CN111821233A - 一种植物美白天然活性复配组合物及其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种植物美白天然活性复配组合物及其制备方法及应用，属于化妆品技术领域，一种植物美白天然活性复配组合物的制备方法包括：按药材的A组方或B组方配料；加水，湿法球磨，超高压提取；离心得固相药渣及水提液；水提液经膜浓缩，加醇试剂配至醇浓度70‑80%，搅拌后离心得含多糖的固体及水‑醇混合提取液；含多糖的固体加水溶解，用内生真菌发酵；取固相药渣及多糖发酵液加入水‑醇混合提取液，超高压提取得提取液；对提取液离心后进行膜过滤处理或离心后浓缩、冻干。通过桑白皮、覆盆子、积雪草或牡丹皮的特有配比复配，并有机地结合提取和发酵组合工艺，可制得功效、安全性、性价比更高的植物美白天然活性复配组合物。

Description

一种植物美白天然活性复配组合物及其制备方法及应用
技术领域
本发明属于化妆品技术领域，更具体地说，它涉及一种植物美白天然活性复配组合物及其制备方法及应用。
背景技术
东方女性以白为美，因此亚洲女性对皮肤美白类化妆品一直是宠爱有加。
造成人体皮肤存在色差的主要原因是黑色素，黑色素广泛存在于人的皮肤、粘膜、视网膜、软脑膜及胆囊与卵巢等处。黑色素的存在对皮肤起到了保护作用，但是过多的黑色素则会影响外表的美观，甚至引发雀斑、黄褐斑等皮肤问题。
黑色素的大量产生多与内分泌失调、日光照射有关，而黑色素细胞(即带有黑色素或其他类似色素的细胞)的多少主要取决于遗传。
其中，黑色素的生物合成途径是一个氧化过程：
第一阶段由酪氨酸酶(Tyrosinase，简称TYR，一种含铜的氧化酶，是黑色素合成的关键性酶)将酪氨酸转变为L-多巴(L-DOPA)，多巴进一步转变为多巴醌(DQ)；
第二阶段中多巴醌可以和与半胱氨酸或者谷胱甘肽反应会生成褐黑素；不存在半胱氨酸或者谷胱甘肽时，多巴醌聚合成多巴色素，再转变为5，6-二羟基吲哚(DHI)，最后氧化聚合形成DHI黑色素；无色多巴色素在酪氨酸酶相关蛋白2(Tyrosinase-related protein-2，简称TRP-2)作用下互变异构转化为5，6-二羟基吲哚羧酸(DHICA)，然后在酪氨酸酶相关蛋白1(Tyrosinase-related protein-1，简称TRP1)作用下生成DHICA黑色素。
在黑色素的合成途径中，酪氨酸酶是关键性酶，因此抑制酪氨酸酶是抑制黑色素合成的有效途径。
酪氨酸酶抑制剂常见的有：通过烟酸合成的烟酰胺，用量大，起效较慢，且残留的烟酸有副作用；维生素C及其衍生物，维生素C本身在水中不稳定，且高浓度会产生刺激，其衍生物如维生素C磷酸镁(MAP)，稳定性远超维生素C，但是其效果相对较弱；熊果苷在高浓度下具有光敏性，可能产生氢醌；光甘草定效果好但是价格昂贵；曲酸及其衍生物活性好，但是对皮肤屏障有损伤，会造成刺激。
现有的TW200413021专利申请中描述了一种含有天然萃取物的组方，从其中上百种提取物中挑选一至两种，配合其他化合物，组成具有美白功效的皮肤外用剂。提取物组合B在配方中的用量为：除B组外，A-H总和的余量(75-99.99795％)。其中植物提取物的萃取部位不限，提取方法为使用使用水、低级醇、石油醚、及常温下为液态的烃为溶剂提取，前处理为切断植物，50℃下浸渍或搅或回流提取3-48小时；或用水蒸气蒸馏提取，在用前述溶剂萃取提纯，该方法提取物添加量大且工艺耗时长。
CN110664679A专利申请中对牡丹皮、川芎、赤芍、青蒿、益母草和龙胆草，进行提取、提纯，得到具有美白抗衰老功效的中药组合物，提取方式为：粉碎药材，使用水、乙醇为溶剂(5-20倍)，在40-90℃提取1-3h，至少3次，经离心、过滤后浓缩，使用大孔树脂进行分离，洗脱液为水-乙醇，回收洗脱液并浓缩，使用丙二醇配制。牡丹皮为君药，组方中占1-30％，组方提取物在化妆品中使用量0.05-30％，该工艺使用大孔树脂提纯，产生废液和废树脂且工艺耗时长。
因此需要提出一种新的技术方案来解决工艺耗时长，美白效果差，安全性能不高的问题。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的之一在于提供一种植物美白天然活性复配组合物的制备方法，通过特有配比、提取和发酵组合工艺，得到功效更强、安全性更高、性价比更高的植物美白天然活性复配组合物。
本发明的上述发明目的一是通过以下技术方案得以实现的：
一种植物美白天然活性复配组合物的制备方法，包括如下操作步骤：
步骤一、按照重量份数，药材的A组方主要是由桑白皮45-55份，覆盆子25-35份和积雪草10-30份组成的；
步骤二、加药材量12-14倍的水，湿法球磨20-25min；
步骤三、在300-500Mpa的压力下提取3-5min；
步骤四、离心分别得到固相药渣以及水提液；
步骤五、水提液经膜浓缩至药材投料量的1.2-1.4倍，然后加入醇试剂，配至醇浓度达到70-80％，搅拌10-15min后，离心，分别得到含多糖的固体及水-醇混合提取液；
步骤六、将离心得到的含多糖的固体加水溶解至药材重量的1.2-1.4倍，使用相应的内生真菌发酵，得到多糖发酵液；
步骤七、取步骤四中的固相药渣，以及步骤六中的多糖发酵液加入步骤五中的水-醇混合提取液内，在300-500MP的压力下提取3-5min，得到提取液；
步骤八、对步骤七中得到的提取液进行离心、膜过滤处理或者离心、膜浓缩、冻干处理。
通过采用上述技术方案，桑白皮是桑科植物桑(Morus alba L.)的根皮，据《中国药典》记载，有疏散风热，清肺润燥，清肝明目的功效。桑白皮含有桑素、桑根皮素、桑黄酮(A-I,K,L,Y,Z)、桑白皮素、桑根酮(A-P)等丰富的黄酮类成分，具有抗氧化，抗炎功效；含有桑皮苷A、氧化白藜芦醇、白藜芦醇(芪三酚)等芪类化合物，具有抗氧化、抗自由基、抗炎等功效；桑白皮多酚具有抑制B16细胞内黑色素生成的作用，桑白皮还含有桑多糖等多糖类化合物、苯丙素类、生物碱类化合物以及多种维生素和氨基酸等对皮肤有益的组分。
覆盆子为蔷薇科植物华东覆盆子Rubus chingii Hu的干燥果实，黄酮类成分是覆盆子中的主要活性成分之一，具有抗氧化、抑菌消炎等功效；以三萜(苷)类为代表的萜类化合物，具有抗炎、抗菌、调节免疫等功效；含有具有增强细胞免疫力和清除自由基的功能的多糖以及丰富的有机酸、鞣花酸、生物碱、甾体、维生素、氨基酸等对皮肤有益的活性物。
积雪草为伞形科植物积雪草Centella asia tica(L.)Urb.的干燥全草。积雪草含有以积雪草苷和羟基积雪草苷、积雪草酸、羟基积雪草酸为代表，具有抗炎、愈合皮肤创伤及抑制黑色素合成的功效，能促进成纤维细胞合成胶原蛋白；积雪草多酚具有清除自由基抗氧化的功效；积雪草中还含有有黄酮、多糖、内消旋肌醇、维生素和氨基酸类营养物质。
本申请采用桑白皮、覆盆子、积雪草三者特有的配比进行复配使用，其制备方法中先后使用水、水-醇混合提取液先后提取药材，充分利用药材提取得到有效成分；其次在使用超高压提取前，用湿法球磨处理药材，使药材在常温下被溶剂充分浸润，使超高压提取的效果更好。使用超高压提取设备解决了丙二醇(丁二醇)水溶液渗透性差、提取效率低的问题，使药材利用率最大化；同时使用超高压提取有能耗低、时间短，在足够的压力下可以常温灭活细菌和霉菌的优点，且常温提取保护了有效成分免受高温的影响。
此外采用超高压保证了第一步得到的提取液中没有杂菌影响，使得后续使用内源菌发酵可以顺利进行而不被杂菌干扰，第二次超高压提取还能配合溶剂中的醇使发酵液中的菌快速灭活，并使发酵产物低聚糖迅速在提取液中溶解，超高压设备全程与发酵过程紧密有机地互相配合。
然后操作步骤中使用高速离心除去大分子杂质，保证了超滤膜的工作效率和使用寿命，超滤膜进一步除去杂质使活性成分纯度提高，同时获得的滤液的颜色更浅；并且在提取除杂全过程能够在不高于室温的条件下进行(即不需要进行主动加热)，低温充分保护了有效成分不变色、变质，产品无需额外添加防腐剂，避免了对皮肤造成的刺激作用。
本发明的上述发明目的二是通过以下技术方案得以实现的：
一种植物美白天然活性复配组合物的制备方法，包括如下操作步骤：
步骤一、按照重量份数，药材的B组分主要是由桑白皮50-60份，牡丹皮15-25份和积雪草15-35份组成的；
步骤二、加药材量12-14倍的水，湿法球磨20-25min；
步骤三、在300-500Mpa的压力下提取3-5min；
步骤四、离心分别得到固相药渣以及水提液；
步骤五、水提液经膜浓缩至药材投料量的1.2-1.4倍，然后加入醇试剂，配至醇浓度达到70-80％，搅拌10-15min后，离心，分别得到含多糖的固体及水-醇混合提取液；
步骤六、将离心得到的含多糖的固体加水溶解至药材重量的1.2-1.4倍，使用相应的内生真菌发酵，得到多糖发酵液；
步骤七、取步骤四中的固相药渣，以及步骤六中的多糖发酵液加入步骤五中的水-醇混合提取液内，在300-500MP的压力下提取3-5min，得到提取液；
步骤八、对步骤七中得到的提取液进行离心、膜过滤处理或者离心、膜浓缩、冻干处理。
通过采用上述技术方案，牡丹皮为毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮，有清热凉血，活血化瘀的功效。牡丹皮中含有丰富的萜类(及其苷)如芍药苷、酚类(及其苷)如丹皮酚成份，具有抗炎、抗菌、抗氧化、止痛、止痒和改善黑色素代谢的作用。
采用牡丹皮代替覆盆子与桑白皮、积雪草通过特有的配比进行复配使用，根据试验结果可知，通过配比的调整，两种组方(A组方和B组方)对于有效成分的提取效果相近，可以作为替代产品使用，A组方和B组方均可制备得到性能较好且安全性高的美白天然活性复配组合物。
本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：在步骤五中，所述醇试剂选自丙二醇和丁二醇的混合液，乙醇，丙二醇和丁二醇中的一种。
通过采用上述技术方案，乙醇、丙二醇、丁二醇、丙二醇和丁二醇混合液均是常见的溶解性能较好的溶剂，能够与水以任意比互溶，且能溶解植物提取物中的有效成分。
本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：步骤五中，当所述醇试剂选用乙醇时，在步骤八中，需对步骤七中得到的提取液进行离心、膜浓缩至药材投料量1.6-1.8倍；浓缩液经冷冻干燥后得到提取物粉末。
通过采用上述技术方案，当选用乙醇作为醇试剂使用时，可对离心后提取液进行浓缩处理，然后经由冻干操作(冷冻干燥)后可获得冻干粉，由此制得的上述冻干粉方便储存和运输，且经浓缩、冻干操作后也能高效地保留其活性成分。
本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：在步骤六中，所述内生真菌的制备方法如下：
将A组桑白皮，覆盆子，积雪草，B组桑白皮、牡丹皮、积雪草的新鲜药材，用纯水洗净后，使用75°乙醇浸泡30秒，再以4％次氯酸钠浸泡30秒，取出后立即用无菌纯水冲洗，于超净台沥干后，用灭菌手术刀将药材切成薄片后，一起放入PDA培养基中培养内生真菌，25℃培养箱中培养7天，每天观察培养皿中真菌生长状况，有新的菌丝生长出来时，挑取菌丝接入新的培养皿中培养，继续纯化，获得纯化后的内生真菌的菌种。
本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：在步骤六中，内生真菌筛选阶段，发酵液的制备方法如下：
以水为溶剂，使用湿法研磨对A组方或B组方进行处理后，用超高压提取设备进行提取，得到的提取液浓缩至药材重量的1.2倍，加入乙醇配至80°的醇，醇沉产物于40℃回收溶剂干燥；
将培养出的内生真菌的菌种分别接入装有1000mLPDA液体培养基的2000mL锥形瓶中，分别加入A、B两组的醇沉产物，摇床发酵14天，获得发酵液。
本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：在步骤六中，内生真菌筛选阶段，发酵营养源的制备方法如下：
发酵液使用超高压提取设备灭菌后，滤去沉淀，将发酵产物送分析检测，将多糖完全转化为低聚糖的小组，送安全与功效评价筛选，从无皮肤刺激的组别中挑出黑素细胞抑制效果最优的组，其对应A组方真菌菌株S18，B组方真菌菌株S33，并将其用作后续发酵，同时以这两组混合真菌的灭活废菌丝体作为发酵的营养源。
通过采用上述技术方案，发酵的营养源采用内生真菌的灭活废菌丝体，避免额外加入培养基、盐等影响提取液稳定性。使用混合内生真菌主要对第一步水提取产物中分离出的多糖发酵，而不是对水提液整体发酵，避免发酵过程因药材中部分抑菌组份被提取至提取液中，影响发酵。
本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：在步骤九中，冷冻干燥的条件是：-40℃预冷12小时，抽真空至10Pa，然后干燥温度由-40℃升至20℃，每隔15℃保温1h。
通过采用上述技术方案，在-40℃的温度和10Pa压力条件下将将膜浓缩后的浓缩液，此时浓缩液中的水分在低温下迅速凝结成冰晶然后快速升温，高真空下让冰晶升华干燥后得到内部多孔的冻干产品，由此冻干方式保存可有效防止细胞的生物特性发生改变，最大程度的保护了其活性与功效，也减小了受污染的机会，大大延长了保存期限。
本发明的目的之三在于提供一种植物美白天然活性复配组合物，采用桑白皮、覆盆子、积雪草或牡丹皮进行复配，得到功效更强、安全性更高、性价比更高的植物美白天然活性复配组合物。
本发明的上述发明目的二是通过以下技术方案得以实现的：
本发明的一种植物美白天然活性复配组合物，采用上述植物美白天然活性复配组合物的制备方法制备得到。
本发明的一种植物美白天然活性复配组合物在乳剂、水剂、精华、膏霜领域中的应用。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
本发明使用桑白皮、覆盆子、积雪草或牡丹皮进行复配，先后使用水、水-醇混合提取液的提取和精制，在最大程度提取各药材有效成分的同时，除去了杂质，提高了有效成分的纯度，从而减少使用添加量；提取和除杂过程全程不进行加热，避免有效成分的损失；产品中杂质少，天然温和，对皮肤无副作用；使用植物内生真菌发酵得到安全且易被皮肤吸收的植物美白天然活性复配组合物。
附图说明
图1为一种植物美白天然活性复配组合物的制备方法的工艺流程图，主要用于体现是采用非乙醇试剂作为醇试剂时的离心、膜过滤的操作步骤；
图2为一种植物美白天然活性复配组合物的制备方法的工艺流程图，主要用于体现是采用乙醇试剂作为醇试剂时的离心、膜浓缩以及冻干的操作步骤。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
一、菌种的筛选和培养
步骤S1、将药材的A组方：桑白皮，覆盆子，积雪草的新鲜药材，可以按照桑白皮45份，覆盆子25份和积雪草30份的比例进行配料；药材的B组方：桑白皮、牡丹皮、积雪草的新鲜药材，可以按照桑白皮50份，牡丹皮15份和积雪草35份的比例进行配料。然后用纯水洗净后，使用75°的乙醇浸泡30秒，再以4％次氯酸钠浸泡30秒，取出后立即用无菌纯水冲洗，于超净台沥干后，用灭菌手术刀将药材切成薄片(3-5mm)后，一起放入PDA培养基中培养内生真菌，25℃培养箱中培养7天，每天观察培养皿中真菌生长状况，有新的菌丝生长出来时，挑取菌丝接入新的培养皿中培养，继续纯化，获得纯化后的真菌菌种；总计获得内生真菌68株。
步骤S2、以水为溶剂，使用湿法研磨对药材组方A和组方B进行处理后，用超高压提取设备进行提取，得到的提取液浓缩至药材重量的1.2倍，加入乙醇配至80°醇，醇沉产物于40℃回收溶剂干燥。
步骤S3、将培养出的68株内生真菌分别接入装有1000mLPDA液体培养基的2000mL锥形瓶中，分别加入A组方、B组方两组的醇沉产物，摇床发酵14天，获得发酵液；
步骤S4、发酵液使用超高压提取设备灭菌后，滤去沉淀，将发酵产物送分析检测，将多糖完全转化为低聚糖的小组(经过凝胶色谱检测，发酵产物中的低聚糖分子量不超过2000道尔顿的视为多糖完全转化)送安全与功效评价筛选，从无皮肤刺激的组别中挑出黑素细胞抑制效果最优的组，其对应真菌菌株S18(A组方)，S33(B组方)，用作后续发酵，同时以这两组混合真菌的灭活废菌丝体作为发酵的营养源。
二、实施例
实施例1：一种植物美白天然活性复配组合物，按照重量份数，药材A组方是由桑白皮45份，覆盆子25份和积雪草30份组成。
上述实施例1的一种植物美白天然活性复配组合物的制备方法，如图1所示，包括如下步骤：
步骤一、按照重量份数，称取药材组方：桑白皮45份，覆盆子25份和积雪草30份。
步骤二、在上述药材组方中加药材量12倍的纯水，湿法球磨，在转速为70％的最大转速(XMQ型锥形球磨机的最大转速为90r/min)下，研磨25分钟。
步骤三、在压力300Mpa的超高压力下提取5min。
步骤四、经由直管离心机，按照2万转/分钟的转速下进行离心操作，离心得固相药渣以及水提液。
步骤五、水提液经膜浓缩至药材投料量1.4倍，然后加入丙二醇，配至丙二醇的浓度达到70％，搅拌15分钟后，经直管离心机，按照2万转/分钟的转速下进行离心操作，离心得含多糖的固体及水-醇混合提取液。
步骤六、将离心的含多糖的固体以适量纯水溶解，纯水加入量为药材重量1.2倍，使用内生真菌S18发酵，得到多糖水解液。
步骤七、取步骤四中的固相药渣，以及步骤六中的多糖水解液加入步骤五中的水-醇混合提取液，在压力300Mpa的超高压力下提取5min，得到提取液。
步骤八、对步骤七中得到的提取液经直管离心机，按照2万转/分钟的转速进行离心操作，然后再经由5000分子量超滤膜过滤处理。
实施例2：一种植物美白天然活性复配组合物，按照重量份数，药材A组方是由桑白皮55份，覆盆子35份和积雪草10份组成。
上述实施例2的一种植物美白天然活性复配组合物的制备方法，如图1所示，包括如下步骤：
步骤一、按照重量份数，称取药材组方：桑白皮55份，覆盆子35份和积雪草10份。
步骤二、在上述药材组方中加药材量14倍的纯水，湿法球磨，在转速为80％的最大转速(XMQ型锥形球磨机的最大转速为90r/min)下，研磨20分钟。
步骤三、在压力500Mpa的超高压力下提取3min。
步骤四、经由直管离心机，按照2万转/分钟的转速下进行离心操作，离心得固相药渣以及水提液。
步骤五、水提液经膜浓缩至药材投料量1.2倍，然后加入丁二醇，配至丁二醇的浓度达到80％，搅拌10分钟后，经直管离心机，按照2万转/分钟的转速下进行离心操作，离心得含多糖的固体及水-醇混合提取液。
步骤六、将离心的含多糖的固体以适量纯水溶解，纯水加入量为药材重量1.4倍，使用内生真菌S18发酵，得到多糖水解液。
步骤七、取步骤四中的固相药渣，以及步骤六中的多糖水解液加入步骤五中的水-醇混合提取液，在压力500Mpa的超高压力下提取3min，得到提取液。
步骤八、对步骤七中得到的提取液经直管离心机，按照2万转/分钟的转速进行离心操作，然后再经由5000分子量超滤膜过滤处理。
实施例3：一种植物美白天然活性复配组合物，按照重量份数，药材B组方是由桑白皮50份，牡丹皮15份和积雪草35份组成。
上述实施例3的一种植物美白天然活性复配组合物的制备方法，如图1所示，包括如下步骤：
步骤一、按照重量份数，称取药材组方：桑白皮50份，牡丹皮15份和积雪草35份。
步骤二、在上述药材组方中加药材量12倍的纯水，湿法球磨，在转速为70％的最大转速(XMQ型锥形球磨机的最大转速为90r/min)下，研磨25分钟。
步骤三、在压力300Mpa的超高压力下提取5min。
步骤四、经由直管离心机，按照2万转/分钟的转速下进行离心操作，离心得固相药渣以及水提液。
步骤五、水提液经膜浓缩至药材投料量1.4倍，然后加入丙二醇，配至丙二醇的浓度达到80％，搅拌15分钟后，经直管离心机，按照2万转/分钟的转速下进行离心操作，离心得含多糖的固体及水-醇混合提取液。
步骤六、将离心的含多糖的固体以适量纯水溶解，纯水加入量为药材重量1.2倍，使用内生真菌S33发酵，得到多糖水解液。
步骤七、取步骤四中的固相药渣，以及步骤六中的多糖水解液加入步骤五中的水-醇混合提取液，在压力300Mpa的超高压力下提取5min，得到提取液。
步骤八、对步骤七中得到的提取液经直管离心机，按照2万转/分钟的转速进行离心操作，然后再经由5000分子量超滤膜过滤处理。
实施例4：一种植物美白天然活性复配组合物，按照重量份数，药材B组方是由桑白皮60份，牡丹皮25份和积雪草15份组成。
上述实施例4的一种植物美白天然活性复配组合物的制备方法，如图1所示，包括如下步骤：
步骤一、按照重量份数，称取药材组方：桑白皮60份，牡丹皮25份和积雪草15份。
步骤二、在上述药材组方中加药材量14倍的纯水，湿法球磨，在转速为80％的最大转速(XMQ型锥形球磨机的最大转速为90r/min)下，研磨20分钟。
步骤三、在压力500Mpa的超高压力下提取3min。
步骤四、经由直管离心机，按照2万转/分钟的转速下进行离心操作，离心得固相药渣以及水提液。
步骤五、水提液经膜浓缩至药材投料量1.2倍，然后加入丁二醇，配至丁二醇的浓度达到70％，搅拌10分钟后，经直管离心机，按照2万转/分钟的转速下进行离心操作，离心得含多糖的固体及水-醇混合提取液。
步骤六、将离心的含多糖的固体以适量纯水溶解，纯水加入量为药材重量1.4倍，使用内生真菌S33发酵，得到多糖水解液。
步骤七、取步骤四中的固相药渣，以及步骤六中的多糖水解液加入步骤五中的水-醇混合提取液，在压力500Mpa的超高压力下提取3min，得到提取液。
步骤八、对步骤七中得到的提取液经直管离心机，按照2万转/分钟的转速进行离心操作，然后再经由5000分子量超滤膜过滤处理。
实施例5：一种植物美白天然活性复配组合物，按照重量份数，药材B组方是由桑白皮55份，牡丹皮20份和积雪草25份组成。
上述实施例5的一种植物美白天然活性复配组合物的制备方法，如图1所示，包括如下步骤：
步骤一、按照重量份数，称取药材组方：桑白皮55份，牡丹皮20份和积雪草25份。
步骤二、在上述药材组方中加药材量13倍的纯水，湿法球磨，在转速为75％的最大转速(XMQ型锥形球磨机的最大转速为90r/min)下，研磨22.5分钟。
步骤三、在压力400Mpa的超高压力下提取4min。
步骤四、经由直管离心机，按照2万转/分钟的转速下进行离心操作，离心得固相药渣以及水提液。
步骤五、水提液经膜浓缩至药材投料量1.3倍，然后加入丙二醇与丁二醇的混合液，其中丙二醇与丁二醇按照重量比为1：1混合，配至丙二醇与丁二醇的混合液的浓度达到75％，搅拌12.5分钟后，经直管离心机，按照2万转/分钟的转速下进行离心操作，离心得含多糖的固体及水-醇混合提取液。
步骤六、将离心的含多糖的固体以适量纯水溶解，纯水加入量为药材重量1.3倍，使用内生真菌S33发酵，得到多糖水解液。
步骤七、取步骤四中的固相药渣，以及步骤六中的多糖水解液加入步骤五中的水-醇混合提取液，在压力400Mpa的超高压力下提取4min，得到提取液。
步骤八、对步骤七中得到的提取液经直管离心机，按照2万转/分钟的转速进行离心操作，然后再经由5000分子量超滤膜过滤处理。
实施例6：一种植物美白天然活性复配组合物，按照重量份数，药材A组方是由桑白皮50份，覆盆子30份和积雪草20份组成。
上述实施例6的一种植物美白天然活性复配组合物，如图2所示，包括如下步骤：
步骤一、按照重量份数，称取药材组方：桑白皮50份，覆盆子30份和积雪草20份。
步骤二、在上述药材组方中加药材量13倍的纯水，湿法球磨，在转速为75％的最大转速(XMQ型锥形球磨机的最大转速为90r/min)下，研磨22.5分钟。
步骤三、在压力400Mpa的超高压力下提取4min。
步骤四、经由直管离心机，按照2万转/分钟的转速下进行离心操作，离心得固相药渣以及水提液。
步骤五、水提液经膜浓缩至药材投料量1.3倍，然后加入乙醇，配至乙醇的混合液的浓度达到70％，搅拌12.5分钟后，经直管离心机，按照2万转/分钟的转速下进行离心操作，离心得含多糖的固体及水-醇混合提取液。
步骤六、将离心的含多糖的固体以适量纯水溶解，纯水加入量为药材重量1.3倍，使用内生真菌S18发酵，得到多糖水解液。
步骤七、取步骤四中的固相药渣，以及步骤六中的多糖水解液加入步骤五中的水-醇混合提取液，在压力400Mpa的超高压力下提取4min，得到提取液。
步骤八、对步骤七中得到的提取液经直管离心机，按照2万转/分钟的转速进行离心操作，然后再经由5000分子量超滤膜过滤处理，接着经膜浓缩，使得浓缩液重量至药材量的1.6倍。
步骤九、在-40℃的温度下预冷12小时，同时抽真空至10Pa，由-40℃的温度升至20℃的过程中，每隔15℃保温1h，冷冻干燥后得到提取物粉末(即冻干粉)。
实施例7：一种植物美白天然活性复配组合物，按照重量份数，药材B组方是由桑白皮55份，牡丹皮20份和积雪草25份组成。
上述实施例7的一种植物美白天然活性复配组合物，如图2所示，包括如下步骤：
步骤一、按照重量份数，称取药材组方：桑白皮55份，牡丹皮20份和积雪草25份。
步骤二、在上述药材组方中加药材量13倍的纯水，湿法球磨，在转速为75％的最大转速(XMQ型锥形球磨机的最大转速为90r/min)下，研磨22.5分钟。
步骤三、在压力400Mpa的超高压力下提取4min。
步骤四、经由直管离心机，按照2万转/分钟的转速下进行离心操作，离心得固相药渣以及水提液。
步骤五、水提液经膜浓缩至药材投料量1.3倍，然后加入乙醇，配至乙醇的浓度达到80％，搅拌12.5分钟后，经直管离心机，按照2万转/分钟的转速下进行离心操作，离心得含多糖的固体及水-醇混合提取液。
步骤六、将离心的含多糖的固体以适量纯水溶解，纯水加入量为药材重量1.3倍，使用内生真菌S33发酵，得到多糖水解液。
步骤七、取步骤四中的固相药渣，以及步骤六中的多糖水解液加入步骤五中的水-醇混合提取液，在压力400Mpa的超高压力下提取4min，得到提取液。
步骤八、对步骤七中得到的提取液经直管离心机，按照2万转/分钟的转速进行离心操作，然后再经由5000分子量超滤膜过滤处理，接着经膜浓缩，使得浓缩液重量至药材量的1.8倍。
步骤九、在-40℃的温度下预冷12小时，同时抽真空至10Pa，由-40℃的温度升至20℃的过程中，每隔15℃保温1h，冷冻干燥后得到提取物粉末(即冻干粉)。
三、对比例
对比例1：一种植物美白天然活性复配组合物的制备方法，与实施例3的不同之处在于：与实施例3的药材B组方一致，对比例1采用常压煎煮；而实施例3采用300Mpa的超高压煎煮。
其具体的操作步骤如下：
步骤一、桑白皮50份，牡丹皮15份和积雪草35份，加入12倍药材重量的水，在60℃的温度下煎煮1.5h，滤出药渣，药液浓缩至药材重量的2倍，过滤得到浓缩液。
步骤二、采用药材重量8倍的80％丙二醇溶液，60℃常压力下煎煮药渣1.5h，滤去药渣，得到水提液。
步骤三、合并步骤一中浓缩液和步骤二中水提液，搅拌均匀，滤纸过滤。
对比例2：一种植物美白天然活性复配组合物的制备方法，与实施例1的不同之处在于：与实施例1的药材A组方一致，对比例2采用粉碎机和超高压协同使用。
其具体的操作步骤如下：
步骤一、桑白皮45份，覆盆子25份，积雪草30份，粉碎机粉碎，过80目筛。
步骤二、加药材量12倍纯水，超高压提取，压力300MPa，时间5min。
步骤三、直管离心机离心，转速2万转/分钟，得固相药渣以及水提液。
步骤四、水提液膜浓缩至药材投料量的1.4倍，加入丙二醇，配至丙二醇的浓度达到70％，搅拌15分钟后，经直管离心机，按照2万转/分钟的转速进行离心操作，离心后得含多糖的固体及水-醇混合提取液。
步骤五、将离心的含多糖的固体以纯水溶解，纯水的加入量为药材重量的1.2倍，使用内生真菌S18发酵，得到多糖水解液。
步骤六、取步骤三中的固相药渣以及步骤五中的多糖水解液，加入步骤四中的水-醇混合提取液，在300Mpa的超高压提取5min。
步骤七、提取液直管离心机，按照2万转/分钟的转速进行离心操作，然后经由5000分子量超滤膜过滤。
对比例3：一种植物美白天然活性复配组合物的制备方法，与实施例1的不同之处在于：药材A组方不同，其配方量超出A组方规定的范围之外，此外制备方法中的压力不同、转速均不同。
其具体的操作步骤如下：
步骤一、按照重量份数，称取药材组方：桑白皮40份，覆盆子20份和积雪草40份。
步骤二、在上述药材组方中加药材量14倍的纯水，湿法球磨，在转速为75％的最大转速(XMQ型锥形球磨机的最大转速为90r/min)下，研磨25分钟。
步骤三、在压力400Mpa的超高压力下提取4min。
步骤四、经由直管离心机，按照2万转/分钟的转速下进行离心操作，离心得固相药渣以及水提液。
步骤五、水提液经膜浓缩至药材投料量1.4倍，然后加入丙二醇，配至丙二醇的浓度达到70％，搅拌15分钟后，经直管离心机，按照2万转/分钟的转速下进行离心操作，离心得含多糖的固体及水-醇混合提取液。
步骤六、将离心的含多糖的固体以适量纯水溶解，纯水加入量为药材重量1.2倍，使用内生真菌S33发酵，得到多糖水解液。
步骤七、取步骤四中的固相药渣，以及步骤六中的多糖水解液加入步骤五中的水-醇混合提取液，在压力400Mpa的超高压力下提取4min，得到提取液。
步骤八、对步骤七中得到的提取液经直管离心机，按照2万转/分钟的转速进行离心操作，然后再经由5000分子量超滤膜过滤处理。
对比例4：一种植物美白天然活性复配组合物的制备方法，与实施例1的不同之处在于：对比例4中不具有发酵操作。
其具体的操作步骤如下：
步骤一、按照重量份数，称取药材组方：桑白皮45份，覆盆子25份和积雪草30份。
步骤二、在上述药材组方中加药材量12倍的纯水，湿法球磨，在转速为70％的最大转速(XMQ型锥形球磨机的最大转速为90r/min)下，研磨25分钟。
步骤三、在压力300Mpa的超高压力下提取5min。
步骤四、经由直管离心机，按照2万转/分钟的转速下进行离心操作，离心得固相药渣以及水提液。
步骤五、水提液经膜浓缩至药材投料量1.4倍，然后加入丙二醇，配至丙二醇的浓度达到70％，搅拌15分钟后，经直管离心机，按照2万转/分钟的转速下进行离心操作，离心得含多糖的固体及水-醇混合提取液。
步骤六、将离心的含多糖的固体以适量纯水溶解，纯水加入量为药材重量1.2倍，滤纸过滤。
步骤七、取步骤四中的固相药渣，以及步骤六中的滤液加入步骤五中的水-醇混合提取液，在压力300Mpa的超高压力下提取5min，得到提取液。
步骤八、对步骤七中得到的提取液经直管离心机，按照2万转/分钟的转速进行离心操作，然后再经由5000分子量超滤膜过滤处理。
对比例5：一种植物美白天然活性复配组合物的制备方法，与实施例1的不同之处在于：对比例5中直接对水提液发酵。
其具体的操作步骤如下：
步骤一、按照重量份数，称取药材组方：桑白皮45份，覆盆子25份和积雪草30份。
步骤二、在上述药材组方中加药材量12倍的纯水，湿法球磨，在转速为70％的最大转速(XMQ型锥形球磨机的最大转速为90r/min)下，研磨25分钟。
步骤三、在压力300Mpa的超高压力下提取5min。
步骤四、经由直管离心机，按照2万转/分钟的转速下进行离心操作，离心得固相药渣以及水提液。
步骤五、水提液用内生真菌S18发酵。
四、性能检测分析
试验一：理化指标检测试验对象：将实施例1-7和对比例1-5制备得到的活性复合组合物作为试验对象，共120个试验小样，共12个小组，每组10个试验小样。
试验方法：
1、提取液总酚以GB/T 8313-2008中的方法二，福林酚法进行测定；
2、总糖以苯酚-硫酸法进行测定；
3、得率＝(M1+M2)÷M0*100％；
其中M1为提取液中总酚质量；M2为提取液中总糖质量；M0为药材质量
4、专业人员观察试验对象实施例1-7和对比例1-5的颜色情况，并将上述得率取平均值并登记在表1中，而将观察得到的70％以上的试验小样的颜色登记在表1中作为该组的最后认定的颜色。
表1理化指标检测结果
Figure BDA0002563104910000141
Figure BDA0002563104910000151
试验结果：由表1的数据可以看出，实施例1-7的得率均大于对比例1-5的数据。同时实施例1-7的产品颜色均为淡黄色，而对比例1、对比例3和对比例5的颜色深于实施例1-7的。由此可知，在本方案配比和工艺条件下，有效成分含量有显著提高，并且颜色更浅。
其次，与对比例5相比较，实施例1的得率为对比例5的约1.8倍，由此可知，对比例5采用直接对水提液进行发酵的方式会影响到复合组合物中有效成分的提取，对比例5的操作方式不利于整个复合组合物的获取。
试验二：络氨酸酶抑制测试
试验方法：
1、酪氨酸酶的提取
1)购买一个较大的马铃薯，预先放入4℃冰箱中预冷2小时以上。并配置0.1mol/L，pH6.5的磷酸盐缓冲液1000ml。
2)将马铃薯洗净，去皮，称50g切碎，放入研钵中研磨。
3)加入200ml磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH6.5)匀浆，四层纱布过滤。
4)缓慢加入经研磨的硫酸铵粉末，使达到30％饱和度，于8000r/min离心15min。取上清液继续加入经研磨的硫酸铵，使达到70％饱和度，于8 000r/min离心20min。
5)沉淀用磷酸缓冲液溶解，定容至100ml，-20℃冰箱保存备用。
3.2酪氨酸酶测定体系的确定以儿茶酚(邻苯二酚)为底物，分光光度计测定在420nm下的吸光度变化。经过多次实验，确定的反应体系为2.5ml体系：1.5ml 0.1mol/L pH6.5的磷酸缓冲液、0.5ml 50mmol/L儿茶酚、待检测药物，放入UV2300紫外分光光度计中，然后加入0.5mL酪氨酸酶溶液启动反应，在120S内对该反应体系吸光值A进行时间扫描。底物儿茶酚以磷酸缓冲液溶解，且需当天配用。
取前120S吸光度对时间的变化率(△A/△t)为反应速率，按下式计算酪氨酸酶抑制率：
酪氨酸酶抑制率＝[(Vo-Vi)/Vo]×100％。
式中Vo为以溶剂(乙醇)代替样品时酶的反应速率；
Vi为加入样品(中药醇溶液)时酶的反应速率。
在不同浓度下检测药物抑制活性，然后以抑制百分比-浓度作图，求出其半数抑制浓度，即酪氨酸酶抑制率IC50值。
2、小鼠B16黑素细胞的半数致死浓度LD50值：
采用MTT法对细胞增值率进行测定，选择对数生长期的细胞接板，加入不同浓度的样品，在37℃，5％CO2条件下培养48h，在测定前4h取出，每孔加入5g/L的MTT溶液20μL，在37℃，5％CO2饱和湿度环境条件下培养4h，然后弃去培养基和MTT，向各孔加入150μL DMSO，以溶解残留的的MTT-甲臜结晶，振荡10min，以不加样品的细胞作阴性对照；用酶标仪测定各孔在570nm下的吸光值OD。然后计算细胞增殖率50％的样品浓度即为半数致死浓度LD50值。
细胞增值率＝(OD试验孔-OD阴性对照孔)÷(OD阳性对照孔-OD阴性对照孔)*100％。
表2功效和安全性测试
Figure BDA0002563104910000161
试验结果：由表2可以看出，与对比例1相比较，实施例3的酪氨酸酶抑制率IC50值明显小于对比例1的，同时实施例3的小鼠B16黑素细胞的半数致死浓度LD50值明显大于对比例1的。由此可知，采用超高压煎煮比常压煎煮，其酪氨酸酶抑制率IC50值更低，同时小鼠B16黑素细胞的半数致死浓度LD50值更高；综上可知采用300-500Mpa的超高压煎煮的方式其功效和安全性获得大幅度的提高。
与对比例2相比较，实施例1中的酪氨酸酶抑制率IC50值小于对比例2的，而小鼠B16黑素细胞的半数致死浓度LD50值两者差别不大。由此可知，对比例2采用粉碎机和超高压协同作业，会增大酪氨酸酶抑制率IC50值(即效果降低)，而对小鼠B16黑素细胞的半数致死浓度LD50值影响不大。
与对比例3相比较，实施例1中的酪氨酸酶抑制率IC50值小于对比例3的，同时实施例1的小鼠B16黑素细胞的半数致死浓度LD50值明显大于对比例3的。但是两组数据IC50值和LD50值各自相差不大。由此可知，对于药材组方中，采用桑白皮45-55份，覆盆子25-35份，积雪草10-30份的配合下其作用效果较好。
与对比例4相比较，实施例1中的酪氨酸酶抑制率IC50值小于对比例4的，同时实施例4的小鼠B16黑素细胞的半数致死浓度LD50值明显大于对比例4的。由此可知，采用发酵操作后小鼠B16黑素细胞的半数致死浓度LD50值更高。综上可知采用发酵操作后期功效和安全性获得大幅度的提高。
具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1.一种植物美白天然活性复配组合物的制备方法，其特征在于，包括如下操作步骤：
步骤一、按照重量份数，药材的A组方主要是由桑白皮45-55份，覆盆子25-35份和积雪草10-30份组成的；
步骤二、加药材量12-14倍的水，湿法球磨20-25min；
步骤三、在300-500 Mpa的压力下提取3-5min；
步骤四、离心分别得到固相药渣以及水提液；
步骤五、水提液经膜浓缩至药材投料量的1.2-1.4倍，然后加入醇试剂，配至醇浓度达到70-80%，搅拌10-15min后，离心，分别得到含多糖的固体及水-醇混合提取液；
步骤六、将离心得到的含多糖的固体加水溶解至药材重量的1.2-1.4倍，使用相应的内生真菌发酵，得到多糖发酵液；
步骤七、取步骤四中的固相药渣，以及步骤六中的多糖发酵液加入步骤五中的水-醇混合提取液内，在300-500 MP的压力下提取3-5min，得到提取液；
步骤八、对步骤七中得到的提取液进行离心、膜过滤处理或者离心、膜浓缩、冻干处理。
2.一种植物美白天然活性复配组合物的制备方法，其特征在于，包括如下操作步骤：
步骤一、按照重量份数，药材的B组分主要是由桑白皮50-60份，牡丹皮15-25份和积雪草15-35份组成的；
步骤二、加药材量12-14倍的水，湿法球磨20-25min；
步骤三、在300-500 Mpa的压力下提取3-5min；
步骤四、离心分别得到固相药渣以及水提液；
步骤五、水提液经膜浓缩至药材投料量的1.2-1.4倍，然后加入醇试剂，配至醇浓度达到70-80%，搅拌10-15min后，离心，分别得到含多糖的固体及水-醇混合提取液；
步骤六、将离心得到的含多糖的固体加水溶解至药材重量的1.2-1.4倍，使用相应的内生真菌发酵，得到多糖发酵液；
步骤七、取步骤四中的固相药渣，以及步骤六中的多糖发酵液加入步骤五中的水-醇混合提取液内，在300-500 MP的压力下提取3-5min，得到提取液；
步骤八、对步骤七中得到的提取液进行离心、膜过滤处理或者离心、膜浓缩、冻干处理。
3.根据权利要求1或2所述的一种植物美白天然活性复配组合物的制备方法，其特征在于，在步骤五中，所述醇试剂选自丙二醇和丁二醇的混合液，乙醇，丙二醇和丁二醇中的一种。
4.根据权利要求3所述的一种植物美白天然活性复配组合物的制备方法，其特征在于，步骤五中，当所述醇试剂选用乙醇时，在步骤八中，需对步骤七中得到的提取液进行离心、膜浓缩至药材投料量1.6-1.8倍；浓缩液经冷冻干燥后得到提取物粉末。
5.根据权利要求1所述的一种植物美白天然活性复配组合物的制备方法，其特征在于，在步骤六中，所述内生真菌的制备方法如下：
将药材的A组方桑白皮，覆盆子，积雪草，药材的B组方桑白皮、牡丹皮、积雪草的新鲜药材，用纯水洗净后，使用75°乙醇浸泡30秒，再以4%次氯酸钠浸泡30秒，取出后立即用无菌纯水冲洗，于超净台沥干后，用灭菌手术刀将药材切成薄片后，一起放入PDA培养基中培养内生真菌，25℃培养箱中培养7天，每天观察培养皿中真菌生长状况，有新的菌丝生长出来时，挑取菌丝接入新的培养皿中培养，继续纯化，获得纯化后的内生真菌的菌种。
6.根据权利要求5所述的一种植物美白天然活性复配组合物的制备方法，其特征在于，在步骤六中使用的内生真菌，筛选阶段使用的发酵液的制备方法如下：
以水为溶剂，使用湿法研磨对A组方或B组方进行处理后，用超高压提取设备进行提取，得到的提取液浓缩至药材重量的1.2倍，加入乙醇配至80°的醇，醇沉产物于40℃回收溶剂干燥；
将培养出的内生真菌的菌种分别接入装有1000mLPDA液体培养基的2000mL锥形瓶中，分别加入A、B两组的醇沉产物，摇床发酵14天，获得发酵液。
7.根据权利要求6所述的一种植物美白天然活性复配组合物的制备方法，其特征在于，在步骤六中使用的内生真菌，其筛选方法，及发酵步骤营养源的制备方法如下：
发酵液使用超高压提取设备灭菌后，滤去沉淀，将发酵产物送分析检测，将多糖完全转化为低聚糖的小组，送安全与功效评价筛选，从无皮肤刺激的组别中挑出黑素细胞抑制效果最优的组，其对应A组方真菌菌株S18，B组方真菌菌株S33，并将其用作后续发酵，同时以这两组混合真菌的灭活废菌丝体作为发酵的营养源。
8.根据权利要求1所述的一种植物美白天然活性复配组合物的制备方法，其特征在于，在步骤九中，冷冻干燥的条件是：-40℃预冷12小时，抽真空至10Pa，然后干燥温度由-40℃升至20℃，每隔15℃保温1h。
9.一种植物美白天然活性复配组合物，其特征在于，采用权利要求1-8中任意一项所述的一种植物美白天然活性复配组合物的制备方法制备得到。
10.一种根据权利要求9所述的一种植物美白天然活性复配组合物在乳剂、水剂、精华、膏霜领域中的应用。
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