图1、图2所示。将试纸条组装在塑料壳中，塑料上盖上开设加样孔（与加样纸4位置对应）和显示孔（与检测线T和质控线C位置对应）。

3、制备标准色卡

采用数码相机拍摄一系列浓度的丝氨酸羟甲基转移酶蛋白溶液（0.0704mg.mL^-1、0.352mg.mL^-1、1.76mg.mL^-1、8.8mg.mL^-1）在反应后的一系列试纸显色情况，制成包括一系列颜色的标准色卡，该标准色卡中的每种颜色对于相应的丝氨酸羟甲基转移酶相对活性。

4、组装试剂盒

将试纸条、标准色卡和四瓶试剂一起放入盒体中，得到检测丝氨酸羟甲基转移酶活性的成品试剂盒。

实施例2 采用实施例1制备的试剂盒检测丝氨酸羟甲基转移酶活性

本发明试剂盒的检测步骤如图3所示，具体包括：

1、获得丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）蛋白样品

从人体血细胞、组织（如肝组织）或细胞系中分别提取出细胞质总蛋白（内含SHMT1）和细胞线粒体总蛋白（内含SHMT2）；具体操作方法如下：

收集肝癌肝移植患者的正常肝组织，将其用磷酸缓冲盐水（pH7.4）洗涤三次，每次洗涤后4℃条件下4500g离心。然后置于200μL的冰冷的1×RIPA裂解缓冲液中，匀浆机制得组织匀浆。然后在4℃条件下12000rpm离心20分钟，所得上清液即为含丝氨酸羟甲基转移酶的细胞全蛋白样品。将上清液转移到新鲜管中，于-80℃下保藏。

也可应用胞质和线粒体蛋白质提取试剂盒提取细胞质和线粒体总蛋白质。

2、向该丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）的蛋白样品（1mg/mL）中加入DL-苯基丝氨酸、磷酸吡哆醛、磷酸钾缓冲液三种检测溶液。然后，于37 ℃ 震荡反应60分钟，反应生产苯甲醛和甘氨酸混合溶液；

3、在得到的混合溶液中加入强碱氢氧化钠溶液，使苯甲醛与氢氧化钠溶液混合发生氧化还原反应，生成苯甲酸和苯甲醇混合溶液；

4、将反应后的混合溶液滴入苯甲酸免疫胶体金检测试纸条中，计时5-7min后，肉眼观察试纸条的颜色变化。

检测结果判定：当试纸条中的检测线T为深红色，质控线C呈浅红或深红色时，结果为阴性；当试纸条中的检测线T为浅红色或无色，质控线C呈深红色时，结果为阳性；当试纸条中的检测线T为深红色或无色，质控线C无色时，试纸条失效。

实施例3 本发明试剂盒的性能测试

1、灵敏度实验

将苯甲酸标准品用阴性样品配制成0、0.156、0.312、0.625、1.25、2.5、5、10、20μg/mL等标准系列溶液，在室温且较为干燥的环境下，用吸管取200μL标准系列溶液于试纸条的加样孔中，观察不同时间段试纸条灵敏度显示结果，并比较同一批次及不同批次的重复实验结果。结果如图4所示，检测结果显示质控线C均显色，检测线T显示随着苯甲酸浓度的增高颜色逐渐变浅。

将丝氨酸羟甲基转移酶配制成总蛋白含量为0.0704mg.mL^-1、0.352mg.mL^-1、1.76mg.mL^-1、8.8mg.mL^-1的溶液，分别添加在试纸条的加样孔中，观察其结果。结果如图5所示，随着总蛋白浓度得增加，检测线T显色逐渐变浅。

通过以上实验可以看出，本发明试剂盒的检测限为0.156μg/mL，可在5~7min内完成测试，与苯酚、甲苯、苯乙酸、苯丙氨酸等均无交叉反应，检测结果与酶联免疫吸附法完全一致。

Claims (7)

1.一种检测丝氨酸羟甲基转移酶活性的试剂盒，其特征在于：具有检测液，强碱溶液以及苯甲酸免疫胶体金检测试纸条。

2.根据权利要求1所述的检测丝氨酸羟甲基转移酶活性的试剂盒，其特征在于：所述检测液包括DL-苯基丝氨酸溶液、磷酸吡哆醛和磷酸钾缓冲液；所述检测液的pH值 为 8.0。

3.根据权利要求1所述的检测丝氨酸羟甲基转移酶活性的试剂盒，其特征在于：所述检测液中DL-苯基丝氨酸的浓度为20mmol﹒L^-1，磷酸吡哆醛的浓度为20μmol﹒L^-1，磷酸钾缓冲液的浓度为20mmol﹒L^-1。

4.根据权利要求1所述的检测丝氨酸羟甲基转移酶活性的试剂盒，其特征在于：所述强碱溶液为氢氧化钠溶液。

5.根据权利要求1所述的检测丝氨酸羟甲基转移酶活性的试剂盒，其特征在于：所述苯甲酸免疫胶体金检测试纸条包括金标抗体垫，带有检测线和质控线的包被膜；所述金标抗体垫上标记有苯甲酸金标抗体，所述检测线上包被有苯甲酸抗原，所述质控线上包被有羊抗兔二抗。

6.根据权利要求5所述的检测丝氨酸羟甲基转移酶活性的试剂盒，其特征在于：所述胶体金采用柠檬酸三钠还原法制备而得，其颗粒直径为17nm。

7.一种用于非治疗目的的丝氨酸羟甲基转移酶活性半定量检测方法，其特征在于包括下述步骤：

第一步，获取含丝氨酸羟甲基转移酶的蛋白样品；

第二步，向该丝氨酸羟甲基转移酶的蛋白样品中加入DL-苯基丝氨酸、磷酸吡哆醛、磷酸钾缓冲液，于37 ℃ 震荡反应60分钟，形成丝氨酸羟甲基转移酶延伸反应产物；

第三步，向第二步得到的反应产物中加入强碱氢氧化钠溶液进行反应；

第四步，将反应后的混合体系使用苯甲酸免疫胶体金检测试纸条进行反应，肉眼观察显色结果。

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