CN111793583A - 一种高效降低固氮细菌筛选假阳性的改良型阿须贝氏培养基及用途 - Google Patents

一种高效降低固氮细菌筛选假阳性的改良型阿须贝氏培养基及用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物培养技术领，具体涉及一种高效降低固氮细菌筛选假阳性的改良型阿须贝氏培养基，在传统的阿须贝氏培养中含有含氮琼脂，从而在筛选固氮菌种时往往导致大量假阳性结果的出现，并且传统阿须贝氏培养基中含有难溶于水的碳酸钙导致培养基培养菌落不均匀，不利于固氮菌的筛选。本发明中使用不含氮元素的phytagel植物凝胶，易溶于水的氯化钙，ACES缓冲液以及调整了含量的硫酸镁重新改良阿须贝培养基，可以极大降低筛选固氮细菌的假阳性、提高筛选效率、节约实验成本和耗时。

Description

一种高效降低固氮细菌筛选假阳性的改良型阿须贝氏培养基 及用途
技术领域
本发明属于微生物培养技术领域，涉及一种改良型生化培养基，具体为一种高效降低固氮细菌筛选假阳性的改良型阿须贝氏培养基。
背景技术
阿须贝氏(Ashby)无氮培养基是一种缺乏结合态无机或有机氮源的培养基，可有效从土壤中分离自生固氮菌。其选择的原理是自生固氮菌在保证碳源和无机营养供应的情况下，可利用空气中的游离氮合成自身需要的含氮有机物(而其他各类微生物多无自生固氮能力)，从而达到筛选自养固氮菌的效果。然而，利用传统的阿须贝氏培养基筛选出的菌落，经基于16s rDNA的PCR检测后，常常发现有很多假阳性菌落，即培养出的菌落并非具有固氮作用的微生物。因此，一种能极大程度降低实验假阳性、提高筛选固氮细菌的效率，并且最大程度降低实验成本及耗时的改良型阿须贝氏固氮培养基的使用是非常有必要的。
发明内容
针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种高效降低固氮细菌筛选假阳性的改良型阿须贝氏培养基。通过对阿须贝氏培养基成分的改良，实现极大程度降低假阳性结果，提高固氮菌的筛选效率，降低实验成本及耗时，同时配置出的培养基澄清透亮无沉淀，更方便固氮细菌的筛选，细菌生长也更均匀。
为了达到以上目的，本发明采用以下技术方案：
一种高效降低固氮细菌筛选假阳性的改良型阿须贝氏培养基，其特征在于：由Phytagel植物凝胶替换琼脂，并利用镁盐促使phytagel植物凝胶凝固。
进一步地，所述镁盐为MgSO4，用量为1.0-1.4g/L。
进一步地，所述改良型阿须贝氏培养基中，钙源采用氯化钙；利用Good's缓冲液调节所述培养基的PH＝7.0。
进一步地，所述Good's缓冲液为ACES。
进一步地，所述改良型阿须贝氏培养基包含以下成分：葡萄糖8.0-12.0g、KH2PO40.2g、NaCl 0.1-0.3g、MgSO4 1.0-1.4g、CaCl2 0.0838g、Phytagel植物凝胶14.0-16.0g、H2O1000ml，以及ACES，所述ACES的用量为9.11g。
所述改良型阿须贝氏培养基用于筛选固氮细菌。
首先，使用不含氮元素的phytagel植物凝胶来替代琼脂。phytagel含有葡萄糖醛酸、鼠李糖和葡萄糖等不含任何氮源的物质，并具有无色、透明以及韧度高等特点。
其次，在原培养基中含有碳酸钙，其难溶于水，在倒平板前如摇不均匀，很容易造成菌落生长不均匀。碳酸钙一方面提供钙离子，因此在本发明专利的改良型固氮菌筛选的阿须贝氏培养基中用氯化钙来代替；另一方面，碳酸钙还用于调节培养基pH，因此，在本发明专利的改良型固氮菌筛选的阿须贝氏培养基中用Good's缓冲液来替代。Good's缓冲液又称为两性离子缓冲液。其主要优点是：不参加并且不干扰生物化学反应过程，对酶化学反应等无抑制作用。结合原配方中的pH范围，选择Good's缓冲液中的ACES代替碳酸钙充当培养基中的缓冲剂。原培养基中的硫酸钙微溶于水，也容易造成培养基有悬浮颗粒，导致培养基质地不均匀。因此，在本发明中，用易溶于水的硫酸镁代替硫酸钙。
本发明改良的阿须贝培养基中使用不含氮元素的phytagel植物凝胶替代含氮的琼脂，可以极大降低筛选固氮细菌的假阳性、提高筛选效率、节约实验成本和耗时。
改良的阿须贝培养基中用氯化钙及ACES缓冲液替换碳酸钙，使得培养基澄清透亮，没有固体沉淀，更适宜固氮细菌的筛选，也不会因培养基有固体沉淀而导致细菌生长不均匀。
附图说明
图1为本发明所述改良的阿须贝培养基上的固氮细菌生长状态图。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
传统阿须贝氏培养基的成分如表1所示，虽然不额外添加氮素，但该培养基中含有琼脂，而琼脂是一种从红藻中提取的多糖，主要由琼脂糖和琼胶质组成，此外还有牛胆碱和维生素B2等多种成分，其中，牛胆碱和维生素B2中就含有N5。因此，琼脂里事实上含有丰富的有机氮，不可避免会被微生物所利用，常常导致大量假阳性实验结果的出现。
表1原阿须贝培养基配方
成分 含量
葡萄糖 10.0g
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 0.2g
MgSO<sub>4</sub> 0.2g
NaCl 0.2g
CaSO<sub>4</sub> 0.1g
CaCO<sub>4</sub> 5.0g
H<sub>2</sub>O 1000ml
pH 7.0
琼脂 20.0g
本发明所述的改良的阿须贝培养基，使用不含氮元素的phytagel植物凝胶来替代琼脂。phytagel含有葡萄糖醛酸、鼠李糖和葡萄糖等不含任何氮源的物质，并具有无色、透明以及韧度高等特点。
原培养基中所使用的碳酸钙，难溶于水，在倒平板前如摇不均匀，很容易造成菌落生长不均匀。碳酸钙在原培养基中的作用一方面提供钙离子，另一方面，碳酸钙还用于调节培养基pH的作用。在本发明中的用氯化钙来代替碳酸钙，来提供钙源；用Good's缓冲液来调节pH。Good's缓冲液不参加并且不干扰生物化学反应过程，对酶化学反应等无抑制作用。结合原配方中的pH范围，选择Good's缓冲液中的ACES充当培养基中的缓冲剂。
原培养基中的硫酸钙微溶于水，也容易造成培养基有悬浮颗粒，导致培养基质地不均匀。因此，在本发明中，用易溶于水的硫酸镁代替硫酸钙。同时为了促进phytagel凝固，也需要加入镁盐，或采用高浓度的phytagel的方式。由于硫酸镁的含量过高，可能会形成盐胁迫，因此，通过表2所述的对照实验确定MgSO4的最佳浓度。
表2 MgSO4添加量对照实验
MgSO<sub>4</sub>(g) pH Phytagel 培养基质地 划线难易 细胞盐胁迫
0.2 5.30 8 松软 不易 不胁迫
0.5 5.32 8 松软 不易 不胁迫
1.0 5.34 10 松软 不易 不胁迫
1.5 5.37 10 凝固 容易 胁迫
1.0 5.34 12 松软 不易 不胁迫
1.0 5.34 14 凝固 容易 不胁迫
因此，最终本发明专利发明的改良阿须贝培养基的配方如表3所示，利用表3所示成分制成的培养基培养的固氮细菌生长状态如图1所示。
表3高效降低固氮细菌筛选假阳性的改良型阿须贝氏培养基的成分表
成分 质量
葡萄糖 10.0g
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 0.2g
NaCl 0.2g
MgSO<sub>4</sub> 1.0g
CaCl<sub>2</sub> 0.0838g
ACES(50mM) 9.11g
H<sub>2</sub>O 1000ml
pH 7.0
Phytagel 14.0g
用原阿须贝氏培养基及本改良型阿须贝氏培养基筛选同一批菌落中的固氮菌后，用PCR验证固氮基因后得到固氮菌株。两种培养基的对比结果如表4所示，用改良型阿须贝氏培养基筛选出来的菌株100％为固氮菌。
表4用两种阿须贝氏培养基筛选固氮菌株
Figure BDA0002607296200000041
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种高效降低固氮细菌筛选假阳性的改良型阿须贝氏培养基，其特征在于：由Phytagel植物凝胶替换琼脂，并利用镁盐促使phytagel植物凝胶凝固。
2.根据权利要求1所述的改良型阿须贝氏培养基，其特征在于：所述镁盐为MgSO4，用量为1.0-1.4g/L。
3.根据权利要求1所述的改良型阿须贝氏培养基，其特征在于：所述改良型阿须贝氏培养基中，钙源采用氯化钙；利用Good's缓冲液调节所述培养基的PH＝7.0。
4.根据权利要求1所述的改良型阿须贝氏培养基，其特征在于：所述Good's缓冲液为ACES。
5.根据权利要求1所述的改良型阿须贝氏培养基，其特征在于：所述改良型阿须贝氏培养基包含以下成分：葡萄糖8.0-12.0g、KH2PO4 0.2g、NaCl 0.1-0.3g、MgSO4 1.0-1.4g、CaCl20.0838g、Phytagel植物凝胶14.0-16.0g、H2O 1000ml，以及ACES，所述ACES的用量为9.11g。
6.根据权利要求1-5任一项所述的改良型阿须贝氏培养基用于筛选固氮细菌。
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