CN111811983A

CN111811983A - 石英晶体剪切振动调幅调频甩脱法生物传感检测

Info

Publication number: CN111811983A
Application number: CN202010569955.4A
Authority: CN
Inventors: 司士辉; 张润; 万富; 扶梅; 冯浪霞; 余建芳
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2020-06-24
Filing date: 2020-06-24
Publication date: 2020-10-23

Abstract

本发明提出一种质量负荷减量法石英晶体微天平生物传感方法。将生物分子探针（例如抗体，单链DNA）修饰到石英晶体上，将检测溶液（例如致病细菌、待检测的DNA分子等）加到传感器表面，采用直接数字频率合成（DDS）技术研制一种频谱扫描系统，按照预定频率和正弦波振幅对石英晶体振子进行扫描激励；基于超外差接收正交相敏检波技术构建一种石英晶体频率信号采集分析系统，绘制出QCM响应信号幅频及相频特性曲线。通过QCM响应信号图谱实现质量负荷减量法石英晶体微天平生物传感。该方法实现在检测液中原位得到检测信号，直接采用石英晶体微天平进行生物传感检测，对于医学即时检测以及现场快速检测具有重要应用价值。

Description

石英晶体剪切振动调幅调频甩脱法生物传感检测

技术领域

本发明是一种新型生物传感器，属于分析化学领域中的仪器检测，涉及传感检测技术领域，尤其涉及质量负荷减量法石英晶体微天平生物传感方法。通过石英晶体剪切振动调幅调频甩脱法进行生物监测，调节不同的激励电压使晶体振动幅度不同继而甩脱掉表面的检测目标，从而实现定量检测或者定性检测。该技术操作简单，具有生物样品无需任何标记、检测时间短、检测灵敏度高等优点，并且还能够实现在线、实时连续检测，可广泛地应用于生命科学研究、药物筛选、环境检测、食品检测等多个领域。

背景技术

近年来，随着生物医学科技突飞猛进对现代生物检测技术的发展提出了更高的要求。在免疫反应，病毒检测，食品安全以及突发性生化恐怖事件等实时、快速检测领域，目前使用的生物化学检测手段，需要几小时到几天的检测周期，成本较高且操作复杂，可能会造成经济效益损失。以AT切型剪切振动石英晶振作为传感元件的石英晶体微天平技术（quartz crystal microbalance，QCM）是直接在纳克级精确测量物质质量的仪器。QCM仪器价格便宜，操作都很简单，具有生物样品无需任何标记、检测灵敏度高、检测时间短、可在线实时连续检测等优点。QCM传感技术被广泛地应用于疾病诊断、药物检测、环境检测、食品检测等多个领域。

QCM主要由石英晶体传感器、信号检测和数据处理等部分组成。石英晶体传感器是由一块石英晶体上沿着与石英晶体主光轴成35°15'切割即AT切型得到的石英晶体振荡片，在它的两个对应面上真空蒸镀金层或银层作为电极，石英晶体夹在两片电极中间形成三明治结构。在每个电极上各焊一根引线接到管脚上。目前石英晶体传感进行生物检测时，通常将生物分子探针（例如抗体，单链DNA）修饰到石英晶体金属电极上，检测溶液（例如致病细菌、待检测的DNA分子等）滴上晶体表面或者从传感器表面流淌，修饰的分子探针与靶向待测物发生结合，从而产生频率变化信号，但是实际检测的生物大分子间作用力较弱，活性结合位点有限，这将使得检测过程时间长，耗费的检测溶液多，会增加生物检测成本，增加检测时间。目前石英晶体微天平传感器对分析目标物检测响应信号通常基于表面质量负荷增加导致的频率信号下降，谐振频率下降的差值（频率变化值，频移数值）在一定范围内与分析目标物的浓度具有线性相关性。测定过程是在气相中干燥条件下测定英晶体微天平表面分子探针与目标物结合前后的频率变化值，或者在磷酸盐缓存溶液中测定测定英晶体微天平表面分子探针与目标物结合前后的频率变化。通常石英晶振一般是由圆形AT切石英晶片和在晶片上下表面镀上两个同心圆形金属电极构成，金属通常为金、银、铝等材料。在溶液中使用时通常是镀金电极，厚度至少20nm (为了增加金电极的附着性通常预先真空蒸镀2nm厚的铬或钛层)，电极金属镀层降低了石英晶片谐振品质因子，也制约了高频QCM在溶液中的使用，通常使用的QCM基频在10MHz以下。

目前驱动QCM振动并采集其输出信号的方法主要有两种: 振荡电路方法，频谱分析方法。振荡电路方法是将QCM接入自激振荡电路中，使其构成固频元件，电路的振荡频率等于QCM的谐振频率，通过测量电路振荡频率的变化，便可得到QCM谐振频率的变化。这种自激振荡电路方法只能测量唯一参数串联谐振频率，在大阻尼待测溶液中易于发生停振。国内外的很多学者做了大量研究，设计了多种适用于QCM在液态条件下工作的振荡电路，如：射极耦合振荡电路、杠杆振荡电路(lever oscillator)、标准桥式振荡电路、主动桥式振荡电路(active bridge oscillator)以及平衡桥式电路为代表，这些电路都是基于自激振荡的原理,满足相位平衡条件和幅度平衡条件。频谱分析方法是扫描QCM在其谐振频率附近一段频率范围内的频谱(QCM等效阻抗的幅频和相频特性)，通过该频谱可得到QCM的谐振频率、品质因子等参数。

生物传感器的基本原理主要是利用特异性识别，特异性识别也是酶-配体和抗体-抗原相互作用的基础。多为非共价相互作用（例如氢键和疏水相互作用）产生分子识别，即多弱相互作用结合在一起形成强的特异性键。当两个分子各自具有拓扑和化学互补的表面时，弱的和局部的相互作用才会形成总的强键。在适宜条件下抗体和目标抗原之间就会形成强键。此外，抗体和非特异性抗原或蛋白质也可能形成较弱的键。这些较弱的非特异性键合会影响QCM的常规检测精度。一方面，传感器上额外增加的质量会导致频率偏移，这就无法通过目标抗原的响应来区分；另一方面，非特异性结合占据了结合位点，减少了目标抗原与抗体的结合。

通过用压电声波装置（压电石英晶体））剪切振动表面惯性质量的变化来测量键断裂，基于以单调增加的幅度振动表面（带有非共价键结合生物大分子或病毒微粒的表面），从而产生加速度。并以其多次谐波模式运行，提高晶体振动频率，当加速度的变化产生的离心力大于剪切振动石英体表面生物物质间非共价键结合力，键断裂产生的频率变化和电噪声。测量键断裂方法已用于功能化和自组装单层（SAM）高度特异性识别生物分子之间的相互作用，例如抗体及其抗原。迄今为止，还没有任何关于键断裂方法定量检测的研究。键断裂技术需要注意生物传感器的固定，再生，亲和力和特异性。诊断学中最具挑战性的问题之一是区分特异性结合与非特异性结合，在检测过程中非特异性结合会产生较大的误差，键断裂方法可以区分特异性结合和非特异性结合可以解决误差问题，而且键断裂方法不需要再生程序，操作更加简便，检测时间也大大缩短提高了效率。

在本项发明中，提出了通过石英晶体共振产生机械位移引入能量导致键断裂，扫描断键过程来表征键的结合与断裂，即质量负荷减量法。可使结合的颗粒从表面上摇晃掉，将键的断裂信号检测为电子噪声信号和频率信号。键断裂扫描的方法可以作为一种有前景的诊断工具，通过测量破坏所需键能的特征水平来研究固定化生物分子表面上细菌或病毒的各种相互作用。石英晶体传感进行生物检测时，将生物分子探针（例如抗体，单链DNA）修饰到石英晶体上，将检测溶液（例如致病细菌、待检测的DNA分子等）加到传感器表面，修饰的分子探针与靶向待测物发生结合，生物分子间亲和作用过程完成后，采用直接数字频率合成（DDS）技术研制一种频谱扫描系统，按照预定频率和正弦波振幅对石英晶体振子进行扫描激励；为了提高接收线圈中石英晶体产生的电磁信号信噪比，基于超外差接收正交相敏检波技术构建一种石英晶体频率信号采集分析系统，PC机将接收到的所有频率点上的信号值，绘制出QCM响应信号幅频及相频特性曲线。结合在石英晶体表面的物质随着剪切振动的石英晶体发生振动，随着石英晶体振动频率增加和振幅增大，结合在石英晶体表面的物质会被甩脱，结合力弱的非特异吸附物质先被甩脱掉，结合力强的特异性目标物质后被甩脱掉，通过QCM响应信号图谱实现质量负荷减量法石英晶体微天平生物传感。键断裂方法（质量负荷减量法）其主要优点是快速简单，且能够区分特定的相互作用和非特定的相互作用，而特异性和非特异性键的分离对于在现实生活中的复杂样品（例如血液）中工作非常重要，可在检测液中原位得到检测信号，例如血液以及实际样本中许多非特异吸附物质干扰目标物检测时，不需要反复地洗脱这些干扰物，可以直接采用石英晶体微天平进行生物传感检测，对于医学即时检测以及现场快速检测具有重要应用价值。键断裂技术既可以提供定性结果（目标的检测），又可以提供定量结果（目标的浓度）。而且是通过无标记方法实现的，不需要对分析物进行预处理。石英晶体剪切振动调幅调频甩脱法生物传感检测可发展多种基于QCM的免疫传感检测，可广泛应用于实验室测试，医学诊断，药物发现和研究以及其他应用包括环境，食品和农业监控等诸多领域。

石英晶体微天平的质量负荷减少传感原理

石英晶体是非各向同性材料，生物传感器中的石英芯片，均有一定的切型。不同切型的石英芯片，其物理特性如压电特性、温度特性、弹性特性也均不相同。石英晶体常见的模式有伸缩振动模式、弯曲振动模式、面切变振动模式和厚度切变振动模式等。AT切型石英晶体的频率范围是500 KHz到350 MHz，是所有切型中频率上限最高的。当石英晶体在外加的交变电场作用下会产生剪切机械振荡，在晶体内部原子重新排列从而产生机械声波，这种机械波对于石英晶体来说是一种厚度剪切模式声波。石英晶振在基频下产生谐振时，机械波的波长等于晶体厚度的2倍，此时石英晶体的基频谐振频率为

其中f _o为石英晶体的基频，ν为声波在晶振中的传播速率，ρ_q为石英晶振的密度，μ_q为石英晶振的压电剪切模量。当石英晶振表面附着物的质量远小于石英晶振本身的质量时，Sauebrey方程描述了石英晶振谐振频率变化量与其表面质量负载变化之间的关系。AT切型石英晶体具有品质因数高、频率稳定性好等优点，因此市场上得到了广泛应用。本设计采用的正是AT切型石英晶体。AT切割石英晶体的基频频率通常都限制在20 MHz以内，因为此时晶体的厚度只有0.041 mm。如果晶体的基频继续增加，则厚度越薄，最终导致晶体强度不够容易断裂。因此，若要求QCM工作在更高的频率时，一般采用泛音方式提高基频。

对于键断裂传感器，需要测量谐振频率，以便在谐振时驱动QCM，以实现最大位移。已使用的QCM位移的近似值为2003年库珀提出的QCM位移幅度为A=CQVd，其中C=1.4×10^-12是实验确定的常数，Q是QCM品质因数（Q因数），Vd是驱动电压。Q因数在粘度低的液体与QCM振幅为线性关系。QCM振幅在电极中心处最高，而在边缘处消失，这已通过实验和建模得到证实，所得的振幅分布近似为高斯分布。QCM的工作频率会影响施加在键上的力，为了增加QCM的基本频率，需要减小厚度，从而使晶体比较脆弱。QCM可以在基频的奇次谐波下运行，随着谐波次数的增加，电极的位移越来越局限于电极中心。QCM中心的峰值位移与谐波阶次的平方成反比。故本发明在检测时采用3，5，7次泛音谐波下进行以提高晶体工作频率，提高检测灵敏度。键上的力来自晶体表面和附着颗粒的相对运动。颗粒的加速度以及因此作用在键上的力将取决于多种因素，包括附着的颗粒的质量，其大小和形状以及键的性质。对于大小可观的粒子（例如微珠），可能会形成数千个键。库珀等提出了石英晶体表面和球形颗粒之间的结合力模型。而实际上，分析物可能比微珠小得多，既不是球形，也不是对称的。粒子在枢轴点处绑定到表面，并假定围绕该点滚动。库珀的模型预测，作用在键上的力为F=27mA(2πf)²其中F是作用在键上的力（N），m是颗粒的质量（kg），A是中心位置与枢轴点的最大位移，f是表面振荡的频率（Hz）。该模型忽略了键本身的作用，会增加额外的阻力。估计表明，每个球体在破裂时需要大约10μN的力，石英晶体驱动振幅产生的力足以使它们破裂。

QCM电极的振荡导致了SAM自组装层的振荡。SAM近似为刚性单层，附着在电极的表面。当QCM振荡时，SAM与附着的抗原、抗体的往返运动产生了方向相反的力，该力施加在了抗原一抗体形成的强键上。这个力的大小取决于若干因素，如粘度、驱动频率和驱动振幅。当这个力超过键强度时，就会使键断裂。由于键强度的不同而产生的力相同就能区分强健和弱键，即区分特异性结合和非特异性结合。当施加一组线性增加的电压至QCM上时，非特异性结合、特异性结合以及化学键会依此断裂。通过调节激励电压，使驱动电压和频率不同，导致产生的力大小不同，采用特定的激励电压就能实现对目标检测物的定性分析。在晶体表面修饰上容易甩脱的自组装层，经过不同浓度抗原抗体免疫反应或者夹心式免疫反应后，通过晶体振动导致自主装层甩脱或者夹心层的某部分被甩脱，在甩脱瞬间晶体表面上的质量减少，这时可捕捉到减量的噪声信号和频率信号，就可实现检测物的定量分析。因此，QCM甩脱减量技术可应用于包括病毒、细菌等生物物质的实时检测、痕量分析，免疫反应中抗原或抗体的鉴别，以及生物分子间相互作用研究等。

发明内容

石英晶体剪切振动调幅调频甩脱法生物传感系统

石英晶体微天平扫频激励系统系统

本发明采用的无极石英晶体微天平测频系统框图如图1所示，主要由 PC计算机控制与信号显示，arduino单片机控制AD9959 DDS信号源，石英晶体传感器（4），信号调理电路和幅值相位检测以及电源模块等。系统通过arduino 单片机给DDS写入程序以产生扫频信号，扫频信号一路施加到溶液一个与石英晶体正对的铂金电极上，激励电极与无极石英晶体的距离1mm，一路直接输出，两路信号经过信号调理电路后，被送入幅度和相位检测单元AD8302，单片机利用片内A/D对AD8302的输出信号进行检测，串口通讯模块将处理结果发送到上位机，上位机进行下一步处理并显示结果。

石英晶体微天平测试系统硬件电路主要由以下四个部分组成:

1) arduino单片机模块

arduino单片机模块电路主要功能是通过串口控制信号源的频率输出以及对检测模块输出的电压信号进行A/D采集、计算、滤波，最后又通过串口将数据上传到上位机进行下一步的处理。通过arduino单片机设置程序输出不同的电压，从而实现调幅调频。

2)信号源电路模块

信号源电路模块包括信号发生和调理两大模块。信号发生器以AD9959为核心，以标准的20MHz的晶振作为参考频率源，通过微控制器控制DDS输出不同频率的激励信号。因为AD9959输出的信号是微弱的电流信号且含有噪声，所以在激励信号作用于石英晶体前还需要通过电流电压转换电路，低通滤波电路等对DDS的输出进行处理。信号调理主要是对参考信号以及通过石英晶体后的测量信号进行进一步的放大和滤波等以满足后期信号检测模块的要求。

3)信号检测模块

检测模块主要是对参考信号和测量信号的输出幅值、相位进行检测，DDS系统的核心是相位累加器，它由一个相位寄存器和一个加法器组成，当时钟脉冲关的上升沿来临时，相位寄存器以固定步长增加，相位寄存器的输出与相位控制字相加，然后输入到波形存储器的地址上。外部指令FSW的改变控制相位增量的大小。一旦给定了相位增量，输出频率就确定了。波形存储器把输入的地址相位信息映射成正弦波幅度的数字量信号，驱动DAC输出模拟量。低通滤波器做进一步的平滑处理并滤掉杂散频率得到的所需的信号波形AD9850与AD9851缺少可调节的倍频功能，要产生较高的频率输出，不适合采用高精度恒温晶振作为DDS输入源信号，这样输出必然会产生大的误差。由于AD9959输出DAC位数较高，可以使输出的频率更光滑，相位噪声更小。考虑到QCM系统的设计需要，选用了ADI公司的DDS芯片AD9959作为DDS信号发生器，可输出200MHz以下的正弦频率信号。本文采用幅度和相位测量芯片AD8302对两路输出信号的幅值比和相位差进行测量。

4)电源模块

电源系统为整个测量系统的提供电源，各个模块所需电源电压不同，需要合理的分配电源以及对电源进行优化设计。

石英晶体片处理

QCM调幅调频免疫传感器使用的是8MHz和10MHz，AT型切割的石英晶体，该石英晶体的两面都涂覆有金盘形膜（厚度为100 nm），该膜通过金属气相沉积沉积在铬底层（厚度为10nm）上。晶体用1.0M NaOH预处理20分钟，用1.0M HCl 预处理5分钟，用Piranha(浓硫酸:双氧水=3:1)蚀刻溶液预处理5分钟，以获得干净且高度疏水的金表面。每次预处理后，依次用乙醇和水冲洗晶体，并在氮气流中干燥。将清洗后的晶体在室温下浸入15m12-巯基十二烷酸的乙醇溶液中4小时，在金表面形成自组装单层。在此过程中，巯基通过 Au-S键与金底物反应。用乙醇和水冲洗后，在室温下依次用15mM NHS和110mM EDC水溶液处理晶体2 h，通过典型的碳二亚胺偶联方法制备的改性晶体表面容易与蛋白质反应。

石英晶体的表面的生物探针修饰

将所得修饰好的晶体进一步在4°C下浸入IgG抗体溶液中过夜。用pH 7.4的PBS冲洗除去过量的抗体。最后，将IgG抗体修饰的QCM晶体在37 °C下用3.0 wt％BSA-PBS处理60分钟，以封闭未反应的位点，并洗涤以备后用。

生物传感检测

(1)动态检测

本发明动态检测采用检测池结构如图2所示，将一个直径8mm的中间电极直径5mm的10MHz石英晶体固定在一个圆形检测池底部，电极周边用防水胶圈密封，上方留两个小孔连接外部液体，用流动注射泵注射液体，整个检测池进行温度恒温控制在温度37度。以10μl/min的速率注射pH=7.2的磷酸缓冲液流过石英晶体上方，测定初始谐振频率。检测时将一定体积恒温加热至37度的不同浓度的IgG溶液从上方注射流动到检测石英晶体上，调节底部液体流出阀门，控制流速，让检测液体缓慢的流淌穿过石英晶体，控制反应时间15分钟，完成检测反应过程后，关闭液体流出阀，测定反应后谐振频率。调节0.02V-20V范围内的激励电压，使晶体表面振动浮动不同，当发生频率大幅度增加时，此时发生键断裂，测定此时的谐振频率，同时可以的到键断裂过程频率动态变化的图谱，反应后的初始谐振频率减去目标检测物甩脱时的谐振频率便是石英晶体传感信号，用标准已知浓度的检测物溶液建立一个相关校正方程便可测定未知待测物浓度。由实验结果可知，自组装层大概在17V电压左右达到频差最大值。

（2）静态检测

静态检测无流动注射的动态，而是采用滴加方式进行检测。为了稳定溶液中的振荡频率，将8MHz石英晶体用两个用四个螺钉压在一起的O形环密封，并用有弹性的塑料垫圈上下固定密封。检测池上方留出圆柱形凹槽，以方便加入检测溶液，晶体一面被密封，另一面面向凹槽。把50μl不同的10mg/ml蛋白质溶液（BSA、溶菌酶、IgG、蛋白质A等）分别滴入自组装层修饰好的QCM晶体上，设置激励电压为15V，利用程序设置激励时间为60s，然后停止激励180s，先测定未激励时的谐振频率，一般为稍向下倾斜的近似直线，当激励时不记录频率，停止激励后记录频率，由此可以得到如图3所示的图谱，由图可以得到停止激励时抗原抗体会重新结合达到平衡，检测不同的蛋白时其到达平衡的时间不同，频率也不相同由此可以利用不同的元素用主成分分析法构建图谱以实现定性检测。静态检测无需拆卸晶体，可重复使用再生率高，较动态检测更为方便。

本发明具有如下技术特点

1.本发明采用AT切型8MHz石英晶体作为传感元件，通过调节激励电压的大小而实现调幅调频，当QCM振荡时，附着的抗原、抗体的往返运动产生了方向相反的力，该力施加在了抗原一抗体形成的强键上。当这个力超过键强度时，就会使键断裂。与石英晶体以往免疫传感器不同，不是通过增量检测而是质量负荷减量法，通过甩脱附着物导致频率或电噪声发生变化，从而实现定量分析和定性分析。

2.检测液体过孔流淌而不是传统平流方式，生物大分子间可以密切有效相互作用，大大减少试样体积，缩短检测时间。

3.采用动态检测，将检测池与流动注射系统连用，通过调节电压使键断裂，控制免疫反应时间15分钟，完成检测反应过程后，关闭液体流出阀，测定反应后谐振频率。将激励电压施加在晶体上，使晶体表面振动，当发生频率大幅度增加时，此时发生键断裂，测定此时的谐振频率，同时可以的到键断裂过程频率动态变化的图谱。反应后的初始谐振频率减去目标检测物被甩脱时的谐振频率便得到石英晶体传感信号。

4.本发明的静态检测，采用滴加方式进样，设置激励电压为15V，利用程序设置激励时间为60s，然后停止激励180s，先测定未激励时的谐振频率，一般为稍向下倾斜的近似直线，当激励时不记录频率，停止激励后记录频率，得到时间频率图谱，检测不同的蛋白时其到达平衡的时间不同，频率也不相同由此可以利用不同的元素用主成分分析法构建图谱以实现定性检测。不需要再生程序，操作更加简便，检测时间也大大缩短提高了效率。

5.本发明的静态检测方式，检测液体积可低至10微升，可以实现单滴检测。

6.采用直接数字频率合成（DDS）技术研制一种频谱扫描系统，按照预定频率和正弦波振幅对石英晶体振子进行扫描激励；为了提高接收线圈中石英晶体产生的电磁信号信噪比，基于超外差接收正交相敏检波技术构建一种石英晶体频率信号采集分析系统，PC机将接收到的所有频率点上的信号值，绘制出QCM响应信号幅频及相频特性曲线。通过QCM响应信号图谱实现质量负荷减量法石英晶体微天平生物传感。

7.为了提高信噪比实现无极石英晶体的稳定振荡，采用在石英晶体边缘区真空蒸镀一层金属电极，该电极作为反馈电极连接一个10千欧电阻后接入线路接地端。

附图说明

附图1石英集体谐振频率检测系统包括 PC计算机（1），arduino单片机（2），AD9959DDS信号源（3），石英晶体传感器（4），信号调理电路（5），信号调理电路（6），幅值相位检测（7），AD转换（8），电源模块（9）。

附图2调幅调频动态检测石英晶体检测池包括石英晶体表面金电极（1），石密封胶圈（2），AT切型石英晶体（3），温度控制系统的加热模块（4），温度控制系统的温度传感器（5），液体流出口控制阀（6）。

附图3 初始基频（1），60s激励后180s的频率曲线（2），检测频率（3），检测时间（4）。

具体实施方式

实施例1 溶菌酶适配体测定溶菌酶，将一个直径8毫米的中间直径5毫米裸石英晶体固定在一个圆形检测池底部，距离石英晶体裸露背面1毫米放置一个金属激励电极，电极周边用防水胶密封，整个检测池进行温度恒温控制在温度37度。用无水乙醇清洗晶体表面，用1mg/ml带硫醇的溶菌酶适配体PBS溶液在4℃下处理过夜后，然后用PBS溶液洗去未固定的溶菌酶适配体，最后用1mg/ml的牛血清蛋白封闭。开始前用流动注射泵在石英晶体上方通入pH=7.2的磷酸缓冲液，测定一次初始谐振频率。检测时将10mg/ml的溶菌酶PBS溶液以10μl/min的流速流过修饰有适体的晶体表面，调节底部液体流出阀门，控制流速，控制反应时间15分钟，完成检测反应过程后。关闭液体流出阀。测定反应后谐振频率。调节0.02V-20V范围内的激励电压，使晶体表面振动浮动不同，当发生频率大幅度增加时，此时发生键断裂，测定此时的谐振频率，同时可以的到键断裂过程频率动态变化的图谱，反应后的初始谐振频率减去甩脱溶菌酶时的谐振频率便是石英晶体传感信号反应前的初始谐振频率减去反应后的谐振频率便是石英晶体传感信号，测得响应频率变化值200Hz，5次测定相对偏差小于9%。

实施例2 IgG的测定，将清洗后的晶体在室温下浸入15m12-巯基十二烷酸的乙醇溶液中4小时，在金表面形成自组装单层。在此过程中，巯基通过 Au-S键与金底物反应。用乙醇和水冲洗后，在室温下依次用15mM NHS和110mM EDC水溶液处理晶体2 h。将一个直径8mm，中间电极直径5mm预处理好的石英晶体固定在一个圆形检测池底部，电极周边用防水胶圈密封，上方留两个小孔连接外部液体，用流动注射泵注射液体，整个检测池进行温度恒温控制在温度37度。以10μl/min的速率注射pH=7.2的磷酸缓冲液流过石英晶体上方，测定初始谐振频率。检测时将一定体积恒温加热至37度的不同浓度的IgG溶液从上方注射流动到检测石英晶体上，调节底部液体流出阀门，控制流速，让检测液体缓慢的流淌穿过石英晶体，控制反应时间15分钟，完成检测反应过程后，关闭液体流出阀，测定反应后谐振频率。调节0.02V-20V范围内的激励电压，使晶体表面振动浮动不同，当发生频率大幅度增加时，此时发生键断裂，测定此时的谐振频率，同时可以的到键断裂过程频率动态变化的图谱，反应后的初始谐振频率减去IgG被甩脱时的谐振频率便是石英晶体传感信号，用标准已知浓度的检测物溶液建立一个相关校正方程便可测定未知待测物浓度。由实验结果可知，自组装层大概在5V电压左右达到频差最大值。测得响应频率变化值150Hz，5次测定相对偏差小于9%。

实施例3 将石英晶体用两个用四个螺钉压在一起的O形环密封，并用有弹性的塑料垫圈上下固定密封。检测池上方留出圆柱形凹槽，以方便加入检测溶液，晶体一面被密封，另一面面向凹槽。把50μl不同的10mg/ml蛋白质溶液（BSA、溶菌酶、IgG、蛋白质A等）分别滴入自组装层修饰好的QCM晶体上，设置激励电压为15V，利用程序设置激励时间为60s，然后停止激励180s，先测定未激励时的谐振频率，一般为稍向下倾斜的近似直线，当激励时不记录频率，停止激励后记录频率，由此可以得到频率时间图谱，由图可以得到停止激励时抗原抗体会重新结合达到平衡，检测不同的蛋白时其到达平衡的时间不同，频率也不相同由此可以利用不同的元素用主成分分析法构建图谱以实现定性检测。其中BSA平衡时的频率为7995270Hz，溶菌酶平衡时频率为7993970Hz，蛋白质A平衡时频率为79955310Hz，5次测量相对偏差在几十Hz以内，可通过不同蛋白的平衡时频率实现定性分析。

实施例4 将石英晶体用两个用四个螺钉压在一起的O形环密封，并用有弹性的塑料垫圈上下固定密封。检测池上方留出圆柱形凹槽，以方便加入检测溶液，晶体一面被密封，另一面面向凹槽。分别滴加入100μl1%、3%、5%、10%、12.5%、25%的丙三醇溶液，设置激励电压为15V，利用程序设置激励时间为60s，然后停止激励180s，先测定未激励时的谐振频率，一般近似直线，当激励时不记录频率，停止激励后记录频率，由此可以得到频率时间图谱。记录激励10次后的频率，1%-12.5%的频率-浓度曲线呈较好的线性相关，其线性方程为y=-259.2x+5176.4，相关系数R²=0.9528。

Claims

1.本发明建立了一种石英晶体剪切振动调幅调频甩脱法生物传感检测方法，其技术特征在于通过调节激励电压的大小而实现调幅调频，当QCM振荡时，附着的抗原、抗体的往返运动产生了方向相反的力，该力施加在了抗原一抗体形成的强键上；当这个力超过键强度时，就会使键断裂；与石英晶体以往免疫传感器不同，不是通过增量检测而是质量负荷减量法，通过甩脱附着物导致频率或电噪声发生变化，从而实现定量分析和定性分析。

2.根据权利要求1所述构建了石英晶体剪切振动调幅调频甩脱法生物传感系统，采用直接数字频率合成（DDS）技术研制一种频谱扫描系统，按照预定频率和正弦波振幅对石英晶体振子进行扫描激励；为了提高接收线圈中石英晶体产生的电磁信号信噪比，基于超外差接收正交相敏检波技术构建一种石英晶体频率信号采集分析系统，PC机将接收到的所有频率点上的信号值，绘制出QCM响应信号幅频及相频特性曲线；通过QCM响应信号图谱实现质量负荷减量法石英晶体微天平生物传感。

3.根据权利要求1所述调幅调频QCM传感器，检测液体过孔流淌而不是传统平流方式，生物大分子间可以密切有效相互作用，大大减少试样体积，缩短检测时间。

4.根据权利要求1所述调幅调频QCM传感器，采用动态检测，将检测池与流动注射系统连用，通过调节电压使键断裂，控制免疫反应时间15分钟，完成检测反应过程后，关闭液体流出阀，测定反应后谐振频率；将激励电压施加在晶体上，使晶体表面振动，当发生频率大幅度增加时，此时发生键断裂，测定此时的谐振频率，同时可以的到键断裂过程频率动态变化的图谱；反应后的初始谐振频率减去目标检测物被甩脱时的谐振频率便得到石英晶体传感信号。

5.根据权利要求1所述调幅调频QCM传感器，采用静态检测，采用滴加方式进样，设置激励电压为15V，利用程序设置激励时间为60s，然后停止激励180s，先测定未激励时的谐振频率，一般为稍向下倾斜的近似直线，当激励时不记录频率，停止激励后记录频率，得到时间频率图谱，检测不同的蛋白时其到达平衡的时间不同，频率也不相同由此可以利用不同的元素用主成分分析法构建图谱以实现定性检测；不需要再生程序，操作更加简便，检测时间也大大缩短提高了效率；静态检测溶液体积可低至10微升，可以实现单滴检测。

6.根据权利要求1所述调幅调频QCM传感器，为了提高信噪比实现无极石英晶体的稳定振荡，采用在石英晶体边缘区真空蒸镀一层金属电极，该电极作为反馈电极连接一个10千欧电阻后接入线路接地端。