CN111770925A - 焦脱镁叶绿酸轭合物及其在癌症治疗中以及作为荧光标记的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及式(I)化合物及其药学上可接受的盐。本发明还涉及所述式(I)化合物特别通过光动力疗法在治疗癌症中的用途。

Description

焦脱镁叶绿酸轭合物及其在癌症治疗中以及作为荧光标记的 用途
技术领域
本发明涉及光敏剂领域，更特别地，涉及其在用于治疗癌症，特别是卵巢癌的光动力疗法方案中的用途。
背景技术
在法国，卵巢癌代表每年4500例新病例。该病的预后差与诊断的延迟有关，因为大多数病例是在国际妇产科联合会(FIGO)的III和IV期诊断的，并且存活率随疾病的发展而降低。在美国和西欧，卵巢癌是导致妇科癌症死亡的主要原因。在法国，每年约有3500例死亡归因于此。
该疾病经常发展为出现以腹膜癌的形式转移，这对应于盆腹腔器官表面存在众多肿瘤。腹膜是连续的浆膜(由单层间皮细胞形成)，其覆盖腹部、骨盆和内脏，界定了腹膜腔的虚拟空间。内脏腹膜(其覆盖器官的外部)和壁层腹膜(其覆盖腹壁的内表面)之间存在区别。
在可能的情况下，当前的疗法联合基于使用铂盐的化疗手术，在某些情况下还联合靶向疗法。公认的是，术后不存在残留病灶是良好预后的主要因素。因此，手术治疗以根除所有肿瘤植入物的能力是决定性的。全身辅助化疗或新辅助化疗已使生存率提高到五年，尤其是在早期：卡铂和紫杉醇联合化疗三个周期后，I和II期的生存率为81％。在最大程度的细胞减少的情况下，并且作为宏观上完整的肿瘤减少手术的补充，可以设想治疗策略，诸如腹膜内化疗和腹膜内光动力疗法。尽管进行了大量的临床试验，腹腔内化疗的益处尚未在该适应症中得到证实，并且不建议在临床试验之外推荐这种选择。
与有或没有热疗的腹膜内化疗相反，依靠选择性靶向早期病灶的光敏剂，并且只有靶向这些病灶，才有可能降低治疗的毒性，因为光的作用仅在肿瘤组织内存在光敏剂存在时发生。它还可能使治疗在手术期间被忽略的显微镜可见的转移成为可能。因此，依靠更特异性的光敏剂靶向通过卵巢肿瘤细胞过表达的受体可以增强光动力疗法(PDT)的功效。
在这种情况下，Schneider et al.(Bioorganic&Medicinal Chemistry,2005,13,2799-2808)合成了包含与叶酸(TPP-FA)共轭的三苯基卟啉单元的光敏剂，所述三苯基卟啉单元具有有利于光动力疗法应用的荧光性能和抗增殖性。更具体地，
Figure BDA0002416466210000021
et al.(Photodiagnosis and Photodynamic Therapy,2016,13,130-138)在动物模型上证明了该光敏剂对卵巢上皮癌的腹膜转移特别具有特异性，因此建议将其用于对患者无毒的腹膜内光动力疗法方案的开发中。但是，一方面，该光敏剂显示出非常弱的荧光，因此妨碍了其在妇科医生常用的医疗设备中的检测，另一方面，该光敏剂显示出低稳定性。
You et al.(Bioorganic&Medicinal Chemistry,2015,23,1453-1462)也开发了脱镁叶绿酸-a的轭合物，特别是包含通过聚乙二醇型的间隔臂与叶酸共轭的脱镁叶绿酸-a单元(Pheo-PEG-FA)的光敏剂。特别地，You等表明，该光敏剂(Pheo-PEG-FA)靶向叶酸受体，并且鉴于其荧光性，因此可以用于治疗过表达叶酸受体的癌症的光动力疗法方案中。但是，该光敏剂显示出相对中等的荧光。
因此，目前真正需要开发用于光动力疗法的新光敏剂。这些光敏剂必须既具有良好的治疗功效并且选择性靶向病灶以不损害健康组织，并且还必须具有足够的荧光以便通过医疗装置可视化这些病灶。
发明简述
面对这个问题，本发明人已经通过确保优异收率的方法合成了新光敏剂，其包含通过聚乙二醇型的间隔臂与叶酸共轭的焦脱镁叶绿酸单元(Pyro-PEG-FA)。与上述结构相似的轭合物相比，对该光敏剂的分析使其可以表现出改进的理化性质，并且还具有良好的光稳定性。发明人还表明，这种新光敏剂可以特异性地靶向卵巢上皮癌的显微镜可见的腹膜转移，而不损害抗肿瘤效应物免疫应答的质量。
因此，本发明涉及式(I)化合物及其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002416466210000031
本发明还涉及式(I)化合物作为药物的用途。
根据本发明的一个具体实施方案，式(I)化合物用于治疗癌症，特别是通过光动力疗法。特别地，本发明的式(I)化合物用于减少发生转移的风险。优选地，式(I)化合物用于治疗选自卵巢癌、肺癌、肾癌、子宫内膜癌、结肠直肠癌或乳腺癌、胰腺癌、脑癌、胃癌、肝癌、前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌或头颈癌的癌症。更优选地，式(I)化合物用于治疗卵巢癌。
根据另一个具体实施方案，式(I)化合物旨在经腹膜内或静脉内施用。
本发明的另一个主题涉及用于制备如上所示的式(I)化合物的方法，其包括偶联式(II)化合物和叶酸的步骤：
Figure BDA0002416466210000032
本发明的另一个主题还涉及如上所示的式(I)化合物作为荧光标记的用途。
本发明的另一个主题还涉及用于在受试者中成像的方法，包括可视化先前被施用于所述受试者并被光源光活化的式(I)化合物发出的荧光。
附图说明
图1：用于合成式(I)的Pyro-PEG-FA化合物的方法。
图2：叶酸(FA)、式(I)的Pyro-PEG-FA化合物(Pyro-S-FA)、Pheo-PEG-FA化合物(Pheo-S-FA)和TPP-FA化合物(P1-S-FA)随时间变化的光降解(365nm,5mW/cm2,[0.45mM]于DMSO中)。
图3A：测量进行PDT的SKOV-3(A)和OVCAR-3(B)卵巢肿瘤细胞中ATP的相对含量。
图3B：PDT对OVCAR-3卵巢肿瘤细胞分泌细胞因子的影响。
图4A：在注射式(I)的Pyro-PEG-FA化合物后已经发生腹膜癌的免疫活性大鼠中的腹腔镜图像的照片。
图4B：在白光中的图4A的照片。
发明详述
如发明人在以下实施例中阐明和证实的，本发明提供了式(I)的与叶酸偶联的新光敏剂：
i)可以特异性靶向卵巢上皮癌的显微镜可见的腹膜转移，
ii)具有良好的治疗功效，
iii)通过常规医疗设备提供足够的荧光以可视化病灶，
iv)仅需几个步骤进行合成，和
v)激活免疫细胞增殖。
式(I)的Pyro-PEG-FA化合物
因此，本发明涉及式(I)化合物及其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002416466210000051
该式(I)化合物是包含通过聚乙二醇型的间隔臂与叶酸共轭的焦脱镁叶绿酸-a单元的共轭化合物(Pyro-PEG-FA)。焦脱镁叶绿酸-a单元为式(I)化合物提供用于可视化病灶的令人满意的荧光。聚乙二醇型的间隔臂包含聚乙二醇PEG2的两个单体。叶酸单元可以特异性靶向叶酸受体。在本说明书中，式(I)化合物由“Pyro-PEG-FA”或“Pyro-PEG2-FA”表示。
表述“其药学上可接受的盐”表示具有所需生物活性的目标式(I)化合物的盐。药学上可接受的盐包含特定化合物中存在的酸性或碱性基团的盐。药学上可接受的酸加成盐包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乙酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、古洛糖酸盐、蔗糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐以及棕榈酸盐(即1,1'-亚甲基双(2-羟基-3-萘甲酸盐))。合适的碱盐包括但不限于铝、钙、锂、镁、钾、钠、锌和二乙醇胺盐。特别地，药学上可接受的盐的列表公开在Berge等人的综述(J.Pharm.Sci.1977,66(1),1-19)中。
式(I)化合物可以通过简单的方法合成，该方法包括偶联式(II)化合物和叶酸的步骤：
Figure BDA0002416466210000061
更特别地，式(I)化合物可以通过包括从Boc sciences公司销售的式(IV)的焦脱镁叶绿酸-a开始的三个步骤的方法合成。根据一个优选实施方案，式(I)化合物通过包括以下步骤的方法制备：
(a)偶联式(IV)化合物：
Figure BDA0002416466210000062
和N-Boc-2,2’-(亚乙二氧基)二乙胺的步骤，从而获得式(III)化合物：
Figure BDA0002416466210000063
b)将步骤a)中获得的式(III)化合物脱保护的步骤，以获得式(II)化合物：
Figure BDA0002416466210000071
c)偶联步骤b)中获得的式(II)化合物与叶酸的步骤，以获得式(I)化合物：
Figure BDA0002416466210000072
该仅需三个步骤的简单方法使得可以以非常令人满意的收率获得式(I)化合物，所述收率特别高于通过使用You等的化合物(Pheo-PEG-FA)的方法获得的收率。因此，该方法更有利并且适用于工业应用。
应用
如上所述的式(I)化合物可以用作药物，优选用于治疗癌症。
为了本发明的目的，术语“治疗”表示就癌症而言的疾病或病症的改善、预防或逆转。术语“治疗癌症”旨在等同地是指减少转移的数目和/或减少发展转移的风险。就治疗转移而言，其目的特别在于在发展癌症方面降低患者的再发率或复发率。术语“治疗癌症”还旨在是指抑制癌细胞增殖。
不希望受限于特定的作用机制，式(I)化合物可以激活免疫系统，从而有助于对抗癌症。因此，提出将根据本发明的式(I)化合物用于通过免疫疗法，特别是通过在光动力治疗后激活免疫系统来治疗癌症。
更特别地，式(I)化合物用于通过光动力疗法治疗癌症。
光动力疗法，通常简称为PDT，在于使病理组织与可光激活的分子(称为光敏剂或光增敏剂)接触，在这种情况下为本发明的式(I)化合物，然后用具有适合于光敏剂的活化特性的波长(颜色)的光照射该组织。在通过光激活分子并与组织中的氧反应后，局部产生了剧毒物质，以最终诱导癌症病灶的破坏。PDT的主要优点是其选择性。事实上，所用的光本身并不是有害的；没有光的光敏剂无毒。为了引发该反应，光、光敏剂和氧气的组合作用是必需的。因此，通过优化光敏剂浓度和光的剂量，可以选择性地破坏细胞。
因此，本发明还涉及如上所述的式(I)化合物用于治疗癌症的用途，其中使有效剂量的式(I)化合物与癌细胞和/或转移物接触，随后将该癌细胞和/或转移物暴露于光源。
本发明还涉及用于治疗癌症的方法，包括以下步骤：使癌细胞与有效剂量的如上所述的式(I)化合物接触，并将该癌细胞暴露于光源。
术语“有效剂量”旨在是指足以获得令人满意的荧光并因此获得所需治疗效果的剂量。本领域技术人员能够根据待治疗癌症的严重性和类型来调节该剂量。然而，式(I)化合物的有效剂量可以为0.1mg/kg-100mg/kg、0.1mg/kg-50mg/kg、0.1mg/kg-10mg/kg，优选0.1mg/kg-5mg/kg，甚至更优选0.1mg/kg-3mg/kg。
就本发明式(I)化合物而言，光敏剂的光活化可通过本领域技术人员已知的任何类型的光源获得。特别地，光活化可以通过人造光(灯、激光)在辐射(诸如紫外线或红外线类型的辐射)下进行，或者通过可见光或自然光进行。本领域技术人员根据待治疗的癌症类型选择通过置于人体腔内的光装置的合适辐照方式。例如，对于肝癌，将光装置置于腹膜腔中。对于卵巢癌，将光装置置于骨盆腔中；等等。作为光装置的非限制性实例，可以提及如Munck等描述的光气球(Photodiagnosis and Photodynamic Therapy,2016,16,23-26)或如Guyon等描述的发光织物(LEF)(Journal of Biomedical Optics,2012,17(3)。
选择所用的光的波长以获得最有效的光敏剂效果。特别地，使用300-800nm，优选400-700nm，并且更优选约668nm的波长。
通常以1-200焦耳/cm2，优选1-150焦耳/cm2，甚至更优选约150焦耳/cm2的剂量施加辐射。在细胞上，通常施加1-10焦耳/cm2的剂量。
优选地，使用光强度为1-150mW/cm2，1-100mW/cm2，30-70mW/cm2，优选约50mW/cm2的光源。在细胞上，使用光强度为1-10mW/cm2，或者更好地约5mW/cm2的光源。
光敏剂的光活化和癌细胞暴露于光源可进行1分钟-3小时，10分钟-2小时，30分钟-90分钟，优选为1小时或60分钟。
本申请描述的发明优选在人类中进行。
式(I)化合物具有叶酸单元，因此可以用于通过光动力疗法治疗任何类型的表达叶酸受体的癌症。Assaraf等描述了这些表达叶酸受体的癌症的清单(Drug resistanceUpdates,2014,17,89-95)，且其特别包括卵巢癌、肺癌、肾癌、子宫内膜癌、结直肠癌和乳腺癌、胰腺癌、脑癌、胃癌、肝癌、前列腺癌、睾丸癌和膀胱癌或头颈癌。
根据本发明的一个优选实施方案，所述癌症选自卵巢癌、肺癌、肾癌、子宫内膜癌、结肠直肠癌和乳腺癌、胰腺癌、脑癌、胃癌、肝癌、前列腺癌、睾丸癌和膀胱癌或头颈癌。根据一个甚至更优选的实施方案，所述癌症是卵巢癌。
根据待治疗的癌症类型，可以通过本领域技术人员已知的任何类型的途径向患者施用式(I)化合物。例如，腹膜内途径或静脉内途径可用于治疗卵巢癌。根据本发明的一个优选实施方案，式(I)化合物旨在经腹膜内或静脉内施用，优选经静脉内施用。
鉴于其改进的吸收和荧光性能，式(I)化合物可以用作荧光标记。例如，式(I)化合物作为荧光标记物可用于通过荧光引导的手术治疗癌症和/或用于成像或诊断方法。
因此，描述了成像或诊断受试者的癌症的方法，包括向所述受试者施用并辐射或光活化式(I)化合物，以及可视化所发出的荧光。该方法使得可以可视化在癌细胞中过表达的叶酸受体。因此，该成像使得可以在适当的情况下划定癌症区域，并且还可以引导消融类型的外科手术。
因此，本发明的主题是用于在受试者中成像的方法，其包括可视化先前被施用于所述受试者并被光源光活化的式(I)化合物发出的荧光。
鉴于其相同性能，式(I)化合物还可以在化妆品和皮肤病学应用(例如光子嫩肤、治疗普通痤疮或皮肤老化)中用作光敏剂。
因此，本发明还涉及上述式(I)化合物作为光敏剂的非治疗用途。
通过阅读以下实施例，本发明的其他方面和优点将显现出来，这些实施例应被认为是说明性而非限制性的。
具体实施方式
实施例1：根据本发明的式(I)的Pyro-PEG-FA轭合物和You等的Pheo-PEG-FA轭合物的合成。
包括三个步骤的用于合成Pyro-PEG-FA轭合物的方法描述于下文并且还通过图1说明。
步骤a)合成Pyro-PEG-NHBoc(式III)
将100mg焦脱镁叶绿酸-a(0.19mmol)、46.4mg N-Boc-2,2'-(亚乙二氧基)二乙胺(0.19mmol)、71.7mg(0.38mmol)EDC和30.5mg(0.25mmol)DMAP溶于30ml THF中。将反应混合物在环境温度下在氮气氛下和黑暗中搅拌24小时。然后，蒸发掉溶剂。将粗物质在硅胶色谱柱上用5％EtOH(于CH2Cl2中)纯化。获得深绿色固体形式的Pyro-PEG-NHBoc化合物，产率为92％(132mg)。Rf＝0.27(CH2Cl2/EtOH＝95/5,v/v).1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ(ppm)＝-2.01(s,2H,NH,Pyro(a)-COOH),1.30(s,9H,Boc),1.60(t,3H,CH3,Pyro(a)-COOH),1.79(d,3H,CH3,Pyro(a)-COOH),2.98(q,2H,CH2),3.15,3.35,3.59(3 x s,3H x 3,CH3,Pyro(a)-COOH),3.46(q,2H,CH2),3.60(m,8H,CH2),3.65(m,2H,CH2,Pyro(a)-COOH),4.31,4.56(2 xd,1H x 2,CH,Pyro(a)-COOH),5.16(q,2H,CH2,Pyro(a)-COOH),6.34,6.40(2 x d,1H x 2,＝CH2,Pyro(a)-COOH),6.66(s,1H,NH-间隔区),7.83(t,1H,NH-间隔区),8.19(q,1H,-CH＝,Pyro(a)-COOH),8.88,9.38,9.65(3x s,1H x 3,CH,Pyro(a)-COOH).HRMS(ESI+):m/z计算值C44H56N6O6[M+H]+765.4334；实测值765.4304。
步骤b)合成Pyro-PEG-NH2(式II)
将Pyro-PEG-NHBoc化合物溶于2ml TFA中。将溶液在环境温度下、在黑暗中并在氮气下搅拌2小时，然后冷冻干燥以去除TFA。将有色残余物溶于CH2C12(10ml)中，并加入无水碳酸钾，直到颜色从蓝色变为绿色。过滤后，将有机相浓缩。将粗物质在硅胶色谱柱上用CH2C12/EtOH(90∶10-50∶50，v/v)纯化，获得绿色固体形式的Pyro-PEG-NH2(103mg，90％)。Rf＝0.17(CH2C12/EtOH＝1:1,v/v).1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ(ppm)＝-1.94(s,2H,NH,Pyro(a)-COOH),1.63(t,3H,CH3,Pyro(a)-COOH),1.79(d,3H,CH3,Pyro(a)-COOH),2.87(t,2H,CH2),3.17(q,2H,CH2),3.23-3.62(3 x s,3H x 3,CH3,Pyro(a)-COOH),3.50(s,8H,CH2),3.71(m,2H,CH2,Pyro(a)-COOH),4.30,4.58(2 x d,1H x 2,CH,Pyro(a)-COOH),5.17(q,2H,CH2,Pyro(a)-COOH),6.22,6.39(2 x d,1H x 2,＝CH2,Pyro(a)-COOH),7.98(t,1H,NH),8.18(s,2H,NH2),8.24(q,1H,-CH＝,Pyro(a)-COOH),8.90,9.45,9.73(3x s,1H x 3,C20-10-5,Pyro(a)-COOH).HRMS(ESI+):m/z计算值C39H48N6O4[M+H]+665.3810；实测值665.3801。
步骤c)合成Pyro-PEG-FA(式I)
将叶酸(0.95当量，63mg)和DCC(1当量，31mg)溶于无水DMSO(5ml)和吡啶(2ml)的混合物中。将该混合物在环境温度下、在黑暗中和氮气下搅拌15分钟。然后，加入Pyro-PEG-NH2(0.9当量)，并将反应混合物在环境温度下搅拌24小时。将该溶液缓慢倒入剧烈搅拌的冷二乙醚(45ml)中。通过离心收集获得的沉淀物，并用二乙醚(50ml)洗涤。将Pyro-PEG-FA粉末真空干燥(107mg，69％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6):-1.97(s,2H,NH,Pyro(a)-COOH),1.62(t,3H,C8:CH3,Pyro(a)-COOH),1.76(d,3H,C18:CH3,Pyro(a)-COOH),4.32(2H,CH+C17,FA+Pyro(a)-COOH),4.40(d,2H,CH2,FA),4.56(d,1H,C18,Pyro(a)-COOH),5.17(q,2H,C13:CH2,Pyro(a)-COOH),6.21,6.50(2 x d,1H x 2,C3:＝CH2,Pyro(a)-COOH),6.60(d,2H,CHarom.,FA),7.29(br,3H,NH+NH2),7.61(d,2H,CHarom.,FA),7.81(s,2H,NH2),7.92(d,1H,NH,FA),8.20(q,1H,C3:-CH＝,Pyro(a)-COOH),8.59(d,1H,CHarom.,FA),8.88,9.42,9.68(3x s,1H x 3,C20-10-5,Pyro(a)-COOH).HRMS(ESI+):m/z计算值C58H65N13O9[M+Na]+1110.4920；实测值1110.4872。
根据上述相同的三步法合成You等的轭合物(Pheo-PEG-FA)。在下表1中描述了三个步骤中每个步骤获得的产率。
表1：
Figure BDA0002416466210000121
出乎意料的是，上述合成方法使得获得的式(I)化合物的总产率比You等的化合物高两倍。因此，特别是从经济的角度来看，式(I)化合物的合成比You等的化合物的合成在工业上更具优势。
实施例2：根据本发明的式(I)的Pyro-PEG-FA轭合物、You等的Pheo-PEG-FA轭合物和Schneider等的TPP-FA轭合物的光物理性能。
材料和方法
用UV-3600双光束紫外可见分光光度计(Shimadzu,Marne La Vallée,France)测量吸收光谱。通过配备450W氙弧灯、恒温(25℃)比色皿支架隔室和R928紫外可见光电倍增管(Hamamatsu,Japan)和液氮冷却的InGaAs红外探测器(DSS-16A020L Electro-OpticalSystem Inc,Phoenixville,PA,USA)的Fluorolog FL3-222分光荧光计(Horiba JobinYvon,Longjumeau,France)测量荧光光谱。激发光束由SPEX双光栅单色仪衍射(在330nm处发出1200线/mm)。通过SPEX双光栅发射单色仪(在500nm发出1200线/mm)通过紫外可见检测器测量荧光。通过SPEX双光栅发射单色仪(在1μm处发出600线/mm)和高通滤光器通过红外检测器在780nm处测量单线态氧的产生。使用四面石英比色皿测量所有光谱。通过灯和光电倍增管校正，所有发射光谱(单线态氧荧光和发光)都与相同的吸光度(小于0.2)相关。
荧光量子产率由公式(1)测定：
Figure BDA0002416466210000131
其中Φf和Φfo、If和Ifo、OD和ODo、n和no分别是样品和参照品的量子产率、荧光强度、光密度和折射率。
用于计算荧光量子产率的参照品是甲苯中的四苯基卟啉，其
Figure BDA0002416466210000133
为0.11。
单线态氧产生的量子产率由公式(2)测定：
Figure BDA0002416466210000132
其中ΦΔ和ΦΔo、I和Io,OD和ODo分别是样品和参照品的单线态氧产生的量子产率、单线态氧产生的强度和光密度。
用于计算单线态氧产生的量子产率的参照品是乙醇中的Rose Bengal，其
Figure BDA0002416466210000134
为0.68。
使用用于激发的耦合到PDL 800-D脉冲发生器(PicoQuant GmbH,Berlin,Germany)的407nm发射的脉冲激光二极管(LDH-PC-400M，FWHM<70ps，1MHz)和用于检测的耦合到650nm的高通滤光器的SPCM-AQR-15雪崩光电二极管(EG&G,Vaudreuil,Canada)来进行荧光寿命实验。
使用连接到PHR-800 4通道路由器(PicoQuant GmbH,Berlin,Germany)的PicoHarp 300模块进行采集。使用单光子计数方法(时间相关的单光子计数TCSPC)记录荧光下降。收集数据直到在通道中获得1000个累积计数，然后使用允许获得多指数下降的Levensberg-Marquandt算法基于迭代再卷积，使用TCSPC Fluofit软件(PicoQuant GmbH,Berlin,Germany)分析。
使用Tempro-01分光光度计(Horiba Jobin Yvon,Longjumeau,France)进行单线态氧寿命测量，该分光光度计由以415nm发射的SpectraLED-415脉冲激发二极管、比色杯架隔室、Seya-Namioka型发射单色仪(600-2000nm)和H10330-45热电调节型近红外光电倍增管(Hamamatsu,Japan)组成。该组件由FluoroHub-B计数模块以及DataStation和DAS6软件(Horiba Jobin Yvon)控制。
发射光谱和磷光寿命的测量使用配备有450W连续氙灯、氙气闪光灯和恒温(25℃)的比色杯架隔室和R928紫外线可见光电倍增管(Hamamatsu,Japan)的Fluorolog FL3-22分光荧光计(Horiba Jobin Yvon,Longjumeau,France)进行。该组件由FluoroHub-B计数模块控制。荧光光谱软件(Horiba Jobin Yvon)用于发射光谱；DataStation和DAS6软件(HoribaJobin Yvon)用于测量磷光寿命。
结果
乙醇中的光物理性能示于下表2中。
表2：
Figure BDA0002416466210000141
Figure BDA0002416466210000151
ε:摩尔消光系数；Q:Q带；λexc:激发波长；φf:荧光量子产率；φΔ:发光量子产率；τf:荧光寿命；τΔ:单线态氧寿命。
本发明的式(I)化合物Pyro-PEG-FA表现出比You等的Pheo-PEG-FA化合物更大的吸收。特别地，临床上使用的激发波长(668nm)处的摩尔消光系数(εQI)高1.5倍。
本发明的式(I)化合物Pyro-PEG-FA表现出比Schneider等的TPP-FA化合物更大的吸收。特别地，本发明的化合物在668nm处具有吸收峰，该吸收峰比TPP-FA化合物(643nm处的吸收峰)更有利于较好的渗透。另外，对于本发明化合物，荧光量子产率(φF)和摩尔消光系数(εQI)分别约高三倍和十倍。
总之，与You等的Pheo-PEG-FA化合物和Schneider等的TPP-FA化合物相比，本发明的式(I)化合物Pyro-PEG-FA在吸收方面具有改进的光物理性能。
实施例3：根据本发明的式(I)的Pyro-PEG-FA轭合物、You等的Pheo-PEG-FA轭合物和Schneider等的TPP-FA轭合物的光稳定性。
材料和方法
将PS-arm-叶酸(式(I)的Pyro-PEG-FA)(0.45mM)的DMSO(3ml)溶液(λ＝365nm,5mW.cm-2,Xe-Hg灯，LightningcureTM LC5Hamamatsu)辐照2小时。每15分钟取100μl溶液，并用1.9ml甲醇稀释。在Prostar HPLC仪器(Varian)上通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析每个样品(40μl)。使用乙腈/(水+0.1％TFA)梯度[10％:90％]至[0％:100％]在Pursuit 5-C18色谱柱(2.5μm，4.6×150mm，Varian)上进行HPLC 25分钟，然后乙腈等度稳定(isocraticplateau)10分钟，然后回到初始条件5分钟。通过比较对应于初始轭合物和降解的轭合物的峰面积来计算降解百分数。
结果
结果提供于图2。
本发明式(I)化合物Pyro-PEG-FA比You等的Pheo-PEG-FA化合物和Schneider等的TPP-FA化合物稳定得多。实际上，在辐射2小时(120分钟)后，本发明的Pyro-PEG-FA化合物显示出5％的降解，而Pheo-PEG-FA和TPP-FA化合物则降解30％-40％。
鉴于其良好的光稳定性，本发明式(I)化合物Pyro-PEG-FA因此更适合于光动力疗法应用。
实施例4：体外生物学评估
4.1.光动力疗法对肿瘤细胞及其分泌组的影响
材料和方法
I.细胞培养
SKOV-3和OVCAR-3卵巢肿瘤系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。将SKOV-3细胞培养在50％DMEM(4.5g/L D-葡萄糖，L-谷氨酰胺；Gibco)和50％F-12(Ham's F-12Nutrient Mix，Gibco)中，将OVCAR-3细胞培养在含有1％2mM的谷氨酰胺、0.02mM的丙酮酸钠、100U/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素和10％的去补(decomplemented)胎牛血清(Gibco)的RPMI-1640中。
II.光动力疗法
将一百万个细胞沉积在25cm2的烧瓶中；24小时后，用含有本发明式(I)化合物Pyro-PEG-FA(PS)的培养基(每100ml培养基1mg)替换完全培养基。24小时后，在用PBS(Gibco BRL，Invitrogen，GB)冲洗两次后，用完全培养基替换含有PS的培养基。最后，使细胞经历特定波长(668nm)的激光一小时。24小时后，回收上清液，离心去除悬浮液中的肿瘤细胞，然后在-20℃冷冻。使用了三种对照：未经处理的SKOV-3和OVCAR-3肿瘤细胞(NT)、与PS接触但未照射的细胞(+PS)、仅受照射的细胞(+illu)和经历PDT的细胞(PDT)。
III.PBMC分离
从在一个体积的无菌PBS(Gibco BRL，Invitrogen，GB)中稀释的血液样品中分离外周血单核细胞(PBMC)，并将其沉积在Ficoll-Paque TM Plus(Amersham BiosciencesAB，Sweden)密度梯度上。在不减速的情况下以400g离心40分钟后，回收单核细胞环，在PBS中洗涤两次(300g，10分钟)，然后过滤。
IV.实时定量PCR
1.RNA提取
根据制造商的说明，使用RNeasy Plus Mini提取试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)从2×105个细胞的干燥沉淀中提取NK细胞、B淋巴细胞、CD4+淋巴细胞、调节性T淋巴细胞(Treg)和CD8+淋巴细胞中的RNA。30μl无RNAse/DNase的水(UltraPure DistilledWater,Gibco BRL,Invitrogen,GB)用于RNA洗脱。根据制造商的说明，从溶解在1ml trizol(Invitrogen,New Zealand)中的106个细胞的沉淀中进行SKOV-3、OVCAR-3和PBMC RNA的提取。将沉淀溶解在10μl无RNAse/DNase的水中。通过分光光度法(Ultraspec 3100 Pro,Amersham Biosciences,USA)进行RNA定量。将总RNA储存在-80℃。1％琼脂糖凝胶电泳(UltraPure Agarose,Invitrogen,USA)可以验证提取的RNA的完整性。
2.反转录
将Superscript II逆转录酶试剂盒用于RT(Gibco BRL，Invitrogen，GB)。cDNA由在体积为15μl的水中的2μg/μl的总RNA合成。然后，添加5μl以下混合物：1μl of oligo dT(Roche,France)+0.1μl RNAsin 40U/μl(Promega,USA)+4μl无RNAse/Dnase的水。在70℃下10分钟，然后在AT下5分钟后，添加10μl第二混合物，其含有：6μl 5X缓冲液(Tris-HCl,KCl,MgCl2,Invitrogen,GB)+1μl二硫苏糖醇(Invitrogen，GB)+2μl 10mM dNTPs(AmershamBiosciences,GB)+0.1μl RNAsin(Promega,USA)+1μl Superscript II反转录酶(Invitrogen，GB)。将样品在45℃孵育1小时，然后在95℃孵育5分钟。通过添加70μl水/μg初始RNA来终止反应；最终浓度为10ng/μl。
3.定量PCR
原理是通过测量SybrGreen(插入DNA中的荧光染料)的掺入来监测DNA双链的新合成。该反应是从cDNA开始以相当于10ng RNA/μl反应混合物的浓度进行的。设计并合成了特异于Q-PCR的引物(MWG-Biotech,Germany)。使用三个持家基因将结果标准化：18S、GAPDH和HPRT(下表3)。
使用Mx3005P(Stratagene,USA)在96孔光学平板(Eurogentech,France)中定量转录本。将10μl一对特异性引物(10pmol/μl)沉积在每个孔中，每个板一式两份，包含44对引物和含有H2O的对照孔。从1μl cDNA样品(浓度相当于10ng RNA/μl)/孔开始，根据制造商的说明，使用Mesa Green qPCR MasterMix Plus for
Figure BDA0002416466210000181
Assay kit(Eurogentec,France)进行Q-PCR。在95℃下第一次变性5分钟后，对反应混合物进行45个扩增循环，该循环包括在95℃下连续传代(DNA双链变性)15s，然后在60℃下连续传代1分钟(引物的杂交和新合成的DNA链的延长)。在每个延长循环结束时测量荧光强度，并在最终扩增后立即编程熔融循环。分析了通过SKOV-3和OVCAR-3肿瘤细胞同时表达叶酸受体的两种同种型FOLR1和FOLR2，以及通过各种免疫细胞系(诸如PBMC、天然杀伤(NK)淋巴细胞、B淋巴细胞、CD4+淋巴细胞、CD8+淋巴细胞和调节性T淋巴细胞)同时表达所述同种型。
4.结果的分析和表示
使用ΔCT方法解释基因的定量表达。将基因表达表示为“CT”(循环阈值)，然后通过三个持家基因的平均值＝ΔCT进行标准化。实验进行两次。
Figure BDA0002416466210000191
表3：引物汇总
V.生存力测试
在肿瘤细胞上：将2000个肿瘤细胞(SKOV-3和OVCAR-3)置于100μl其相应培养基(DMEM/F-12和RPMI)中的白色底96孔板
Figure BDA0002416466210000192
中。将细胞用之前施加在平板上(37℃下2小时)的1μg/ml的抗CD3抗体(Ab)和1μg/ml的抗CD28抗体激活。根据3小时、24小时、72小时和120小时的时间进程进行培养，然后在每个时间进行生存力测试。该测试可以通过萤光素酶反应来定量细胞中存在的ATP，从而确定培养物中存活的细胞数量。
在免疫细胞上：将105个PBMC与50％的ML10(50μl)和50％的肿瘤细胞上清液一起培养，使其经受各种条件(未经处理、仅PS、仅照射以及经历PDT)，并预先收集(50μl)。
VI.增殖测定
将105个PBMC培养于圆底96孔板
Figure BDA0002416466210000193
的50μl培养基中：RPMI-1640、1％2mM L-谷氨酰胺，0.02mM丙酮酸钠、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素，10％去补人AB血清(GIBCO BRL，Invitrogen，GB)和根据各种条件(NT、仅PS、仅光照和PDT)来自肿瘤细胞的50μl上清液。细胞用之前沉积在平板上(37℃下2小时)的1μg/ml的抗CD3和100ng/ml的抗CD28激活。在培养结束前18小时，通过掺入1μCi/孔的氚化胸苷(3H-Th)(GE Healthcare,France)评估增殖。根据24小时、48小时、72小时和120小时的时间进程，将板过滤并在放射性计数器(1450 Trilux,Wallac,Finland)中读取滤光器。实验进行三次，结果以每分钟计数(cpm)表示。
VII.流式细胞仪
将使用的抗人单克隆抗体与荧光染料偶联(参见下表4)。对于对照，使用各种单克隆抗体的同种型作为对照。将105个细胞置于100μl无菌PBS溶液中，并与5μl每个Ac一起孵育(在环境T°(AT)10分钟并在黑暗中)。通过加入200μl PBS然后以600g离心5分钟来洗涤标记的细胞；然后丢弃上清液。然后，将细胞置于200μl PBS中，最后通过流式细胞仪(BDFACSCanto-II)分析。
表4：用于流式细胞仪的各种抗人单克隆抗体的代表。
Figure BDA0002416466210000211
结果
转录组分析表明，所研究的卵巢肿瘤细胞系(SKOV 3和OVCAR-3)优先表达FOLR1同种型，从而显示出它们对本发明的新光敏剂(式(I)的Pyro-PEG-FA)的潜在敏感性，因此显示出它们对光动力疗法(PDT)诱导的死亡的敏感性。
在PDT结束时，对SKOV-3和OVCAR-3卵巢肿瘤细胞的体外形态学分析表明，它们对PDT敏感，最早在照射后一小时就可见效果(非粘附细胞，细胞裂解的外观)。这些结果得到了在体外经历光动力疗法的卵巢肿瘤细胞的生存力测试(MTT)的支持。实际上，观察到经受PDT的SKOV-3和OVCAR-3卵巢肿瘤细胞显示出其随时间的细胞生存力的显著降低。另一方面，观察到未处理的肿瘤细胞或仅经历PS或照射的肿瘤细胞的生存力没有显著改变。因此，这些结果证实了本发明的PS，即式(I)的Pyro-PEG-FA的功效，并且表明PDT确实能够以非常快速的作用诱导卵巢肿瘤细胞死亡，因为仅照射一个小时后，90％的肿瘤细胞死亡(图3A)。
研究了经历PDT的卵巢肿瘤细胞的分泌组对人外周血单核细胞(PBMC)的影响。用经历PDT的来自OVCAR-3或来自SKOV-3的上清液培养的PBMC在仅培养3小时后就显示出其生存力增加。线粒体代谢的这种增加是在三个独立的实验中获得的，并且是统计学显著的(在48小时和120小时)。因此，这些结果说明，使用这种式(I)的新光敏剂Pyro-PEG-FA的PDT可以改变肿瘤细胞的分泌组，这有利于激活人免疫细胞增殖的分泌组。
分析了经历PDT的SKOV-3肿瘤细胞的分泌组对免疫群表型的影响。为此，通过流式细胞仪分析了各种免疫群的标记的表达。获得的结果表明，不论培养条件如何，SKOV-3肿瘤细胞的分泌组不诱导PBMC中CD4+ T和CD8+ T淋巴细胞、单核细胞、B淋巴细胞或NK细胞的百分比的任何改变。而且，在CD4+ T细胞中特异性分析了早期和晚期活化标记，结果表明，经历各种处理的卵巢肿瘤细胞的分泌组也不诱导CD4+T活化的任何改变。因此，与放疗或化疗相反，所获得的所有结果表明，使用式(I)的新光敏剂Pyro-PEG-FA的PDT不会损害抗肿瘤效应物免疫应答的质量。
还研究了经历PDT的SKOV-3细胞的分泌组对天然调节性T淋巴细胞和诱导性调节性T淋巴细胞(Tr1)群的影响。对获得的结果的分析(通过在三重标记CD4+CD18+CD49b或CD4+CD49b+LAG3+的基础上分析Tr1)表明，未处理的SKOV-3细胞的分泌组诱导了Tr1型群。令人惊讶地，观察到各种处理(照射+、PS+或PDT)不促进该Tr1诱导。因此，与常规放疗相反，使用这种式(I)的新光敏剂Pyro-PEG-FA的PDT不会改变有利于具有更强免疫抑制作用的环境的肿瘤细胞的分泌组，这将对逃逸免疫系统的肿瘤有利，因此对肿瘤进展有利。
4.2.免疫细胞活化
通过流式细胞仪分析各种T淋巴细胞群(特别是CD4+(CCR7+、CD25、CD30、CD69、CTLA4和HLADR)T淋巴细胞(LT)和CD8+(CCR7+、CD25、CD30、CD69、CTLA4和HLADR)LT的活化状态。
对于CD4+LT，首先观察到CD69+标记(早期活化标记)的存在时间为24小时-72小时。与未处理的细胞相比，PDT可以使CD69+标记表达更高。关于单独照射或单独使用光敏剂(Ps)的条件，与未处理的细胞相比，结果未显示任何重大变化。
对于CD8+LT，CD69+标记的存在时间为24小时-120小时。经历PDT的细胞允许增加作为早期活化标记的CD69+标记的表达，因为荧光中值大于未处理的细胞。关于单独的ILL或单独的Ps条件，与未处理的细胞相比，结果未显示任何重大变化。
因此，这些结果表明，经历PDT的卵巢癌细胞产生促进CD4+和CD8+ T淋巴细胞早期活化的因子。
从24小时到72小时，观察到CD4+和CD8+LT存在CTLA4+标记(早期活化标记)。注意，在两种情况下，与未处理的细胞相比，经历PDT的细胞的中值荧光更大。这表明，经历PDT的癌细胞所调节的培养基可以增强标记在CD4+LT和CD8+LT上的表达。
光照条件使该标记的表达极大增加。
关于单独的Ps条件，观察到CTLA4+标记的表达总是低于未处理的细胞。72小时后，在PDT条件下，对于CD4+LT和对于CD8+LT，CTLA4+标记的表达丧失，并且所述标记被HLADR+标记(与抗原呈递相关的活化标记)代替。因此，我们的结果表明，PDT间接促进(i)HLADR的表达，这有利于免疫活化，以及(ii)最初促进CTLA4的表达，然后观察到该标记的表达降低。该结果是一致的，因为CTLA4在免疫应答期间稍后被认为是免疫检查点，也就是说是免疫应答的负反馈点。
在24小时时，基本上观察到经历PDT的细胞的CD30+标记(晚期活化标记)的表达增加；CD4+LT在48小时时也是这种情况。另一方面，对于CD8+LT，PDT条件允许CD30+标记的过表达，然后是CD25+标记(活化标记和IL-2R-α受体)的过表达。72小时后，在PDT条件/未处理条件下，CD4+LT上的CD30+活化标记降低。另一方面，对于CD8+LT，PDT条件下CD30+标记的表达非常高。120小时后，PDT条件下的细胞在CD4+LT和CD8+LT这两种情况下，CD25+标记的表达增加。因此，所有这些结果表明，经历PDT的卵巢癌细胞产生促进CD4+和CD8+T淋巴细胞活化的因子。
培养48小时和最多120小时后，对于CD4+LT和CD8+LT，观察到CCR7+标记(CCL19和CCL21趋化因子受体)的表达增加。对于经历PDT的细胞，标记的表达通常更大。因此，PDT允许作为参与免疫细胞淋巴结迁移的趋化因子受体的CCR7+标记的表达。应该注意的是，单独的照射本身也允许该CCR7+标记的表达显著增加。因此，这些结果表明，经历PDT的卵巢癌细胞产生能够通过CCL19和21趋化因子促进CD4+和CD8+ T淋巴细胞迁移的因子。
因此，通过流式细胞仪，本发明人表明，条件培养基不仅诱导免疫细胞的克隆扩增，而且随时间(早期或晚期)诱导一定数量的活化标记的增加，表明免疫细胞是效应细胞，即免疫细胞具有激活的表型，从而可以确保抗肿瘤作用。
4.3.对细胞因子分泌的影响
在经PDT处理的OVCAR-3卵巢癌肿瘤细胞的上清液上进行免疫测定，以确定在PDT处理后来自肿瘤细胞的上清液是否表达和释放细胞因子。
方法
进行夹心ELISA测定。首先，将特异于所寻求的细胞因子的一抗在4℃下与载体结合过夜。第二天，用PBS-0.05％Tween洗涤可以去除未结合的抗体。为了防止载体上其他非特异性分子的吸收，可通过在自由区上包被与一抗的可变区和特异区没有亲和力的分子(在这种情况下为牛血清白蛋白(BSA))来完成饱和。然后在添加样品之前进行洗涤以去除悬浮液中的分子。如果存在所寻求的细胞因子，则与特异于所述免疫复合物的一抗形成免疫复合物。存在的可能的非特异性分子保持悬浮。洗涤可以去除未结合的元素。最后一步包括添加特异于细胞因子的二抗。可视化通过酶(过氧化物酶)进行，该酶将发色底物(邻苯二胺)转化为可在分光光度计上定量的发色团产物。该酶与链霉亲和素偶联。由于存在于二抗上的生物素，其对链霉亲和素具有很强的亲和力，形成生物素/链霉亲和素/过氧化物酶复合物，从而可以定量。为了终止酶促反应，添加二酸(在这种情况下为HCl)。
结果
结果显示于图3B中。
白介素6(IL6)
IL6是促炎细胞因子，也就是说它能够促进炎症过程，这是无益的，因为特别是在该癌症中，炎症的产生促进肿瘤的进展和转移的扩散。结果表明，对于未经处理的对照Ovcar-3细胞(NT)，观察到IL6细胞因子浓度为53.45pg/ml(大量)。对于经照射的Ovcar-3细胞，与未处理的细胞相比，观察到细胞因子的极大降低(9.06pg/ml)，从而可以推断照射Ovcar-3卵巢癌细胞1小时导致IL6细胞因子的存在降低，这是非常令人鼓舞的。单独的Ps允许IL6细胞因子降低(29.08pg/ml)。与未处理的细胞(53.45pg/ml)相比，对于用PDT处理的测试Ovcar-3细胞观察到降低(19.12pg/ml)。
因此，这些结果表明用PDT处理的Ovcar-3细胞减少了其IL6细胞因子的产生。关于使用PDT作为抗肿瘤治疗，这些最初的结果是非常有利的。
白介素2(IL2)
IL2在通过促进特别是T淋巴细胞的存活和增殖的免疫应答稳态中起主要作用。对于未经处理的Ovcar-3细胞对照条件(NT)，检测到存在浓度为72.50pg/ml的IL2。另一方面，对于ILL和Ps条件，不再观察到IL2细胞因子，其浓度等于0pg/ml。因此，仅通过照射处理的细胞以及仅与Ps接触的细胞引起IL2细胞因子分泌的显著降低。对于经历PDT的Ovcar-3细胞，本发明人观察到与未处理的细胞相比，IL2产生增加(122.50pg/ml)，从而表明PDT处理有利于LT增殖。
因此，这些结果表明PDT促进卵巢癌细胞的IL-2分泌，这有利于对免疫细胞特别是对LT的增殖作用。此结果与CD4+和CD8+LT上CD25表达的增加相关(参见细胞计数结果)。
干扰素γ(IFN-γ)
对于对照条件，对于未处理的癌细胞，检测到浓度为2.72pg/ml的IFN-γ。通过照射处理的Ovcar-3细胞允许该细胞因子非常略微的增加(2.85pg/ml)。另一方面，对于仅与Ps接触的Ovcar-3细胞，无法检测到IFN-γ，这意味着单独的Ps导致消除这种细胞因子。对于测试条件(经受PDT的细胞)，观察到IFN-γ的强烈增加(28.55pg/ml)。
这些结果表明，PDT能够促进卵巢癌细胞产生IFN-γ，并因此通过该细胞因子促进抗肿瘤作用。实际上，特别地通过抑制血管生成，通过刺激B和T淋巴细胞的成熟，以及通过激活其他免疫细胞类型(诸如单核细胞)，IFN-γ可以预防恶性肿瘤和转移的发展。
TGF-β
未经处理的癌细胞产生浓度为28.94pg/ml的TGF-β。“通过照射处理的Ovcar-3细胞”条件显示细胞因子浓度降低(8.95pg/ml)，这令人鼓舞。另一方面，对于仅与PS接触的Ovcar-3细胞，观察到细胞因子浓度显著增加(49.56pg/ml)。对于PDT条件，观察到浓度确实下降了(1.36pg/ml)。
因此，获得的结果表明PDT减少了卵巢癌细胞产生的免疫抑制细胞因子TGF-β。该效果是有益的，因为它可以限制有利于肿瘤生长的免疫抑制微环境。
结论
发明人研究了经历PDT的卵巢癌细胞的上清液对外周血单核细胞的影响。他们研究了各种T淋巴细胞群，特别是CD4+LT和CD8+LT的活化状态。结果表明，经历PDT的Ovcar-3细胞能够激活CD4+T和CD8+T淋巴细胞。因此观察到CD69+、CTLA4+、CCR7+、CD30+、CD25+和HLADR+活化标记的增加。
发明人还研究了经PDT处理Ovcar-3细胞后潜在的细胞因子产生。观察到的结果表明，经历PDT的肿瘤细胞允许降低促炎性细胞因子(诸如IL6)，并降低作为免疫抑制的TGF-β的存在。该结果也可以揭示有利于免疫细胞存活以及增殖和活化的细胞因子(诸如IL2和IFN-γ细胞因子)的增加。
卵巢肿瘤细胞PDT产物促进Th1途径(细胞免疫途径)，这特别有利于抗肿瘤免疫应答。此外，它们不激活炎症或调节途径。
实施例5：体内研究
I.大鼠卵巢癌：NuTu-19细胞系
NuTu-19细胞系是大鼠同基因卵巢腺癌系，其允许在免疫活性大鼠中发展卵巢肿瘤(Rose et al.,Am.J.Obstet.Gynecol.1996,175(3Pt1),593-9)。将细胞储存在液氮中(每个冷冻管5×106个细胞)，然后在补充有10％去补胎牛血清和1％青霉素/链霉素混合物和1％的glutamax的DMEM(Gibco-Life TechnologiesTM)中培养。将细胞在标准化条件(5％CO2、100％湿度，37℃)下孵育。当细胞汇合时，将它们胰蛋白酶化以增强粘附力并允许其收集(0.25％胰蛋白酶溶液，Gibco-Life TechnologiesTM)，然后用PBS(Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水，Gibco-Life TechnologiesTM)洗涤，并在进行台盼蓝排除试验后计数，以评估生存力。将细胞以PBS中的细胞悬浮液的形式腹膜内注入各种大鼠中，以获得腹膜癌模型。
II.腹膜癌的动物模型
使用验证的腹膜癌模型(Rose et al.,Am.J.Obstet.Gynecol.1996,175(3Pt 1),593-9)。雌性Fisher F344大鼠获自供应商
Figure BDA0002416466210000271
将动物饲养在DépartementHospitalo-Universitaire de Recherche Expérimentale[Hospital-UniversityExperimental Research Department](DHURE-University of Medicine Research Pole-CHRU of Lille)的动物舍中。饲料(SAFETM)和水自由供应。
通过腹膜内接种PBS中的NuTu-19细胞悬液(每只大鼠20×106个细胞)获得癌症水平。定期监测大鼠直到出现腹水发展以证实肿瘤进展，或进行探索性腹腔镜检查以证实腹膜癌病灶的存在。
Figure BDA0002416466210000285
等(Int J Gynecol Cancer 2015)证实了NuTu-19细胞系和癌症病灶中叶酸受体的表达。
在以4mg/kg的剂量腹膜内施用光敏剂后4小时进行体内荧光测量。为了观察癌症病灶发出的荧光(光诊断)，在异氟醚麻醉后立即进行了腔镜检查方案。
III.光诊断
式(I)的Pyro-PEG-FA化合物用具有PDD(光诊断)功能的医用
Figure BDA0002416466210000281
腹腔镜装置(Evis Exera II)通过荧光检测。所用的腹腔镜光学器件是具有30°视角的4mm
Figure BDA0002416466210000282
膀胱镜。
PDD功能由
Figure BDA0002416466210000283
开发，用于诊断在白光下不可见的膀胱肿瘤(原位癌、异型增生、小局灶性肿瘤)。施用原卟啉IX前体(PpIX)、5-氨基乙酰丙酸(5ALA)和最近的氨基酮戊酸酯(HAL，
Figure BDA0002416466210000286
)可以特异性地可视化在蓝光下呈荧光色(红色)的膀胱病灶。
光源是氙气光源。第一滤光器系统允许在380-440nm激发蓝光。黄色的第二滤光器可以增强在625nm-655nm发射的蓝光和红色荧光之间的对比度，前提是该滤光器能够优化观察640nm附近发射的荧光。由于PpIX发射的红色荧光与蓝光相比太弱，因此将黄色滤光器插入相机的水平位置，以加深蓝色和红色之间的对比度，并允许对病灶的良好可视化。
腹膜内注射后四小时，通过连续吸入异氟烷(浓度为1.5％-3％)施用全身麻醉。在中线进行开放式腹腔镜检查，以引入5mm套管针。用
Figure BDA0002416466210000284
2.0插入荷包缝合，以保持套管针周围的密封性。将吹入气体放置在该套管针顶部，其中CO2流速为0.2l/min，从而可以获得3mmHg的恒定气腹。通过该套管针引入5毫米腹腔镜可以探索腹膜腔，首先在白光下，然后在蓝光下。
腹膜内施用4mg/kg剂量的PS后，对三只大鼠进行了该过程。
图4A表示IP注射NuTu-19细胞(大鼠同基因卵巢腺癌细胞系)后发展为腹膜癌的免疫活性大鼠中获得的腹腔镜图像。癌症病灶呈白色。图4B对应于白光下的图4A。
Figure IDA0002416466250000011
Figure IDA0002416466250000021
Figure IDA0002416466250000031

Claims (12)

1.式(I)化合物及其药学上可接受的盐：
Figure FDA0002416466200000011
2.根据权利要求1所述的化合物用作药物的用途。
3.根据权利要求1所述的化合物用于治疗癌症的用途。
4.根据权利要求3所述的化合物的用途，用于通过光动力疗法治疗癌症。
5.根据权利要求3或4所述的化合物的用途，用于减少发生转移的风险。
6.根据权利要求3或4所述的化合物的用途，其中所述癌症选自卵巢癌、肺癌、肾癌、子宫内膜癌、结肠直肠癌或乳腺癌、胰腺癌、脑癌、胃癌、肝癌、前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌或头颈癌。
7.根据权利要求6所述的化合物的用途，其中所述癌症是卵巢癌。
8.根据权利要求2-7中任一项所述的化合物的用途，其中所述化合物旨在经腹膜内或静脉内施用。
9.用于制备式(I)化合物的方法，
Figure FDA0002416466200000021
其特征在于所述方法包括偶联式(II)化合物和叶酸的步骤：
Figure FDA0002416466200000022
10.根据权利要求9所述的用于制备式(I)化合物的方法，其特征在于其包括以下步骤：
(a)偶联式(IV)化合物：
Figure FDA0002416466200000023
和N-Boc-2,2’-(亚乙二氧基)二乙胺的步骤，从而获得式(III)化合物：
Figure FDA0002416466200000031
b)将步骤a)中获得的式(III)化合物脱保护的步骤，以获得式(II)化合物：
Figure FDA0002416466200000032
和
c)偶联步骤b)中获得的式(II)化合物与叶酸的步骤，以获得式(I)化合物：
Figure FDA0002416466200000033
11.根据权利要求1所述的式(I)化合物作为荧光标记的用途。
12.用于在受试者中成像的方法，包括可视化根据权利要求1所述的式(I)化合物发出的荧光，所述式(I)化合物先前被施用于所述受试者并被光源光活化。
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