CN110004055A - 一种基于超声阵列的一体化分析检测芯片 - Google Patents

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朱庆麟
张学记
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Abstract

本发明提供了一种基于超声阵列的一体化分析检测芯片，涉及生物传感器技术领域，将微球阵列化平台和荧光监测技术相结合，实现原位、可视化、流程化、芯片化的快速实时精准分析检测，实现对待测物的富集和收集；该芯片包括：超声控制单元，用于生成超声波；和分析检测单元，用于完成微球的捕获和修饰，以及对待测物进行富集、检测和/或收集；所述超声控制单元与所述分析检测单元连接。本发明提供的技术方案适用于生物领域分子分析与检测的过程中。

Description

一种基于超声阵列的一体化分析检测芯片
【技术领域】
本发明涉及生物传感器技术领域，尤其涉及一种基于超声阵列的一体化分析检测芯片。
【背景技术】
目前，传统分析检测主要包括待测物的分离、纯化富集和检测等多个步骤。分离的主要方法有离心、蒸馏、膜分离等，纯化富集方法主要是PCR、QPCR等。采用这些方法的检测系统需要昂贵的设备，高技能的技术人员，以及已建立的实验室和运输基础设施，极大的限制了临床检测的可操作性。
超声驱动技术因其廉价，生物相容性好，操作简单等特点在生物研究上得到了广泛的应用。有研究应用超声驱动技术进行了细胞的阵列化培养，保持了良好的细胞活性，并实现了预想的组织功能。超声驱动技术在生物应用中展现了良好的潜力。
【发明内容】
有鉴于此，本发明提供了一种基于超声阵列的一体化分析检测芯片，能够采用超声波，并将微球阵列化平台和荧光监测技术相结合，实现原位、可视化、流程化、芯片化的快速实时精准分析检测，实现对待测物的富集和收集。
一方面，本发明提供一种基于超声阵列的一体化分析检测芯片，其特征在于，包括：
超声控制单元，用于生成超声波；
和分析检测单元，用于在超声波作用下完成对微球的捕获和修饰，以及在超声波作用下对待测物进行富集、检测和/或收集；
所述分析检测单元包括用于输入液体的微流体装置和用于检测的主视框；所述微流体装置嵌设在所述主视框中。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述主视框设置在基板的中间，所述基板上围绕所述主视框设有四个冷槽；所述主视框和所述冷槽的下方分别设有载玻片。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述微流体装置包括中间体、下底和上底，所述下底位于所述中间体的下方，所述上底位于所述中间体的上方；所述微流体装置垂直向设有用于观看的方孔；所述方孔的边缘对称设有进液口和出液口。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述超声控制单元包括信号发生器、功率放大器和压电陶瓷；所述功率放大器与所述信号发生器连接，所述功率放大器用于将所述信号发生器发出的正弦波信号进行放大；所述压电陶瓷与所述功率放大器连接，所述压电陶瓷用于将放大后的正弦波信号转化为超声波；所述压电陶瓷位于所述冷槽内。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述微流体装置的材料为PMMA、PLA和PDMS三种聚合物中的任意一种。
另一方面，本发明提供一种适用于以上任一所述基于超声阵列的一体化分析检测芯片的使用方法，其特征在于，步骤包括：
S1、对微球进行捕获，具体为通过所述微流体装置将微球溶液输置入所述主视框中，开启超声控制单元使超声波频率为所述微球溶液的谐振频率，在该超声条件下使微球呈有序排列，得到阵列化微球溶液；
S2、对微球进行修饰，具体为：通过所述微流体装置将探针溶液输入到所述阵列化微球溶液中，在同S1中同样频率的超声条件下对微球进行修饰，得到修饰后微球溶液；
S3、对待测物进行富集，具体为：通过所述微流体装置将待测物溶液输入到所述修饰后微球溶液中，在同S1中同样频率的超声条件下对待测物进行富集；
S4、采集富集后待测物的信号对所述待测物进行检测。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述待测物为miRNA、单链DNA、蛋白质和外泌体中的任意一种。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述微球为硅球或聚合物球；所述微球的尺寸根据超声波波长进行调整。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述S4中采集所述待测物的信号的方式为：通过共聚焦显微镜采集所述待测物的荧光信号和/或通过拉曼显微镜采集所述待测物的拉曼信号。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，还包括步骤：S5、通过输入PBS溶液的方式排出所述待测物，并在出液口对待测物进行收集。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：将微球阵列化平台与荧光检测技术结合，可实现原位、可视化、流程化、芯片化的快速实时精准分析检测，并可以实现对待测物的富集和收集，在疾病多标志物检测、药物筛选和高通量细胞分析等领域有着广泛的应用前景。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
【附图说明】
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是本发明一个实施例提供的基于超声阵列的一体化分析检测芯片示意图；
图2是本发明一个实施例提供的微球的捕获、修饰及检测装置结构示意图；
图3是本发明一个实施例提供的基于超声阵列的一体化分析检测芯片微球捕获图片；
图4是本发明一个实施例提供的基于超声阵列的一体化分析检测芯片微球的修饰及miRNA检测过程示意图；
图5是本发明一个实施例提供的基于超声阵列的一体化分析检测芯片miRNA检测表征图片。
其中，图2中，
主视框-1；冷槽-2；压电陶瓷-3；载玻片-4；基板-5；微流体通道-6。
【具体实施方式】
为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明实施例进行详细描述。
应当明确，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
本申请的基于超声阵列的一体化分析检测芯片，将微球阵列化平台与现有的分析检测技术相结合，实现原位、可视化、流程化、芯片化的快速实时精准分析检测，还可以实现对待测物的富集和收集。在疾病多标志物检测、药物筛选和高通量细胞分析等领域有着广泛的应用前景，为快速实时精准的分析检测提供了一种高效可行的方案。
基于超声阵列的一体化分析检测芯片，包括超声控制单元和分析检测单元；其中，超声控制单元主要包括信号发生器、功率放大器和压电陶瓷；分析检测单元主要包括微流体装置、多孔微球和分析检测用探针。多孔微球以溶液形式置于所述微流体装置中。信号发生器发出正弦波信号，功率放大器将信号放大，压电陶瓷将电信号转化为超声波完成微球的捕获并在捕获的微球上进行原位的修饰、富集、检测和收集。
超声控制单元通过压电陶瓷发出超声波进行微球的捕获，分别通过微流体装置输入含有捕获探针的溶液完成对微球的修饰，输入含待测物溶液完成对待测物的富集，并结合信号输出手段(荧光、SERS等)对待测物实时监测和检测，最终停止施加超声完成对待测物的收集以进一步分析。
待测物可以是miRNA、单链DNA、蛋白质或外泌体等。
信号采集手段可以是通过共聚焦显微镜采集荧光信号，也可以是通过拉曼显微镜采集拉曼信号等。
1、超声控制单元的组装：
步骤一、将厚度为6mm的PET板裁成100×100mm的方形作为基板，在基板中心处切割出20×20mm贯穿基板的方形孔作为主视框1，在距主视框1边缘8mm处切割沿中心线对称的17mm×10mm贯穿基板的长方形孔作为冷槽2。
步骤二、将四片17mm×3mm×6mm的压电陶瓷3对称于主视框粘贴在冷槽2内，使用氰基丙烯酸乙酯胶水进行连接。
步骤三、将载玻片4裁成一片22×22mm的方形片及四片20mm×12mm的长方形片，将载玻片4和基板5进行自下而上的组装，五片载玻片分别设置在主视框和四个冷槽的下方，使用基丙烯酸乙酯胶水进行封装，确认主视框和冷槽装满水后，下方无液体漏出。
步骤四、微流体装置的制备和组装：本发明以3D打印聚乳酸模板为例，通过3DMAX设计出10mm×10mm×2mm的长方体模型，使用3D打印技术打印出设计好的聚乳酸模型，平整地放置在直径为30mm的培养皿中。调配PDMS(PDMS：固化剂为10:1的PDMS溶液)，真空抽出气泡后，均匀地浇在放有模具的培养皿中使其厚度为3mm作为上底，并另行浇筑厚度为3mm中间无模具的平整的PDMS作为微流体装置的下底，在60℃下固化4-5小时至完全固化，取出后将上底脱模。在上底上方凹陷式的开一个10×10的方形孔，该方形孔贯穿设置，用于观看载玻片上的各步骤时的反应现象以及微球的阵列变化等。在方形孔边缘沿中心点对称打出直径为0.5mm的圆孔并在圆孔中塞入直径为0.5mm的乳胶软管作为进液口和出液口，进液口和出液口均与载波片上的空间相通，分析检测过程中所需的溶液通过进液口进入到载玻片上，进行待测物收集时待测物通过出液口流出本申请的芯片，在出口处进行收集。调配PDMS：环己烷：固化剂为10:10:1的溶液，取少量溶液滴在表面光滑的塑料板上使用旋涂机进行旋涂直至成为液膜，用下底蘸取少量液膜后压在上底镂空一侧，在60℃中固化2小时至上下底完全粘连不脱落，将基板和微流体装置自下而上地组装，微流体装置应完全嵌入基板的主视框中，在微流体装置和基板主视框处应完全嵌合，使二者之间无空隙，微流体装置空腔应处于压电陶瓷工作范围，得到微球的捕获、修饰及检测装置，如图2所示。
微流体装置的材料可以为PMMA、PLA、PDMS等聚合物中的任意一种。
2、待测物miRNA-141的检测方法，包括：
步骤一、将信号发生器、功率放大器和微球的捕获、修饰及检测装置依次连接。
步骤二、微球的捕获：将1mL浓度为0.1mg/mL的微球溶液M置入基板的主视框中，调节信号发生器的输出频率为压电陶瓷的谐振频率并通过功率放大器放大后输入压电陶瓷片使其震动发出超声波，且压电陶瓷片输出的超声波频率为微球溶液的谐振频率；在此超声条件下，微球在经过微流体空腔后呈有序排列，得到阵列化微球溶液，完成微球捕获，如图3所示。
微球可以是硅球、聚合物球以及其它可替代的微球，其尺寸并无固定值，可根据超声波波长进行调整，超声波的半波长应大于或等于微球直径，其频率应随微球直径的降低而增加。
步骤三、微球修饰：在步骤二所得的阵列化微球溶液中，通过微流体装置输入含有捕获探针的溶液，完成对微球的修饰。具体为：
1)将capture DNA加入PBS缓冲液，充分摇匀，得到浓度为100μmol/mL的溶液A，即含有捕获探针的溶液。探针可以通过抗体-抗原反应、化学键修饰、亲疏水修饰等方式进行。
2)取2μL溶液A通过微流体装置输入至阵列化微球溶液中，在超声条件(该超声条件与步骤二中超声条件相同)下反应15分钟后得到溶液H，完成对微球的修饰，如图4所示。
步骤四、待测物miRNA-141的富集和检测：在步骤三所得的阵列化修饰了捕获探针的微球溶液中输入待测物，持续的超声波条件下完成待测物的富集，使用信号采集手段等对待测物进行分析检测。具体为：
1)将目标miRNA-141加入PBS缓冲液，充分摇匀，得到浓度为20μmol/mL的溶液B，即待测物溶液。
2)将修饰荧光基团的探针DNA溶液H加入PBS缓冲液，充分摇匀，得到浓度为100μmol/mL的溶液C。
3)取10μL所述溶液B，取2μL所述溶液C，在同一容器内进行摇匀混合，得到混合液K。
4)将12μL所述混合液K加入阵列化修饰了捕获探针的微球溶液中，即溶液H中，在超声条件(该超声条件与步骤二中超声条件相同)下反应30分钟后得到溶液L完成miRNA-141的富集，如图4所示。
5)在荧光显微镜下观察溶液L，采集荧光信号，完成待测物miRNA的检测，如图5所示。
步骤四、miRNA-141的收集：停止正弦信号的输入即停止超声波的输出，从进液口输入PBS溶液在微流体通道中进行冲洗并在出液口进行包含了miRNA-141的PBS溶液的输出，完成miRNA-141的收集。
修饰了生物素的capture DNA序列为：5’-biotin-TAA CTT AAC CAT CTT TAC-cy3-3’；
目标miRNA-141序列为：5’-UAA CAC UGU CUG GUA AAG AUG G-3’；
修饰荧光基团的探针DNA序列为：5’-CAG ACA GTG TTA GAT CTA TTG-FAM-3’。
以上对本申请实施例所提供的一种基于超声阵列的一体化分析检测芯片，进行了详细介绍。以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。
如在说明书及权利要求书当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可理解，硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求书并不以名称的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求书当中所提及的“包含”、“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含/包括但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求书所界定者为准。
还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。
应当理解，本文中使用的术语“和/或”仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求书的保护范围内。

Claims (10)

1.一种基于超声阵列的一体化分析检测芯片，其特征在于，包括：
超声控制单元，用于生成超声波；
和分析检测单元，用于在超声波作用下完成对微球的捕获和修饰，以及在超声波作用下对待测物进行富集、检测和/或收集；
所述分析检测单元包括用于输入液体的微流体装置和用于检测的主视框；所述微流体装置嵌设在所述主视框中。
2.根据权利要求1所述的基于超声阵列的一体化分析检测芯片，其特征在于，所述主视框设置在基板的中间，所述基板上围绕所述主视框设有四个冷槽；所述主视框和所述冷槽的下方分别设有载玻片。
3.根据权利要求2所述的基于超声阵列的一体化分析检测芯片，其特征在于，所述微流体装置包括中间体、下底和上底，所述下底位于所述中间体的下方，所述上底位于所述中间体的上方；所述微流体装置垂直向设有用于观看的方孔；所述方孔的边缘对称设有进液口和出液口。
4.根据权利要求2所述的基于超声阵列的一体化分析检测芯片，其特征在于，所述超声控制单元包括信号发生器、功率放大器和压电陶瓷；所述功率放大器与所述信号发生器连接，所述功率放大器用于将所述信号发生器发出的正弦波信号进行放大；所述压电陶瓷与所述功率放大器连接，所述压电陶瓷用于将放大后的正弦波信号转化为超声波；所述压电陶瓷位于所述冷槽内。
5.根据权利要求1-4任一所述的基于超声阵列的一体化分析检测芯片，其特征在于，所述微流体装置的材料为PMMA、PLA和PDMS三种聚合物中的任意一种。
6.一种适用于权利要求1-5任一所述基于超声阵列的一体化分析检测芯片的使用方法，其特征在于，步骤包括：
S1、对微球进行捕获，具体为通过所述微流体装置将微球溶液输置入所述主视框中，开启超声控制单元使超声波频率为所述微球溶液的谐振频率，在该超声条件下使微球呈有序排列，得到阵列化微球溶液；
S2、对微球进行修饰，具体为：通过所述微流体装置将探针溶液输入到所述阵列化微球溶液中，在同S1中同样频率的超声条件下对微球进行修饰，得到修饰后微球溶液；
S3、对待测物进行富集，具体为：通过所述微流体装置将待测物溶液输入到所述修饰后微球溶液中，在同S1中同样频率的超声条件下对待测物进行富集；
S4、采集富集后待测物的信号对所述待测物进行检测。
7.根据权利要求6所述的基于超声阵列的一体化分析检测芯片的使用方法，其特征在于，所述待测物为miRNA、单链DNA、蛋白质和外泌体中的任意一种。
8.根据权利要求6所述的基于超声阵列的一体化分析检测芯片的使用方法，其特征在于，所述微球为硅球或聚合物球；所述微球的尺寸根据超声波波长进行调整。
9.根据权利要求6所述的基于超声阵列的一体化分析检测芯片的使用方法，其特征在于，所述S4中采集所述待测物的信号的方式为：通过共聚焦显微镜采集所述待测物的荧光信号和/或通过拉曼显微镜采集所述待测物的拉曼信号。
10.根据权利要求6所述的基于超声阵列的一体化分析检测芯片的使用方法，其特征在于，还包括步骤：S5、通过输入PBS溶液的方式排出所述待测物，并在出液口对待测物进行收集。
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