CN111855844B - 磷脂酰丝氨酸的分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分析化学及检测技术领域，具体涉及一种基于液相色谱‑质谱联用的磷脂酰丝氨酸的检测分析方法。本发明所提供的磷脂酰丝氨酸的分析方法，采用高效液相色谱‑质谱联用法进行检测，检测参数如下：色谱条件：色谱柱为C18色谱柱；流动相A为含有55‑65％乙腈、8‑12mmol/L甲酸铵、0.05‑0.15％甲酸、4‑6μmol/L亚甲基二磷酸的水溶液；流动相B为含有5‑15％乙腈、8‑12mmol/L甲酸铵、0.05‑0.15％甲酸、4‑6μmol/L亚甲基二磷酸的异丙醇溶液；柱温为40‑50℃；梯度洗脱；质谱条件：ESI源正离子模式和动态多反应监测。本发明所提供的分析方法灵敏度高，重复性和特异性好，简单快速，稳健可靠。

Description

磷脂酰丝氨酸的分析方法
技术领域
本发明涉及分析化学及检测技术领域，具体涉及一种基于液相色谱-质谱联用的磷脂酰丝氨酸的检测分析方法。
背景技术
肝脏是人或动物的重要器官，是脂质代谢的主要场所，磷脂酰丝氨酸是磷脂质中的一种，也是细胞膜的成分之一，虽然所占肝脏中的总脂质的比例不高，但有着重要的生理功能。在对其进行反相柱子液相色谱-质谱联用方法(RPLC-MS)分析时，由于磷脂酰丝氨酸的极性头部是丝氨酸，具有弱酸性，在传统甲酸铵-甲酸体系中很难充分分子化，与反向柱的硅醇基作用较强，容易形成很宽的峰，导致其定性定量分析很容易受到影响。
因此，开发一种可靠的磷脂酰丝氨酸的检测分析方法具有重要意义。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种基于液相色谱-质谱联用的磷脂酰丝氨酸的分析方法。该方法灵敏度高、重复性好、特异性强，简单快速。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供了一种磷脂酰丝氨酸的分析方法，采用高效液相色谱-质谱联用法进行检测，检测参数如下：
色谱条件：
色谱柱为C18色谱柱；流动相A为含有55-65％乙腈、8-12mmol/L甲酸铵、0.05-0.15％甲酸、4-6μmol/L亚甲基二磷酸的水溶液；流动相B为含有5-15％乙腈、8-12mmol/L甲酸铵、0.05-0.15％甲酸、4-6μmol/L亚甲基二磷酸的异丙醇溶液；柱温为40-50℃；梯度洗脱；
质谱条件：ESI源正离子模式和动态多反应监测。
在本发明的一种实施方式中，梯度洗脱程序为：0～1.5min，保持B％为30％；1.5～3min，B％从30％升至45％；3～10min，B％从45％线性升至85％；10～10.5min，B％从85％线性升至95％，并保持2min；之后0.2min内，B％回到30％。
在本发明的一种实施方式中，流动相A为含有60％乙腈、10mmol/L甲酸铵、0.1％甲酸、5μmol/L亚甲基二磷酸的水溶液；流动相B为含有10％乙腈、10mmol/L甲酸铵、0.1％甲酸、5μmol/L亚甲基二磷酸的异丙醇溶液。
在本发明的一种实施方式中，质谱条件为：电喷雾离子源(electrosprayionization，ESI)温度＝550℃，质谱电压＝5500V，离子源GS1＝50psi，GS2＝50psi，帘气(curtaingas,CUR)＝35psi，碰撞诱导电离(collision-activated dissociation，CAD)参数设置为Medium。
在本发明的一种实施方式中，质谱中离子对信息为：
Figure BDA0002567422620000021
Figure BDA0002567422620000031
在本发明的一种实施方式中，还包括样品预处理步骤，样品预处理步骤如下：将研磨均匀的样品加入水溶解，然后再加入脂质提取液，震荡，静置，离心，取上清，冷冻干燥后用体积比为1：1的异丙醇和甲醇溶液复溶，离心后取上清，即得待检测液。
在本发明的一种实施方式中，所述脂质提取液为甲基叔丁基醚：甲醇＝10:3(V:V)。
在本发明的一种实施方式中，样品预处理步骤如下：将样品解冻后吸去表面水分，再用手术刀切碎，离心使样本至管底，加入钢珠研磨，每次研磨后都在4℃条件下离心使样品至管底。
本发明具有以下有益技术效果：
(1)流动相中添加了一定量的亚甲基二磷酸，使得磷脂酰丝氨酸类脂质的峰型显著变窄，提高了信噪比，检测灵敏度高；
(2)采用研磨、提取液提取、异丙醇：甲醇＝1:1复溶的方式进行前处理，操作简单快速，溶剂毒性小；
(3)本发明所提供的分析方法灵敏度高，重复性和特异性好，简单快速，稳健可靠。
附图说明
图1为实施例1中正离子模式XIC图；
图2为对比例1中正离子模式XIC图；
图3为实施例1中PS(34:0)离子对在样品和标品中的XIC对比图；
图4为实施例1中PS(34:1)离子对在样品和标品中的XIC对比图。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
一种磷脂酰丝氨酸的分析方法，其不同之处在于，采用高效液相色谱-质谱联用法进行检测，检测参数如下：
色谱条件：
色谱柱为C18色谱柱；流动相A为含有55-65％乙腈(以体积计)、8-12mmol/L甲酸铵、0.05-0.15％甲酸(以体积计)、4-6μmol/L亚甲基二磷酸的水溶液；流动相B为含有5-15％乙腈(以体积计)、8-12mmol/L甲酸铵、0.05-0.15％甲酸(以体积计)、4-6μmol/L亚甲基二磷酸的异丙醇溶液；柱温为40-50℃；梯度洗脱；
质谱条件：ESI源正离子模式和动态多反应监测。
进一步，梯度洗脱程序为：0～1.5min，保持B％为30％；1.5～3min，B％从30％升至45％；3～10min，B％从45％线性升至85％；10～10.5min，B％从85％线性升至95％，并保持2min；之后0.2min内，B％回到30％。
进一步，流动相A为含有60％乙腈、10mmol/L甲酸铵、0.1％甲酸、5μmol/L亚甲基二磷酸的水溶液；流动相B为含有10％乙腈、10mmol/L甲酸铵、0.1％甲酸、5μmol/L亚甲基二磷酸的异丙醇溶液。
进一步，质谱条件为：电喷雾离子源温度550℃，质谱电压5500V，离子源GS150psi，GS250psi，帘气35psi，碰撞诱导电离为Medium。
进一步，质谱中离子对信息为：
化合物class 母离子Q1(Da) 子离子Q3(Da) 去簇电压DP 碎裂能量CE
PS(32:0) 736.5 551.5 30 35
PS(34:0) 764.5 579.5 30 35
PS(36:0) 792.6 607.6 30 35
PS(32:1) 734.5 549.5 30 35
PS(34:1) 762.5 577.5 30 35
PS(36:1) 790.6 605.6 30 35
PS(38:1) 818.6 633.6 30 35
PS(40:1) 846.6 661.6 30 35
PS(42:1) 874.6 689.6 30 35
PS(34:2) 760.5 575.5 30 35
PS(36:2) 788.5 603.5 30 35
PS(38:2) 816.6 631.6 30 35
PS(40:2) 844.6 659.6 30 35
PS(42:2) 872.6 687.6 30 35
PS(44:2) 900.7 715.7 30 35
PS(36:3) 786.5 601.5 30 35
PS(38:3) 814.6 629.6 30 35
PS(40:3) 842.6 657.6 30 35
PS(42:3) 870.6 685.6 30 35
PS(44:3) 898.6 713.6 30 35
PS(36:4) 784.5 599.5 30 35
PS(38:4) 812.5 627.5 30 35
PS(40:4) 840.6 655.6 30 35
PS(42:4) 868.6 683.6 30 35
PS(44:4) 896.6 711.6 30 35
PS(38:5) 810.5 625.5 30 35
PS(40:5) 838.6 653.6 30 35
PS(42:5) 866.6 681.6 30 35
PS(44:5) 894.6 709.6 30 35
PS(38:6) 808.5 623.5 30 35
PS(40:6) 836.5 651.5 30 35
PS(42:6) 864.6 679.6 30 35
PS(44:6) 892.6 707.6 30 35
PS(40:7) 834.5 649.5 30 35
进一步，还包括样品预处理步骤，样品预处理步骤如下：将研磨均匀的样品加入水溶解，然后再加入脂质提取液，震荡，静置，离心，取上清，冷冻干燥后用体积比为1：1的异丙醇和甲醇溶液复溶，离心后取上清，即得待检测液。
进一步，所述脂质提取液中甲基叔丁基醚：甲醇的体积比为10:(2-4)，优选地为10：3。
进一步，样品预处理步骤如下：将样品解冻后吸去表面水分，再用手术刀切碎，离心使样本至管底，加入钢珠研磨，每次研磨后都在4℃条件下离心使样品至管底。
实施例1
一种生物体肝脏中磷脂酰丝氨酸的分析方法，包括以下步骤：
S1，样品预处理：
第一步：将低温保存的小鼠肝脏样本解冻后，放于滤纸上吸去组织表面水份，再用手术刀切碎并称量20±1mg加入到对应编号的2mL圆底离心管中，先5000rpm、4℃条件下离心1min使样本离心到管底，再放入1颗钢珠(内径约4mm)；
第二步：用球磨仪研磨(工作频率30Hz，时间30s)，一共研磨3次，每次研磨后都在4℃条件下，5000rpm离心1min将样本离心到管底，再进行下一次研磨；
第三步：研磨均匀后加入50μL水，涡旋仪2500rpm转速下室温振荡3min，再加入1mL脂质提取液(甲基叔丁基醚：甲醇＝10:3，体积比)，涡旋仪振荡30min；
第四步：加入200μL水，振荡1min，4℃冰箱静置10min；
第五步：4℃条件下12000rpm转速离心3min；吸取500μL上层清液到对应编号的1.5mL离心管中，冷冻干燥；
第六步：干燥好的样品用100μL复溶液(异丙醇：甲醇＝1:1)进行复溶，涡旋3min，4℃条件下12000rpm离心3min，取上清液装于进样小瓶(附有250μL内衬管)。
S2，高效液相色谱-质谱联用方法检测：
仪器：ExionL CADUPLC–Triple QuadTM 6500+(SCIEX,USA)。
检测参数如下：
高效液相色谱条件：色谱柱：UPLC ACQUITYTM BEH C18column(2.1mm×100mm×1.7μm,Waters,Milford,USA)；流动相A：乙腈和水按照60：40的体积比的混合液，且含有10mmol/L甲酸铵、0.1％甲酸、5μmol/L亚甲基二磷酸；流动相B：异丙醇和乙腈按照90：10的体积比的混合液，且含有10mmol/L甲酸铵、0.1％甲酸、5μmol/L亚甲基二磷酸；流速为0.5mL/min；柱温45℃；进样体积2μL，梯度洗脱程序如下表：
时间 流动相A 流动相B
0～1.5min 70％ 30％
1.5～3min 55％ 45％
3～10min 15％ 85％
10～10.5min 5％ 95％
10.5～10.7min 70％ 30％
质谱条件：ESI源正离子模式下，采用动态多反应监测(Scheduled MRM,sMRM)
电喷雾离子源(electrospray ionization，ESI)温度＝550℃，质谱电压＝5500V，离子源GS1＝50psi,GS2＝50ps，帘气(curtain gas,CUR)＝35psi，碰撞诱导电离(collision-activated dissociation，CAD)参数设置为Medium。
MRM模式下各离子对的去簇电压(declustering potential，DP)参数为30，碎裂能量(collision energy，CE)参数为35。
离子对信息为：
Figure BDA0002567422620000071
Figure BDA0002567422620000081
得到的所有离子对的MRM提取图即为肝脏中磷脂酰丝氨酸脂质种类。利用Analyst1.6对检测结果进行分析，34个内源性磷脂酰丝氨酸离子对应的多峰图(XIC图)如图1所示，PS(34:0)离子对在样品和标品中的XIC对比图如图3所示；PS(34:1)离子对在样品和标品中的XIC对比图如图4所示。
实施例2
一种生物体肝脏中磷脂酰丝氨酸的分析方法，包括以下步骤：
S1，样品预处理：按实施例1中所描述的方法，准确称取18份小鼠肝脏样品20±1mg，分3天进行提取实验。每天处理6个样品。
S2，高效液相色谱-质谱联用方法检测：
仪器：ExionL CAD UPLC–Triple QuadTM 6500+(SCIEX,USA)。
检测参数如下：
高效液相色谱条件：色谱柱：UPLC ACQUITYTM BEH C18 column(2.1mm×100mm×1.7μm,Waters,Milford,USA)；流动相A：乙腈和水按照60：40的体积比的混合液，且含有10mmol/L甲酸铵、0.1％甲酸、5μmol/L亚甲基二磷酸；流动相B：异丙醇和乙腈按照90：10的体积比的混合液，且含有10mmol/L甲酸铵、0.1％甲酸、5μmol/L亚甲基二磷酸；流速为0.5mL/min；柱温45℃；进样体积2μL，梯度洗脱程序如下表：
时间 流动相A 流动相B
0～1.5min 70％ 30％
1.5～3min 55％ 45％
3～10min 15％ 85％
10～10.5min 5％ 95％
10.5～10.7min 70％ 30％
质谱条件：ESI源正离子模式下，采用动态多反应监测(Scheduled MRM,sMRM)。电喷雾离子源(electrospray ionization，ESI)温度＝550℃，质谱电压＝5500V，离子源GS1＝50psi,GS2＝50psi,帘气(curtain gas,CUR)＝35psi，碰撞诱导电离(collision-activated dissociation，CAD)参数设置为Medium。MRM模式下各离子对的去簇电压(declustering potential，DP)参数为30，碎裂能量(collision energy，CE)参数为35。
离子对信息为：离子对信息如实施例1中表格所示。
质谱MRM数据用MultiQuant 3.0软件进行分析，证明该方法具有很好的重复性，日内精密度90％以上的物质RSD<10％，日间精密度80％以上的物质RSD<10％。各物质的精密度结果如下表。
Figure BDA0002567422620000091
Figure BDA0002567422620000101
对比例1
一种生物体肝脏中磷脂酰丝氨酸的分析方法，包括以下步骤：
S1，样品预处理：
第一步：将低温保存的小鼠肝脏样本解冻后，放于滤纸上吸去组织表面水份，再用手术刀切碎并称量20±1mg加入到对应编号的2mL圆底离心管中，先5000rpm、4℃条件下离心1min使样本离心到管底，再放入1颗钢珠(内径约4mm)；
第二步：用球磨仪研磨(工作频率30Hz，时间30s)，一共研磨3次，每次研磨后都在4℃条件下，5000rpm离心1min将样本离心到管底，再进行下一次研磨；
第三步：研磨均匀后加入50μL水，涡旋仪2500rpm转速下室温振荡3min，再加入1mL脂质提取液(甲基叔丁基醚：甲醇＝10:3，体积比)，涡旋仪振荡30min；
第四步：加入200μL水，振荡1min，4℃冰箱静置10min；
第五步：4℃条件下12000rpm转速离心3min；吸取500μL上层清液到对应编号的1.5mL离心管中，冷冻干燥；
第六步：干燥好的样品用100μL复溶液(异丙醇：甲醇＝1:1)进行复溶，涡旋3min，4℃条件下12000rpm离心3min，取上清液装于进样小瓶(附有250μL内衬管)。
S2，高效液相色谱-质谱联用方法检测：
仪器：ExionL CAD UPLC–Triple QuadTM 6500+(SCIEX,USA)。
检测参数如下：
高效液相色谱条件：色谱柱：UPLC ACQUITYTM BEH C18 column(2.1mm×100mm×1.7μm,Waters,Milford,USA)；流动相A：乙腈和水按照60：40的体积比的混合液，且含有10mmol/L甲酸铵、0.1％甲酸；流动相B：异丙醇和乙腈按照90：10的体积比的混合液，且含有10mmol/L甲酸铵、0.1％甲酸；流速为0.5mL/min；柱温45℃；进样体积2μL，梯度洗脱程序如下表：
Figure BDA0002567422620000111
Figure BDA0002567422620000121
质谱条件：ESI源正离子模式下，采用动态多反应监测(Scheduled MRM,sMRM)，电喷雾离子源(electrospray ionization，ESI)温度＝550℃，质谱电压＝5500V，离子源GS1＝50psi，GS2＝50psi，帘气(curtain gas,CUR)＝35psi，碰撞诱导电离(collision-activated dissociation，CAD)参数设置为Medium。MRM模式下各离子对的去簇电压(declustering potential，DP)参数为30，碎裂能量(collision energy，CE)参数为35。
离子对信息为：
化合物class 母离子Q1(Da) 子离子Q3(Da) 去簇电压DP 碎裂能量CE
PS(32:0) 736.5 551.5 30 35
PS(34:0) 764.5 579.5 30 35
PS(36:0) 792.6 607.6 30 35
PS(32:1) 734.5 549.5 30 35
PS(34:1) 762.5 577.5 30 35
PS(36:1) 790.6 605.6 30 35
PS(38:1) 818.6 633.6 30 35
PS(40:1) 846.6 661.6 30 35
PS(42:1) 874.6 689.6 30 35
PS(34:2) 760.5 575.5 30 35
PS(36:2) 788.5 603.5 30 35
PS(38:2) 816.6 631.6 30 35
PS(40:2) 844.6 659.6 30 35
PS(42:2) 872.6 687.6 30 35
PS(44:2) 900.7 715.7 30 35
PS(36:3) 786.5 601.5 30 35
PS(38:3) 814.6 629.6 30 35
PS(40:3) 842.6 657.6 30 35
PS(42:3) 870.6 685.6 30 35
PS(44:3) 898.6 713.6 30 35
PS(36:4) 784.5 599.5 30 35
PS(38:4) 812.5 627.5 30 35
PS(40:4) 840.6 655.6 30 35
PS(42:4) 868.6 683.6 30 35
PS(44:4) 896.6 711.6 30 35
PS(38:5) 810.5 625.5 30 35
PS(40:5) 838.6 653.6 30 35
PS(42:5) 866.6 681.6 30 35
PS(44:5) 894.6 709.6 30 35
PS(38:6) 808.5 623.5 30 35
PS(40:6) 836.5 651.5 30 35
PS(42:6) 864.6 679.6 30 35
PS(44:6) 892.6 707.6 30 35
PS(40:7) 834.5 649.5 30 35
得到的所有离子对的MRM提取图即为肝脏中磷脂酰丝氨酸脂质种类。利用Analyst1.6对检测结果进行分析，34个内源性磷脂酰丝氨酸离子对应的多峰图(XIC图)如图2所示。
通过实施例1中离子对的多峰图和对比例1中离子对的多峰图比较可知，流动相中添加亚甲基二磷酸可以显著提高检测结果的可靠性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.磷脂酰丝氨酸的分析方法，其特征在于，采用高效液相色谱-质谱联用法进行检测，检测参数如下：
色谱条件：
色谱柱为C18色谱柱；流动相A为含有55-65％乙腈、8-12mmol/L甲酸铵、0.05-0.15％甲酸、4-6μmol/L亚甲基二磷酸的水溶液；流动相B为含有5-15％乙腈、8-12mmol/L甲酸铵、0.05-0.15％甲酸、4-6μmol/L亚甲基二磷酸的异丙醇溶液；柱温为40-50℃；梯度洗脱；
质谱条件：ESI源正离子模式和动态多反应监测。
2.根据权利要求1所述的磷脂酰丝氨酸的分析方法，其特征在于，梯度洗脱程序为：0～1.5min，保持B％为30％；1.5～3min，B％从30％升至45％；3～10min，B％从45％线性升至85％；10～10.5min，B％从85％线性升至95％，并保持2min；之后0.2min内，B％回到30％。
3.根据权利要求1或2所述的磷脂酰丝氨酸的分析方法，其特征在于，流动相A为含有60％乙腈、10mmol/L甲酸铵、0.1％甲酸、5μmol/L亚甲基二磷酸的水溶液；流动相B为含有10％乙腈、10mmol/L甲酸铵、0.1％甲酸、5μmol/L亚甲基二磷酸的异丙醇溶液。
4.根据权利要求1所述的磷脂酰丝氨酸的分析方法，其特征在于，质谱条件为：电喷雾离子源温度550℃，质谱电压5500V，离子源GS1 50psi，GS2 50psi，帘气35psi，碰撞诱导电离为Medium。
5.根据权利要求1所述的磷脂酰丝氨酸的分析方法，其特征在于，质谱中离子对信息为：
Figure FDA0002567422610000011
Figure FDA0002567422610000021
6.根据权利要求1所述的磷脂酰丝氨酸的分析方法，其特征在于，还包括样品预处理步骤，样品预处理步骤如下：将研磨均匀的样品加入水溶解，然后再加入脂质提取液，震荡，静置，离心，取上清，冷冻干燥后用体积比为1：1的异丙醇和甲醇溶液复溶，离心后取上清，即得待检测液。
7.根据权利要求6所述的磷脂酰丝氨酸的分析方法，其特征在于，所述脂质提取液中甲基叔丁基醚：甲醇的体积比为10:(2-4)。
8.根据权利要求6-7任一项所述的磷脂酰丝氨酸的分析方法，其特征在于，样品预处理步骤如下：将样品解冻后吸去表面水分，再用手术刀切碎，离心使样本至管底，加入钢珠研磨，每次研磨后都在4℃条件下离心使样品至管底。
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