CN111855993A - 一种基于声波微流体的高灵敏度快速免疫检测方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于声波微流体的高灵敏度快速免疫检测方法和应用，该免疫检测方法包括采用声波微流体对试剂中有效物质进行富集，然后利用声波进行清洗的步骤；所述清洗为应用声波微流体对非特异性吸附的分子进行解吸附。本发明提供的免疫检测方法，基于声波微流体将分子富集以及非特异性解吸附作用相结合以提高免疫检测灵敏度和加快检测速度，实现高灵敏度、快速的免疫检测，具有广阔的市场前景。

Description

一种基于声波微流体的高灵敏度快速免疫检测方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医学免疫检测技术领域，尤其涉及一种基于声波微流体的高灵敏度快速免疫检测方法和应用。
背景技术
微流控技术具有试剂用量少、低成本和高集成度等优点,已经在环境监测领域展示了良好的应用前景,并能够满足分析仪器便携、微型的发展方向。对免疫球蛋白的快速检测和传染性疾病的早期诊断尤为重要。免疫检测是诊断传染性疾病的重要手段。在过去的数十年内，此领域得到了迅速的发展，科学家先后发明了多种免疫检测方法。由于病患发病初期阳性血清中抗原/抗体的浓度较低，其对检测的灵敏度有更高的要求。同时由于传染性具有集中爆发的可能性，快速检测对于迅速确诊感染者，减少医疗资源占有具有重要作用。因此免疫检测的灵敏度和速度的优化将是一个不断追求的方向。然而目前多数免疫检测方法停留在试剂的研发和优化的技术路线上，极少在仪器、方法上对灵敏度和快速性进行优化，如通过富集被测分子来提高灵敏度；通过辅助手段除去非特异性吸附，增加检测极限；通过声波等辅助清洗加快速度。这极大的限制了灵敏度和速度的快速提高。
发明内容
为了优化现有免疫检测的灵敏度和检测速度，本发明提供了一种基于声波微流体的高灵敏度快速免疫检测方法及应用。本发明的免疫检测方法，基于声波微流体将分子富集以及非特异性解吸附作用相结合以提高免疫检测灵敏度和加快检测速度，实现高灵敏度、快速的免疫检测，具有广阔的市场前景。
本发明的一方面在于提供一种基于声波微流体的高灵敏度快速免疫检测方法，包括采用声波微流体对所述试剂中有效物质进行富集，然后利用声波进行清洗的步骤；所述清洗为应用声波微流体对非特异性吸附的分子进行解吸附。(清洗包括两个部分：一种是普通的快速清洗，一种是解吸附)
根据本发明的一些优选实施方式，在1G～10GHz的频率下，1mW～10W的功率下进行所述富集；和/或，在1G～10GHz的频率下1mW～10W的功率下进行所述解吸附。
根据本发明的一些优选实施方式，声波微流体区域的高度为1～1000μm，优选为10～50μm。
根据本发明的一些优选实施方式，所述试剂包括样本、检测抗体、抗原、标记物、荧光底物、化学发光实际、显色剂中的一种或多种。
根据本发明的一些优选实施方式，加入所述试剂之前还包括包被、清洗、封闭和清洗的步骤。此处的清洗可以不用声波器件。
根据本发明的一些优选实施方式，采用声波微流控器件进行所述富集和所述解吸附，所述声波微流控器件包括相互键合的声波器件和微流控器件，优选的，所述声波器件为体声波器件。
根据本发明的一些优选实施方式，所述声波器件与所述微流控器件的键合处还包括界面材料。
根据本发明的一些优选实施方式，所述界面材料选自聚苯乙烯、聚氯乙烯、二氧化硅、掺杂二氧化硅中的一种或多种。
根据本发明的一些优选实施方式，所述声波器件的工作频率为10M～10GHz，优选为1G～5GHz。
本发明的另一方面在于提供所述的方法在生物医学免疫检测中的应用，优选在白细胞介素、乙肝病毒、新冠病毒检测中的应用。
本发明采用声学微流控芯片技术，应用声波微流体的富集效应和对非特异性吸附的解吸附效应，来增强免疫检测灵敏度和速度。如图1所示，本发明的方法应用声波微流体的富集效应，增强免疫检测中待测物质的局部浓度(浓度提高10～100倍)，提高检测的灵敏度，同时局部浓度的提高能够加快生物化学反应的速度；应用声波微流体对非特异性吸附的解吸附效应，去除表面非特异性吸附，能够降低免疫检测的本底噪声，提高检测的灵敏度，同时在清洗换液的过程中，解吸附作用能够加快清洗的速度(将清洗的时间降低到0.1～10s之间)。结合以上两个声波微流体的效应，本发明能够提高免疫检测的灵敏度和检测速度。
本发明的免疫检测方法，基于声波微流体将分子富集以及非特异性解吸附作用相结合以提高免疫检测灵敏度和加快检测速度，实现高灵敏度(灵敏度提高10～1000倍)、快速的免疫检测(检测时间降低到1min-30min，优选10min)，具有广阔的市场前景。
附图说明
图1为本发明一些实施方式中基于体声波微流体进行免疫检测原理示意图。
图2为本发明一些实施方式中实施流程示意图；
图3为本发明一些实施方式中声波微流体器件的结构框图；
图4为本发明实施例1中实施流程示意图；
图5为本发明实施例1聚集与非聚集蛋白的浓度实验示意图。
图中，11为基底材料；12为微流体外壁；13为声波微流体的沟道；14为声波谐振器结构。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用仪器、试剂等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。本发明中所用的原料均可在国内产品市场方便买到。
本发明中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，遂图式中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。
根据本发明的一些优选实施方式，如图2所示，本实施方式提供免疫检测的实施流程，包括以下步骤：包被，封闭，加入试剂如样本、检测抗体或抗原、标记物等，最后加入底物进行反应和检测，在每一步骤之间有必要的清洗步骤(本实施例为包被，清洗、封闭、清洗、加入试剂及富集、清洗解吸附、加入底物进行反应和检测)。本实施方式中，不限于加入试剂的种类和次数，图2中步骤21框图内的各步骤(加入试剂、富集和清洗)可进行一次、两次、三次或多次，每次的试剂种类根据具体检测而决定。在步骤21框图这样的过程中，在加入试剂后，开启声波器件的富集功能，将试剂中的有效物质富集到指定区域，以进行快速的生化反应。本实施方式中，富集的区域包括但不限于声波所制作的表面，也包括周围的侧壁区域和顶部区域：使用清洗液，清洗液为行业内所公知的即可，清洗时、开启一次或多次声波器件的解吸附功能，以快速的去除免疫检测中各种非特异性吸附，加快清洗的速度。
根据本发明的一些优选实施方式，如图3所示，本实施方式提供的声波微流体器件，用于通过声学波对微流体进行操控。该声波微流体器件包括声波谐振器(声波器件)和微流控器件，至少包括基底材料11、微流体外壁12、声波微流体的沟道13和声波谐振器14。声波谐振器的表面选择性制备一层可以与微流体键合的材料，并且能够进行免疫反应的修饰，包括但不限于二氧化硅，聚苯乙烯，聚氯乙烯。本实施方式中声波器件的电极延伸到键合区域以外，便于施加电学信号，电学信号可以灵活的打开、关闭以及调节参数，能够满足在免疫检测过程中特定的展现富集效应和非特异性解吸附效应。其中的微流体外壁12应用透明材料，并在其上制备了声波微流体的沟道13，通过与声波器件的键合，包括不限于氧等离子体键合。该声波微流体装置用于免疫检测使用。
实施例1
如图4所示为本实施例提供的典型的免疫检测流程，化学发光法检测白细胞介素6，具体步骤包括：
1.声波微流体器件的表面活化：应用氧等离子体进行5min清洁和疏水处理，然后，在浓度为20mM的3-氨丙基三甲基氧基硅烷中孵育10小时，最后，用甲苯和甲醇清洗。
2.应用注射泵进行器件表面的捕获抗体包被和表面封闭，捕获抗体是白细胞介素6抗体，表面封闭使用的溶液是浓度为1％的BSA的PBS溶液。
3.加入待测样本，同时开启体声波器件，实现待测样本在制定区域的富集，待反应完成，关闭体声波器件，加入清洗液(10mM的磷酸钠、15mM的氯化钠，0.1％的吐温20的水溶液)同时在声波器件上施加去除非特异性吸附的信号，实现非特异性吸附的去除，关闭解吸附功能。
5.加入生物素化的检测抗体，开启声波器件的富集功能，待反应完成，关闭体声波器件，加入清洗液进行清洗同时开启声波器件的解吸附功能，待清洗结束关闭解吸附功能。
6.加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素，开启声波器件的富集功能，待反应完成，关闭体声波器件，加入清洗液进行清洗同时开启声波器件的解吸附功能，待清洗结束关闭解吸附功能。
7.最后加入化学发光底物(鲁米诺增强溶液和双氧水)，实现检测。
进行聚集与非聚集蛋白的浓度实验，结果如图5所示，光亮的区域是聚集的荧光效果，其他区域为非聚集的荧光效果，聚集效应浓度能提高(10-100倍)，此聚集效果建立的时间为1-5min，时间与功率的选择有负相关性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种基于声波微流体的高灵敏度快速免疫检测方法，其特征在于，包括采用声波微流体对试剂中有效物质进行富集，然后利用声波进行清洗的步骤；所述清洗为应用声波微流体对非特异性吸附的分子进行解吸附。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在1G～10GHz的频率下，1mW～10W的功率下进行所述富集；和/或，在1G～10GHz的频率下1mW～10W的功率下进行所述解吸附。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，声波微流体区域的高度为1～1000μm，优选为10～50μm。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述试剂包括样本、检测抗体、抗原、标记物、荧光底物、化学发光实际、显色剂中的一种或多种。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，加入所述试剂之前还包括包被、清洗、封闭和清洗的步骤。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，采用声波微流控器件进行所述富集和所述解吸附，所述声波微流控器件包括相互键合的声波器件和微流控器件，优选的，所述声波器件为体声波器件。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述声波器件与所述微流控器件的键合处还包括界面材料。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述界面材料选自聚苯乙烯、聚氯乙烯、二氧化硅、掺杂二氧化硅中的一种或多种。
9.根据权利要求6-8任一项所述的方法，其特征在于，所述声波器件的工作频率为10M～10GHz，优选为1G～5GHz。
10.权利要求1-9任一项所述的方法在生物医学免疫检测中的应用，优选在白细胞介素、乙肝病毒、新冠病毒的检测中的应用。
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