CN111801024A - 具有肠溶性聚合物屏障的水溶性和脂溶性微量营养素稳定的颗粒 - Google Patents

具有肠溶性聚合物屏障的水溶性和脂溶性微量营养素稳定的颗粒 Download PDF

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Abstract

已经开发了含有一种或多种微量营养素的颗粒调配物，所述微量营养素如硫酸亚铁等铁补充剂、如维生素A、D和E等脂溶性或油溶性维生素、如维生素B族等水溶性维生素和其它微量营养素。这些调配物在加工、储存和烹饪过程中抗氧化和生物活性损失。所述颗粒包含一种或多种肠溶性聚合物，如pH敏感性聚合物。为了防止氧化，所述铁补充剂被如透明质酸(“HA”)等聚合物囊封或与如维生素C等化合物混合，优选地，铁:HA的比例介于1:4与1:10之间。然后，将所得混合物分散在肠溶性聚合物溶液中，并使用如喷雾干燥或旋转盘雾化成颗粒等技术制成颗粒。

Description

具有肠溶性聚合物屏障的水溶性和脂溶性微量营养素稳定的 颗粒
相关申请的交叉引用
本申请要求由Aaron Anselmo、Xian Xu、Wen Tang、Robert S.Langer和AnaJaklenec于2018年1月4日提交的美国临时申请第62/613,485号“稳定的维生素A和铁补充颗粒(STABLE VITAMIN A AND IRON SUPPLEMENTAL PARTICLES)”的权益，所述美国临时申请特此通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本发明属于热稳定颗粒微量营养素调配物领域，具体涉及喷雾干燥的维生素和铁颗粒微量营养素调配物。
背景技术
营养不良/微量营养素(MN)缺乏是发展中国家的一个严重问题，影响到近20亿人，并且每年造成多达200万儿童死亡。在发展中国家，MN缺乏与个体的各种疾病和残疾有关，这进而极大地影响一个地区的集体社会经济发展。
解决微量营养素缺乏的尝试包含补充和强化。补充可以在短时间内为特定个体提供更高剂量的微量营养素。然而，补充具有局限性(包含无法递送所有必需的微量营养素、忽视非目标群体中的个体)以及由于难以在不受控制的条件(湿热的仓库、较差的记录保存)下储存产品、难以分配补充剂和说服最终用户需要定期摄入而导致的低顺应性。
为了解决MN缺乏，已经针对6到24个月大的儿童使用了使用被调配成包含多达22种MN的MN粉末和基于脂质的营养补充剂(LNS)的家庭强化方法。大量研究表明，家庭强化计划可以成为改善MN状态和减少贫血的有效干预方法。
然而，广泛强化代表着巨大的技术挑战，因为大多数非侵入性口服给药方法都存在感官和吸收问题。例如，这些强化方法没有考虑或解决这些产品的最终使用，如烹饪过程中的MN降解、储存过程中的MN降解，或由于添加感官可检测水平的MN和/或密封剂而产生的味道问题。除了技术挑战之外，这些计划还受到社会和经济限制，如覆盖范围有限、依从性问题和阻碍技术采用的文化问题。如此，能够减轻与用户最终使用和供应商合成相关的强化问题的技术可以改善世界范围的强化计划。
盐是一种普遍消费产品，并且因此具备向发展中国家的人们提供维生素和矿物质的潜力。强化盐，也称为碘盐，是与微量的各种含碘盐混合以防止碘缺乏的食盐(NaCl)。还开发了双强化盐，即含铁和碘的食盐。铁用硬脂酸进行微囊封(microencapsulate)，以防止其与盐中的碘反应。然而，在碘盐中添加铁因许多化学、技术和感官问题而变得复杂，包含铁在存在空气的情况下会被氧化的趋势。
如维生素A、D和E等脂溶性维生素在这些条件下的储存和分配尤其成问题。它们通常在几天内表现出生物活性的丧失，并且由于分子的油性性质而难以调配，从而导致结块。
其他人尝试过在如聚(甲基)丙烯酸酯等聚合物和食品添加剂中进行囊封(encapsulation)，但没有成功。参见例如“Eudragit EPO不适合铁强化，因为即使是低有效载荷也能阻止固体颗粒的形成(Eudragit EPO is unsuitable for iron fortification,as even low payloads prevented solid particles formation)。”Dueik,V.和Diosady,L.L.(2016),《食品加工工程杂志(Journal of Food Process Engineering)》doi：10.1111/jfpe.12376。
因此，本发明的一个目的是提供含有微量营养素的组合物及其制备和使用方法，所述组合物含有铁、油或脂溶性维生素(如维生素A、D和E等)、水溶性维生素(如B族维生素)和/或其它微量营养素。含有微量营养素的组合物在加工和储存过程中是稳定的。
本发明的另一目的是提供在食品制备和烹饪过程中稳定并且在胃肠道中的所需部位释放微量营养素的组合物及其制备和使用方法。
发明内容
为了解决与广泛的微量营养素(“MN”)强化相关的技术(例如，烹饪稳定性、储存稳定性、感官检测)和社会经济(例如，实施、依从性)挑战，已经开发了一种在储存和烹饪条件下增强各种水溶性和脂溶性MN的稳定性的MN递送技术。所述技术是一种pH响应性微粒递送系统，所述pH响应性微粒递送系统能够囊封多种不同的MN，包含水溶性和脂溶性微量营养素，并促进MN有效载荷在体内和体外酸性胃条件下的快速释放。已经使用此技术在临床试验中向人类成功地递送生物可利用铁。此外，还开发了一种使用可商购/特定大小的设备来按比例合成此递送系统的方法。
已经开发了含有铁补充剂(如硫酸亚铁)、脂溶性或油溶性维生素(如维生素A、D和E)和/或水溶性维生素(如B族维生素)的颗粒调配物。这些物质在加工过程中抗氧化和生物活性损失，并且耐潮湿和烹饪温度。所述颗粒包含肠溶性聚合物，如在限定的pH范围会降解或溶解以释放囊封的微量营养素的pH敏感性聚合物。优选的pH敏感性聚合物在低pH下溶解或降解，如pH 1-3，优选地pH 1-2，如在胃中所发现的。
为了防止氧化，铁补充剂或含有铁补充剂的铁颗粒被如透明质酸(“HA”)等保护性聚合物囊封，优选地铁:HA的比例介于1:4与1:10之间，或者与如维生素C等保护性化合物混合。然后，将所得混合物分散在肠溶性聚合物(如BASF公司作为
Figure BDA0002660121650000031
出售的聚(甲基)丙烯酸酯，优选地EPO)溶液中，并使用如喷雾干燥或旋转盘雾化等技术制成颗粒，所述颗粒的粒径通常为直径介于一微米与一毫米之间，优选地直径为约150微米。最终调配物的典型范围为：Fe：0.5-3.2％，HA：2.5-32％，以及EPO：97-64.8％。
为了制备含有一种或多种脂溶性维生素(如维生素A、D和维生素E)的稳定颗粒，将维生素溶解或分散在肠溶性聚合物溶液中，并且然后使用如喷雾干燥或旋转盘雾化进入粉末(如防止颗粒结块和变形的淀粉粉末)中等技术制成颗粒。
附图说明
图1A是用于合成水溶性MN-MP的两步乳化工艺的示意图。图1B是用于合成脂溶性MN-MP的一步乳化工艺的示意性表示。
图2A-2K是来自EPO-MP的11种不同的单独囊封的微量营养素在常温水(圆形)、100℃沸水(正方形)和37℃模拟胃液(“SGF”)(三角形)中的累积释放的图。图2A：维生素A；图2B：维生素D；图2C：维生素B2；图2D：维生素C；图2E：锌(ZnSO4)；图2F：碘(KIO3)；图2G：维生素B7(生物素)；图2H：维生素B3(烟酸)；图2I：维生素B9(叶酸)；图2J：维生素B12；图2K：铁(FeSO4)。误差条代表SD(n＝3)。
图3是来自HA-EPO MP的维生素B12在SGF(正方形)、pH 2HCl溶液(圆形)和pH 3HCl溶液(三角形)中的累积释放的图。误差条代表SD(n＝3)。
图4A和4B是示出暴露于(A)沸水和(B)光之后单独囊封的与未囊封的(游离)微量营养素的回收率(回收率％)的图。图4C是示出实验室规模的Fe-HA-EPO MP与未囊封的(游离)铁的颜色变化(ΔE)的时间历程的条形图，指示存在于香蕉牛奶中的铁与多酚之间的化学反应。图4D是示出暴露于沸水两小时之后囊封的(Fe-HA-EPO MP)与未囊封的(游离)铁的回收率(回收率％)的条形图。图4E是示出烘烤之后囊封的(Fe-HA-EPO MP)铁的回收率(回收率％)的条形图。误差条代表SD(n＝3)。“*”符号表示如通过学生t检验(student t-test)确定的统计显著性(p<0.05)。
图5A-5H涉及单个调配物中脂溶性和水溶性微量营养素的共囊封。图5A是用于在微粒中合成共囊封的水溶性维生素B9和维生素B12以及脂溶性维生素A和维生素D微量营养素的乳化工艺的示意性表示。
图5B-5D是维生素B12(圆形)、B9(正方形)、A(三角形)和D(倒三角形)在37℃模拟胃液(图5B)、常温水(图5C)和沸水(图5D)中的累积释放百分比的图。
图5E-5G是如通过HPLC测定的暴露于光之后囊封的和未囊封的脂溶性MN(图5E)、在水中沸腾两小时的脂溶性MN(图5F)、在水中沸腾两小时的水溶性MN(图5G)的微量营养素回收率百分比的条形图。图5H是如通过生物测定法测定的在水中沸腾两小时之后脂溶性和水溶性共囊封的MN的微量营养素回收率百分比的条形图。误差条代表SD(n＝3)。
图6A是示出对胃中囊封的染料、胃中释放的染料、肠中囊封的染料和肠中释放的染料的定量分析的条形图。误差条代表SD(n＝3)。图6B是示出口服管饲游离维生素A(“游离VitA”，圆形)或负载维生素A的EPO MP(“VitA-BMC”，正方形)后6小时时段内放射性标记的维生素A的血液含量(管饲剂量的百分比)的图。误差条代表SEM(n＝6)。
图7A和7B展示了人体内微粒囊封的铁的吸收。图7A是比较未烹饪的未囊封的铁(三角形)和未烹饪的负载铁的HA-EPO-MP(圆形)的相对铁吸收的图。图7B是示出比较未烹饪的负载铁的HA-EPO-MP(圆形)和经过烹饪的负载铁的HA-EPO-MP(正方形)的相对铁吸收的图。值代表几何平均值+/-SD(n＝20)。*表示如通过事后配对学生t检验和邦费罗尼(Bonferroni)校正确定的统计显著性。
图8A-8E涉及过程开发和按比例增加生产。图8A是示出用于按比例合成1kg的Fe-HA-EPO MP的工艺的示意图。图8B是示出在pH 1.5的37℃SGF(三角形)、常温水(圆形)和沸水(正方形)中从成比例的Fe-HA-EPO MP中进行的铁释放的图。图8C是示出在pH 1.5的37℃SGF(三角形)、常温水(圆形)和沸水(正方形)中从3.19％Fe-HA-EPO MP(“3.19％Fe-HA-BMC-MP”)中进行的铁释放的图。图8D是示出在pH 1.5的37℃SGF(三角形)、常温水(圆形)和沸水(正方形)中从18.29％Fe-HA-EPO MP(“18.29％Fe-HA-EPO MP”)中进行的铁释放的图。图8E是示出在60ppm Fe下与FeSO4和FePP(焦磷酸铁)相比食品基质(香蕉牛奶)中成比例的Fe-HA-EPO MP和其单独成分的感官性能的图。“BMC”是指EPO。相对于未强化的基质，绝对颜色变化ΔE±SD在120分钟时给出。水平线代表阈值，低于该阈值时则无法检测到ΔE。
图9A是示出在pH 1.5 37℃SGF(三角形)、常温水(圆形)和沸水(正方形)中从通过旋转盘雾化进入淀粉中制备的负载维生素的EPO MP(“VitA-EPO-淀粉”)中进行的维生素A释放的图。图9B是比较在水中沸腾两个小时之后在VitA-EPO-淀粉MP中囊封的维生素A或游离维生素A的回收率百分比的条形图。图9C-9G是示出来自四种不同调配物的维生素A在不同条件下的回收率百分比的条形图，所述条件包含：(1)40℃，75湿度(图9C)；(2)在室温下暴露于阳光下(图9D)；(3)在室温下悬浮于水中(图9E)；(4)在4℃下悬浮于水中(图9F)；以及(5)15℃，75％湿度(图9G)。这四种调配物是实验室规模的负载维生素A的EPO MP(“VitA-EPO”，圆形)、可商购的维生素A调配物(“BASF 250”，正方形)和按比例增加的负载维生素A的EPO MP(“VitA-EPO-淀粉”，三角形)以及游离维生素A(倒三角形)。
图10是示出通过挤压制备负载维生素A的EPO粉末的工作流程的示意图。
图11A示出了来自在人体中具有高负载的Fe-HA-EPO MP的铁的生物利用度。在摄入如FeSO4(圆形)、3.19％Fe-HA-EPO MP(正方形)和18.29％Fe-HA-EPO MP(三角形)的游离铁后，通过红细胞铁掺入评估年轻女性(n＝24)中的铁生物利用度。“BMC”是指EPO。所述值表示为摄入的总铁量的百分比。条形代表几何平均值(n＝24)和95％置信区间。*(p<0.05)或**(p<0.01)。膳食对铁吸收的显著影响由线性混合模型确定，参与者为随机截距，膳食为重复固定因子，并与邦费罗尼校正进行事后配对比较(p<0.05)。
图11B示出了在与其它EPO MP共同施用时来自3.19％Fe-HA-EPO MP的铁在人体中的生物利用度。在摄入3.19％Fe-HA-EPO MP(圆形)、具有VitA-EPO MP的3.19％Fe-HA-EPOMP(正方形)以及具有VitA-EPO MP和游离叶酸的3.19％Fe-HA-EPO MP后，通过红细胞铁掺入评估年轻女性(n＝24)中的铁生物利用度。“BMC”是指EPO。这些值表示为摄入的总铁量的百分比。条形代表几何平均值(n＝24)。膳食对铁吸收的显著影响由线性混合模型确定，参与者为随机截距，膳食为重复固定因子，并与邦费罗尼校正进行事后配对比较(p<0.05)。
图11C示出了具有单独和组合的每个MP成分的3.19％Fe-HA-EPO MP中铁吸收的比较。在摄入3.19％Fe-HA-EPO MP(圆形)、8.75％Fe-HA MP(正方形)、具有游离HA的游离铁(三角形)、具有游离EPO的游离铁(菱形)、具有游离HA和游离EPO的游离铁(星形)、游离铁(十字形)后，通过红细胞铁掺入评估年轻女性(n＝24)中的铁生物利用度。“BMC”是指EPO。这些值表示为摄入的总铁量的百分比。条形代表几何平均值(n＝24)和95％置信区间。膳食对铁吸收的显著影响由线性混合模型确定，参与者为随机截距，膳食为重复固定因子，并与邦费罗尼校正进行事后配对比较，*(p<0.05)或**(p<0.005)。
图12A和12B涉及在存在不同量的MP成分HA(图12A)和EPO(图12B)的情况下加入铁后跨人体体外肠屏障模型转运的铁，并表示为转运的游离铁的百分比。误差条代表SD(n＝3)。
具体实施方式
I.定义
如本文所使用的，“pH敏感性”通常是指溶解性质取决于pH的材料，如聚合物。
如本文所使用的，“非水溶性”意指如聚合物等材料不溶于pH 5以上的水溶液或缓冲液。
如本文所使用的，“水溶性”意指能够溶于水的材料，如维生素。水溶性维生素被运送到身体组织，但不储存在体内。所述水溶性维生素存在于动植物食品或膳食补充剂中，并且必须每天服用。维生素C和维生素B复合物的成员是水溶性的。
如本文所使用的，“脂溶性”意指能够溶于脂肪和油的材料，如维生素。脂溶性维生素在饮食中与脂肪一起被吸收，并且可以储存在身体的脂肪组织中。所述脂溶性维生素来自动植物食品或膳食补充剂。维生素A、D、E和K是脂溶性的。
如本文所使用的，“热稳定”通常意指材料在给定温度(如在食品制备和/或烹饪(例如，达到并包含沸腾)过程中遇到的温度)下在化学上和/或物理上稳定(例如，不降解)至少约十到二十分钟，例如，长达约两小时到约四小时。在一些形式中，热稳定聚合物包衣在烹饪温度下不会降解和允许材料从核心泄漏。
铁微量营养素调配物的稳定性标准是当暴露于沸水两小时或长期(六十天)暴露于75％湿度和40℃时，与囊封时的生物活性相比，铁不氧化到失去其生物活性的50％、60％、70％、80％、90％或100％以上的程度。
脂溶性维生素(如维生素A、维生素D或维生素E)微量营养素调配物的稳定性标准是当暴露于沸水两小时或长期(六十天)暴露于75％湿度和40℃时，与囊封时的生物活性相比，维生素不失去其生物活性的50％、60％、70％、80％、90％或100％以上。
如本文所使用的，“在储存温度下稳定”通常意指材料在约-4℃(例如，冰箱温度)到约25-35℃、湿度为约40-60％的范围内在化学上和/或物理上稳定(例如，不降解)。
如本文所使用的，“微量营养素”通常是指微量(例如，少于100mg/day)存在的对于生物体(如人)的正常生长和代谢而言必不可少的物质，如维生素或矿物质。“微量营养素”包含微量矿物质或痕量元素和微量维生素。
术语“直径”是本领域公认的，并且在本文中用来指物理直径或流体动力学直径。如本文所使用的，非球形颗粒的直径可以指颗粒表面上两点之间的最大线性距离。当涉及多个颗粒时，颗粒或胶囊的直径通常指颗粒的平均直径。可以使用多种技术测量颗粒的直径，包含但不限于光学或电子显微技术，以及动态光散射和过滤。
如本文所使用的，术语“生物相容的”是指一种或多种本身对宿主(例如，非人动物或人)无毒也不以在宿主体内产生有毒浓度的单体或寡聚亚基或其它副产物的速率降解(如果材料降解的话)的材料。
如本文所使用的，术语“可生物降解的”意指材料降解或分解成其组成亚基，或者例如通过生物化学工艺将材料消化成更小的(例如，非聚合的)亚基。
术语“微粒”是本领域公认的，并且包含微球体和微胶囊，以及可能不容易归入上述两种类型中的任一种的结构，所有这些结构的平均尺寸小于约1000微米。微粒可以是球形或非球形的，并且可以具有任何规则或不规则的形状。如果所述结构的直径小于约一微米，则可以使用对应的本领域公认的术语“纳米球”、“纳米胶囊”和“纳米颗粒”。在某些实施例中，纳米球、纳米胶囊和纳米颗粒的平均直径为约500nm、约200nm、约100nm、约50nm、约10nm或约1nm。
如本文所使用的，“基质”通常是指嵌入一种或多种其它材料的一种或多种固体或半固体材料。
如本文所使用的，“水凝胶”是亲水的聚合物链的网络，有时以胶体凝胶的形式存在，其中水是分散介质。水凝胶是高度吸收的(其可以包含超过90％的水)天然或合成聚合物网络。由于其大量的水含量，水凝胶还具有与天然组织非常相似的柔韧度。
II.稳定的微量营养素调配物
已经开发了含有一种或多种如铁补充剂(如硫酸亚铁)、水溶性维生素(如维生素C和B族维生素的成员)以及脂溶性或油溶性维生素(如维生素A、D和E)等微量营养素的微粒调配物。这些物质在加工过程中抗氧化和生物活性损失，并且耐潮湿和烹饪温度。所述颗粒包含一种或多种肠溶性聚合物，如在限定的pH范围会降解/溶解并释放囊封的微量营养素的pH敏感性聚合物。优选的pH敏感性聚合物在低pH下释放，如pH 1-3，优选地pH 1-2，如在胃中所发现的。
为了防止氧化，铁补充剂或含有铁补充剂的铁颗粒被如透明质酸(“HA”)等保护性聚合物囊封，优选地铁:HA的比例介于1:4与1:10之间，或者与如维生素C等保护性化合物混合。然后，将所得混合物分散在肠溶性聚合物(如BASF公司作为
Figure BDA0002660121650000071
出售的聚(甲基)丙烯酸酯，优选地EPO)溶液中，并使用如喷雾干燥或旋转盘雾化等技术制成颗粒，所述颗粒的粒径通常为直径介于一微米与一毫米之间，优选地直径为约150微米。最终调配物的典型范围为：Fe：0.5-3.2％，HA：2.5-32％，以及EPO：97-64.8％。
为了制备含有如脂溶性维生素(如维生素A、D和维生素E)等一种或多种脂溶性微量营养素的稳定颗粒，将微量营养素溶解或分散在肠溶性聚合物溶液中，并且然后使用如喷雾干燥或旋转盘雾化进入粉末(如防止颗粒结块和变形的淀粉粉末)中等微囊封技术制成颗粒。
为了制备含有如水溶性维生素(如维生素C、B3、B7、B9和B12)和痕量元素(如锌和碘)等一种或多种水溶性微量营养素的稳定颗粒，将微量营养素囊封在第一基质中，所述第一基质由如透明质酸或明胶等亲水性或两亲性聚合物形成。使用如喷雾干燥或旋转盘雾化进入粉末(如防止颗粒结块和变形的淀粉粉末)中等微囊封技术，含有水溶性微量营养素的颗粒进一步被第二基质包衣或囊封，所述第二基质由肠溶性聚合物形成。
调配物由分布在第一基质中的一种或多种微量营养素制成，所述第一基质被第二基质包衣或囊封，所述第二基质由一种或多种pH敏感性热稳定材料形成。在一些形式中，微量营养素被一种或多种pH敏感性热稳定材料直接包衣或囊封，以形成微粒。pH敏感性热稳定材料有助于稳定维生素和痕量矿物质，特别是在高温下，如在制备和烹饪过程中，并且在摄入后在所需位置(例如，胃、小肠等)有效释放维生素和微量营养素。
已经开发了允许脂溶性MN与水溶性MN共囊封的方法。
颗粒或籽粒由一种或多种微量营养素形成。颗粒或籽粒的直径可以变化。然而，在一些实施例中，平均直径为约几纳米到约1000微米，优选地几纳米到约500微米。
A.微量营养素
示例性微量营养素包含但不限于铁、钴、锌、锰、铜、碘、硒、钼、铬、维生素A、β-胡萝卜素、维生素B1、维生素B2(核黄素)、维生素B3(烟酸)、维生素B6、维生素B7(生物素)、维生素B9(叶酸)、维生素B12、维生素C、维生素D3、维生素E、维生素K、泛酸及其组合。大多数微量营养素的每日所需剂量为少于100mg/day。美国农业部2013年的推荐值如表1所示。
维生素A参与导致细胞分化、细胞成熟和细胞特异性的生理过程。维生素A是处于(如妊娠、哺乳或疾病状态引起的)生理应激状态的受试者的营养补充剂的重要组分。维生素A可以以醋酸盐的形式包含在内。6-59个月大的儿童的100％推荐膳食容许量(RDA)为0.9mg/day。成年女性的50％RDA为0.45mg/day。用于所公开调配物的维生素A的有用形式包含棕榈酸视黄酯、乙酸视黄酯和β-胡萝卜素。
β-胡萝卜素根据需要在体内转化为维生素A。β-胡萝卜素还具有强大的抗氧化性质。出于多种原因，抗氧化剂在生理应激事件中非常重要。例如，脂质过氧化与200多种疾病过程相关。抗氧化剂在妊娠期间尤其重要，因为在妊娠的前三个月，进入绒毛间隙的血液流的建立与氧化应激的爆发相关。无法对这种爆发进行有效的抗氧化防御会导致早期妊娠丢失。此外，氧化应激与先兆子痫(妊娠毒血症)的病理生理学有关。最后，妊娠期间的氧化应激在胎儿生长中发挥重要作用，并且健康的抗氧化剂水平与出生体重和身长呈正相关。
B复合物含有通常不储存在体内的水溶性营养素。这些水溶性营养素在对孕妇、哺乳期妇女和胎儿的健康至关重要的各种生物过程(例如，同型半胱氨酸的代谢)中发挥作用。复合维生素B含有维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B6、维生素B7、维生素B9和维生素B12中的一种或多种。B族维生素通常相互协同作用，并且多种维生素B缺乏症被认为比单一维生素B缺乏症更常见。
维生素B1在碳水化合物代谢和神经功能中发挥作用。它是用于α-酮酸(例如，α-酮戊二酸和丙酮酸)的氧化脱羧和用于转酮醇酶的辅酶，所述转酮醇酶是戊糖磷酸途径的组分。维生素B1可以以硝酸硫胺的形式包含在内。
表1.膳食参考摄入量(DRI)
膳食参考摄入量(DRI)：估计平均需求量
国家科学院医学研究所食品与营养委员会
Figure BDA0002660121650000091
Figure BDA0002660121650000101
注意：估计平均需求量(EAR)是估计满足组中一半健康个体的需求量的平均每日营养素摄入水平。尚未针对维生素K、泛酸、生物素、胆碱、铬、氟化物、锰或其它还没有通过DRT过程评估的营养素建立EAR。
a代表视黄醇活性当量(RAE)。1RAE＝1μg视黄醇，12μgβ-胡萝卜素，24μgα-胡萝卜素，或24μgβ-隐黄质。膳食维生素A原类胡萝卜素的RAE是视黄醇当量(RE)的两倍，而预形成的维生素A的RAE与RE相同。
b代表α-生育酚。α-生育酚包含RRR-α-生育酚(天然存在于食物中的α-生育酚的唯一形式)，以及存在于强化食品和补充剂中的α-生育酚的2R-立体异构形式(RRR-、RSR-、RRS-和RSS-α-生育酚)。但不包含也存在于强化食品和补充剂中的α-生育酚的2S立体异构形式(SRR-、SSR-、SRS-和SSS-α-生育酚)。
c代表烟酸当量(NE)。1mg烟酸＝60mg色氨酸。
d代表膳食叶酸当量(DFE)。1DFE＝1μg食品叶酸＝0.6μg来自强化食品的叶酸或与食品一起食用的补充剂＝0.5μg空腹服用的补充剂。
来源：钙、磷、镁、维生素D和氟化物的膳食参考摄入量(Dietary ReferenceIntakes for Calcium,Phosphorous,Magnesium,Vitamin D,and Fluoride)(1997)；硫胺素、核黄素、烟酸、维生素B6、叶酸、维生素B12、泛酸、生物素和胆碱的膳食参考摄入量(Dietary Reference Intakes for Thiamin,Riboflavin,Niacin,Vitamin B6,Folate,Vitamin B12,Pantothenic Acid,Biotin,and Choline)(1998)；维生素C、维生素E、硒和类胡萝卜素的膳食参考摄入量(Dietary Reference Intakes for Vitamin C,Vitamin E,Selenium,and Carotenoids)(2000)；维生素A、维生素K、砷、硼、铬、铜、碘、铁、锰、钼、镍、硅、钒和锌的膳食参考摄入量(Dietary Reference Intakes for Vitamin A,Vitamin K,Arsenic,Boron,Chromium,Copper,Iodine,Iron,Manganese,Molybdenum,NickelSilicon,Vanadium,and Zinc)(2001)；能量、碳水化合物、纤维、脂肪、脂肪酸、胆固醇、蛋白质和氨基酸的膳食参考摄入量(Dietary Reference Intakes for Energy,Carbohydrate，Fiber,Fat,Fatty Acids,Cholesterol,Protein,and Amino Acids)(2002/2005)；以及钙和维生素D的膳食参考摄入量(Dietary Reference Intakes for Calcium and VitaminD)(2011)。这些报告可以通过www.nap.edu进行访问。
维生素B2是两种黄素辅酶——黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的组分。这些黄素酶参与许多氧化还原反应，包含吡哆醇和烟酸的转化。黄素酶还在许多代谢途径中发挥作用，如氨基酸脱氨基、嘌呤降解和脂肪酸氧化，从而有助于维持碳水化合物、氨基酸和脂质代谢。维生素B2可以以核黄素的形式包含在内。
维生素B3或“烟酸”是以下两种化合物的通称：尼克酸(也称为烟酸)和烟酰胺(也称为尼克酰胺)。维生素B3对于维持脂肪酸的健康水平和种类很重要。它也是合成吡哆醇、核黄素和叶酸所必需的。施用维生素B3还可以影响总胆固醇(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)水平的降低以及高密度脂蛋白(HDL)胆固醇水平的增加。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和NAD磷酸盐(NADP)是烟酸的活性辅酶。这些辅酶参与许多酶促反应，如糖酵解、脂肪酸代谢和类固醇合成。维生素B3可以以烟酰胺的形式包含在内。在另一个实施例中，调配物可以包含等摩尔量的烟酸或烟酸和烟酰胺的组合。
维生素B6可以降低同型半胱氨酸的水平。维生素B6的活性形式(吡哆醛-5'-磷酸(PLP)和吡哆胺-5'-磷酸)是许多酶的辅酶，并且因此对糖异生、烟酸形成和红细胞代谢很重要。维生素B6是胱硫醚合酶和胱硫醚酶的辅酶，这两种酶催化甲硫氨酸形成半胱氨酸。同型半胱氨酸是此过程的中间产物，并且血浆同型半胱氨酸水平升高被认为是血管疾病和神经管缺陷的危险因素。维生素B6可以以盐酸吡哆醇的形式包含在内。
维生素B9可以预防由干扰的同型半胱氨酸代谢引起的神经管缺陷，如脊柱裂。维生素B9对骨髓中的红细胞和白细胞的形成也很重要，并且在血红素形成中发挥作用。此外，叶酸缺乏会抑制维生素B1的活性。维生素B9可以以叶酸、叶酸类似物、甲基四氢叶酸钙、叶酸盐和/或叶酸盐的一种或多种天然异构体的形式包含在内，所述天然异构体包含：(6S)-四氢叶酸或其聚谷氨酰衍生物、5-甲基-(6S)-四氢叶酸或其聚谷氨酰衍生物、5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸或其聚谷氨酰衍生物、10-甲酰基-(6R)-四氢叶酸或其聚谷氨酰衍生物、5,10-亚甲基-(6R)-四氢叶酸或其聚谷氨酰衍生物、5,10-次甲基-(6R)-四氢叶酸或其聚谷氨酰衍生物、以及5-亚胺甲基-(6S)-四氢叶酸或其聚谷氨酰衍生物。6-59个月大的儿童的100％RDA为0.15mg/day。成年女性的50％RDA为0.2mg/day。用于所公开调配物的维生素B9的有用形式是叶酸。
维生素B12可以转化成活性辅酶、甲基钴胺素和5'-脱氧腺苷钴胺素。这些辅酶是叶酸代谢、辅酶A转化和髓鞘合成所必需的。甲基钴胺素还催化叶酸辅因子的去甲基化，其参与DNA合成。去甲基化不足可能导致叶酸缺乏。脱氧腺苷钴胺素是将甲基丙二酰CoA转化成琥珀酰CoA的辅酶，其在柠檬酸循环中发挥作用。钴胺素以及吡哆醇和叶酸也与同型半胱氨酸(氨基酸甲硫氨酸的分解产物)的正常代谢有关，所述同型半胱氨酸由于其对内皮功能的负面影响而与心脏病的风险增加相关。维生素B12可以以氰钴胺素的形式包含在内。6-59个月大的儿童的100％RDA为0.0009mg/day。成年女性的50％RDA为0.0012mg/day。用于所公开调配物的维生素B12的有用形式包含氰钴胺素和甲基钴胺素。
维生素C在金属催化羟基化中是共基质。像β-胡萝卜素一样，维生素C具有抗氧化性质。其直接与超氧化物羟基自由基和单线态氧相互作用，并且还为叶酸和维生素E提供抗氧化保护，从而使维生素E保持其最有效的形式。维生素C可以通过参与自由基的清除来提供抗先兆子痫的保护作用。实际上，已经观察到先兆子痫妇女的维生素C水平明显低于对照组。
维生素C还增强铁的吸收。另外，维生素C对于胶原合成、肾上腺素合成和胆汁酸形成是必需的。此外，维生素C通过存在于动脉壁的细胞外液中并且增强一氧化氮活性与抑制动脉粥样硬化相关，从而使血管功能正常化。维生素C可以以抗坏血酸的形式包含在内。6-59个月大的儿童的100％RDA为30mg/day。成年女性的50％RDA为37.5mg/day。用于所公开调配物的维生素C的有用形式包含抗坏血酸和抗坏血酸钠。
维生素D3是对维持骨骼健康很重要的脂溶性“类激素”物质。此维生素增加了胃肠道对钙和磷的吸收，并且改善了骨组织的矿物质吸收。维生素D可以通过将皮肤暴露在阳光下而转化成其活性形式。缺乏维生素D3会导致骨转换和骨质流失增加，并且在严重时会导致骨软化症或软骨病。补充维生素D3已被证明能适度减少骨质流失，增加血清25-羟基维生素D，并降低血清甲状旁腺激素水平。维生素D3在维持钙和磷体内平衡中也发挥作用，而它在细胞分化和免疫功能中也是活跃的。维生素D3可以以胆钙化醇的形式包含在内。6-59个月大的儿童的100％RDA为0.005mg/day。成年女性的50％RDA为0.0075mg/day。用于所公开调配物的维生素D的有用形式包含胆钙化醇和麦角钙化醇。
维生素E是存在于生物膜中的脂溶性维生素抗氧化剂，在所述生物膜中维生素E保护磷脂膜免受氧化应激。维生素E通过捕获过氧化自由基来抑制不饱和脂肪酸的氧化。它还是抗动脉粥样硬化剂，并且研究表明，随着维生素E摄入量的增加，冠心病的风险降低。另外，维生素E，如β-胡萝卜素和维生素C可以通过参与自由基的清除来提供抗先兆子痫的保护作用。与维生素C一样，已经观察到先兆子痫妇女的维生素E水平明显低于对照组。维生素E可以以d-α-生育酚乙酸酯或d-α生育酚琥珀酸酯的形式包含在内。
铁是通过红细胞的血红蛋白部分向身体组织运送氧气所必需的。补充摄入铁对预防贫血至关重要，所述贫血是与多种生理状态(包含例如妊娠或高寄生虫感染)相关的疾病。调配物可以包含螯合或非螯合形式的铁。铁可以以多糖铁复合物的形式包含在内。在另一个实施例中，铁可以以等摩尔量的富马酸亚铁或硫酸亚铁的形式包含在内。6-59个月大的儿童的100％RDA为10mg/day。成年女性的50％RDA为9mg/day。铁的有用形式包含NaFeEDTA、硫酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、富马酸亚铁和焦磷酸铁。
镁主要存在于骨和肌肉中，并且对超过300种不同的酶反应非常重要。镁的主要功能是与三磷酸腺苷(ATP)中的磷酸基团结合，从而形成有助于ATP磷酸转移的复合物。镁在细胞内还起到膜稳定剂的作用。镁在核酸合成、糖酵解、DNA和RNA转录、氨基酸活化、膜转运、转酮酶反应和蛋白质合成中发挥作用。它还参与cAMP的形成，所述cAMP是在细胞信号传导机制中发挥作用的胞内第二信使。镁在神经肌肉传递中还与钙具有协同作用和拮抗作用。具体而言，镁对于维持神经和肌肉膜的电化学电势以及神经肌肉接头传递至关重要，在心脏中尤其重要。并不意外的是，镁缺乏与心血管疾病和高血压有关。实际上，口服镁疗法改善了冠心病患者的内皮功能。
镁可以存在于多种盐中，并且可以以螯合或非螯合的形式包含在调配物中。在一个实施例中，镁以氧化镁的形式包含在内。
锌在许多代谢活动中发挥作用，如核酸产生、蛋白质合成和免疫系统的发育。存在超过200种锌金属酶，包含醛缩酶、醇脱氢酶、RNA聚合酶和蛋白激酶C。锌使RNA和DNA结构稳定，在核受体中形成锌指，并且是参与转录和复制的染色质蛋白的组分。妊娠期间缺乏锌已被证明会导致严重的胎儿畸形。锌有多种形式，并且可以以螯合或非螯合的形式包含在调配物中。在一个实施例中，锌可以以氧化锌的形式包含在内。6-59个月大的儿童的100％RDA为4.1mg/day。成年女性的50％RDA为8mg/day。用于所公开调配物的锌的有用形式包含乙酸锌、葡萄糖酸锌、吡啶甲酸锌和硫酸锌。
硒对于动物而言是必不可少的微量营养素。硒是氨基酸硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的组分。硒充当抗氧化酶还原的辅因子，如谷胱甘肽过氧化物酶和某些形式的硫氧还蛋白还原酶。谷胱甘肽过氧化物酶家族(GSH-Px)催化去除如过氧化氢和有机氢过氧化物等活性氧的某些反应。
硒还在甲状腺的运作和使用甲状腺激素的每个细胞中发挥作用，其通过作为四种已知类型的甲状腺激素脱碘酶中的三种的辅因子参与，所述甲状腺激素脱碘酶激活然后去激活各种甲状腺激素及其代谢物：碘甲腺原氨酸脱碘酶是脱碘酶的亚科，所述脱碘酶使用硒作为原本稀有的氨基酸硒代半胱氨酸。硒可以抑制桥本氏病(Hashimoto's disease)，在所述桥本氏病中，人体自身的甲状腺细胞像外来细胞一样受到攻击。
锰是必不可少的痕量营养素。具有锰辅因子的酶的种类非常广泛，并且包含氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、连接酶、凝集素和整合素。
铜对于动物而言是必不可少的痕量元素。由于其促进铁吸收的作用，铜缺乏可能产生类似贫血的症状、中性粒细胞减少、骨异常、色素减退、生长受损、感染发生率增加、骨质疏松、甲状腺机能亢进以及葡萄糖和胆固醇代谢异常。
钴是必不可少的痕量元素。它是钴胺素(也称为维生素B12)的关键成分，所述钴胺素是钴作为“超痕量”元素的主要生物储库。钴胺素基蛋白质使用咕啉来保存钴。辅酶B12的特征是反应性C-Co键，所述反应性C-Co键参与其反应。在人类中，B12与两种类型的烷基配体共存：甲基和腺苷。MeB12促进甲基(-CH3)基团转移。B12的腺苷版本催化重排，在所述重排中氢原子随着第二取代基X的交换在两个相邻原子之间直接转移，所述第二取代基可以是具有取代基的碳原子、醇的氧原子或胺。甲基丙二酰辅酶A变位酶(MUT)将MMl-CoA转化成Su-CoA，这是从蛋白质和脂肪中提取能量的重要步骤。
碘在动物生物学中的主要作用是作为甲状腺激素甲状腺素(T4)和三碘甲腺原氨酸的成分。这些物质由氨基酸酪氨酸的加成缩合产物制成，并且在释放前储存在被称为甲状腺球蛋白的含碘蛋白质中。T4和T3分别含有每个分子四个和三个碘原子。甲状腺积极地从血液中吸收碘化物，以制造这些激素并将其释放到血液中，这些动作由第二激素的调节。甲状腺激素在生物学中起着基础作用，作用于基因转录以调节基础代谢率。完全缺乏甲状腺激素会使基础代谢率降低高达50％，而在甲状腺激素的过量生产中，基础代谢率可提高100％。
碘和硒具有营养关系。被称为脱碘酶的硒依赖性酶家族通过从酪氨酸外环去除碘原子而将T4转化成T3(活性激素)。这些酶还通过去除内环碘原子将T4转化成反T3(rT3)，并且还通过去除内环原子将T3转化成3,3'-二碘甲腺原氨酸(T2)。这对胎儿和新生儿的发育也很重要。6-59个月大的儿童的100％RDA为0.09mg/day。成年女性的50％RDA为0.075mg/day。用于所公开调配物的碘的有用形式包含碘化钠和碘酸钾。
还可以包含其它治疗剂、营养剂、预防剂或诊断剂。在一个实施例中，抗寄生虫剂被掺入颗粒中。抗寄生虫剂(如抗原虫剂、抗蠕虫药及其组合)包含但不限于抗线虫药、抗绦虫药、抗吸虫药、抗变形虫药、抗原虫药及其组合。
合适的抗线虫(antinematodal)药物包含但不限于苯并咪唑(例如，甲苯咪唑、噻苯达唑)、阿维菌素类(例如，伊维菌素)、双羟萘酸噻嘧啶、乙胺嗪及其组合。
合适的抗绦虫药包含但不限于氯硝柳胺、吡喹酮、阿苯达唑及其组合。
合适的抗吸虫药包含但不限于吡喹酮。
合适的抗变形虫药包含但不限于利福平(rifampin)、两性霉素B及其组合。
合适的抗原虫药包含但不限于美拉胂醇(melarsoprol)、依氟鸟氨酸(eflornithine)、甲硝唑、替硝唑、米替福新(miltefosine)及其组合。
颗粒可以含有一种或多种抗病毒剂和/或抗微生物剂。合适的药剂包含抗流感剂、抗脊髓灰质炎病毒剂、抗肝炎剂、抗树样病毒剂(节肢动物传播的病毒，如登革热、黄热病和疟疾)、抗轮状病毒剂、抗埃博拉病毒剂、抗马尔堡病毒剂、抗拉沙病毒剂及其组合。合适的抗微生物剂包含但不限于抗霍乱剂、抗大肠杆菌剂、抗结核剂、抗麻风病剂及其组合。
不同的药剂和不同的药剂组合可以在相同的调配物、不同的调配物或其组合中进行组合。这样做是为了方便，如为了方便在不同调配物中组合或混合不同的药剂，或者为了基于调配物的组成增加或优化药剂的稳定性或形式，针对不同的药剂使用不同的调配物。
调配物还可以包含益生菌、促进生长或体重增加的酶，如植酸酶、蛋白酶(如
Figure BDA0002660121650000151
ProAct)和碳水化合物。许多此类产品广泛用于动物饲料调配物。
不同的药剂和不同的药剂组合可以分散在相同的颗粒、不同的颗粒或其组合中。这样做是为了方便，如为了方便在不同调配物中组合或混合不同的药剂，或者为了基于颗粒的组成增加或优化药剂的稳定性或形式，针对不同的药剂使用不同的颗粒。
当被pH敏感性热稳定聚合物囊封时，药剂应该对储存、食品制备和/或烹饪过程中遇到的条件稳定。
在一些形式中，颗粒中微量营养素的量可以是每毫克颗粒至少0.1μg(0.01％)、每毫克颗粒至少0.4μg(0.04％)，每毫克颗粒至少1μg(0.1％)，每毫克颗粒至少10μg(1％)，每毫克颗粒至少50μg(5％)，每毫克颗粒至少80μg(8％)，或每毫克颗粒至少180μg(18％)。
B.稳定材料
淀粉
已经发现，将脂溶性pH敏感性聚合物喷雾干燥进入淀粉型材料中可防止结块并维持颗粒大小和形状。优选的材料是食品级淀粉。
透明质酸和维生素C
已经发现两种物质可以稳定铁补充剂，从而防止氧化：透明质酸或其衍生物和维生素C。在一些形式中，这些材料以介于1:4与1:10之间的铁:透明质酸的优选比例添加。在一些形式中，铁补充剂被透明质酸形成的微粒囊封。
水溶性微量营养素的基质聚合物
一种或多种生物相容的亲水性或两亲性聚合物也可以用作囊封水溶性微量营养素(如维生素B9和B12)的基质。基质聚合物优选地是水溶性的。合适的基质聚合物包含但不限于多糖(如透明质酸或其衍生物)、胶原和水解胶原(如明胶)。可以产生基质聚合物的微粒以囊封水溶性微量营养素。此类微粒可以进一步被一种或多种pH敏感性热稳定生物相容性聚合物包衣或囊封。
C.pH敏感性热稳定聚合物
微量营养素可以进一步被一种或多种pH敏感性热稳定生物相容性聚合物包衣或囊封。在一些形式中，微量营养素分散在第一基质(如由透明质酸或明胶形成的基质)中以形成微粒；此类微粒进一步被第二基质包衣或囊封，所述第二基质由一种或多种pH敏感性热稳定生物相容性聚合物形成。聚合物的溶解度依赖于pH，使得可以通过选择适当的聚合物在胃肠道中达到所需的释放点。例如，如果需要在胃中释放，则pH敏感性聚合物理想地在pH小于3(优选地小于2，如1-2)时溶解。在其它实施例中，可能需要在小肠中释放，其中聚合物在十二指肠(pH 6-6.5)或小肠的pH(如6-8，更优选地7-8)下溶解。对于农业应用，如牛、绵羊和山羊等反刍动物的矿物质补充剂，期望介于5与6之间的pH释放以实现瘤胃内的释放。
聚合物是热稳定的。优选的聚合物在烹饪过程中是热稳定的，使得调配物可以像普通的盐一样添加到食品中。通常，通过沸腾或蒸炖10分钟到几个小时、在锅或平底锅中用火烹饪，或者在烤箱里烤15分钟到一个小时来制备食品。调配物通常是针对盐调配物分布的地理区域中最常见的烹饪条件而设计的。
当pH超出触发pH范围时聚合物优选地是非水溶性的，使得在口服施用之前，如在储存或烹饪过程中，当与水分或水或水溶液接触时，聚合物包衣不会溶解。聚合物包衣应保持足够完整，例如，长达或至少约一小时，使得囊封的药剂不会释放和/或变性。聚合物是充分无孔的，使得水或其它水性介质无法通过聚合物扩散并溶解核心中的材料。无孔性还可以用于通过防止空气敏感材料氧化来稳定核心中的材料。材料应在储存条件下保持无孔持续数周到数月，并且在食品制备和/或烹饪条件下持续至少约20分钟到约4小时，优选地至少约20分钟到约2小时，更优选地至少约20分钟到约1小时。
示例性聚合物包含：聚甲基丙烯酸酯及其衍生物(如甲基丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸共聚物和以商标名
Figure BDA0002660121650000172
出售的那些)、天然存在的纤维素聚合物(例如，醋酸琥珀酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯和羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯)和其它多糖(例如，海藻酸钠、果胶、壳聚糖)或其半合成或合成衍生物、聚(2-乙烯基吡啶-共-苯乙烯)、聚乙酸乙烯酯邻苯二甲酸酯、虫胶、脂肪酸(例如，硬脂酸)、蜡、塑料和植物纤维。
在一些实施例中，一种或多种聚合物是聚甲基丙烯酸酯或其衍生物，如以商标名EUDRAGIT出售的那些。在一些实施例中，聚合物在小于6，优选地小于5、4或3，如1-3或1-2的pH下溶解。此类聚合物通常具有在低pH下被质子化的官能团(如胺)，所述官能团由于带电基团的形成而增加水性介质中的溶解度。此类聚合物的实例包含但不限于聚甲基丙烯酸酯或其衍生物，如
Figure BDA0002660121650000173
EPO(聚(甲基丙烯酸丁酯-共-(2-二甲基氨基乙基)甲基丙烯酸酯-共-甲基丙烯酸甲酯)(1:2:1)；“EPO”或“BMC”)、壳多糖和是阳离子或在某些条件下(例如，在体内)变成阳离子的聚合物。在一些形式中，聚甲基丙烯酸酯聚合物具有如方案1所示的结构，其中x>0，y≥0，z≥0，n代表整数，并且单体沿共聚物链随机分布。在一些形式中，x比y比z的比率为约2:1:1。在一些形式中，聚甲基丙烯酸酯聚合物的平均分子量介于约10,000Da与约100,000Da之间、介于约20,000Da与约80,000Da之间，介于约40,000Da与约60,000Da之间，或约47,000Da。
Figure BDA0002660121650000171
方案1
在其它实施例中，聚合物是肠溶性聚合物，所述肠溶性聚合物在大于胃的pH的pH(如大于pH 5-6)下溶解。此类聚合物通常具有在较高pH下形成带电基团(例如，羧酸)的官能团，以增加溶解度。在一些实施例中，聚合物在以下pH下溶解：大于约5.5，如
Figure BDA0002660121650000181
L 30D-55和L 100-55；大于约6.0，如
Figure BDA0002660121650000182
L 100和L 12,5；以及大于约7.0，如
Figure BDA0002660121650000183
S 100、S 12,5和FS 30D。
聚合物包衣或囊封的厚度可以变化，以达到期望的释放速率。在一些实施例中，包衣的厚度为约1埃到数百微米。在一些实施例中，包衣的厚度为约5到约200微米，优选地约10到约100微米，更优选地约10微米到约75微米，最优选地约20微米到约50微米。
D.盐包衣和其它包衣
囊封一种或多种微量营养素的颗粒可以用盐、糖或其它包衣材料进行包衣，优选地盐，优选地适用于如人等动物消耗的盐。示例性盐包含但不限于氯化钠和/或氯化钾、氯化镁、碘化钾、磷酸盐及其组合。在一些实施例中，包衣的厚度为约1埃到数百微米。在一些实施例中，包衣的厚度为约5到约200微米，优选地约10到约100微米，更优选地约10微米到约75微米，最优选地约20微米到约50微米。盐可以是纯化的或不纯的，如通过蒸发盐水或微咸水获得的盐。盐的浓度可以是颗粒重量的约10％到约80％，优选地约10％到约70％，更优选地约20％到约60％，最优选地约40％到约60％。
其它包衣材料包含糖和其它适合作为包衣的食品组分。优选的包衣材料可以与调配物相容，和/或有助于使调配物与食品和要包含在食品中的产物和组分相容(如在食品制备或烹饪过程中)。
用作粘合剂的组合物可以用于促进用盐、糖或其它包衣材料来包衣颗粒。粘合剂用于将盐晶体彼此结合并结合到颗粒表面。用作粘合剂的示例性组合物包含但不限于淀粉(如小麦淀粉、玉米淀粉和马铃薯淀粉)、聚乙烯醇(PVA)、羧甲基纤维素和甲基纤维素。
III.制备方法
图1A示出了将水溶性微量营养素囊封到pH敏感性聚合材料中的工艺(即，两步法)。图1B示出了将脂溶性微量营养素囊封到pH敏感性材料中的工艺(即，一步法)。这些工艺在实例中更详细地描述。
A.微量营养素囊封方法
产生囊封一种或多种微量营养素的微粒的常用微囊封技术包含但不限于：喷雾干燥、界面聚合、热熔囊封、相分离囊封(自发乳液微囊封、溶剂蒸发微囊封和溶剂去除微囊封)、凝聚、低温铸造、相转化毫微囊封(nanoencapsulation)和离心雾化(如旋转盘雾化)。
在一些形式中，通过溶剂去除微囊封或喷雾干燥形成基于HA的微粒。
在一些形式中，通过相转化毫微囊封或旋转盘雾化形成基于pH敏感性聚合物的微粒。
以下简要描述产生囊封一种或多种微量营养素的微粒的示例性方法。
1.喷雾干燥
囊封一种或多种微量营养素的微粒可以通过喷雾干燥技术产生，如授予Mathiowitz等人的美国专利第6,620,617号中所述。在此方法中，微粒形成化合物(也称为“囊封剂”、“颗粒形成化合物”或“颗粒形成聚合物”)溶解于如水性介质(例如，水)、有机介质(如二氯甲烷)或混合溶剂介质(如水和叔丁醇的混合物)等溶剂系统中。将已知量的要掺入微粒中的一种或多种微量营养素悬浮(在不溶性微量营养素的情况下)或共溶解(在可溶性微量营养素的情况下)于前述溶剂系统中。优选地，微量营养素共溶解于溶剂系统中。通过由压缩气体流驱动的微粉化喷嘴来泵送溶液或分散体，并将所得气雾剂悬浮于加热的空气旋风分离器中，从而使溶剂从微滴中蒸发，形成颗粒。
使用此方法可以获得范围在0.1-10微米的微球体/纳米球体。优选地，通过此方法形成的颗粒的大小在约1到约10μm的范围内。
在一些形式中，使用此方法形成基于HA的微粒，如HA-Fe微粒。例如，可以将含有铁补充剂(如无水或含水的硫酸亚铁)、HA或其衍生物(如透明质酸钠)和任选的一种或多种水溶性微量营养素的水溶液送入喷雾干燥器中以产生HA-Fe微粒。
2.离心雾化
在离心雾化(也称为“旋转雾化”)中，喷嘴在旋转杯或旋转盘的中心引入流体。离心力将流体带到圆盘的边缘，并将流体从边缘甩出。液体形成分裂成细小液滴的系带或薄片。通过暴露于空气和/或如粉末状淀粉等药物赋形剂，细小液滴可以固化形成微粒。离心雾化法，尤其是旋转盘雾化，在例如授予Sparks和Mason的美国专利第4,675,140号和PCT专利申请第WO 2012/075309号中进行描述。在一些形式中，通过如旋转盘雾化等离心雾化形成基于pH敏感性聚合物的微粒。例如，首先将pH敏感性聚合物溶解于如二氯甲烷等有机溶剂中。在如吐温(Tween)80等表面活性剂的存在下，将要掺入的一种或多种微量营养素，如脂溶性维生素、HA-Fe微粒和含有一种或多种水溶性微量营养素的微粒混合或溶解于聚合物溶液中。然后将获得的乳液在一定条件下引入到旋转盘雾化器中，以产生囊封微量营养素的基于pH敏感性聚合物的微粒。
B.铁补充剂的囊封
可以使用如研磨等本领域已知的技术来制备含有铁补充剂的铁颗粒。将铁补充剂(优选地硫酸亚铁(FeSO4))或铁补充剂的铁颗粒以优选地介于约1:4与1:10之间的铁:HA比例与如透明质酸或其衍生物等材料混合，或与维生素C混合，和/或用肠溶性聚合物囊封，以防止铁补充剂氧化。然后将混合物分散到pH敏感性聚合物溶液中，所述pH敏感性聚合物优选地为
Figure BDA0002660121650000201
最优选地为EPO。在优选的形式中，pH敏感性聚合物溶液的溶剂是有机溶剂，如二氯甲烷。囊封铁补充剂的基于pH敏感性聚合物的微粒通过微囊封技术，如喷雾干燥和旋转盘雾化，在产生一微米到一毫米，最优选地平均为150微米的颗粒的条件下产生。
在一些形式中，可以通过如图1A所示的两步法将铁补充剂囊封到微粒中。例如，首先将铁补充剂囊封在由HA或其衍生物形成的微粒中。在一些形式中，通过将铁补充剂(如硫酸亚铁)与HA或其衍生物(如透明质酸钠)一起溶解于水性介质(如水)中，然后使用如喷雾干燥和溶剂去除微囊封等技术进行微囊封来形成Fe-HA微粒。所获得的Fe-HA微粒进一步被pH敏感性聚合物(优选地
Figure BDA0002660121650000202
最优选地EPO)包衣或囊封。在一些形式中，其它水溶性微量营养素，包含水溶性维生素和痕量矿物质，可以与铁补充剂一起囊封。例如，在Fe-HA微粒的产生过程中，此类微量营养素可以与铁补充剂共溶解。
C.脂溶性微量营养素的囊封
可以通过如图1B所示的一步法将如脂溶性维生素等脂溶性微量营养素囊封到微粒中。
通过将维生素溶解或分散在pH敏感性聚合物溶液(优选地
Figure BDA0002660121650000203
最优选地EPO)中，然后通过微囊封，如喷雾干燥或旋转盘雾化(spin disking)进入淀粉粉末(等同于淀粉的其它药物赋形剂是已知的和可获得的)中，将如维生素A、D和E等一种或多种脂溶性维生素囊封到pH敏感性聚合物颗粒中。淀粉防止微囊封后颗粒结块，并维持颗粒形状。
在优选的形式中，pH敏感性聚合物溶液的溶剂是有机溶剂，如二氯甲烷。
D.水溶性微量营养素的囊封
可以通过如图1A所示的两步法将如水溶性维生素和痕量矿物质等水溶性微量营养素囊封到微粒中。
首先将一种或多种水溶性微量营养素囊封在由亲水性或两亲性基质聚合物(如HA、明胶及其衍生物)形成的微粒中(第一步)。可以通过将水溶性微量营养素与基质聚合物一起溶解于如水等水性介质中，然后使用如喷雾干燥和溶剂去除微囊封等技术进行微囊封来形成微粒。所获得的微粒进一步被pH敏感性聚合物(优选地
Figure BDA0002660121650000211
最优选地EPO)包衣或囊封，以产生最终的微粒(第二步)。在一些形式中，通过将来自第一步的微粒分散到pH敏感性聚合物(优选地
Figure BDA0002660121650000212
最优选地EPO)的溶液中来形成最终微粒。在优选的形式中，pH敏感性聚合物溶液的溶剂是有机溶剂，如二氯甲烷。可以通过如相转化毫微囊封、喷雾干燥和旋转盘雾化等微囊封技术产生基于pH敏感性聚合物的微粒。
E.水溶性和脂溶性微量营养素的共囊封
可以使用类似于图1A所示的两步工艺来执行水溶性和脂溶性微量营养素的共囊封。首先将如水溶性维生素和痕量矿物质等一种或多种水溶性微量营养素囊封在由亲水性或两亲性基质聚合物(如HA、明胶及其衍生物)形成的微粒中(第一步)。当水溶性微量营养素是或包含如硫酸亚铁等铁补充剂时，可以包含维生素C以避免铁补充剂氧化；可替代地，HA或其衍生物可以用作基质聚合物以形成微粒。
在第二步中，将来自第一步的囊封水溶性微量营养素的微粒分散在含有pH敏感性聚合物(优选到
Figure BDA0002660121650000213
最优选地EPO)的溶液中。在优选的形式中，pH敏感性聚合物溶液的溶剂是有机溶剂，如二氯甲烷。然后，在添加来自第一步的微粒之前或之后，将如脂溶性维生素等脂溶性微量营养素添加到聚合物溶液中。可以通过如相转化毫微囊封、喷雾干燥和旋转盘雾化等微囊封技术产生囊封水溶性和脂溶性微量营养素的基于pH敏感性聚合物的微粒。
F.挤压和/或研磨
在一些形式中，可以使用挤压，任选地随后通过研磨来实现一种或多种微量营养素的包衣或囊封。挤压是无溶剂/无水的工艺。与喷雾干燥相比，此方法可以实现高通量，并且具有更好的可用性。挤压可以产生固体纤维，所述固体纤维随后可以被研磨以获得粉末状产物。
在一些形式中，一种或多种微量营养素(固体或液体形式)与EPO混合。可以对混合物执行冻干以去除溶剂。可以对所得固体混合物执行研磨以获得均匀的粉末，所述粉末可以进一步冻干至干燥。任选地在加热条件下，如在约80℃与约150℃之间，约90℃与约120℃之间，或100℃与约105℃之间，将均匀的粉末装入挤压机。可以进一步研磨挤出的纤维以产生含微量营养素的粉末，所述粉末可以冻干至干燥。
研磨工艺可以在多种条件下执行，以产生具有不同物理性质的含微量营养素的粉末。例如，研磨工艺可以在室温或低温下执行。研磨工艺可以通过菲茨(Fitz)研磨或喷射研磨来执行。
可以在最终研磨步骤之前、期间或之后添加染色助剂，以提高储存稳定性，即，避免结块。
G.药代动力学和稳定性
使用如喷雾干燥和旋转盘雾化等微囊封技术将微量营养素囊封在pH响应性聚合物中。颗粒中微量营养素的释放动力学取决于多种因素，如聚合物溶解时的pH和包衣厚度。在一些实施例中，包衣的厚度为约1埃到数百微米。在一些实施例中，包衣的厚度为约5到约200微米，优选地约10到约100微米，更优选地约10微米到约75微米，最优选地约20微米到约50微米。
可以使用如ELISA、比色测定法、元素分析法、质谱法和/或HPLC等本领域已知的技术来评估颗粒的活性和稳定性。可以进行组合营养囊封研究以确定颗粒中的药剂中的任一种是否相互产生不利反应。
在优选实施例中，在相当于烹饪(如在100℃水中沸腾两小时)和/或在高湿度(75％)和高温(40℃)条件下长期储存(至少60天)的条件下测试颗粒的稳定性。维生素和其它生物活性化合物应保持至少50％、60％、70％、80％、90％或100％的起始生物活性(即，颗粒形成前的生物活性)。
在一些形式中，在pH为1.5的模拟胃液中，颗粒在两小时内、一小时内或30分钟内在37℃下释放>80％的微量营养素有效载荷。在一些形式中，在pH为1.5的模拟胃液中，颗粒在两小时内、一小时内或30分钟内在37℃下释放>90％的微量营养素有效载荷。在一些形式中，在pH为1.5的模拟胃液中，颗粒在两小时内、一小时内或30分钟内在37℃下释放>95％的微量营养素有效载荷。
在一些形式中，颗粒在暴露于100℃水中两小时后保持>80％的微量营养素有效载荷。在一些形式中，颗粒在暴露于100℃水中两小时后保持>85％的微量营养素有效载荷。在一些形式中，颗粒在暴露于100℃水中两小时后保持>90％的微量营养素有效载荷。
在一些形式中，颗粒使囊封的微量营养素有效载荷稳定。含铁微量营养素调配物的稳定性标准是在暴露于沸水中两小时或在储存温度(例如，-4-40℃，如40℃)下长期(例如，14到60天，如14、28和60天)暴露于高湿度(例如，60-75％，如75％)之后，与囊封时的生物活性相比，铁补充剂不氧化到失去其生物活性的50％、60％、70％、80％、90％或100％以上的程度。含维生素微量营养素调配物的稳定性标准是在暴露于沸水中两小时或在储存温度(例如，-4-40℃，如40℃)下长期(例如，14到60天，如14、28和60天)暴露于高湿度(例如，60-75％，如75％)之后，与囊封时的生物活性相比，维生素不失去其生物活性的50％、60％、70％、80％、90％或100％以上。
H.盐包衣
可以使用本领域已知的技术用一种或多种盐(或其它包衣材料)对囊封一种或多种微量营养素的微粒进行包衣。优选的方法使用流化床。其它合适的技术包含聚合物夹套上盐的结晶以及湿盐和干盐制造技术。最终的盐包衣颗粒的直径可以变化，但通常为约500微米到约1000微米(1mm)。
IV.使用方法
可以将如强化盐调配物等调配物进行封装和分配，以便在食品制备和烹饪过程中使用。调配物可以在没有盐包衣(或其它包衣)的情况下使用，以强化面粉和其它食品。调配物可以经受液体和固体灭菌，所述液体和固体灭菌在饮料、液体食品或固体食品的制备中很有用。
调配物可以用于治疗或预防营养不良和/或微量营养素缺乏，特别是在易患此类疾病的人群中，如发展中国家和遭受严重干旱的国家的儿童和成人。调配物可以掺入食物载体中供有需要的人群使用。由于有需要的人群通常消耗的食物载体的高度可变性，调配物可以与各种食物载体一起使用并掺入其中，所述各种食物载体包含小麦粉、食用油、糖和盐。
在一些实施例中，颗粒含有必不可少的微量营养素中的一种或多种，所述微量营养素包含：维生素A、B1、B2、B3、B6、B7、B9、B12、C、D和E；钼、铬、硒、碘、铜、锰、锌和铁。掺入颗粒中的微量营养素的量可以基于特定微量营养素的RDA。例如，微量营养素的量可以基于50％、60％、70％、80％、90％或100％RDA。
在一些实施例中，调配物用于目标人群是包含健康个体的普通人群的通用强化。调配物可以含有高达100％RDA的碘和小于或等于50％RDA的所有其它微量营养素。在其它实施例中，调配物用于目标人群是微量营养素缺乏家庭的目标强化。对于6-59个月大的儿童，调配物可以含有例如高达100％RDA。
在特定实施例中，2g/day的调配物可以为儿童提供高达100％RDA的微量营养元素碘(0.09mg/day)、锌(4.1mg/day)、叶酸(0.15mg/day)、维生素B12(0.0009mg/day)、维生素A(0.4mg/day)、维生素C(30mg/day)、维生素D(0.005mg/day)和/或铁(10mg/day)。
在其它实施例中，5g/day的调配物可以为成年妇女提供高达50％RDA的微量营养素碘(0.075mg/day)、锌(8mg/day)、叶酸(0.2mg/day)、维生素B12(0.0012mg/day)、维生素A(0.45mg/day)、维生素C(37.5mg/day)、维生素D(0.0075mg/day)和/或铁(9mg/day)。
在其它实施例中，调配物可以用于多种食品和主要原料。例如，调配物可以构成或包含在食品配料中，如盐、糖、油、面粉、小苏打、发酵粉、淀粉(如玉米淀粉)、黄油、起酥油、粗粉(如玉米或其它谷物粗粉)、咖啡、茶、香料、调味剂、提取物等。可以掺入调配物的食品的实例包含：饮料，如牛奶、水、苏打水和其它碳酸饮料、运动饮料、果汁；烘焙食品，如面包、蛋糕、饼干和馅饼；加工食品，如酸奶、奶酪和营养或能量棒。
在其它实施例中，调配物用于农业目的，如掺入原料中。矿物质和盐对于动物健康而言是必不可少的，但这些调配物在不利的气候条件下和储存中很难维持完整性。这些调配物耐候性好，并且在高温高湿条件下储存稳定。pH依赖性释放的优点是调配物可以被设计成在胃肠道吸收最有效的区域(如瘤胃)提供最大的释放。通过掺入原本必须单独施用的维生素和药物(如驱虫剂)可以获得另外的益处。
通过参考以下非限制性实例，将进一步理解本发明。
开发了能够在储存和烹饪条件期间保护囊封的MN有效载荷的pH响应性微粒(“MP”)。MN-MP被设计用于通过胃肠道(如胃部环境)中的快速溶解来控制有效载荷释放，以促进下游MN在肠道中的吸收。
实现了单个颗粒中用于组合强化的多种具有不同物理和化学性质的MN(即脂溶性和水溶性MN)的共囊封、保护和释放，所述单个颗粒如维生素A、D、B9和B12。然后，此实验室规模的技术用于囊封铁和其在人体内的吸收。铁缺乏症是世界上最具破坏性的营养缺乏症，影响着发达国家和发展中国家的人群。例如，铁缺乏症在发展中国家中尤其具有破坏性，因为充足的铁摄入量对婴儿和幼儿的发育(例如行为、认知和精神运动技能)至关重要。铁缺乏症也影响发达国家，因为患有慢性肾病的患者通常患有缺铁性贫血。如此，发达国家和发展中国家都在大力解决缺铁问题
在人类试验中，此MN-MP技术已从实验室转化到临床，并从实验室规模转化到工业相关过程，以合成超过1kg的批量，用于铁的非侵入性递送。
治疗技术的临床和商业转化经常受到来自实验室水平(例如体外和体内)、临床水平(例如人类临床研究)和商业/工业水平(例如实验室规模合成方法向工业规模的转化)的试验的挑战的限制。MN-MP递送系统是使用实验室规模的乳化工艺开发的，并示出同时囊封水溶性和脂溶性MN，防止MN有效载荷泄漏，提供受控的和pH响应性释放，并且在烹饪条件下(100℃水中)维持囊封的MN的化学和生物稳定性。在体内，胃中受控的和位点特异性的有效载荷释放被证实促进有效载荷-肠道的相互作用。在人类的临床试验吸收研究中对实验室合成的负载铁的HA-EPO-MP进行了研究，其中MP示出了通过经膳食口服递送而递送铁的功效。在临床试验之后，实验室规模乳化工艺中的颗粒合成被成功地转化成工业相关工艺，如喷雾干燥和旋转盘雾化方法。通过喷雾干燥和旋转盘雾化合成的铁HA-EPO-MP展现出与实验室规模类似的性能。
基于贯穿四种单独维生素的共囊封的成功囊封、释放和MN保护行为，MN递送平台还可以用于多种MN的共递送，所述四种单独维生素是：(i)脂溶性维生素A，(ii)脂溶性维生素D，(iii)水溶性维生素B9，和(iv)水溶性维生素B12。选择维生素A是因为它调节人体的关键生理过程，包含许多与形态发生、生长、成熟、视觉、生殖和免疫力有关的过程。选择通常被描述为“类激素”的维生素D是因为它对维持健康骨骼、增加钙和磷的吸收以及改善骨组织的矿物质吸收至关重要。维生素B9调节骨髓中循环红细胞和白细胞的形成，并作为血红素形成的载体。维生素B12在DNA的合成和修复中发挥着至关重要的作用，并对神经功能有重要影响。
总的来说，全世界范围这些MN的缺乏存在于大约20亿人口中；其强化仍然是未得到满足的世界性需求。此外，患有单一MN缺乏症的个体通常患有至少一到五种其它MN缺乏症。如此，能够在单一调配物中递送多种MN的递送方法可能会产生显著的影响。
在室温和沸水中观察到的共囊封的MN调配物的MN有效载荷的有限泄漏表明，共囊封的维生素与烹饪中涉及的其它化学反应性化合物之间的相互作用被阻止。维生素A和D这两种脂溶性MN在各种条件下的降解已经得到了很好的研究和报告。维生素A含有五个共轭双键，并且因此在高温和暴露于光下时容易氧化。维生素A的氧化会降低其生物利用度，并且还会产生难闻的味道。与维生素A、B9和B12一起共囊封的维生素D在高温和暴露于光下时也不稳定，会导致摄入时生物利用度较低。研究表明，在相同的条件下，热处理和光暴露后囊封的维生素A和D的回收率明显高于等量的未囊封的维生素A和D的回收率。对于共囊封的水溶性维生素B9和B12，无论是囊封形式还是未囊封形式，均未见烹饪条件下降解的报告。这些结果与显示维生素B9和B12均为热稳定的先前报告的研究一致。总的来说，在模拟的烹饪条件下，MP递送系统有效地维持了水溶性MN的稳定性，并且在脂溶性MN的情况下，增加了烹饪稳定性和光保护性。
对于单一铁HA-EPO-MP囊封显示了类似的稳定性结果；具体而言，在水中沸腾2小时后，HA-EPO-MP展现出较高的生物可利用亚铁保留。此外，由于HA-EPO-MP囊封，与香蕉牛奶中多酚的相互作用显著减少，所述相互作用会负面地改变食物的颜色。总之，对HA-EPO-MP中铁的囊封极大地提高了囊封的铁的稳定性，并且还阻止了铁与食物中存在的其它分子之间的相互作用。除了限制有效载荷过早泄漏和热介导MN降解外，在酸性胃环境中铁的快速释放也是一项关键要求。这是因为铁的吸收几乎只发生在小肠的十二指肠，所述小肠是连接胃和空肠的一小段(25-38cm)。因此，如果铁在十二指肠中释放，考虑到十二指肠的长度较短且食物传输时间较快，被吸收的量将很有限。如此，胃中有效载荷的快速且可控释放至关重要。在这项研究中，在烹饪前和烹饪后(在水中沸腾2小时)铁在体外均展现出快速释放。
还在小鼠体内进行了这项研究，其中颗粒在胃中的溶解很快(<60分钟)，并且释放的有效载荷主要与小肠相互作用。总的来说，期望MP有效释放胃中的负荷，所述负荷可以转化成功效研究中的最佳吸收。测试负载铁的HA-EPO-MP在人体中递送铁的功效来证明这一点。
与未囊封的铁相比，HA-EPO-MP技术展现出明显较低的相对生物利用度(RBV)。HA-EPO-MP铁的RBV较低(为未囊封的铁的约45％)表明囊封对铁的吸收有抑制作用。众所周知，当使用为60:40的聚合物:铁比例时，铁的聚合物囊封可以将其吸收抑制大约20％。在本研究中，聚合物:铁的比例明显更高(约99.5:0.5)。微囊封的铁调配物在烹饪和未烹饪条件下没有显示出统计学差异，这表明在烹饪过程中EPO基质保护了囊封的铁。
实例
实例1：能够在储存和烹饪条件期间保护囊封的MN有效载荷的pH响应性MP
材料和方法
此研究旨在开发一种基于MP的MN递送系统，所述基于MP的MN递送系统可以提高MN在烹饪期间的稳定性，并且同时控制有效载荷在胃(gastric/stomach)环境中的释放。体外研究了MN的释放曲线和热稳定性；研究了小鼠中聚合物MP的溶解；并且最后评估铁强化的颗粒在人类受试者中的吸收。动物研究得到了麻省理工学院(MIT)动物保护委员会的批准，并在David H.Koch综合癌症研究所(David H.Koch Institute for Integrative CancerResearch)执行。涉及人类受试者的临床研究得到了MIT利用人类作为实验受试者委员会(the Committee on the Use of Humans as Experimental Subjects at MIT)(人类研究1：COUHES#1502006932；人类研究2：COUHES#1801201448/1801201448A001)和苏黎世ETH伦理委员会(the Ethics Commission of ETH Zurich)的批准，并在苏黎世ETH执行(人类研究1：KEK-ZH-Nr.2015-0094；人类研究2：KEK-ZH-Nr.2017-01624)。所有人类受试者都提供有知情同意书。这些研究在针对人类研究1的临床试验政府标识号(ClinicalTrials.govunder Identifier)NCT02353325和针对人类研究2的临床试验政府标识号NCT03332602上进行了注册。人类研究1中使用的颗粒在MIT产生，并且人类研究2中使用的颗粒在德克萨斯州圣安东尼奥市(San Antonio,TX)的西南研究所(Southwest Research Institute)(SwRI)产生。
HA-MP的调配
HA-MP是用经修改的反相乳化技术(Jha等人,“使用基于透明质酸的双交联网络控制间充质干细胞的粘附和分化(Controlling the adhesion and differentiation ofmesenchymal stem cells using hyaluronic acid-based,doubly crosslinkednetworks)”,《生物材料(Biomaterials)》,32,2466-2478(2011))调配的。尽管关于具体的聚合物、溶剂和表面活性剂以及微量营养素进行了描述，但是应当理解，这些是仅可以用于常规优化的其它材料的代表。
简而言之，空白HA-MP的乳液是通过使用Silverson L5M-A实验室混合器(Silverson Machines公司(Silverson Machines,Inc.))将HA溶液(低分子量HA，Mn＝384kDa，Mw＝803kDa，生命核心生物医学公司(Lifecore Biomedical)；2ml去离子水中1wt％)在含有120μl的
Figure BDA0002660121650000271
80的矿物油(30ml)中均质化10分钟而制备的。为了制备MN囊封的HA-MP，将维生素B9、B12和七水硫酸亚铁分别溶解于浓度为5mg/ml、5mg/ml和73.8mg/ml的HA水溶液(2ml去离子水中1wt％)中。然后所得溶液用于制备如以上所描述的乳液。
使乳液的水相在45℃下持续搅拌蒸发24小时。然后通过以3000rpm离心5分钟来分离获得的HA-MP。在真空下干燥过夜之前，用己烷和丙酮彻底洗涤HA-MP。为了制备荧光标记的HA-MP，首先根据已经报道的程序使用高碘酸钠合成了含有醛基的HA衍生物(HA-CHO)(Jia等人,“基于透明质酸的微凝胶和用于声带再生的微凝胶网络(Hyaluronic acid-based microgels and microgel networks for vocal fold regeneration)”,《生物大分子(Biomacromolecules)》,7,3336-3344(2006))。由于氧化导致HA的链切割，因此使用高分子量HA(Mn＝1096kDa，Mw＝2698kDa，生命核心生物医学公司)。通过凝胶渗透色谱法(GPC)分析获得的HA-CHO的分子量。通过碘量法(Jha等人,“基于透明质酸的双交联网络的结构分析和机械表征(Structural Analysis and Mechanical Characterization ofHyaluronic Acid-Based Doubly Cross-Linked Networks)”,《大分子(Macromolecules)》,42,537-546(2009))将修饰程度量化为65％。
为了调配荧光HA-MP，HA-CHO和未修饰的HA以重量比(1:1)混合，并且然后通过如以上所描述的反相乳化法制备MP。对于染料标记，将一毫克的含有醛基的HA-MP分散在CFTM405M的甲醇溶液(含有氨氧基的荧光染料，Biotium公司(Biotium Inc.))中。加入乙酸(5μl)以加速反应。然后使反应在室温下进行12小时。通过离心(3000rpm，5分钟)收集染料标记的颗粒，并在真空下干燥之前用甲醇彻底洗涤。
EPO-MP和HA-EPO-MP的调配
通过经修改的O/W乳化法制备EPO-MP(Kemala等人,《阿拉伯化学杂志(ArabianJournal of Chemistry)》,5,103-108(2012))。使用一步(图1A)或两步(图1B)乳化工艺将微量营养素单独囊封在EPO-MP中。尽管关于具体的聚合物、溶剂和表面活性剂以及微量营养素进行了描述，但是应当理解，这些是仅可以用于常规优化的其它材料的代表。
用于乳化的有机相由以下任一种组成：(a)一毫克的空白标记的HA MP或染料标记的HA MP，其均匀分散在1ml的100mg/ml
Figure BDA0002660121650000281
EPO(Mn＝153kDa，Mw＝24981kDa，并且玻璃化转变温度＝45℃，赢创公司(Evonik Corporation))于二氯甲烷中的溶液中；(b)维生素A(10mg/ml)、维生素D(2mg/ml)、负载叶酸的HA MP(1.3mg)和负载B12的HA MP(1.3mg)，其溶解于EPO(100mg/ml，1ml)于二氯甲烷中的溶液中以制备与四种不同类型的微量营养素共囊封的EPO MP；(c)HA MP或Ge MP，其用如表2所描述的各种微量营养素囊封，以合成具有各种微量营养素负载的HA-EPO MP和Ge MP；(d)如表2所描述的游离微量营养素，其用于合成具有各种微量营养素负载的EPO MP；或(e)1mg/ml亲脂性碳花菁DiOC18(7)染料(DiR,生命技术公司(Life Technologies))和100mg/ml的EPO于二氯甲烷中，其用于合成荧光标记的EPO MP。然后将所得有机相在20ml、10mg/ml的聚乙烯醇(PVA)溶液中乳化，搅拌速率为300rpm，持续10分钟。在搅拌下(500rpm，持续10分钟)，将获得的乳液加入到100ml去离子水中，以固化MP。使获得的MP在重力作用下沉降，并且用水彻底洗涤。通过冻干获得最终的干燥MP。
值得注意的是，为了制备与四种不同的MN共囊封的EPO-MP，将维生素A(10mg/ml)和维生素D(2mg/ml)直接溶解于EPO(100mg/ml，1ml)于二氯甲烷中的溶液中，并且然后将负载B9的HA-MP(1.3mg)和负载B12的HA-MP(1.3mg)分散在以上溶液中。
形态学MP表征
使用三种不同的微观方法来表征MP的大小、形态和横截面；即，光学显微镜(Olympus MX40)、扫描电子显微镜(JEOL 5910SEM)和共聚焦显微镜(Zeiss LSM 700 LaserScanning Confocal)。在SEM成像之前，用Pt/Pd对干燥的MP进行包衣。在405nm的激发波长下，通过共聚焦显微镜使染料标记的HA-MP可视化，其中带通过滤器为420-475nm。基于至少20个来自SEM图像的颗粒计数，使用ImageJ估计已报告的平均颗粒直径。
MN负载内容和囊封效率
维生素B2、B3(烟酸)、B9(叶酸)、B12、A和D通过HPLC(安捷伦1100；安捷伦科技公司(Agilent Technologies)，圣克拉拉,加利福尼亚州(Santa Clara,CA))使用C-18柱(AcclaimTM PolarAdvantage II，3μm，4.6×150mm)进行分析，并分别在265nm、265nm、286nm、550nm、325nm和264nm下通过光电二极管检测器进行检测。铁、生物素、锌和维生素C通过生物视觉比色测定试剂盒(BioVision colorimetric assay kit)进行分析，并且维生素B7(生物素)通过西格玛比色测定试剂盒(Sigma colorimetric assay kit)进行分析。用UV-Vis吸光度在288nm下测量碘。
将负载微量营养素的HA MP溶解于水中，并如以上所描述的测定每种相应的微量营养素的微量营养素含量。
为了量化EPO MP中的微量营养素负载，首先将已知质量的EPO MP溶解于SGF中，并且然后加入1M氢氧化钠(NaOH)溶液以中和pH。通过使用Amicon超离心过滤器(3000NMWL)在14000×g下离心30分钟来去除沉淀的EPO，并如以上所描述的分离和量化上清液中的溶解的微量营养素。
为了量化维生素A和D的负载，将EPO MP溶解于二氯甲烷中，并如以上所描述的分离和量化已溶解的维生素A和D。
将已知量的负载DiR的EPO-MP溶解于DMSO中，并且然后使用多模式读数器(ECAN
Figure BDA0002660121650000301
M200 PRO)在750nm下对已溶解的货物进行量化。
负载量(LC)被定义为每毫克颗粒的MN含量(μg)。通过将负载到颗粒中的MN的量除以在乳化工艺期间最初添加的MN的量来计算囊封效率(EE)。
MN的体外释放
在三种不同的环境中研究了来自MP的微量营养素的释放曲线：
(a)室温下的水、
(b)100℃的沸水，以及
(c)37℃下的SGF(pH 1.2)。
在预定时间点处，所有样品以4000rpm离心5分钟，并收集900μl的上清液以用于分析，并且然后用900μl的新鲜释放培养基补充样品。具体地对于维生素A和D，将水性释放介质与二氯甲烷层接触，然后使用有机相内的已提取脂溶性维生素进行分析。以上描述了用于每种MN的量化方法。将累积释放计算为在特定时间点处相对于最初负载的量的MN释放总量。
MN稳定性
将干燥的负载微量营养素的MP分散在水中，并且然后在4000rpm下离心5分钟之前在100℃下加热2小时。使用如以上所描述的方法对上清液和MP两者中的化学稳定的MN进行量化。稳定性百分比等于加热后如通过HPLC测定的稳定MN与MP中MN的实际负载含量的比率。对于未囊封形式的样品，在加热2小时之前，将其溶解于水中(水溶性维生素，如维生素B9和B12)或分散在水中(脂溶性维生素，如维生素A和D)。将负载铁的HA-EPO-MP分散在水中，并且然后在100℃下加热2小时，并如以上所描述的分析亚铁和铁的含量。
对于香蕉牛奶实验，强化浓度为每食物鲜重15ppm的铁，使得100g可食用部分将含有1.5mg Fe。香蕉牛奶测试在室温下进行。在0分钟、15分钟、30分钟、60分钟、120分钟和1440分钟(24小时)下使用美能达色度仪CR-300(柯尼卡美能达公司(Konica Minolta))进行颜色测量。将样品在200rpm下搅拌持续时间2小时，并在4℃下储存过夜。颜色的变化用ΔE表示，所述ΔE表示绝对色差，但不是色差的方向。将FeSO4和焦磷酸铁(FePP，20％铁，微粉化粉末)用作阳性对照和阴性对照。
结果
颗粒合成和表征
开发了用于水溶性MN(图1A)和脂溶性MN(图1B)的单独的基于乳化的囊封方法，以解决用于物理上不同的MN和化学上不同的MN的调配物挑战。用于囊封基质的聚合物选择最终决定了性能，并且因此决定了MP强化的潜在影响。MP的外基质由
Figure BDA0002660121650000312
EPO组成，这是一种食物级和pH响应性的基于甲基丙烯酸酯的共聚物，所述共聚物促进在酸性胃条件下的快速降解以及随后的有效载荷释放。酸性条件下的MP降解对于在胃中实现有效载荷释放是必不可少的，以便确保充分的肠道吸收。中性条件下的MP稳定性是经常被忽视的强化要求，如果实现了，将会防止烹饪条件下(例如沸水中)过早的有效载荷释放，这可能导致MN降解，并且因此最小化强化驱动的健康益处。
表2中示出了囊封单个MN的实验室规模的MP中的每一个的调配物参数和负载。
表2实验室规模的MP的调配物参数和负载
Figure BDA0002660121650000311
对于水溶性MN的囊封，使用两步乳化工艺(图1A)，其中首先使用油包水(W/O)乳化步骤将水溶性MN囊封在透明质酸(HA)-MP(HA-MP)或明胶(Ge)-MP(Ge-MP)中。HA是普遍可见于人体的非硫酸化糖胺聚糖，通常用于口服补充HA并且用于增强维生素稳定性。通过SEM对HA-MP和Ge-MP进行检查，揭示了具有光滑表面的球形颗粒的存在。HA-MP和Ge-MP的平均直径大小被测定为大约5μm。例如，HA-MP的平均大小被估计为4±2μm。在第二步骤中，使用水包油(O/W)乳液将HA-MP或Gel-MP囊封到EPO基质中，以合成最终的EPO MP包HA(HA-EPO-MP)或EPO MP包Ge(Ge-EPO-MP)。横截面SEM和荧光标记的HA揭示了HA-EPO-MP展现了分级的颗粒包颗粒结构。
对于脂溶性MN的囊封，利用单步乳化工艺(图1B)将MN直接囊封到EPO基质(EPO-MP)中。在这种情况下，横截面SEM揭示了，在没有HA-MP的情况下，EPO-MP中不存在HA-EPO-MP的分级结构。
HA-EPO-MP、Ge-EPO-MP和EPO-MP表现出具有光滑表面且直径大小大为大约200μm的球形。例如，EPO-MP和HA-EPO-MP的大小被计算为214±16μm。
值得注意的是，图1B所展示的单步乳化工艺还可以用于囊封水溶性MN。生产了囊封单个水溶性MN(包含维生素C、维生素B2、锌和碘)的EPO-MP(表2)。
脂溶性微量营养素和水溶性微量营养素的单独囊封和释放
将代表性的脂溶性MN(包含维生素A和D)和代表性的水溶性MN(包含维生素B2、B3(烟酸)、B7(生物素)、B9(叶酸)、和B12、锌、碘和铁)用作模型MN以建立用于脂溶性MN和水溶性MN的囊封方法。表2中总结了囊封这些代表性MN的MP的调配物。维生素A、B2、C和D、锌和碘通过一步乳化工艺单独囊封，而维生素B3(烟酸)、B7(生物素)、B9(叶酸)和B12以及铁通过两步乳化工艺单独囊封。
体外释放研究证实，在暴露于室温(RT)水和沸(100℃)水后微量营养素保留在MP中(图2A-2K)。当颗粒暴露于pH 1.5的37℃模拟胃液(SGF)中时，表现出pH响应性突然释放。在模拟烹饪条件下，微量营养素在沸水中保留2小时被用作MP稳定性的基线指标，因为如维生素A等微量营养素在暴露于高温或高湿度时会发生化学降解。一步工艺被确认用于实现在100℃水或RT水中的保留(在120分钟下>80％)和在37℃SGF中的快速释放(30分钟下>80％)以用于大多数单独囊封的微量营养素(图2A-2F)。两步工艺被开发以进一步稳定EPO基质中的高水溶性微量营养素(图2G-2K)。更具体地说，当使用包含HA作为稳定化生物聚合物的两步工艺囊封FeSO4时，有效载荷在100℃水或RT水中被大量保留(在120分钟下>90％)，并在37℃SGF中快速释放(在30分钟下>80％)(图2K)，而通过一步工艺合成的FeSO4调配物表现出有效载荷释放，甚至在RT水中也是如此。将棕榈酸视黄酯(维生素A)用作模型MN，以建立用于脂溶性MN的囊封方法。维生素A通过O/W乳化直接掺入EPO-MP中。维生素AEPO-MP在37℃的SGF中表现出快速有效载荷释放(图2A)，这模拟了胃中的酸性胃条件。当维生素A EPO-MP在室温和100℃沸腾条件下与水接触2小时时，不能检测到维生素A的释放(图2A)。维生素A EPO-MP表现出与不含MN的MP类似的光滑表面，这可能是由于EPO和维生素A的脂溶性性质。当在室温下与SGF接触时，用时差显微镜(Time-lapse microscopy)来可视化维生素A从EPO-MP中释放的情况。EPO-MP的快速溶解(<1分钟)促进了维生素A有效载荷的释放，所述维生素A有效载荷可以被视为不溶于水的维生素A的扩散周期，其大小随时间而增长。
负载铁的MP通过两步乳化工艺合成(图1A)，首先将铁囊封在HA中，并且然后到EPO基质中以形成铁HA-EPO-MP，与维生素A EPO-MP相比，表现出类似的释放曲线。大部分铁有效载荷在SGF中在30分钟内迅速释放，并且小于5％的铁有效载荷在2小时后在沸水和室温水中释放(图2K)。与光滑的维生素A EPO-MP表面相比，负载铁的HA-EPO-MP表现出粗糙的表面。通过SEM可视化负载铁的HA-EPO-MP的横截面，在HA-EPO-MP的内部可以清楚地看到类似于不含MN的HA-EPO-MP的内部分级结构的负载铁。与维生素A EPO-MP类似，当在室温下暴露于SGF时，负载铁的HA-EPO-MP在一分钟内迅速溶解并释放铁-HA-MP有效载荷。
这些结果强调了基于EPO-MP的用于水溶性MN或脂溶性MN的两种不同的囊封方法如何促进胃条件下的快速释放，同时限制水条件下的过早释放。
使用维生素B12作为代表性微量营养素研究了pH在调节释放动力学中的作用，其中有效载荷释放在较低的pH值下更快地实现(图3)。
在热、水、紫外线和氧化剂下的微量营养素稳定性
如维生素A和铁等许多微量营养素，对高温、湿度、紫外线或氧化化学物质敏感，这可能导致降解或氧化状态的变化，并且因此限制摄入后的吸收。如此，针对单独囊封的调配物，研究了EPO囊封在改进微量营养素稳定性以应对这些挑战方面的作用。在暴露于沸水2小时后，对微量营养素有效载荷的保护进行了研究，所述沸水使有效载荷暴露于高温和湿度。对于囊封的脂溶性微量营养素维生素A和D，在暴露于沸水条件2小时后，与未囊封的对应物相比，分别观察到超过5倍和18倍的提高的回收率(图4A)。类似地，囊封在沸腾期间保护水溶性维生素C和B2，因为与未囊封的对照相比，两种水溶性维生素均表现出显著提高的回收率(图4A)。
还研究了光暴露24小时后(280μW/cm2)对微量营养素有效载荷的保护，因为维生素A和维生素D均以其未囊封的形式被紫外线快速降解(图4B)。对于维生素A和D，在囊封在EPO MP中后，与未囊封的对照相比，光暴露后的回收率分别显著提高了超过15倍和3倍(图4B)。
强化产品中的微量营养素与食物源中天然存在的微量营养素之间可以容易发生自发氧化还原反应，并且这些反应可能对吸收和生物利用度产生负面影响。例如，食物中存在的多酚催化铁氧化，导致显著的颜色变化，从高度生物可用的亚铁(Fe2+)状态转变为表现出较差生物利用度的铁状态(Fe3+)(Moore等人,《临床研究杂志(Journal of ClinicalInvestigation)》,23,755(1944)；Mellican等人,《农业与食品化学杂志(Journal ofAgricultural and Food Chemistry)》,51,2304-2316(2003))。为了检查EPO囊封是否能防止囊封的铁与氧化化学物质之间的相互作用，将EPO囊封的和未囊封的铁加入到富含多酚的香蕉牛奶中，并对颜色随时间推移的变化进行量化。与未囊封的铁相比，在香蕉牛奶中，HA-EPO MP中的铁囊封表现出显著较少的颜色变化，以及因此较少的氧化(图4C)。这些结果表明，EPO MP基质可以限制食物中囊封的铁与游离多酚之间的相互作用。
研究了HA-EPO-MP中的铁囊封如何影响在开放容器中水沸腾期间的氧化，因为高温和大气暴露均将加速铁的氧化。对于囊封的铁，少于2％氧化成三价铁，并且对于未囊封的铁，超过15％氧化成三价铁(图4D)。在这种情况下，铁的囊封显著改进了对氧化的抗性，以保持处于生物可用的亚铁状态。
还测量了烘烤条件下颗粒中铁的回收率。烘烤后，回收了>65％的铁(图4E)，并保留了完整的颗粒，表明烘烤不会影响颗粒形态。
为了证明在暴露于高温、湿度和氧气之后维持铁的pH受控释放的能力，首先沸腾2小时并且然后浸入SGF的负载铁的MP使用实时显微镜进行可视化，并且证实其在低pH下维持快速释放其铁有效载荷的能力。沸腾后，HA-EPO MP保留了与预沸腾类似的形态。
总的来说，这些结果表明，在暴露于高温、湿度、紫外线和氧化化学物质期间，EPO中的囊封保护了微量营养素有效载荷。
脂溶性微量营养素和水溶性微量营养素的共囊封
另外还使用两步方法来使步骤1中引入的四种维生素(水溶性维生素B12和B9(叶酸))共囊封以形成囊封维生素B12和/或维生素B9的HA-MP。这些HA-MP和脂溶性维生素A和D与EPO一起添加到油相中，然后进行O/W乳化(图5A)。测试了共囊封的颗粒在SGF中的释放以及在室温和沸水中的稳定性。已知烹饪过程中的加热会降解MN，并且从而限制其吸收和代谢。与维生素A EPO-MP和负载铁的HA-EPO-MP类似，囊封EPO的基质促进在37℃的SGF中快速且同时释放共囊封的有效载荷(图5B)。对于MN中的任何MN，这些有效载荷保持稳定，并且在室温下不会在水中释放(图5C)。在沸腾条件下，在水中2小时之后，共囊封的MN中的三个(维生素B12、A和D)释放出<5％其有效载荷(图5D)。然而，与单独的负载MN的颗粒不同，约25％的维生素B9在沸腾条件下在水中2小时之后释放(图5D)，尽管已释放的B9和囊封的B9两者的稳定性不受这些条件的影响。这些结果表明，EPO MP系统用于以模块化方式共囊封微量营养素，在沸水中2小时期间提供保留，并实现在37℃SGF中突然释放。
光暴露16小时后(280μW/cm2)，未囊封的维生素A和D均表现出较低的回收率，分别为4±2％和27±2％(图5E)。然而，对于维生素A和D，在囊封在EPO-MP中后，光敏性分别显著提高超过15倍和3倍(图5E)。
在水中沸腾2小时后，对于维生素A和D，EPO-MP囊封的调配物所引起的维生素回收率提高了超过6倍和18倍(图5F)。在水溶性维生素B9和B12的情况下，HA-EPO-MP囊封在提高烹饪条件期间的维生素稳定性方面没有提供优势(图5G)，这可能是由于维生素B9和B12在没有囊封的情况下在烹饪条件下就已经稳定了。
最后，测试EPO-MP囊封的MN在水中沸腾2小时后维持生物活性的能力。在脂溶性维生素A和D的情况下，使用ELISA测定来确认已释放的MN的生物活性，而对于水溶性维生素B9和B12，使用微生物测定。
在所有情况下，至少75％的囊封的MN维持与生物实体相互作用的能力(图5H)。总的来说，这些结果表明，共囊封多种脂溶性MN和水溶性MN的EPO-MP系统增强了脂溶性MN的光稳定性和热稳定性两者，并促进保存所有共囊封的维生素的生物活性。
实例2：从EPO-MP中释放有效载荷的体内研究
材料和方法
在小鼠中研究负载DiR的EPO-MP的溶解
雌性SKH1-精英小鼠(Crl：SKH1-hr)在8-12周龄时购自查尔斯河实验室(CharlesRiver Laboratories)。在治疗前，向小鼠饲喂不含苜蓿的平衡膳食(哈兰实验室(HarlanLaboratories)，AIN-76A)10天，以降低与食物相关的自体荧光。
在100μl水中通过管饲法(n＝3)施用大约200mg如实例1所描述的制备的负载DiR的EPO-MP。15分钟、30分钟或60分钟之后，用二氧化碳窒息法对小鼠实施安乐死。胃肠道立即被移植并使用体内成像系统进行成像(IVIS，珀金埃尔默(PerkinElmer))。将来自已经摄入了负载DiR的EPO-MP的小鼠的荧光信号与未接受MP的小鼠进行比较。然后在计算上将与囊封和释放的DiR相关的频谱特征与组织自体荧光(在对照样品中标识)分离，以确定染料释放的位置和状态。通过将胃或肠中囊封或释放的染料信号标准化为未接受EPO MP的对照动物中的背景来确定已量化的信号/背景比率。
大鼠体内维生素A的吸收
氚标记的棕榈酸视黄酯(美国放射性标记化学公司(American RadiolabeledChemicals,Inc.))用于检测血液中已吸收的维生素A的量。通过以上所描述的O/W乳化法制备放射性标记的VitA-EPO MP。雌性威斯塔大鼠(Wistar rats)(约250g)购自查尔斯河实验室。将大鼠分成两组：(i)游离维生素A和(ii)VitA EPO-MP。在游离组中，维生素A以4％v/v的乙醇/水混合物的形式递送，以实现维生素A的溶解。VitA EPO-MP分散在水中，并旋涡形成悬浮液。对每只大鼠口服管饲10μCi游离形式的或350μL乙醇/水混合物或水总量中的囊封的MP中的维生素A。注射器和管饲针中的残留维生素A被保存，并通过闪烁计数器进行量化，以计算每只大鼠的T-RP的实际饲喂量。在0.5、1、2、3、4、5、6小时处，通过异氟烷麻醉大鼠，并从侧尾静脉收集200μL的血液。通过Tri-Carb 2810 TR液体闪烁计数器的液体闪烁计数对样品中的放射性进行量化。为了计算维生素A在VitA EPO-MP中的负载，首先将MP溶解于1mL的二氯甲烷中，并且然后将5μL溶液与10mL Ultima GoldTM F液体闪烁混合液(珀金埃尔默公司(PerkinElmer Inc.))混合。遵循已推荐的方案，将血液(200μL)溶解于SOLVABLETM(珀金埃尔默公司)中，并且然后1mL的已溶解血液是作为样品溶液的10mL Hionic-Fluor液体闪烁混合液。
结果
在小鼠中研究负载DiR的EPO-MP的溶解
为了证实EPO-MP在体内的溶解，使用雌性SKH1-精英小鼠来用EPO-MP囊封的NIR荧光染料DiR(1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚三碳菁碘化物)作为模型有效载荷跟踪有效载荷释放。口服管饲负载DiR的EPO-MP，并且切除完整的胃肠道组织以用于离体荧光成像。在3个不同的时间点(长达1小时)下可视化和量化染料的物理状态(囊封或释放)以及染料在胃肠道中的生理位置。
通过使用已建立的成像技术研究环境条件对DiR的荧光性质的影响，证实DiR可以在囊封状态和释放状态下进行区分(Ran和Moore,《分子成像和生物学(Molecular Imagingand Biology)》,14,293-300(2012))。当负载DiR的EPO-MP悬浮于水中时，获得了负载DiR的EPO-MP的14点频谱指纹(fingerprint)。相比而言，当DiR从SGF中的EPO-MP中释放时，DiR表现出蓝色转移。此转移表现出与囊封的DiR不同的频谱曲线，并且因此囊封的DiR和释放的DiR可以使用其不同的荧光指纹进行区分。囊封形式或释放形式的染料的两个指纹用于间接反映EPO-MP在体内的溶解。
在15分钟时，胃含有囊封的DiR和释放的DiR的混合物，这表明EPO-MP部分溶解，并且有效载荷的一部分被释放，但尚未进入肠。
在30分钟时，大部分DiR信号被检测为肠中释放的染料。
在60分钟时，可检测到EPO-MP囊封的DiR的最小信号，强调了所有颗粒在1小时时如何释放其有效载荷。此外，释放的染料信号仅在肠中，这暗示着已释放的有效载荷有效地离开胃并进入肠进行吸收。
图6A示出了对胃中的囊封的染料、胃中的释放染料、肠中的囊封染料和肠中的释放染料的量化分析。
这些发现证实了模型有效载荷从口服施用的MP快速释放到小鼠胃肠道中。
大鼠体内维生素A的吸收
为了确定有效载荷从EPO-MP体内快速释放是否会促进囊封的微量营养素的吸收，研究了雌性威斯塔大鼠中维生素A的吸收。以游离形式和EPO囊封的形式通过管饲法向大鼠口服施用氚标记的维生素A，并在6小时时段内采集血液样品以评估维生素A含量(图6B)。相对于游离维生素A，囊封的维生素A表现出统计学上不可区分的吸收(图6B)，强调了在EPO中的囊封不影响吸收。
实例3：临床研究1：实验室规模Fe-HA-EPO MP的铁生物利用度
材料和方法
参与者
人类研究采用随机单盲交叉设计。在研究1和研究2中，从苏黎世瑞士联邦理工学院(Swiss Federal Institute of Technology in Zurich)(ETH)和苏黎世大学(University of Zurich)(UZH)的女学生中招募了参与者。纳入标准为：女性，明显健康、年龄在18到40岁之间、低铁存储(血浆铁蛋白<25μg/L)、体重<65kg、身体质量指数18.5–25kg/m2、未孕(通过妊娠测试评估)非泌乳、血红蛋白>90g/L、正常C-反应蛋白(<5.0mg/L)、无慢性疾病或药物治疗(口服避孕药除外)、第一次测试膳食施用前2周内不食用矿物质补充剂和维生素补充剂、过去4个月期间没有输血、献血或重大失血(意外、手术)、签署了知情同意书。
由苏黎世州伦理委员会(Cantonal Ethics Commission of Zurich)的伦理审查委员会(ethical review committee)(人类研究1：KEK-ZH-Nr.2015-0094；人类研究2：KEK-ZH-Nr.2017-01624)和MIT利用人类作为实验受试者委员会(人类研究1：COUHES#1502006932；人类研究2：COUHES#1801201448/1801201448A001)提供了两项研究的伦理批准；两个试验在针对人类研究1的临床试验政府标识号NCT02353325和针对人类研究2的临床试验政府标识号NCT03332602上进行注册。
研究设计
使用单盲随机交叉设计进行了两项研究。在研究1中，施用了由玉米粥组成的三种测试膳食，并且在研究2中，参与者食用了九种小麦面包测试膳食。使用稳定的铁同位素(54Fe、57Fe、或58Fe)用4mg Fe将所有测试膳食标记为FeSO4。已标记的FeSO4由Dr.PaulLohmann GmbH公司(德国)从同位素中富含54Fe-58Fe和57Fe的元素铁(Chemgas公司，法国布洛涅(Boulogne,France))中制备。维生素A(BASF)、HA(华熙生物科技有限公司(BloomageFreda Biopharm Co.,Ltd.))和叶酸(频谱化学公司(Spectrum Chemical))均为食物级。在每个研究中包含不同的参与者，在登记后，将每个参与者分配到随机均衡块设计中的测试膳食组合的预定时间表，并且将每个参与者用作其自己的对照。在研究1中，测试膳食是玉米粥，在烹饪之前或之后加入强化盐。所述研究基于与对数转换铁吸收的0.23的标准偏差、5％的I型错误率且80％的效能来检测组内35％的在铁吸收方面的差异。此计算产生了20名受试者的样品大小。受试者以随机顺序食用3种铁稳定同位素标记的测试膳食(随机平衡块设计)。在负载铁的EPO-HA-MP中两种膳食含有作为标记的FeSO4(54Fe或58Fe)的4mg Fe并且一种膳食含有标记的铁(57Fe)。测试膳食是玉米粥，在烹饪之前或之后加入强化盐。通过强化盐加入到粥中的铁的量大致对应于直接强化玉米粉中60ppm的铁的水平。强化盐含有以下任一种：a)FeSO4(参考)；b)在烹饪前加入的负载铁的EPO-HA-MP；或c)烹饪之后加入的负载铁的EPO-HA-MP。在一周内连续3天施用测试膳食。从筛选到最终静脉穿刺的研究持续时间为24天。
在研究2中，测试膳食为小麦面包，所述小麦面包在烘烤前被强化。加入到面包的铁的量是小麦粉中67ppm的铁。测试膳食含有以下任一种：(a)负载铁的EPO-HA-Fe(3.19％)；(b)负载铁的EPO-HA-Fe(18.29％)；(c)负载铁的HA-Fe(8.75％)；(d)具有VitA-EPO(3.4％；37.65mg vitA)的负载铁的EPO-HA-Fe(3.19％)；(e)具有VitA-EPO(3.4％；37.65mg vitA)以及游离叶酸(0.34mg)的负载铁的EPO-HA-Fe(3.19％)；(f)FeSO4；(g)具有HA的FeSO4(25.68mg，以与组(a)中的HA匹配)；(h)具有EPO的FeSO4(85.19mg，以与组(a)中的EPO匹配)；或(i)具有EPO(85.19mg，以与组(a)中的EPO匹配)以及HA(25.68mg，以与组(a)中的HA匹配)的FeSO4。
研究程序
研究1于2016年3月到4月在苏黎世的人类营养学实验室(Laboratory for HumanNutrition)(HNL)进行。118名参与者在测试膳食施用前1-2周参加了筛查，测量了体重和身高，收集了Hb、PF和CRP测量的血液样品，并且邀请20名符合纳入和排除标准的参与者参与。三分之二的受试者缺铁；没有人贫血。所有膳食都含有4mg标记为FeSO4的铁。具有EPO-HA-Fe微球体的膳食含有800mg EPO和40mg HA。施用前，根据美国药典，对负载铁的EPO-HA-MP进行了测试，并宣布溶剂残留、内毒素和微生物生物负荷为阴性。
标准化测试膳食在每个研究日都是新鲜准备的。其由50g全玉米粉制成的粥，配有30g蔬菜酱(44％卷心菜、21％胡萝卜、21％西葫芦、12％洋葱、2％油)和2.5g盐组成。根据测试膳食，在烹饪之前或之后(在100℃下烘烤1小时)，用加入到测试膳食中的FeSO4或负载铁的EPO-HA-MP强化2.5g盐。玉米粉含有1.52mg Fe/100g和736.8mg植酸/100g。每种测试膳食含有50g玉米粉和另外的4mg的强化铁；因此，测试膳食中的总铁和植酸含量为4.8mg Fe和368mg植酸，导致铁与植酸的比率为1:6.5。测试膳食的抗坏血酸含量可忽略不计，为0.4mg/膳食。因此，就铁吸收而言，测试膳食基质是抑制性基质。蔬菜酱是批量制备的，并且部分地冷冻保存直到施用。玉米粉预烹饪如下：在测试膳食施用的前一天晚上，将每个单独的玉米部分与18MΩ/cm的温水混合，在微波炉中预热(1分钟，600W)，并且然后在100℃的烤箱中烘烤60分钟。
冷藏过夜后，在施用当天，玉米粥在微波炉中以600W预热1分钟，并且然后在烤箱(100℃)中烹饪另外的30分钟。在微波步骤之前，对具有已烹饪的负载铁的EPO-HAMP的测试膳食进行强化。在加入微球体之前，将具有未烹饪的负载铁的EPO-HA MP的测试膳食冷却10分钟至略低于50℃。解冻和预热的蔬菜酱是仅在上菜前加入的。超纯水(300ml)充当测试膳食的饮料。
连续3天(研究日D1、2和3)施用测试膳食A、B和C。受试者被要求在测试膳食施用的前一天晚上21.00之后不食用固体食物，并且24.00之后不食用流体。在直接监督下，他们每天早上07.00-09.00之间食用测试膳食。受试者食用完整个膳食后，用10ml水冲洗碗两次，并且参与者饮用冲洗液体，并在测试膳食施用之后保持禁食3小时(不吃不喝)。在D17，采集静脉血液样品以测定Hb、PF、CRP，并测定进入红细胞的稳定铁同位素比率。
研究2在2018年4月至7月之间在HNL处进行。在测试膳食之前，77名参与者参加了筛查，测量了体重和身高，收集了Hb、PF和CRP测量的血液样品，邀请24名符合条件的参与者参与。参与者被要求与研究1中相同的禁食条件。在食用完整个面包测试膳食后，参与者被要求食用掉在盘子里的所有面包屑。与研究1一样，参与者在测试膳食施用后保持禁食3小时。将9种测试膳食分3块进行施用，在第一周内，连续3天(D1、2和3)施用3种测试膳食。在D22，抽取血液样品以用于测定Hb、PF、CRP，并测定进入红细胞的稳定铁同位素比率。在D22、23和24施用下一块测试膳食，并在D43再次抽取血液样品，在所述周内在D43、44和45施用最后一块测试膳食。在D64采集最后一份血液样品。所有面包卷测试膳食在测试膳食施用的前一天下午制备，制备两个面团，每个面团由1kg精制小麦粉、5.5g盐、14g干酵母和650g超纯水制成，使用厨房机器揉捏面团10分钟。并且然后称重到100g的一部分中，所述部分的1/3用微球体强化，并且所述部分的2/3用于覆盖强化核心。成型后，面包卷在30℃和80％相对湿度下发酵45分钟，并且然后在190℃下烘烤20分钟。他们在冷却机架上冷却，并用纸包裹起来，并且在室温下储存直到第二天早上食用。面包卷由59.9g小麦粉、0.3g盐和0.8g干酵母组成。300ml超纯水用作饮料。
测试膳食分析和血液分析
在开始研究铁同位素组成和示踪铁浓度之前，使用以下概述的实验技术，通过反向同位素稀释质谱法分析标记的铁化合物。通过使用库尔特计数器(Coulter Counter)测定Hb(研究1：贝克曼库尔特(Beckman Coulter),美国加利福尼亚州；研究2：Sysmex XN-350)。血浆铁蛋白(PF)和C-反应蛋白(CRP)通过免疫测定法测定(研究1：西门子医疗保健IMMULITE 2000；研究2：IMMULITE 1000)。贫血被定义为Hb<12g/dL，缺铁(ID)被定义为PF<15mg/L，并且ID贫血被定义为Hb<12g/dL且PF<15mg/L。
测试膳食的样品分析一式三份地进行。微波消解矿化后(MLS ETHOSplus，MLS)，通过石墨炉原子吸收分光光度法(AA240Z；Varian)测定玉米粉和面包卷中的铁浓度。通过分光光度法使用Makower方法测定玉米粉和面包卷的植酸盐浓度，其中铁在沉淀步骤中被铈代替(Makower,《谷类化学(Cereal Chem)》,47,288-&(1970))。在10％偏磷酸中稳定后，通过HPLC(Acquity H级UPLC系统；水AG)测定测试膳食中抗坏血酸浓度。
在D17(研究1)和在研究2中在D22、43和64收集的全血液样品使用HNO3/H2O2混合物和微波消解进行矿化，随后通过阴离子交换色谱和氢氧化铵沉淀步骤从血液基质中分离铁。使用MC-ICP-MS(Neptune；赛默飞(Thermo Finnigan))执行所有同位素分析。在施用测试膳食后14天，基于铁同位素比率的转移和铁在体内循环的估计量计算血液中57Fe、54Fe和58Fe同位素标记的量。基于血红蛋白和血容量计算铁在体内循环，所述血红蛋白和血容量由参与者的身高和体重得出。基于将已吸收的铁80％掺入到红细胞的假设计算吸收分数(Fractional absorption)(FIA)。在研究2中，D22和43的同位素比值用作随后测试膳食施用的新基线值。铁的相对生物利用度(RBV)计算如下：100/FIA参考膳食*FIA测试膳食。
统计分析
使用双尾学生t检验评估统计显著性。<0.05的P值被认为在统计学上是不同的。两项人类研究基于与对数转换铁吸收的0.35的标准偏差、5％(双尾)的I型错误率且80％的效能来检测组内30％的营养相关的在铁吸收方面的差异；此计算产生了18名受试者的样品大小。在研究1中，预期退出率为10％，并且因此招募了20名参与者；在研究2中，由于研究持续时间较长，预期退出率为30％，因此招募了24名受试者。
统计分析使用SPSS版本22(人类研究1)和版本24(人类研究2)(IBM SPSS统计)来完成。所有数据在分析前都进行了正态分布检查，年龄、体重、身高、Hb、CRP都是正态的，并且数据以平均值和标准偏差呈现。PF和Fe吸收分数是非正态的，并且呈现为几何平均数和95％CI。膳食之间的比较是使用线性混合模型中拟合的平方根变换数据进行的。膳食作为重复的固定因素(协方差类型的缩放身份)输入，并且受试者作为随机因素(截距)输入。如果发现膳食的显著的总体影响，则使用邦费罗尼校正执行不同膳食内的事后测试以进行多项比较。显著性水平设置为p值<0.05。
在研究1中，使用关于对数转换数据的SPSS(版本22，IBM公司)将广义线性混合模型拟合到数据。膳食作为固定因素输入[玉米FeSO4；玉米负载铁的EPO-HA-MP(预烹饪)、玉米负载铁的EPO-HA-MP(后烹饪)]从并且受试者作为随机因素(截距)。如果发现膳食的显著的总体影响，则使用邦费罗尼校正执行不同膳食内的事后测试以进行多项比较。
结果
缺铁性贫血是发展中国家最普遍的MN缺乏之一，并且也是发达国家的关注点，因为正在开发许多新技术来向患有慢性肾脏疾病的患者递送铁。如此，对负载铁的HA-EPO-MP进行了进一步评估，以研究其促进人体铁吸收的功效。EPO-MP基质可保护脂溶性MN免受热降解。然而，由于B9和B12两者固有地都是热稳定的，因此未建立对如B9和B12等水溶性MN的保护。与B9和B12不同，铁可以从高度生物利用的亚铁(Fe2+)状态氧化为表现出较差生物利用度的铁状态(Fe3+)。因此，在口服铁补充剂中防止铁氧化是必不可少的。
对实验室规模Fe-HA-EPO MP在人体内递送生物可利用铁的能力进行了研究。通过食用在随机单盲交叉设计中施用的3种铁稳定同位素标记的测试膳食以使年轻女性禁食(n＝20，血红蛋白(Hb)＝13.4±0.85g/L从，以及几何平均值(95％CI)，血浆铁蛋白(PF)11.6(9.4，14.5)μg/L)(表3)来研究人类对铁的吸收。在HA-EPO-MP中两种膳食含有作为标记的FeSO4(54Fe或58Fe)的4mg铁并且一种膳食含有标记的铁(57Fe)。测试膳食是玉米粥，其中在烹饪之前或之后加入强化盐。将未烹饪的囊封的铁与未烹饪的未囊封的铁直接比较。与游离未囊封的铁相比，负载铁的HA-EPO-MP表现出约45％的相对铁吸收(P<0.01)(图7A)。虽然数据的分布相当广泛，但游离的未烹饪铁的几何平均值为3.36，而未烹饪的微囊封(EPO-HA-Fe)的铁的几何平均值为1.46(表4)。
表3人类研究1和2的受试者特性。所有女性，研究群体之间基线特性无显著差异。
Figure BDA0002660121650000421
Figure BDA0002660121650000431
表4人类研究1中铁吸收分数的列表形式的临床结果。
Figure BDA0002660121650000432
1代表几何平均值(±SD)，是此类值。通过线性混合效应模型获得膳食对铁吸收的显著影响。通过邦费罗尼校正的事后配对比较，不同的下标显著不同(t检验，P<0.01)。
接下来在烹饪条件和未烹饪条件下比较负载铁的HA-EPO-MP。在这种情况下，未烹饪的负载铁的HA-EPO-MP的铁吸收几何平均值为1.46，而烹饪的负载铁的HA-EPO-MPs的Fe吸收几何平均值为1.41(表4)。这些结果强调了烹饪HA-EPO-MP囊封的铁如何不损害其吸收，因为对于烹饪或未烹饪的微囊封的铁，铁吸收没有显著差异(图7B)。尽管临床研究清楚地表明，如与未经受烹饪的未囊封相比，HA-EPO-MP中的铁囊封抑制了铁的吸收，但实验室规模和实验室开发的调配物在向人类递送生物可利用铁方面显示出了与烹饪条件无关的功效。
实例4：扩大生产
到目前为止描述的所有MP都是作为小规模研究实验室调配物构思和合成的。虽然在学术水平上，基于乳化的微囊封方法是大部分生物材料和调配物实验室的主要手段，但其限制了许多令人激动的技术的临床和商业翻译。如此，此实验室规模的技术被扩大用于合成大规模的负载铁的HA-EPO-MP和负载维生素A的EPO MP以用于工业转变。
材料和方法
扩大Fe-HA-EPO MP的生产
图8A示出了用于制造1kg或更多的Fe-HA-EPO MP的工艺。可商购的喷雾干燥器用于调配HA-MP来代替最初的W/O乳液。用于实验室规模的调配物的第二乳化步骤被可商购的旋转盘雾化器代替。
Niro生产小型中试规模的喷雾干燥器首先用于制备Fe-HA MP。进料溶液含有525.5g透明质酸钠、1309.5g水合硫酸铁和77L去离子水。将此溶液以250g/min进料到干燥器中，并用2mm的双流体喷嘴雾化。干燥器入口温度设置为257℃，导致出口温度为90℃。回收了1215g的MP。
使用定制的旋转盘雾化系统，用EPO囊封Fe-HA MP。用溶解于12000g的二氯甲烷(DCM)中的1152g EPO和1.87g的聚山梨醇酯80制备进料溶液。将48g Fe-HA MP加入到DCM溶液中，并放置在超声浴中10分钟以形成稳定的悬浮液。将悬浮液以110g/min进料到直径为4的以1300rpm旋转的不锈钢定制盘上。将盘安装在30ft，高为20ft.×20ft的塔上。房间被加热到35-40℃。颗粒被收集在位于塔底部处的抗静电塑料上。回收了1059g的MP。
通过使用用于Fe-HA MP的Pro-CepT 4M8实验室喷雾干燥器，对这些工艺进行了修改以用于人类研究2中的批次。
除了用肥皂水和70％IPA水溶液清洗所有湿部件外，所有新的管道和过滤器都与喷雾干燥器一起使用。喷雾干燥器的入口温度设置为160℃，导致出口温度为大约53℃。通过0.4mm空气雾化喷嘴以8mL/min干燥溶液。
相同的旋转盘设置用于将Fe-HA MP囊封在EPO内。擦拭塔并清洗，随后用VespheneIIse处理。
扩大生产负载维生素A的EPO MP
还使用相同的旋转盘系统制备了用于饲喂研究的囊封的维生素A。将棕榈酸视黄酯形式的维生素A与EPO一起溶解于有机溶剂中，随后旋转盘雾化进入淀粉粉末中。当进料溶液以大约115或85g/min进料到4英寸的旋转盘中时，使用1675rpm的盘速度。所述材料被收集在粉末状的
Figure BDA0002660121650000441
淀粉中。然后从样品中筛分多余的淀粉，以回收维生素A MP。将所有样品放置在真空下，用缓慢的N2吹扫1周，以去除残留的DCM。
在一些形式中，调配物含有2g棕榈酸视黄酯，18g EPO(来自赢创公司)和270g二氯甲烷。
用丙酮直接代替二氯甲烷以测试溶剂对雾化的影响。使用与如以上所描述的相同的方法生产所得EPO MP。
还执行了由可替代的Vikram EPO(Vik-EPO)直接代替赢创EPO。使用与如以上所描述的相同的方法生产所得EPO MP。
将维生素A挤出到EPO中，以产生含有维生素A的颗粒或粉末。挤出是无溶剂/无水工艺。与喷雾干燥相比，此方法可以实现高通量，并且具有更好的可用性。
结果
扩大Fe-HA-EPO MP的生产
到目前为止描述的MP都是作为实验室规模调配物构思和合成的。尽管基于乳剂的微囊封方法在学术水平上是许多生物材料和调配物实验室的主要手段，但是当将其囊封在EPO中时，在增加铁负载方面遇到了明显的挑战。为了解决此，并且为了克服第一人类研究中遇到的吸收问题，开发了用于增加微量营养素调配物中负载铁的新工艺(图8A)。使用可商购的喷雾干燥器和定制的旋转盘雾化器分别以千克规模调配Fe-HA MP和Fe-HA-EPO MP。最初缩放的调配物被设计用于再创造第一人类研究中所用的0.6％铁负载。以中试规模(>1kg)生产Fe-HA-EPO MP的批次以及在第一人类研究中使用的那些相同组分，与在人类中测试的实验室规模调配物符合相同的负载、稳定性和pH控制的释放标准(图8B)。
在朝大规模批次转移时，负载铁的HA-EPO-MP表现出：(i)与实验室规模的调配物类似的大小；(ii)由于颗粒形态现在略微缩小/凹陷的球体而引起的结构变化；(iii)在37℃SGF中、在室温和100℃水中的释放曲线几乎相同(图8B)，以及(iv)在开放式容器沸腾期间对铁抗氧化的类似保护。
加入第二水溶性MN(氧化锌)既充当颜色掩蔽剂，又作为初始实例，以强调2种不同MN在单个颗粒中的扩大共囊封。测试了氧化锌的宽百分比范围，从总微量营养素的0％到95％。具有低百分比的氧化锌的MP由于较高浓度的铁而在MP中表现出棕色，而具有高百分比的氧化锌的MP由于较低浓度的铁表现出浅白色。
将EPO颗粒中铁的负载增加到3.19％(图8C)和18.29％(图8D)的工艺，另外降低了EPO量(表5)。还检查了这些缩放的MP防止如以上所描述的囊封的铁和食物中存在的氧化化学物质与富含多酚的香蕉牛奶之间相互作用的能力。已证明，如与所有游离形式的铁相比，Fe-HA-EPO MP在具有和不具有其它MP成分(即HA、EPO和具有具有EPO的HA)的情况下，诱导较少的颜色变化(图8E)。
扩大生产负载维生素A的EPO MP
使用旋转盘雾化进入淀粉粉末中的扩大生产产生了不同于实验室规模方法产生的那些负载维生素A的EPO MP的负载维生素A的EPO MP。
在朝大规模批次转移时，负载维生素A的EPO MP表现出(i)颗粒被淀粉包衣的结构变化；(ii)在37℃SGF中、在室温和100℃水中的类似释放曲线(图9A)；以及(iii)在水中沸腾2小时之后的类似的回收率(图9B)。
在各种条件下比较了实验室规模的负载维生素A的EPO MP、可商购的BASF维生素A调配物和缩放的负载维生素A的EPO MP的稳定性，包含(1)40℃，75湿度(图9C)；(2)在室温下暴露于阳光(图9D)；(3)在室温下悬浮于水中(图9E)；(4)在4℃下悬浮于水中(图9F)；以及(5)15℃，75％湿度(图9G)。显然，扩大负载维生素A的EPO调配物MP在稳定囊封的维生素A方面具有最佳性能。
在旋转盘雾化工艺期间将有机溶剂从二氯甲烷切换为丙酮不会在颗粒形成和收集方面造成任何显著差异。
从不同的供应商(即从赢创EPO到Vikram EPO)切换到可替代的EPO批次，不会在形成和收集方面造成任何显著差异。
如图10所展示的，使用挤出成功制备含有10％维生素的粉末，随后进行研磨。粉末的平均粒径易于受到研磨条件的影响，如研磨温度(例如，室温研磨或冷冻研磨)和研磨方法(例如，Fitz研磨或喷射研磨)。平均粒径的直径为大约30μm到大约500μm。随着时间的推移，粉末易于结块。
实例5：人类研究2–人类中较高负载的铁颗粒的生物利用度
材料和方法
实例3描述了人类研究2的详细程序。人类研究2中使用的负载铁的微粒在实例4中进行了描述，并在表5中列出。
表5.第二人类研究中使用的用于MP的工艺设计调配物参数和负载。
Figure BDA0002660121650000461
结果
在第二人类研究中，与第一人类试验中使用的实验室规模批次相比，Fe HA-EPOMP具有超过5倍且超过30倍的铁负载，即分别为3.19％的Fe-HA-EPO MP和18.29％的Fe-HA-EPO MP，以研究其将生物可利用铁递送给人类的能力。
在此研究中，非铁抑制性食物基质(小麦面包)被用于通过仅关注吸收来更好地比较未囊封的铁和囊封的铁，这与吸收和颗粒介导的防止与铁螯合或反应的小分子相反。在此研究中，在部分随机单盲交叉设计中施用的含有相同剂量的铁(4mg Fe)的9种测试膳食以使年轻女性禁食(n＝24，Hb:13.2±0.95g/l，以及PF:13.2(10.5，16.5)μg/L)(表3)。在3.19％54Fe-HA-EPO MP、18.29％57Fe-HA-EPO MP、和4mg未囊封的硫酸亚铁(58Fe，参考膳食)中，三种膳食含有标记为硫酸亚铁的铁。在所有情况下，在190℃下烘烤面包20分钟之前加入铁。与第一人类研究相比，18.29％的Fe-HA-EPO-MP(FIA:17.0(13.2，21.9)％)表现出相对于未囊封的铁(FIA:19.2(15.3，24.29)％)的无统计学差异的铁吸收(图11A)。如与未囊封和最高负载的18.29％Fe-HA-EPO Mp相比，5倍的高负载的3.19％Fe-HA-EPO MP(FIA:13.7(11.1，16.8)％)表现出显著较低的吸收。与参考膳食相比，3.19％和18.29％的Fe-HA-EPO MP分别表现出71(62，82)％和89(74，107)％的相对铁生物利用度。在此相同的人类研究中，研究了竞争性吸收可以如何影响Fe-HA-EPO MP中铁的吸收，所述竞争性吸收与其它微量营养素或EPO囊封的微量营养素以及Fe-HA-EPO MP的共递送相关。已证明，共同递送：(i)VitA-EPO MP(FIA:12.7(9.29，17.5)％)，或(ii)具有游离叶酸的VitA-EPO MP(FIA:14.3(11.2，18.3)％)不影响铁吸收(图11B)，这表明共同递送的微量营养素或EPO囊封的微量营养素之间的竞争并不是此处所研究组合的主要关注点。如与调配物Fe-HA-EPO MP相比，在4种另外的测试膳食中，研究了每种MP组分的单独作用以及以游离形式共同施用这些组分如何影响铁的吸收。结果表明，来自游离硫酸亚铁的吸收不会受到HA(FIA:20.7(16.1，26.7)％)、EPO(FIA:16.6(12.0，23.2)％)或HA-EPO(FIA:16.3(11.7，22.8)％)的显著影响。类似地，当将Fe囊封在HA中(FIA:15.1(11.3，20.3)％)时，铁吸收与参考膳食相比没有显著差异(图11C)。结果表明，如与游离铁相比，吸收不会受到HA或EPO的显著影响；然而，当将HA和EPO调配成MP时，与游离铁和具有HA的游离铁相比，观察到吸收降低(图11C)。重要的是，针对最高负载为18.29％的Fe-HA-EPO MP调配物，此现象不太可能发生，因为相对于参考其表现出相当的吸收(图11C)。总的来说，这些结果清楚地表明，可以通过开发和增加铁的负载以及减少HA-EPO MP中EPO含量来克服和解决在第一人类研究中观察到的吸收限制囊封。
实例6：体外肠屏障模型中的铁转运
材料和方法
表肠(EpiIntestinal)组织购自MatTek(马萨诸塞州亚什兰(Ashland,Massachusetts))，并按推荐使用。对于转运实验，分别制备并加入了颗粒成分EPO、Fe和HA，以实现如所报道的最终质量百分比。在37℃和5％CO2下温育1小时之后，使用先前描述的生物视觉比色测定法在底部井腔室中分析转运铁。
结果
尽管第一人类研究表明，如与未囊封的铁相比，Fe囊封在HA-EPO MP中降低了铁的生物利用度，但所述囊封系统在向人来递送生物可利用铁方面显示了与烹饪条件无关的功效。先前已经报道了，囊封微量营养素的材料可能对干扰吸收(Zimmermann,《国际维生素营养学研究杂志(Int J Vitam Nutr Res)》,74,453-461(2004))。因此，研究了HA和EPO在铁的肠吸收中独立发挥的作用。体外研究被设计为模拟口服摄入Fe-HA-EPO MP后人类肠上皮细胞屏障铁渗透的条件。可商购的人类肠上皮细胞屏障模型(表肠，MatTek，Ashland，MA)提供了测试平台以通过系统地改变铁、HA和EPO的相对浓度，来研究MP成分对肠铁吸收的影响。所述模型由从健康人供体获得的原代小肠上皮细胞组成，其中细胞被酶解离并在12孔板内的细胞培养插入物上的定制培养基中培养，形成功能性的柱状3D上皮屏障层(Maschmeyer等人,欧洲制药学与生物制药学杂志(Eur J Pharm Biopharm)》,95,77-87(2015))。通过将样品加入到肠屏障的顶表面来模拟铁调配物的口服施用，可将其作为孔板的上部隔室中的细胞培养插入物，并在一小时温育期之后将铁转运量化为通过组织屏障的量并且可以通过分析孔板下部隔室中的培养基来测定。与HA和/或EPO结合加入的铁的转运表示为在没有HA或EPO的情况下加入的游离铁的转运百分比。HA存在对铁通过肠屏障的转运没有表现出显著影响(图12A)。此外，铁很容易通过屏障以在此第一人类研究中测试的MP中使用的Fe:HA比率转运。相反，未囊封的EPO以增加百分比加入到铁中，则显著降低了铁通过肠屏障的转运(图12B，圆圈)。具体地，当以96％的EPO百分比(相当于在人类受试者中测试的MP中的EPO百分比)存在时，铁很难通过屏障转运。以当前MP调配物中存在的EPO的百分比计，与游离铁相比，铁的转运降低到37％。类似地，当将通过在SGF中温育而解离的MP的中性内容物加入到肠屏障中时，铁转运降低到针对游离铁测量的33％(图12B，黑色正方形)。有趣的是，随着EPO百分比的降低，EPO的铁转运抑制作用变得忽略不计，这表明含有较低百分比的EPO的调配物可能不会抑制跨肠的铁转运。

Claims (22)

1.一种在表面上包括阻挡水分和空气的肠溶性聚合物屏障的颗粒，所述颗粒在包括淀粉或透明质酸的惰性基质内具有共囊封于其中的脂溶性和水溶性微量营养素。
2.根据权利要求1所述的颗粒，其通过在有机溶剂中乳化所述脂溶性微量营养素以及在水性溶剂中乳化所述水溶性微量营养素来调配。
3.根据权利要求1或2所述的颗粒，其中所述颗粒通过喷雾干燥或旋转盘雾化(spindisking)形成。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的颗粒，其中所述颗粒包括铁微量营养素，并且所述肠溶性聚合物屏障防止所述铁氧化。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的颗粒，其中所述微量营养素在囊封前或囊封时与透明质酸混合。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的颗粒，其中所述颗粒是通过使任选地处于溶剂中的微量营养素喷雾干燥或旋转盘雾化进入淀粉、透明质酸、环糊精、胶原、海藻酸、甲壳素或其衍生物中形成的。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的颗粒，其包括铁微量营养素。
8.根据权利要求7所述的颗粒，其中所述颗粒包括按以下比例与透明质酸混合的硫酸亚铁：铁:透明质酸介于约1:4与约1:10之间。
9.根据权利要求1到8中任一项所述的颗粒，其中所述脂溶性微量营养素是选自由维生素A、维生素E和维生素D组成的组的一种或多种维生素。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的颗粒，其中所述水溶性微量营养素选自由维生素C、B3、B7、B9和B12以及如锌和碘等痕量元素组成的组。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的颗粒，其中所述水溶性微量营养素被囊封在由如透明质酸或明胶等亲水性或两亲性聚合物形成的第一基质中，然后由第二基质进一步包衣或囊封，所述第二基质由肠溶性聚合物形成。
12.根据权利要求11所述的颗粒，其中使用如喷雾干燥或旋转盘雾化进入粉末中等微囊封技术囊封所述微量营养素，所述粉末如防止所述颗粒结块和变形的淀粉粉末。
13.根据权利要求1到12中任一项所述的颗粒，其中所述调配物在100℃下稳定长达一小时，或者在75％湿度、40℃下稳定至少六十天。
14.根据权利要求1到13中任一项所述的颗粒，其直径介于一微米与一毫米之间，优选地约150微米。
15.根据权利要求1到14中任一项所述的颗粒，其中pH敏感性聚合物在约1-5，优选地约1-3，更优选地约1-2的pH下溶解。
16.根据权利要求1到14中任一项所述的颗粒，其中所述pH敏感性聚合物在约5-8，优选地约5-7，更优选地约5-6的pH下溶解。
17.根据权利要求1到16中任一项所述的颗粒，其中所述pH敏感性聚合物是聚甲基丙烯酸酯。
18.一种提供铁和/或其它微量营养素的方法，所述方法包括向有需要的个体提供有效量的根据权利要求1到17中任一项所述的调配物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中任选地与盐混合或用盐包衣的所述调配物与食物混合。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述调配物以批量形式提供给农业动物。
21.一种用于制备根据权利要求1到17中任一项所述的颗粒的方法，所述方法包括
提供与抗氧化剂聚合物混合的铁补充剂和/或一种或多种脂溶性维生素的颗粒，所述抗氧化剂聚合物如透明质酸，
将铁混合物或维生素分散在pH敏感性肠溶性聚合物中，
通过喷雾干燥或旋转盘雾化形成颗粒，并且
其中在所述颗粒含有脂溶性维生素时将所述颗粒喷入淀粉或其它非结块性聚合物粉末中以形成粉末包衣。
22.一种将水溶性微量营养素和脂溶性微量营养素共囊封到根据权利要求1到17中任一项所述的肠溶性聚合物屏障包衣的颗粒中的方法，所述方法包括
将所述水溶性微量营养素溶解和/或分散到水性溶剂中，以形成水溶性微量营养素溶液，所述水溶性微量营养素溶液任选地包括淀粉、透明质酸、环糊精、胶原、海藻酸、甲壳素或其衍生物；
在将所述微量营养素溶解或分散到所述水性溶剂中时或之后加入油；
将所述脂溶性微量营养素溶解和/或分散到有机溶剂和/或油和肠溶性聚合物中，以形成脂溶性微量营养素聚合物溶液；
用所述脂溶性微量营养素聚合物来乳化所述水溶性微量营养素溶液；以及
使用如喷雾干燥、旋转盘雾化或溶剂去除等方法去除所述溶剂。
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