CN111850070A - 一种用磷酸钠和过氧化氢预处理甘蔗渣的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，公开了一种用磷酸钠和过氧化氢预处理甘蔗渣的方法，包括如下步骤：将甘蔗渣风干后进行粉碎，筛选密封干燥保存；将处理好的甘蔗渣放入磷酸钠和过氧化氢混合溶液中进行一步或分步预处理；待反应结束后，冷却至室温，进行固液分离，固体部分用热水洗至中性，收集固体残渣，烘干至恒重；过氧化氢与磷酸钠组成的预处理液，能够显著提高酶解效率和木质素去除率，且混合预处理液中过氧化氢的负载量更低，加入过氧化氢不会明显降低体系的pH，能更好的改变甘蔗渣的表面形态。

Description

一种用磷酸钠和过氧化氢预处理甘蔗渣的方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，更具体地，涉及一种用磷酸钠和过氧化氢预处理甘蔗渣的方法。
背景技术
由于石油持续性供应的不确定性增加，化石燃料对环境的不利影响，特别是温室气体的排放，导致了对可再生燃料替代品的广泛探索。当前最常见的可再生燃料是乙醇，它可以由木质纤维素通过预处理，随后的酶促水解和发酵产生。木质纤维素农业残留物是一种绿色、廉价、丰富且富含碳水化合物的可持续原料，甘蔗渣是我国最常见的农业副产品，在天然甘蔗渣中，纤维素被木质素和半纤维素保护和包裹，木质素也可以与碳水化合物共价连接，并且甘蔗渣的顽强结构使其难以进行酶水解。一些研究表明，木质素和半纤维素是影响酶消化率的主要因素。而预处理可以破坏木质素和半纤维素的结构，增加纤维素酶的可及性。
中国专利“一种甘蔗渣的预处理方法”(申请号：201310131157.3，公开日：2013-07-17)公开了一种甘蔗渣的预处理方法，该方法将甘蔗渣干燥，粉碎，筛分后，用氢氧化钠和双氧水对甘蔗渣进行预处理，即得到预处理后甘蔗渣，经该方法预处理后的甘蔗渣材料半纤维素和木质素的最大脱除率分别达到78.18％和94.56％，纤维素最高酶水解率为64.37％，相比未处理蔗渣原材料的酶解效率提高了60.67％。由此可见，该方法打破了半纤维素和木质素对纤维素的包裹，提高了纤维素水解率，改善了蔗渣的抗酶解特性，所得到的蔗渣材料被酶解后可用于微生物发酵转化乙醇等高附加值产品，实现蔗渣等生物质资源的有效利用。
但上述发明预处理采用了强碱，容易腐蚀机器；且上述预处理时间长。
发明内容
本发明旨在克服上述现有技术的至少一种缺陷(不足)，提供一种用磷酸钠和过氧化氢预处理甘蔗渣的方法，预处理时间短、预处理液不具有腐蚀性、能有效提高木质素去除率和酶解效率。
本发明采取的技术方案是，一种用磷酸钠和过氧化氢预处理甘蔗渣的方法，包括如下步骤：
A.将甘蔗渣风干后进行粉碎，筛选密封干燥保存；
B.将步骤A处理好的甘蔗渣放入预处理溶液中进行一步或分步预处理；
C.待反应结束后，冷却至室温，进行固液分离，固体部分用热水洗至中性，收集固体残渣，烘干至恒重；
所述步骤B中预处理溶液包括磷酸钠溶液及过氧化氢溶液。
进一步地，所述步骤B具体为：将步骤A中处理好的甘蔗渣放入磷酸钠溶液与过氧化氢溶液的混合溶液中，混合均匀后升温至60～140℃预处理20～100min。
进一步地，所述步骤B具体为：将步骤A中处理好的甘蔗渣放入磷酸钠溶液中升温至60～140℃预处理20～100min，结束后将样品冷却至室温，过滤收集甘蔗渣，用去离子水洗涤，烘干；再放入过氧化氢溶液中，在60～100℃水浴条件下进一步预处理20～100min，结束后将样品冷却、过滤、洗涤后烘干。
进一步地，所述步骤B具体为：将步骤A中处理好的甘蔗渣放入过氧化氢溶液中，在60～100℃水浴条件下进一步预处理20～100min，预处理结束后将样品冷却至室温，过滤收集甘蔗渣，用去离子水洗涤，烘干；再放入磷酸钠溶液中升温至60～140℃预处理20～100min，结束后将样品冷却、过滤、洗涤后烘干。
进一步地，所述步骤A甘蔗渣粉碎后筛选50～200目的颗粒；所述步骤B中甘蔗渣与预处理溶液的固液比为1：10；所述步骤C中固体残渣置于60-80℃的烘箱烘干至恒重。
进一步地，所述磷酸钠溶液的浓度为2～10％，所述过氧化氢溶液的浓度为0.5～2.5％。
过氧化氢作为一种弱酸，过高浓度的过氧化氢会使pH值下降，对于在碱性条件下能更好发挥作用的预处理过氧化氢分子明显不利。
进一步地，所述磷酸钠溶液的浓度为8％，所述过氧化氢溶液的浓度为2％。
在Na3PO4预处理中引入过氧化氢，在碱性条件下，过氧化氢能被分解生成氢过氧阴离子(HOO-)，氢过氧阴离子通过与木质素的醌结构以及木质素中侧链的双键或羰基发生反应，增加了其溶解度，从而增加了木质素的去除率。H2O2在高温下分解会产生羟基和氧气，羟基自由基会氧化并降解木质素，而氧气会导致生物质纤维膨胀并增加孔隙度，增加酶与底物的接触面积，从而提高了酶解效率。
将H2O2添加到Na3PO4预处理中，还会导致木质素和半纤维素解散，酯键的去除，木质素片段的重排和修饰，从而增强木质素的去除，并增强了残留木质素的亲水性，从而提高其酶解效率。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：过氧化氢与磷酸钠组成的预处理液，能够显著提高酶解效率和木质素去除率，且混合预处理液中过氧化氢的负载量更低，加入过氧化氢不会明显降低体系的pH，能更好的改变甘蔗渣的表面形态。
附图说明
图1为本发明对比例1、实施例1、实施例4和实施例5的SEM对比图。
图2为本发明对比例1、实施例1、实施例4和实施例5的XRD对比图。
图3为本发明对比例1、实施例1、实施例4和实施例5的FTIR对比图。
具体实施方式
本发明附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。为了更好说明以下实施例，附图某些部件会有省略、放大或缩小，并不代表实际产品的尺寸；对于本领域技术人员来说，附图中某些公知结构及其说明可能省略是可以理解的。
实施例1
一种用磷酸钠和过氧化氢预处理甘蔗渣的方法，包括如下步骤：
1)将甘蔗渣风干后进行粉碎，筛选100～200目的颗粒密封干燥保存；
2)称取5g甘蔗渣放入250ml的锥形瓶中，加入50ml的含有8％的磷酸钠和2％的过氧化氢混合溶液，充分混匀后，于121℃预处理60min。
3)待反应结束后，立即冷却至室温，然后用布氏漏斗进行固液分离，固体部分用热水洗至中性，收集固体残渣，置于75℃的烘箱烘干至恒重。
实施例2
一种用磷酸钠和过氧化氢预处理甘蔗渣的方法，包括如下步骤：
1)将甘蔗渣风干后进行粉碎，筛选100～200目的颗粒密封干燥保存；
2)称取5g甘蔗渣放入250ml的锥形瓶中，加入50ml的含有2％的磷酸钠和2.5％的过氧化氢混合溶液，充分混匀后，于60℃预处理20min。
3)待反应结束后，立即冷却至室温，然后用布氏漏斗进行固液分离，固体部分用热水洗至中性，收集固体残渣，置于60℃的烘箱烘干至恒重。
实施例3
一种用磷酸钠和过氧化氢预处理甘蔗渣的方法，包括如下步骤：
1)将甘蔗渣风干后进行粉碎，筛选100～200目的颗粒密封干燥保存；
2)称取5g甘蔗渣放入250ml的锥形瓶中，加入50ml的含有10％的磷酸钠和0.5％的过氧化氢混合溶液，充分混匀后，于140℃预处理100min。
3)待反应结束后，立即冷却至室温，然后用布氏漏斗进行固液分离，固体部分用热水洗至中性，收集固体残渣，置于80℃的烘箱烘干至恒重。
实施例4
一种用磷酸钠和过氧化氢预处理甘蔗渣的方法，包括如下步骤：
1)将甘蔗渣风干后进行粉碎，筛选100～200目的颗粒密封干燥保存；
2)称取5g甘蔗渣放入250ml的锥形瓶中，加入50ml的8％的磷酸钠溶液，升温至121℃预处理60min，结束后将样品冷却至室温，过滤收集甘蔗渣，用去离子水洗涤，烘干；
3)再放入50ml的2％的过氧化氢溶液在80℃水浴进一步预处理甘蔗渣60min，结束后将样品冷却、过滤、洗涤后烘干。
实施例5
一种用磷酸钠和过氧化氢预处理甘蔗渣的方法，包括如下步骤：
1)将甘蔗渣风干后进行粉碎，筛选100～200目的颗粒密封干燥保存；
2)称取5g甘蔗渣放入250ml的锥形瓶中，加入50ml的2％的过氧化氢溶液，在80℃水浴进一步预处理甘蔗渣60min，预处理结束后将样品冷却至室温，过滤收集甘蔗渣，用去离子水洗涤，烘干；
3)再放入50ml的8％的磷酸钠溶液中，升温至121℃预处理60min，结束后将样品冷却、过滤、洗涤后烘干。
对比例1
仅将甘蔗渣风干后进行粉碎，筛选100～200颗粒密封干燥，不做预处理。
对比例2
将实施例1中的磷酸钠替换为碳酸钠，其它实施条件与实施例1一致。
将经过对比例2处理的甘蔗渣进行酶解，结果发现经对比例2处理的甘蔗渣酶解效率明显低于实施例1的。
将实施例1、实施例4、实施例5及对比例1处理后的甘蔗渣进行酶解，不同预处理对甘蔗渣成分和酶解效果的影响如表1所示。
表1不同预处理对甘蔗渣成分和酶解效果的影响
Figure BDA0002605580500000051
a:混合8％Na3PO4和2％H2O2在121℃预处理60min
b:先8％Na3PO4在121℃预处理SCB 60min，后2％H2O2在80℃预处理SCB 60min
c:先2％H2O2在80℃预处理SCB 60min，后8％Na3PO4在121℃预处理SCB 60min
由表1可知，Na3PO4和H2O2两步法的预处理顺序能显著影响固体回收率，与未预处理的甘蔗渣相比，葡聚糖和木聚糖含量都明显增加；与混合Na3PO4和H2O2预处理相比，经过Na3PO4-H2O2预处理后，此时葡聚糖含量有所上升，为48.08％，而木聚糖含量有所降低，为36.31％；而经过H2O2-Na3PO4预处理后，葡聚糖含量有所降低，为45.64％，而木聚糖含量无明显变化。经过Na3PO4-H2O2和H2O2-Na3PO4预处理甘蔗渣的木质素含量分别为7.32％和6.07％，相应的木质素去除率分别为84.20％和86.76％，这表明经过两种不同顺序的两步法预处理后，甘蔗渣的结构明显不同，成分变化有明显区别。其中H2O2-Na3PO4预处理的去木质素率最高(86.76％)，先加H2O2更有助于木质素的去除。
未预处理的甘蔗渣酶解效果最低(9.35％)，因为甘蔗渣表面光滑且致密的纤维素结构阻碍了纤维素酶的水解。经过预处理后的甘蔗渣酶解效率都显著提高，经过Na3PO4-H2O2预处理和H2O2-Na3PO4预处理甘蔗渣的纤维素酶解效率分别为60.21％和70.11％，总还原糖浓度分别为11.28g/L，12.96g/L。与混合Na3PO4和H2O2预处理相比，两步法酶解效率均降低，是因为两步法预处理的过程中形成了更多的抑制物，降低了纤维素酶和纤维素之间的接触面积。这表明两步法预处理(Na3PO4-H2O2和H2O2-Na3PO4)虽然能够提高木质素的去除率，但是对酶解过程有不利影响。
采用场发射扫描电子显微镜SEM观察实施例1、实施例4、实施例5及对比例1处理后的甘蔗渣的表面形态结构，如图1(ABCD和abcd分别表示在220倍和1000倍下的SEM图)所示：
对比例1(A,a)甘蔗渣的SEM图显示出高度有序，表面光滑完整、无孔且规则排列的纤维结构，表面还吸附着多个尘土颗粒。经过磷酸钠和过氧化氢混合液预处理后，实施例1(B,b)甘蔗渣的形态结构发生了明显变化，甘蔗渣的尺寸变小，高度不规则，表面出现明显的分裂、断裂、多孔结构。研究表明甘蔗渣的表面积越大，粗糙程度越高，就能增加纤维素酶对甘蔗渣的接触面积，从而提高酶解效率。对比实施例4(C,c)和实施例5(D,d)甘蔗渣的SEM图，磷酸钠和过氧化氢混合液预处理的甘蔗渣(实施例1)小面积碎片最多，多孔结构更多，表面更蓬松粗糙。而经过实施例4(C,c)和实施例5(D,d)处理后，甘蔗渣的表面结构较完整，碎片化程度低，依然有序排列，表明经实施例4(C,c)和实施例5(D,d)预处理不利于酶和底物的充分接触。因此，磷酸钠和过氧化氢混合液预处理(实施例1)的甘蔗渣表面结构受到严重破坏，能够增加酶对底物的可及性，最大化的促进酶解。
利用X-射线衍射法对实施例1、实施例4、实施例5及对比例1处理后的甘蔗渣的结晶度进行测定，如图2所示：
结晶度能够表征纤维素晶体的结晶区和无定形区的比例，结晶区范围越大则结晶度越高，结晶区和无定形区的比值决定纤维素的结晶系数(CrI)。不同预处理前后甘蔗渣的X-衍射图谱没有发生明显变化，均有两个典型的纤维素峰面，分别在16°和22°处，说明经过不同预处理后甘蔗渣的晶体类型没有发生变化。未处理的甘蔗渣(对比例1)的CrI为52.36％，经混合磷酸钠和过氧化氢预处理(实施例1)、两步法Na3PO4-H2O2预处理(实施例4)和两步法H2O2-Na3PO4预处理(实施例5)甘蔗渣后，甘蔗渣纤维素的结晶度分别增至64.95％、58.77％和62.13％，其中，经磷酸钠和过氧化氢混合液预处理后的CrI最高。这可能是由于混合磷酸钠和过氧化氢预处理甘蔗渣去除了更多的木质素和非结晶半纤维素等无定形成分。
利用傅里叶红外光谱对实施例1、实施例4、实施例5及对比例1处理后的甘蔗渣的物质组成和结构进行分析，如图3所示。
利用FTIR检测预处理前后甘蔗渣的化学官能团的变化、特征峰的数量和强度分析木质素和碳水化合物中发生的化学变化。不同预处理前后甘蔗渣成分在4000-500cm-1波数范围的红外光谱图如图3所示。
波数3420cm-1和2914cm-1附近的宽带与羟基伸展振动和亚甲基的不对称伸展振动有关，波数在1648cm-1、1382cm-1、1029cm-1、899cm-1分别表示吸收水的弯曲振动、CH弯曲振动、C-O、C-C振动和C-O-C伸展振动。木质素相关峰在波数1725cm-1，是半纤维素的羧基与木质素的酚羟基之间形成的糖醛酸酯键振动，波数1604cm-1和1514cm-1来源于木质素中的芳族骨架结构振动，波数1240cm-1和831cm-1处振动是由于木质素与碳水化合物间中的β-酯键振动和木质素结构中的丁香基团振动。不同预处理后的甘蔗渣波数2914cm-1和899cm-1处的振动有不同程度地增强，这跟甘蔗渣中碳水化合物含量的增加有关。由图中可以看出，经过两步法Na3PO4-H2O2(实施例4)和两步法H2O2-Na3PO4(实施例5)的甘蔗渣的特征峰没有显着差异。与未预处理甘蔗渣(对比例1)相比，经磷酸钠和过氧化氢混合液预处理甘蔗渣(实施例1)，其峰在波数831cm-1、1604cm-1处的振动均消失了，波数1725cm-1、1514cm-1、1240cm-1处的振动明显减弱或几乎消失，这些与木质素相关峰的减弱或几乎消失表明混合磷酸钠和过氧化氢预处理(实施例1)去除了甘蔗渣样品中的大部分木质素。
分别对实施例1、实施例4、实施例5及对比例1处理后的甘蔗渣进行酶解，发现两步法Na3PO4-H2O2预处理(实施例4)甘蔗渣的总还原糖浓度和纤维素酶解效率分别为11.28g/L和60.21％；两步法H2O2-Na3PO4预处理(实施例5)甘蔗渣的总还原糖浓度和纤维素酶解效率分别为12.96g/L和70.11g/L；混合磷酸钠和过氧化氢预处理(实施例1)甘蔗渣的总还原糖和纤维素酶解效率分别为14.55g/L和82.22％。通过对比发现，两步法预处理(Na3PO4-H2O2和H2O2-Na3PO4)预处理的酶解效率低，混合磷酸钠和过氧化氢预处理甘蔗渣(实施例1)的酶解效率最高，没有经过处理的甘蔗渣酶解效率最低(对比例1)。后续发酵结果显示，混合磷酸钠和过氧化氢预处理的甘蔗渣(实施例1)无论是在分步糖化发酵过程中还是在同步糖化发酵过程中，所得乙醇浓度和得率均显著高于实施例4、5及对比例1因此，混合磷酸钠和过氧化氢预处理甘蔗渣是一种绿色环保，简单易行且具有潜在经济前景的方法。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用磷酸钠和过氧化氢预处理甘蔗渣的方法，其特征在于，包括如下步骤：
A.将甘蔗渣风干后进行粉碎，筛选密封干燥保存；
B.将步骤A处理好的甘蔗渣放入预处理溶液中进行一步或分步预处理；
C.待反应结束后，冷却至室温，进行固液分离，固体部分用热水洗至中性，收集固体残渣，烘干至恒重；
所述步骤B中预处理溶液包括磷酸钠溶液及过氧化氢溶液。
2.根据权利要求1所述的一种用磷酸钠和过氧化氢预处理甘蔗渣的方法，其特征在于，所述步骤B具体为：将步骤A中处理好的甘蔗渣放入磷酸钠溶液与过氧化氢溶液的混合溶液中，混合均匀后升温至60～140℃预处理20～100min。
3.根据权利要求1所述的一种用磷酸钠和过氧化氢预处理甘蔗渣的方法，其特征在于，所述步骤B具体为：将步骤A中处理好的甘蔗渣放入磷酸钠溶液中升温至60～140℃预处理20～100min，结束后将样品冷却至室温，过滤收集甘蔗渣，用去离子水洗涤，烘干；再放入过氧化氢溶液中，在60～100℃水浴条件下进一步预处理20～100min，结束后将样品冷却、过滤、洗涤后烘干。
4.根据权利要求1所述的一种用磷酸钠和过氧化氢预处理甘蔗渣的方法，其特征在于，所述步骤B具体为：将步骤A中处理好的甘蔗渣放入过氧化氢溶液中，在60～100℃水浴条件下进一步预处理20～100min，预处理结束后将样品冷却至室温，过滤收集甘蔗渣，用去离子水洗涤，烘干；再放入磷酸钠溶液中升温至60～140℃预处理20～100min，结束后将样品冷却、过滤、洗涤后烘干。
5.根据权利要求1所述的一种用磷酸钠和过氧化氢预处理甘蔗渣的方法，其特征在于，所述步骤A甘蔗渣粉碎后筛选50～200目的颗粒；所述步骤B中甘蔗渣与预处理溶液的固液比为1：10；所述步骤C中固体残渣置于60-80℃的烘箱烘干至恒重。
6.根据权利要求1～5任一所述的一种用磷酸钠和过氧化氢预处理甘蔗渣的方法，其特征在于，所述磷酸钠溶液的浓度为2～10％，所述过氧化氢溶液的浓度为0.5～2.5％。
7.根据权利要求6所述的一种用磷酸钠和过氧化氢预处理甘蔗渣的方法，其特征在于，所述磷酸钠溶液的浓度为8％，所述过氧化氢溶液的浓度为2％。
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