CN111770837B - 用于感知尿代谢物和毒素的超疏水性平台 - Google Patents

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Abstract

本文公开了复合超疏水性材料，其包含：衬底层，该衬底层包含一组带正电荷的或带负电荷的官能团；在衬底层的顶部上的金属纳米颗粒涂层，其中所述金属纳米颗粒涂层包含具有带负电荷的或带正电荷的官能团的不同形状和/或尺寸的金属纳米颗粒；在金属纳米颗粒涂层的顶部上的金属层；以及在金属层的顶部上的第一超疏水性层。本文还公开了制造所述材料的方法，以及使用所述材料预测自然流产风险增加的方法。

Description

用于感知尿代谢物和毒素的超疏水性平台
技术领域
本发明涉及适合于在表面增强拉曼散射(SERS)中使用的复合超疏水性材料，制造所述材料的方法，以及其用于通过SERS预测自然流产风险增加的用途。
背景技术
在本说明书中对先前出版的文件的列出或讨论并不一定应被认为承认该文件是现有技术的一部分或是公知常识。
自然流产占所有先兆流产的大约25％。先兆流产被定义为具有阴道出血的持续妊娠并可能伴有腹痛。尽管自然流产的发生率很高，但是当前的产前护理不能精确地确定高度易受自然流产影响的孕妇。
此外，自然流产的当前管理可能也已经被过度医疗化。例如，为了减少流产的风险，例行地为患者开处方孕酮类似物，诸如地屈孕酮(dydrogesterone)，尽管尚无确凿证据表明地屈孕酮可以预防或减少呈现先兆流产症状的患者中流产的风险。进一步地，这些患者中的大多数(约75％)最后都继续健康分娩–有或没有地屈孕酮处方。因此，似乎当前方案给可能不会经受自然流产的患者带来了不必要的压力和医疗费用，尽管他们呈现先兆流产的症状。
最近，经由液相色谱/质谱(LC/MS)确定了六种尿代谢物与自然流产相关联(参见PCT公开号
WO 2018/199849)。典型地，与成功生产的女性相比，遭受自然流产的孕妇具有较高水平的四氢可的松和己酰基肉碱，以及较低水平的5β-孕甾烷-3α,20α-二醇葡糖苷酸、丙酰基肉碱、异戊酰基肉碱和3-甲基戊二酰基肉碱。
然而，使用LC/MS确定目标尿代谢物可能是不切实际的并且不能广泛应用于临床环境。首先，仪器装备是昂贵的(>S$500,000)并且要求大的面积(>1m2)以容纳仪器。此外，运行整个采样过程(包括样品制备和破译测试结果)需要训练有素的人员。整个采样过程需要至少几个小时才能完成，并且因此无法在医院环境中处理高的患者数量。鉴于以上限制，目前似乎没有允许容易且快速地将有遭受自然流产风险的患者与呈现流产症状的患者组区分开的可用的测试试剂盒。
鉴于此，仍然需要新的强健的感知平台或检测试剂盒，其允许迅速且灵敏地检测重要的尿代谢物，以便确定自然流产风险增加的孕妇。这可以使高风险患者得到及早且快速的确定，使得可以迅速地给予必要的治疗。更重要地，这些方法或试剂盒必须精确、具有成本效益且易于执行。
表面增强拉曼散射(SERS)是增强吸附在等离子体金属纳米颗粒的表面上或附近的分子的拉曼散射的技术。典型地，由于在SERS衬底上相关“热点”处的电磁增强，分子的拉曼信号可被增强几个数量级。除了SERS现象外，超疏水性SERS平台还可以充当理想的平台以通过减少水溶液的随机扩散进一步增强检测灵敏度(Phys.Chem.Chem.Phys.,2014,16,26983-26990；Anal.Chem.,2014,86,10437-10444)。超疏水性表面可以被定义为难以润湿，或具有超过150°的水滴的静态接触角与小于10°的滚落角的表面。
发明内容
本发明的方面和实施方式通过以下编号的条款提供。
1.适合于在表面增强拉曼散射中使用的复合超疏水性材料，所述材料包含：
衬底层，所述衬底层包含一组带正电荷的或带负电荷的官能团；
在所述衬底层的顶部上的金属纳米颗粒涂层，所述金属纳米颗粒涂层包含一组带负电荷的或带正电荷的官能团；
在所述金属纳米颗粒涂层的顶部上的金属层；以及
在所述金属层的顶部上的第一超疏水性层，其中：
所述金属纳米颗粒涂层包含第一组和第二组金属纳米颗粒，其中所述第一组金属纳米颗粒具有比所述第二组的直径小0.1至90％的直径；
所述第一组金属纳米颗粒的金属是金和/或银；
所述第二组金属纳米颗粒的金属是金和/或银；并且
所述衬底层和金属纳米颗粒涂层上的带电荷的官能团彼此电子地互补。
2.根据条款1所述的复合超疏水性材料，其中，所述衬底层的表面上的金属纳米颗粒涂层的密度是2至20颗粒/μm2，诸如2.5至10颗粒/μm2、诸如3至5颗粒/μm2、诸如4.4颗粒/μm2。
3.根据条款1或条款2所述的复合超疏水性材料，其中，所述复合材料进一步包含夹在所述金属纳米颗粒涂层与所述金属层之间的第二超疏水性层。
4.根据前述条款中任一项所述的复合超疏水性材料，其中，所述材料显示了大于150°的与水的静态接触角，诸如151°至170°、诸如155°至165°。
5.根据前述条款中任一项所述的复合超疏水性材料，其中，所述第一组纳米颗粒具有的平均直径为10至250nm，诸如20至100nm、诸如30至50nm、诸如130至240nm、诸如135至230nm。
6.根据前述条款中任一项所述的复合超疏水性材料，其中，所述第二组纳米颗粒具有的平均直径为250至1,000nm，诸如300至600nm、诸如311至540nm。
7.根据前述条款中任一项所述的复合超疏水性材料，其中，所述第一组金属纳米颗粒具有的直径比所述第二组的直径小0.2至60％，诸如比所述第二组的直径小0.5至57％、诸如1至55％、诸如10至50％、诸如25至45％，诸如比所述第二组的直径小61至89％，诸如比所述第二组的直径小75至85％、诸如79至83％。
8.根据前述条款中任一项所述的复合超疏水性材料，其中，所述复合材料具有的均方根表面粗糙度为30至150nm，诸如40至140nm、诸如50至125nm、诸如110至125nm。
9.根据前述条款中任一项所述的复合超疏水性材料，其中，所述复合材料上的所述第二组纳米颗粒中的颗粒的总数目比所述第一组纳米颗粒中的颗粒的总数目是1:10至10:1，诸如1:5至5:1、诸如2:1至4:1。
10.根据前述条款中任一项所述的复合超疏水性材料，其中，所述衬底层由聚(二甲基硅氧烷)、玻璃和硅组成的组中的一种或多种形成。
11.根据前述条款中任一项所述的复合超疏水性材料，其中，所述衬底层上的所述带电荷的官能团的组是带正电荷的，并且所述金属纳米颗粒涂层上的所述带电荷的官能团是带负电荷的。
12.根据条款11所述的复合超疏水性材料，其中，所述衬底层上的所述带正电荷的官能团的组是铵离子，任选地其中所述衬底层上的所述带正电荷的官能团的组衍生自含有一个或两个氨基的硅烷化合物，诸如3-氨基丙基三乙氧基硅烷。
13.根据条款11或条款12所述的复合超疏水性材料，其中，所述第一和第二组金属纳米颗粒上的所述带负电荷的官能团的组是羧酸根离子或醇盐离子，任选地其中所述第一和第二组金属纳米颗粒上的所述带负电荷的官能团的组衍生自含有一个或多个羧酸基团的烷基硫醇或者含有一个或多个羟基的烷基硫醇，诸如11-巯基十一烷酸。
14.根据条款1至10中任一项所述的复合超疏水性材料，其中，所述衬底层上的所述带电荷的官能团的组是带负电荷的，并且所述金属纳米颗粒涂层上的所述带电荷的官能团是带正电荷的。
15.根据条款14所述的复合超疏水性材料，其中，所述衬底层上的所述带负电荷的官能团的组是羧酸根离子或醇盐离子，任选地其中所述衬底层上的所述带负电荷的官能团的组衍生自含有一个或多个羧酸基团的硅烷化合物或者含有一个或多个羟基的硅烷化合物。
16.根据条款14或条款15所述的复合超疏水性材料，其中，所述第一和第二组金属纳米颗粒上的所述带正电荷的官能团的组是铵离子，任选地其中所述第一和第二组金属纳米颗粒上的所述带正电荷的官能团的组衍生自含有一个或多个氨基的烷基硫醇化合物。
17.根据前述条款中任一项所述的复合超疏水性材料，其中，所述金属层是5至53nm厚，诸如15至43nm厚、诸如20至33nm厚、诸如25至30nm厚。
18.根据前述条款中任一项所述的复合超疏水性材料，其中，所述金属层包含银层、金层或者银和金层，任选地其中所述银层、金层或者银和金层是5至48nm厚，诸如10至38nm厚、诸如15至28nm厚、诸如20至25nm厚。
19.根据条款18所述的复合超疏水性材料，其中，所述金属层进一步包含铬层，任选地其中所述铬层是2至5nm厚。
20.根据条款18或条款19所述的复合超疏水性材料，其中，所述铬层在所述金属纳米颗粒涂层的顶部上，并且所述金属层在所述铬层的顶部上。
21.根据前述条款中任一项所述的复合超疏水性材料，其中，通过在所述金属纳米颗粒涂层中的纳米颗粒之间的间隙在所述金属层与所述衬底层之间存在直接附接。
22.根据前述条款中任一项所述的复合超疏水性材料，其中，所述第一超疏水性层包含未取代的或被一个或多个氟基团取代的C10至C20硫醇，任选地其中所述第一超疏水性层包含由1-十二烷硫醇、1-十六烷硫醇和1H,1H,2H,2H-全氟癸烷硫醇组成的组中的一种或多种。
23.根据条款3至22中任一项所述的复合超疏水性材料，其中，所述第二超疏水性层包含未取代的或被一个或多个氟基团取代的C10至C20硫醇，任选地其中所述第二超疏水性层包含由1-十二烷硫醇、1-十六烷硫醇和1H,1H,2H,2H-全氟癸烷硫醇组成的组中的一种或多种。
24.根据前述条款中任一项所述的复合超疏水性材料，其中，所述第一组金属纳米颗粒是纳米立方体，并且所述第二组金属纳米颗粒是具有多于六个面的纳米多面体并且选自具有7至30个面的一种或多种纳米多面体。
25.根据条款24所述的复合超疏水性材料，其中，所述第二组金属纳米颗粒是纳米八面体。
26.根据前述条款中任一项所述的复合超疏水性材料，其中，所述第一和第二组纳米颗粒是银纳米颗粒。
27.一种部件试剂盒，包含：
(ai)如条款1至26中任一项所述的复合超疏水性材料；以及
(bi)尿分析配制品，所述尿分析配制品包含涂覆有包含硫醇基团的有机硼酸的银和/或金纳米颗粒，任选地其中：
所述纳米颗粒由在所述复合超疏水性材料中使用的一种或多种相同金属形成；和/或
所述有机硼酸是4-巯苯基硼酸。
28.预测自然流产风险增加的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含从受试者获得的尿样品的非盐组分的水溶液；
(b)使所述水溶液与包含涂覆有包含硫醇基团的有机硼酸的银和/或金纳米颗粒的尿分析配制品反应持续第一时间段以提供络合样品，任选地其中所述纳米颗粒由在所述复合超疏水性材料中使用的一种或多种相同金属形成和/或所述有机硼酸是4-巯苯基硼酸；
(c)将所述络合样品放置到如条款1至26中任一项所述的复合超疏水性材料上并且通过蒸发来去除水以提供干燥的样品；以及
(d)对所述干燥的样品进行拉曼光谱分析以确定孕甾烷和四氢可的松的丰度，并且然后基于下式预测自然流产的风险：
Figure GDA0002655633560000071
其中低于阈值的值指示自然流产风险增加，任选地其中所述第一时间段是3至48小时，诸如3小时。
29.根据条款28所述的方法，其中，所述反应在10至12，诸如11的pH值下进行。
30.根据条款29所述的方法，其中，在进行步骤(c)之前，将步骤(b)的反应产物离心持续第二时间段，并且将上清液去除并用具有10至12诸如11的pH的液体替换，并且将这个离心、上清液去除以及液体替换步骤重复另外一次至四次，诸如另外两次。
31.根据条款28至30中任一项所述的方法，其中，所述方法的步骤(a)中提供的水溶液是通过以下步骤获得的：
(i)将从受试者获得的包含盐和非盐组分的尿样品添加到反相柱中以提供加载柱；
(ii)通过用水洗脱从所述加载柱中去除所述盐组分，然后通过用C1-4醇(例如甲醇)洗脱从所述加载柱中去除并分离所述非盐组分并然后去除所述C1-4醇；以及
(iii)将水溶液添加至所述分离的非盐组分中以提供步骤(a)的所述水溶液，任选地其中所述水溶液具有10至12诸如11的pH。
32.根据条款28至31中任一项所述的方法，其中，所述拉曼光谱分析使用532nm的激光激发波长、使用0.01至1mW的激光功率以及1至60秒的采集时间进行，任选地其中所述激光功率是0.2mW并且所述采集时间是1秒。
33.制造适合于在表面增强拉曼散射中使用的复合超疏水性材料的方法，所述方法包括：
(ia)提供金属涂覆的复合材料，所述金属涂覆的复合材料包含：
衬底层，所述衬底层包含一组带正电荷的或带负电荷的官能团；
在所述衬底层的顶部上的金属纳米颗粒涂层，所述金属纳米颗粒涂层包含一组带负电荷的或带正电荷的官能团，其中所述金属纳米颗粒涂层包含第一组和第二组金属纳米颗粒，其中所述第一组金属纳米颗粒具有比所述第二组的直径小0.1至90％的直径；以及
在所述金属纳米颗粒涂层的顶部上的金属层；以及
(ib)将所述金属涂覆的复合材料浸入包含超疏水性材料的溶液中以在所述金属层的顶部上形成超疏水性层，从而形成所述复合超疏水性材料，其中：
所述第一组金属纳米颗粒的金属是金和/或银；
所述第二组金属纳米颗粒的金属是金和/或银；并且
所述衬底层和金属纳米颗粒涂层上的带电荷的官能团彼此电子地互补。
34.根据条款33所述的方法，其中，所述金属涂覆的复合材料通过以下方式形成：
(A)提供金属纳米颗粒涂覆的衬底，所述金属纳米颗粒涂覆的衬底包含衬底层以及在所述衬底层的顶部上的金属纳米颗粒涂层，所述衬底层包含一组带正电荷的或带负电荷的官能团，所述金属纳米颗粒涂层包含一组带负电荷的或带正电荷的官能团，其中所述金属纳米颗粒涂层包含第一组和第二组金属纳米颗粒；以及
(B)将金属层沉积在所述金属纳米颗粒涂覆的衬底的顶部上，任选地其中所述沉积通过热蒸发金属进行薄膜淀积。
35.根据条款34所述的方法，其中，所述金属涂覆的复合材料包含夹在所述金属纳米颗粒涂层与所述金属层之间的另外的超疏水性层。
36.根据条款35所述的方法，其中，所述另外的超疏水性层通过以下方式形成：将金属纳米颗粒涂覆的衬底浸入包含超疏水性材料的溶液中以在所述金属纳米颗粒层的顶部上形成超疏水性层，其中所述金属纳米颗粒涂覆的衬底包含衬底层以及在所述衬底层的顶部上的金属纳米颗粒涂层，所述衬底层包含一组带正电荷的或带负电荷的官能团，所述金属纳米颗粒涂层包含一组带负电荷的或带正电荷的官能团，其中所述金属纳米颗粒涂层包含第一组和第二组金属纳米颗粒。
37.根据条款33至36中任一项所述的方法，其中，所述金属层是5至53nm厚，诸如15至43nm厚、诸如20至33nm厚、诸如25至30nm厚。
38.根据条款33至37中任一项所述的方法，其中，所述金属层包含银层、金层或者银和金层，任选地其中所述银层、金层或者银和金层是5至48nm厚，诸如10至38nm厚、诸如15至28nm厚、诸如20至25nm厚。
39.根据条款38所述的方法，其中，所述金属层进一步包含铬层，任选地其中所述铬层是2至5nm厚。
40.根据条款38或条款39所述的方法，其中，所述铬层在所述金属纳米颗粒层的顶部上，并且所述银层、金层或者银和金层在所述铬层的顶部上。
41.根据条款33至40中任一项所述的方法，其中，所述金属纳米颗粒涂覆的衬底通过使包含一组带正电荷的或带负电荷的官能团的衬底与包括包含一组带负电荷的或带正电荷的官能团的金属纳米颗粒的溶液接触来形成，其中所述金属纳米颗粒包含第一和第二组金属纳米颗粒。
42.根据条款33至41中任一项所述的方法，其中，所述第一组纳米颗粒具有的平均直径为10至250nm，诸如20至100nm、诸如30至50nm、诸如130至240nm、诸如135至230nm。
43.根据条款33至42中任一项所述的方法，其中，所述第二组纳米颗粒具有的平均直径为250至1,000nm，诸如300至600nm、诸如311至540nm。
44.根据条款33至43中任一项所述的方法，其中，所述第一组金属纳米颗粒具有的直径比所述第二组的直径小0.2至60％，诸如比所述第二组的直径小0.5至57％、诸如1至55％、诸如10至50％、诸如25至45％，诸如比所述第二组的直径小61至89％，诸如比所述第二组的直径小75至85％、诸如79至83％。
45.根据条款33至44中任一项所述的方法，其中，所述复合材料具有的均方根表面粗糙度为30至150nm，诸如40至140nm、诸如50至125nm、诸如110至125nm。
46.根据条款33至45中任一项所述的方法，其中，所述复合材料上的所述第二组纳米颗粒中的颗粒的总数目比所述第一组纳米颗粒中的颗粒的总数目是1:10至10:1，诸如1:5至5:1、诸如2:1至4:1。
47.根据条款33至46中任一项所述的方法，其中，所述衬底是由聚(二甲基硅氧烷)、玻璃和硅组成的组中的一种或多种。
48.根据条款33至47中任一项所述的方法，其中，所述衬底层上的所述带电荷的官能团的组是带正电荷的，并且所述金属纳米颗粒涂层上的所述带电荷的官能团是带负电荷的。
49.根据条款48所述的方法，其中，所述衬底层上的所述带正电荷的官能团的组是铵离子，任选地其中所述衬底层上的所述带正电荷的官能团的组衍生自含有一个或两个氨基的硅烷化合物，诸如3-氨基丙基三乙氧基硅烷。
50.根据条款48或条款49所述的方法，其中，所述第一和第二组金属纳米颗粒上的所述带负电荷的官能团的组是羧酸根离子或醇盐离子，任选地其中所述第一和第二组金属纳米颗粒上的所述带负电荷的官能团的组衍生自含有一个或多个羧酸基团的烷基硫醇或者含有一个或多个羟基的烷基硫醇，诸如11-巯基十一烷酸。
51.根据条款33至47中任一项所述的方法，其中，所述衬底层上的所述带电荷的官能团的组是带负电荷的，并且所述金属纳米颗粒涂层上的所述带电荷的官能团是带正电荷的。
52.根据条款51所述的方法，其中，所述衬底层上的所述带负电荷的官能团的组是羧酸根离子或醇盐离子，任选地其中所述衬底层上的所述带负电荷的官能团的组衍生自含有一个或多个羧酸基团的硅烷化合物或者含有一个或多个羟基的硅烷化合物。
53.根据条款51或条款52所述的方法，其中，所述第一和第二组金属纳米颗粒上的所述带正电荷的官能团的组是铵离子，任选地其中所述第一和第二组金属纳米颗粒上的所述带正电荷的官能团的组衍生自含有一个或多个氨基的烷基硫醇化合物。
54.根据条款33至53中任一项所述的方法，其中，在条款33的步骤(ib)中使用的所述超疏水性材料是未取代的或被一个或多个氟基团取代的C10至C20硫醇，任选地其中所述超疏水性材料选自由1-十二烷硫醇、1-十六烷硫醇和1H,1H,2H,2H-全氟癸烷硫醇组成的组中的一种或多种。
55.根据条款35至54中任一项所述的方法，其中，用于形成所述另外的超疏水性层的超疏水性材料是未取代的或被一个或多个氟基团取代的C10至C20硫醇，任选地其中所述超疏水性材料选自由1-十二烷硫醇、1-十六烷硫醇和1H,1H,2H,2H-全氟癸烷硫醇组成的组中的一种或多种。
56.根据条款33至55中任一项所述的方法，其中，所述第一组金属纳米颗粒是纳米立方体，并且所述第二组金属纳米颗粒是具有多于六个面的纳米多面体并且选自具有7至30个面的一种或多种纳米多面体。
57.根据条款56所述的方法，其中，所述第二组金属纳米颗粒是纳米八面体。
58.根据条款33至57中任一项所述的方法，其中，所述第一和第二组纳米颗粒是银纳米颗粒。
附图说明
图1描绘了：在本发明的实施方式中使用的AgNC和AgNO的(a，c)SEM图像；(b，d)吸收光谱；以及(e，f)尺寸分布。
图2描绘了分别地在水和乙醇中(a，b)AgNO；以及(c，d)AgNC的SEM图像。
图3描绘了：(a)硅衬底的表面官能化的示意图；以及(b)经处理的或官能化的衬底40、60和80的静态接触角。
图4描绘了(a)初始批次的超疏水性衬底107；和(b)最佳批次的超疏水性衬底109的制造的示意图。
图5描绘了使用从(a-f)20至120min的在Ag纳米颗粒混合物中的衬底80的温育时间制备的超疏水性衬底107的SEM图像和静态接触角。
图6描绘了在浸于PFDT溶液中15至45hr之后超疏水性衬底107的SERS光谱。
图7描绘了：(a-c)分别地含有AgNC、AgNO以及AgNC和AgNO两者的衬底的AFM图像；(d，e)含有仅AgNC的衬底的SEM图像和静态接触角；(f，g)含有仅AgNO的衬底的SEM图像和静态接触角。
图8描绘了与亲水性衬底相比超疏水性衬底的液体浓缩效应：(a，b)分别地亲水性衬底和超疏水性衬底107的静态接触角；(c)干燥的样品在亲水性衬底上的斑点区域的光学图像；(d)干燥的样品在衬底107上的SEM图像；
(e，f)分别地亲水性衬底和超疏水性衬底109的静态接触角；(g)干燥的样品在亲水性衬底上的斑点区域的光学图像；(h)干燥的样品在衬底109上的SEM图像。
图9描绘了AgNC与AgNO的颗粒比对超疏水性衬底109的(a)静态接触角；和(b)颗粒密度的影响。
图10描绘了衬底80在Ag纳米颗粒混合物(AgNC和AgNO)中的温育时间对超疏水性衬底109的(a)静态接触角；和(b)颗粒密度的影响。
图11描绘了：(a)具有单独的AgNC或AgNO，以及AgNC和AgNO的二元组合对超疏水性衬底109的静态接触角的影响；和(b)各自衬底的AFM图像。
图12描绘了(a)超疏水性二氧化硅珠阵列；(b)超疏水性衬底109；和(c)具有AgNC/4-MPBA的超疏水性衬底109的亚甲蓝和相应的分析增强因子(AEF)的SERS光谱。
图13描绘了使用初始批次的超疏水性衬底107来检测尿代谢物和毒素：(a，b)分别示出了各种浓度的5β-孕甾烷-3α,20α-二醇葡糖苷酸(孕甾烷)的SERS光谱，以及信号强度随浓度变化的校正曲线；(c，d)分别示出了各种浓度的对氨基苯胂酸和罗沙胂(roxarsone)的SERS光谱。
图14描绘了：(a)THC(120)和孕甾烷(125)结合到锚定在AgNC表面135上的4-MPBA(130)上的示意图；(b)使用AgNC/4-MPBA与超疏水性衬底109的4-MPBA、在分别地用THC和孕甾烷温育之后的4-MPBA的SERS光谱；在结合至THC(120)和孕甾烷(125)上之后4-MPBA的光谱的(c)范围(i)；和(d)范围(ii)中的实验和模拟的SERS光谱。
图15描绘了：(a，b)在超疏水性衬底109上在10-4-10-9M的不同浓度下分别用孕甾烷和THC温育之后的AgNC/4-MPBA的SERS光谱；(c)与AgNC/4-MPBA以及在分别用孕甾烷和THC温育后相关的各自SERS光谱的PCA簇集；(d，e)10-4-10-9M的孕甾烷和THC分别的PLS浓度预测模型；以及(f)不同孕甾烷百分比的孕甾烷和THC的混合物的PLS模型。
图16描绘了：(a)人造或实际尿样品的ZIPTIP预处理的示意图；(b)使经处理的样品238经受AgNC/4-MPBA，然后进行在超疏水性衬底109上的SERS检测和化学统计分析240的示意图。
图17描绘了：(a)在人造尿中使用各种浓度的孕甾烷制备的PLS预测模型；(b)从模拟稳定的妊娠(98.7％的孕甾烷)的人造尿样品以及从模拟流产(97.4％的孕甾烷)的尿样品中获得的SERS光谱的PCA簇集；(c)在用具有各种浓度的孕甾烷的人造尿样品温育后，与AgNC/4-MPBA相关的SERS光谱；(d)在用分别地掺有98.7％孕甾烷(以模拟稳定的妊娠)和掺有97.4％孕甾烷(以模拟流产风险)的人造尿样品温育后与AgNC/4-MPBA相关的SERS光谱；以及(e)在人造尿中使用各种浓度的孕甾烷建立的PLS模型，用分别表示模拟稳定的妊娠和模拟流产的两个点(星形)拟合。
图18描绘了：(a)使用在非孕妇的实际尿样品中各种浓度的孕甾烷制备的PLS预测模型。预测图用对应于成功生产(S1-S3)和流产(M1-M3)的个体的点(星形)进行拟合；(b)掺有不同浓度的孕甾烷的非孕妇的实际尿样品的SERS光谱；(c)来自对应于成功生产(S1-S3)和流产(M1-M3)的那些的孕妇的真实尿样品的SERS光谱；以及(d)从来自成功生产(S1)和流产(M1)的孕妇的真实样品获得的SERS光谱的PCA簇集。
图19描绘了：(a，b)分别地AgNS的SEM图像和颗粒尺寸分布；含有AgNS和AgNO的二元组合的超疏水性衬底的(c)SEM图像和静态接触角；以及(d)颗粒密度。
具体实施方式
如上文提出的，本发明涉及适合于在表面增强拉曼散射中使用的复合超疏水性材料，所述材料包含：
衬底层，所述衬底层包含一组带正电荷的或带负电荷的官能团；
在所述衬底层的顶部上的金属纳米颗粒涂层，所述金属纳米颗粒涂层包含一组带负电荷的或带正电荷的官能团；
在所述金属纳米颗粒涂层的顶部上的金属层；以及
在所述金属层的顶部上的第一超疏水性层，其中：
所述金属纳米颗粒涂层包含第一组和第二组金属纳米颗粒，其中所述第一组金属纳米颗粒具有比所述第二组的直径小0.1至90％的直径；
所述第一组金属纳米颗粒的金属是金和/或银；
所述第二组金属纳米颗粒的金属是金和/或银；并且
所述衬底层和金属纳米颗粒涂层上的带电荷的官能团彼此电子地互补。
当本文中使用时，术语“超疏水性”指的是具有高度疏水性的一个或多个表面的材料，使得这些表面极其难于润湿。例如，本文提及的超疏水性材料可以是具有显示大于150°的与水的静态接触角的一个或多个表面的材料。本文可以提及的合适的与水的静态接触角的实例包括但不限于151°至170°，诸如155°至165°的接触角。在以下实施例部分中提供了静态接触角测量技术的细节。
为了避免疑问，当数值在本申请中呈现时，端点的任何合适的组合在本文中都是明确考虑的。例如，以下接触角范围被考虑：
大于150°、大于150°至151°、大于150°至155°、大于150°至165°、大于150°至170°；
151°至155°、151°至165°、151°至170°；以及
155°至165°、155°至170°。
表面增强拉曼散射(SERS)是通过吸附在粗糙金属表面上的分子或通过表面上的纳米结构增强拉曼散射的表面灵敏技术。因此，本文讨论的所得复合材料可具有能够进行SERS分析的适当粗糙的表面。例如，复合材料可具有30至150nm，诸如40至140nm、诸如50至125nm、诸如110至125nm的均方根粗糙度值。
当本文中使用时，术语“衬底”指的是适合于用正或负官能团官能化的任何合适的基体材料。合适的衬底的实例包括但不限于硒、聚(二甲基硅氧烷)、硅、玻璃、塑料等。所述衬底可以任何合适的平面形式，诸如芯片或晶片呈现。以下提供了可以如何将这样的衬底官能化以呈现带电荷的表面的细节。
当本文中使用时，术语“带正电荷的官能团”指的是在合适的条件下携带正电荷的官能团。合适的官能团的实例包括但不限于氨基官能团(例如呈铵基团的形式)等。
当本文中使用时，术语“带负电荷的官能团”指的是在合适的条件下携带负电荷的官能团。合适的官能团的实例包括但不限于羧酸和醇官能团(例如呈羧酸根基团和醇盐的形式)、磺酸、核酸等。
术语“金属纳米颗粒”本文中旨在指的是金纳米颗粒、银纳米颗粒、金和银的合金以及其任何合适的组合。
如以上提出的，衬底层的顶部上的金属纳米颗粒涂层具有与衬底层的电荷相反的电荷。例如，如果衬底是带正电荷的，则金属纳米颗粒涂层含有带负电荷的金属纳米颗粒，并且反之亦然。鉴于此，在衬底与金属纳米颗粒之间形成静电吸引，这使得能够形成涂层层。
金属纳米颗粒涂层层通过在衬底的表面上沉积的两个不同尺寸组的金属纳米颗粒形成。如指示的，第一组金属纳米颗粒具有比第二组的直径小0.1至90％的直径。例如，第一组金属纳米颗粒可具有比第二组的直径小0.2至60％，比第二组的直径小诸如0.5至57％、诸如1至55％、诸如10至50％、诸如25至45％的直径。在替代性实施方式中，第一组金属纳米颗粒可具有比第二组的直径小61至89％，比第二组的直径小诸如75至85％、诸如79至83％的直径。为了避免疑问，明确考虑的是可以组合所有以上规定的数值以提供合适的范围。例如，以上值还公开了0.2至89％、0.5至89％和0.5至83％等等的范围。
在本文可以提及的某些实施方式中，第一组纳米颗粒可具有10至250nm，诸如20至100nm、诸如30至50nm、或诸如130至240nm、诸如135至230nm的平均直径；和/或第二组纳米颗粒具有250至1,000nm，诸如300至600nm、诸如311至540nm的平均直径。如将理解，可以任何合适的方式组合这些范围。例如，当第一组纳米颗粒具有130至250nm的平均直径时，则第二组纳米颗粒可具有选自以下范围的直径：250至300nm、250至311nm、250至540nm、250至600nm和250至1,000nm。在其中第一组纳米颗粒具有250nm的直径的情况下，则将第二组纳米颗粒的下限相应地调节为增大至少0.1％(即至少大约250.25nm的直径)。
可以使用任何合适的第一与第二组纳米颗粒的比率。例如，在本文可以提及的本发明的实施方式中，复合材料上的第二组纳米颗粒中的颗粒的总数目比第一组纳米颗粒中的颗粒的总数目可以是1:10至10:1，诸如1:5至5:1、诸如2:1至4:1。
第一和第二组金属纳米颗粒可具有任何合适的形状。例如，第一和第二组金属纳米颗粒可具有球状形状或多面体形状。合适的多面体形状的实例包括立方体和具有多于六个面的多面体，诸如具有7至30个面的多面体。第一和第二组金属纳米颗粒可具有相同的形状(因此仅通过尺寸区分)或具有不同形状(因此通过尺寸和形状两者区分)。在本文可以提及的某些实施方式中，第一组金属纳米颗粒可以是纳米立方体并且第二组金属纳米颗粒可以是具有多于六个面的纳米多面体，这些纳米多面体可以选自具有7至30个面的一种或多种纳米多面体(例如第二组金属纳米颗粒可以是纳米八面体)。
金属纳米颗粒层由通过在金属纳米颗粒与衬底的表面上的各自带电荷的官能团的组之间的电荷吸引静电地结合至衬底层的表面的单独纳米颗粒构成。
在某些实施方式中，衬底层上的带电荷的官能团的组可以是带正电荷的并且金属纳米颗粒涂层上的带电荷的官能团可以是带负电荷的。当衬底层上的官能团是带正电荷的时，它们可以是铵离子。能够结合至衬底并且提供铵离子的任何合适的配体可以用于这个目的。例如，衬底层上的带正电荷的官能团的组可以衍生自含有一个或两个氨基的硅烷化合物，诸如3-氨基丙基三乙氧基硅烷。当第一和第二组金属纳米颗粒上的官能团是带负电荷的时，它们可以是羧酸根离子或醇盐离子。能够结合至金属并且提供羧酸根或氢氧根离子的任何合适的配体可以用于这个目的。例如，第一和第二组金属纳米颗粒上的带负电荷的官能团的组可以衍生自含有一个或多个羧酸基团的烷基硫醇或含有一个或多个羟基的烷基硫醇，诸如11-巯基十一烷酸。
在某些实施方式中，衬底层上的带电荷的官能团的组可以是带负电荷的并且金属纳米颗粒涂层上的带电荷的官能团可以是带正电荷的。当衬底层上的官能团是带负电荷的时，它们可以是羧酸根离子或醇盐离子。能够结合至衬底并且提供羧酸根或醇盐离子的任何合适的配体可以用于这个目的。例如，衬底层上的带负电荷的官能团的组可以衍生自含有一个或多个羧酸基团的硅烷化合物或含有一个或多个羟基的硅烷化合物。当第一和第二组金属纳米颗粒上的官能团是带正电荷的时，它们可以是铵离子。能够结合至金属并且提供铵离子的任何合适的配体可以用于这个目的。例如，第一和第二组金属纳米颗粒上的带正电荷的官能团的组可以衍生自含有一个或多个氨基的烷基硫醇化合物。
衬底层的表面上的金属纳米颗粒涂层可具有2至20颗粒/μm2，诸如2.5至10颗粒/μm2、诸如3至5颗粒/μm2、诸如4.4颗粒/μm2的密度。如将理解，以上密度可导致相邻金属纳米颗粒之间存在间隙，其可暴露衬底表面的一部分以与放置在金属纳米颗粒涂层层的顶部上的层相互作用。例如，金属纳米颗粒涂层中的间隙可允许通过所述间隙将放置在金属纳米颗粒涂层的顶部上的金属层与衬底层直接附接，从而通过物理约束以及通过在金属纳米颗粒与衬底上的带正电荷的和带负荷电的官能团之间的静电相互作用，将金属纳米颗粒锁定在衬底表面上的适当位置。
金属层可以是5至53nm厚，诸如15至43nm厚、诸如20至33nm厚、诸如25至30nm厚。金属层可以是银层、金层或者银和金层，其可以是5至48nm厚，诸如10至38nm厚、诸如15至28nm厚、诸如20至25nm厚。在某些实施方式中，金属层可进一步含有铬层，其可以是2至5nm厚。当存在时，铬层可以直接在金属纳米颗粒涂层的顶部上，其中其余金属层(即银、金或者银和金层)在铬层的顶部上。
第一超疏水性层可以使用任何合适的超疏水性材料或其组合。合适的超疏水性材料的实例包括但不限于未取代的或被一个或多个氟基团取代的C10至C20硫醇。例如，第一超疏水性层可以由1-十二烷硫醇、1-十六烷硫醇和1H,1H,2H,2H-全氟癸烷硫醇组成的组中的一种或多种形成。
在本发明的某些实施方式中，第二超疏水性层夹在金属纳米颗粒涂层与金属层之间。不希望受理论的束缚，第二疏水性层替换金属纳米颗粒的暴露表面上的带电荷的官能团，因此提供更干净的SERS衬底背景光谱。第二超疏水性层可以由与第一超疏水性层相同的材料形成。
在本发明的实施方式中，金属纳米颗粒和金属层可以选自银、金或其组合/合金。虽然任何合适的组合是可能的，特别是本文提及的实施方式，但是金属纳米颗粒和金属层可以由银形成(其中金属层任选地由铬层和银层形成)。
适合于在表面增强拉曼散射中使用的复合超疏水性材料可以通过包括以下的方法制造：
(ia)提供金属涂覆的复合材料，所述金属涂覆的复合材料包含：
衬底层，所述衬底层包含一组带正电荷的或带负电荷的官能团；
在所述衬底层的顶部上的金属纳米颗粒涂层，所述金属纳米颗粒涂层包含一组带负电荷的或带正电荷的官能团，其中所述金属纳米颗粒涂层包含第一组和第二组金属纳米颗粒，其中所述第一组金属纳米颗粒具有比所述第二组的直径小0.1至90％的直径；以及
在所述金属纳米颗粒涂层的顶部上的金属层；以及
(ib)将所述金属涂覆的复合材料浸入包含超疏水性材料的溶液中以在所述金属层的顶部上形成超疏水性层，从而形成所述复合超疏水性材料，其中：
所述第一组金属纳米颗粒的金属是金和/或银；
所述第二组金属纳米颗粒的金属是金和/或银；并且
所述衬底层和金属纳米颗粒涂层上的带电荷的官能团彼此电子地互补。
如将理解，通过以上方法制造的复合超疏水性材料的所得组分和大小与以上描述的那些相同，并因此本文现将关于方法对其进行描述。
金属涂覆的复合材料可以通过以下方式形成：
(A)提供金属纳米颗粒涂覆的衬底，所述金属纳米颗粒涂覆的衬底包含衬底层以及在所述衬底层的顶部上的金属纳米颗粒涂层，所述衬底层包含一组带正电荷的或带负电荷的官能团，所述金属纳米颗粒涂层包含一组带负电荷的或带正电荷的官能团，其中所述金属纳米颗粒涂层包含第一组和第二组金属纳米颗粒；以及
(B)将金属层沉积在所述金属纳米颗粒涂覆的衬底的顶部上，任选地其中所述沉积通过热蒸发金属进行薄膜淀积。
关于复合超疏水性材料产物，以上描述了金属层和金属纳米颗粒的细节。
在某些实施方式中，金属涂覆的复合材料可包含夹在金属纳米颗粒涂层与金属层之间的另外的超疏水性层。在存在这种另外的超疏水性层的实施方式中，它可以通过以下方式形成：将金属纳米颗粒涂覆的衬底浸入包含超疏水性材料的溶液中以在金属纳米颗粒层的顶部上形成超疏水性层，其中所述金属纳米颗粒涂覆的衬底包含衬底层以及在所述衬底层的顶部上的金属纳米颗粒涂层，所述衬底层包含一组带正电荷的或带负电荷的官能团，所述金属纳米颗粒涂层包含一组带负电荷的或带正电荷的官能团，其中所述金属纳米颗粒涂层包含第一组和第二组金属纳米颗粒。
所述金属纳米颗粒涂覆的衬底可通过使包含一组带正电荷的或带负电荷的官能团的衬底与包括包含一组带负电荷的或带正电荷的官能团的金属纳米颗粒的溶液接触来形成，其中所述金属纳米颗粒包含第一和第二组金属纳米颗粒。关于复合超疏水性材料产物，以上描述了所述第一和第二组金属纳米颗粒。
虽然单独地使用以上描述的复合超疏水性材料可以改进样品中分析物的SERS检测，但是当与可直接添加至经加工的尿样品中的金属纳米颗粒结合使用时，它尤其有效。因此，本发明还包括部件试剂盒，该部件试剂盒包含：
(ai)如以上描述的复合超疏水性材料；以及
(bi)尿分析配制品，该尿分析配制品包含涂覆有包含硫醇基团的有机硼酸的银和/或金纳米颗粒。
如将理解，单独地使用复合超疏水性材料可允许直接进行分析物的SERS检测和量化。即，通过直接检测孕甾烷和/或四氢可的松，其在以下实施例2中更详细地进行讨论。将理解，实施例2中描述的技术可以用于检测四氢可的松。可替代地，当复合超疏水性材料与金属纳米颗粒组合使用时，SERS检测可以通过间接手段，凭此通过它们对有机硼酸的SERS光谱的影响获得分析物的量化(参见以下实施例3-6)。应注意，涂覆有包含硫醇基团的有机硼酸的银和/或金纳米颗粒可以提供“镜象效应”，其进一步增强衬底的分析增强因子，如在以下实施例中更详细地描述的。
尿分析配制品的银和/或金纳米颗粒可以是由与用于形成该复合超疏水性材料的那些相同的金属形成的。即，如果超疏水性材料使用用于金属纳米颗粒和金属层的银形成，则尿分析配制品的纳米颗粒可以是银纳米颗粒。如果超疏水性材料使用用于金属纳米颗粒和金属层的金形成，则尿分析配制品的纳米颗粒可以是金纳米颗粒等。
可以使用任何合适的有机硼酸，并且合适的有机硼酸的实例通过以下式I的化合物提供：
Figure GDA0002655633560000241
其中：
X1是N或CR3；
X2是N或CR4；
X3是N或CR5；
R1至R5独立地表示H、B(OH)2、CH3、CHO、CO2H、CN、NH2、OH、SH、NO2、F、Br、Cl，
其中X1至X3都不是N或X1至X3之一是N，并且前提是当X1至X3之一是N时，则R1至R5独立地表示H、B(OH)2、CH3、CO2H、CN、NH2、OH、SH、NO2、F、Br、Cl。
本文可以提及的合适的有机硼酸是4-巯苯基硼酸。
尿分析配制品的纳米颗粒可具有任何合适的尺寸或形状。例如，尿分析配制品的纳米颗粒可以呈球体或多面体的形式，诸如立方体。所述纳米颗粒可具有任何合适的表面积，诸如50,000至150,000nm2。在本文可以提及的具体实例中，尿分析配制品的纳米颗粒可以呈具有128.9nm的边长的立方体的形式，其提供了99,810.4nm2的表面积。如果有机硼酸是4-巯苯基硼酸，则当结合至纳米颗粒的表面时，估计该分子具有约0.34nm2的表面积。因此，估计结合至立方体的表面的表面的4-巯苯基硼酸分子的总数目(假设完全覆盖)为293,560个分子。
如在PCT专利申请公开No.WO 2018/199849中概述的，该申请通过引用以其全文并入本申请，可将怀孕女性尿中某些分子的水平用于确定受试者中的流产风险。虽然在WO2018/199849中指示的任何或所有分子可以与使用SERS的以上描述的部件试剂盒组合使用，但是已经发现，孕甾烷(即，3α,20α-二羟基-5-孕甾烷-3-葡糖苷酸或5β-孕甾烷-3α,20α-二醇葡糖苷酸)和四氢可的松可以特别可用于这样的方法中。因此，提供了预测自然流产风险增加的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供包含从受试者获得的尿样品的非盐组分的水溶液；
(b)使所述水溶液与包含涂覆有包含硫醇基团的有机硼酸的银和/或金纳米颗粒的尿分析配制品反应持续第一时间段以提供络合样品，任选地其中所述纳米颗粒由在所述复合超疏水性材料中使用的一种或多种相同金属形成和/或所述有机硼酸是4-巯苯基硼酸；
(c)将所述络合样品放置到如以上描述的复合超疏水性材料上并且通过蒸发来去除水以提供干燥的样品；以及
(d)对所述干燥的样品进行拉曼光谱分析以确定孕甾烷和四氢可的松的丰度，并且然后基于下式预测自然流产的风险：
Figure GDA0002655633560000261
其中低于阈值的值指示自然流产风险增加，任选地其中所述第一时间段是3至48小时，诸如3小时。
如本文(以及WO 2018/199849)中描述的，孕甾烷/四氢可的松的比率为76指示稳定的妊娠，并且其相应的孕甾烷百分比是98.7％。孕甾烷/四氢可的松的比率为38指示流产风险，并且相应的孕甾烷百分比是97.4％。
虽然以上反应步骤(b)可以在任何合适的pH下进行，但是反应可以最平稳地在10至12(诸如11)的pH范围中进行。在其中步骤(b)的pH是10至12的一些实施方式中，在进行以上方法的步骤(c)之前，可以将步骤(b)的产物离心持续第二时间段，并且将上清液去除并用具有10至12(诸如11)的pH的液体(诸如水性KOH)替换，并且可以将该离心、上清液去除以及液体替换步骤重复另外一至四次，诸如另外两次。
上述方法的步骤(a)中使用的水溶液可以通过以下步骤获得：
(i)将从受试者获得的包含盐和非盐组分的尿样品添加到反相柱中以提供加载柱；
(ii)通过用水洗脱从所述加载柱中去除所述盐组分，然后通过用C1-4醇(例如甲醇)洗脱从所述加载柱中去除并分离所述非盐组分并然后去除所述C1-4醇；以及
(iii)将水溶液添加至所述分离的非盐组分中以提供所述步骤(a)的水溶液。在某些实施方式中，步骤(a)的水溶液可具有10至12(诸如11)的pH。
虽然可以选择用于拉曼光谱学的任何合适的设置，但是本文可以提及的条件的方便设置是其中拉曼光谱学使用532nm的激光激发波长、使用0.01至1mW的激光功率以及1至60秒的采集时间进行。例如，激光功率可以是0.2mW并且采集时间可以是1秒。
对于每种样品所取的光谱数可以是10至5,000个SERS光谱，诸如20至2,000个SERS光谱。在本发明的实施方式中，总计30个SERS光谱可以是最佳的。
如将理解，在运行实际样品之前，进行超疏水性(SPHB)衬底本身的背景扫描以确保不存在由11-巯基十一烷酸引起的干扰信号。仅当来自SPHB衬底背景的SERS信号的基线是平坦且无特征时才运行样品。为了建立校正曲线，使用掺有不同量的90–100％孕甾烷/四氢可的松浓度比率的非孕妇的尿样品运行SERS实验和分析。然后将该校正曲线用于预测测试样品中与THC相比孕甾烷的相对丰度。应注意，要求分析物-特定校正曲线用于量化每种特定分析物。
在以下实施例部分中提供了SERS分析的另外细节。
现在将关于以下非限制性实施例讨论本发明的另外方面和实施方式。
实施例
材料
硝酸银(≥99％)、无水1,5-戊二醇(PD，≥97％)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP，平均MW＝55,000g/mol)、甲苯(99.5％)、11-巯基十一烷酸(95％)、4-巯苯基硼酸(90％)、氨溶液(28-30％)、1H,1H,2H,2H-全氟癸烷硫醇(PFDT，97+％)购自Sigma Aldrich。氯化铜(II)(≥98％)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(98％)购自Alfa Aesar。乙醇(ACS，ISO，Reag.Ph Eur)购自EMSURE；盐酸(HCl，37％)购自Analar Normapur。四氢可的松(THC)购自ScientificResources。5β-孕甾烷-3α,20α-二醇葡糖苷酸(被称为“孕甾烷”)购自AXIL ScientificPte Ltd。所有化学品均不用进一步纯化而使用。使用Sartorius Arium 611 UV超纯水系统获得Milli-Q水(＞18.0MΩ.cm)。
通用方法
在5kV的加速电压下使用JEOL-JSM-7600F显微镜进行SEM成像。紫外-可见光谱测量是使用Cary 60紫外-可见光谱仪进行的。使用具有DTS1070折叠的毛细管电池的ZETASIZER NANO进行ζ电位测量。使用Syskey热蒸发器(中国台湾)进行Ag的热蒸发。使用JPK Nanowizard 3BioScience原子力显微镜(AFM)在Zeiss倒置显微镜上测量样品的粗糙度。
用Ramantouch微型光谱仪(Nanophoton Inc，大阪，日本)在532nm的激发波长(0.01-1mW的功率，和1-60s的采集时间)下进行x-y SERS测量。具有10s积聚时间的20x(N.A.0.45)物镜用于在500cm-1至1600cm-1之间的数据收集。所有SERS光谱均通过将至少10个单独的光谱/拉曼图像求平均值来获得。填充有C18柱的ZIPTIP(Merck Millipore)用于样品预处理。使用Panorama软件(LabCognition，Analytical Software GmbH&Co.KG)进行PCA和PLS分析。
接触角测量
使用配备有Firewire数字摄像机的Theta Lite张力计测量接触角。通过将4μL水滴的座滴(sessile droplet)落下到衬底上测量静态接触角。在固-液界面与液体-空气界面之间形成的角是静态接触角。测量前进接触角作为通过将少量液体(20μL)缓慢添加至液滴测量的最大接触角。在添加液体期间，接触线保持不变，而接触角在润湿过程期间增加。还测量了后退接触角作为当从液滴中缓慢去除少量液体时的最小接触角。在去除液体期间，接触线保持不变，而接触角在去润湿过程期间减小。在前进接触角与后退接触角之间的差产生接触角滞后。在整个每个衬底上将每种类型的接触角测量进行至少五次以获得平均润湿角。
衬底的液体浓缩效应
为了确定衬底的液体浓缩效应，将使用修改的
Figure GDA0002655633560000291
方法合成的二氧化硅颗粒悬浮液用在衬底上。
典型地，在剧烈搅拌下将去离子水(1.5mL)和氨溶液(1.5mL)的混合物滴加到原硅酸四乙基酯乙醇溶液(0.35M，0.76mL)中持续30min。通过离心、用乙醇和水洗涤并且随后再分散于去离子水中来获得二氧化硅珠。分别地，将1μL的水可溶性二氧化硅珠滴铸到各自超疏水性衬底和O2等离子体处理的Si衬底(亲水性衬底)上，并且使其在环境条件下干燥。然后将干燥的斑点通过SEM表征，并且使用ImageJ软件测量超疏水性和亲水性表面两者上的表面积。
通用程序1–合成和纯化银纳米立方体(AgNC)
根据在Angew.Chem.Int.Ed.2006,45,4597中描述的多元醇方法进行银纳米立方体(AgNC)的制备。典型地，通过反复涡旋和超声处理混合物直至固体完全溶解于PD中，首先分别制备了CuCl2(8mg/mL)和PVP(20mg/mL)的两种10mL溶液。然后将35μL的CuCl2溶液添加至AgNO3溶液(20mg/mL，10mL)中，反复涡旋和超声处理直至固体完全溶解。
向已经用王水清洁并且在190℃下加热10min的100mL圆底烧瓶中，添加20mL的1,5-戊二醇(PD)，接着每30s滴加250μL的聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)溶液(PVP使AgNC稳定)至混合物中，以及每分钟快速地添加500μL的AgNO3溶液(含有CuCl2)。继续这个过程直到反应混合物变成红棕色。对于“通用程序2”中的银纳米八面体(AgNO)的随后生长，使用这种溶液而没有进一步处理。
为了纯化AgNC用于进一步自组装实验，将丙酮添加至AgNC溶液中并离心以去除过量PD。然后将上清液分散于乙醇中以去除过量丙酮。将所得悬浮液分散于10mL乙醇中并且随后用100mL的PVP水溶液(0.2g/L)稀释。然后使用具有孔径5000、650、450和220nm的PVDF过滤膜将混合物在每种孔径上真空过滤若干次。
将初始批次的AgNC通过紫外-可见光谱学和SEM成像表征以确定AgNC的吸光度(等离体子共振)和边长(图1a和1b)。将边长在使用ImageJ软件的SEM图像中测量并且确定为116±3nm(图1e)。
对于随后的最佳批次的AgNC，将边长使用ImageJ软件对于100个颗粒进行测量并分析，并且确定为128±7nm。合成后原样的AgNC具有2mg/mL的近似浓度，其中颗粒浓度为1.2x 1011颗粒/mL。
通用程序2–合成和纯化银纳米八面体(AgNO)
使用在“通用程序1”中合成的AgNC进行AgNO的合成。首先，通过在10mL的PD中反复涡旋和超声处理混合物直至固体完全溶解，分别制备了CuCl2(8mg/mL)和PVP(20mg/mL)的前体溶液。然后，将40μL的CuCl2溶液添加至AgNO3溶液(40mg/mL，在PD中)中，反复涡旋和超声处理直至完全溶解。
将含有在PD中的合成后原样的AgNC溶液的圆底烧瓶加热至190℃持续10min。在这之后，每30s滴加250μL的PVP溶液至混合物中，以及每分钟快速地添加500μL的AgNO3溶液(含有CuCl2)。继续这个过程持续大约一小时，并且反应混合物变成灰棕色。
为了纯化合成后原样的AgNO，将丙酮添加至AgNO溶液中并且在8000rpm下离心10min以去除过量PD，接着分散于10mL的乙醇中以去除过量丙酮。然后将所得悬浮液再分散于10mL乙醇(AR等级)中并然后用100mL的PVP水溶液(0.2g/L)稀释。然后使用具有孔径5000和650nm的PVDF过滤膜将混合物在每种孔径上真空过滤若干次。
将初始批次的AgNO通过紫外-可见光谱学和SEM成像表征以确定AgNO的吸光度(等离体子共振)和边长(图1c和d)。将边长在使用ImageJ软件的SEM图像中测量并且确定为270±6nm(图1f)。
对于随后的最佳批次的AgNO，将边长使用ImageJ软件对于100个颗粒进行测量并分析，并且确定为299±22nm。合成后原样的AgNO具有13.7mg/mL的近似浓度，其中颗粒浓度为1.2x1011颗粒/mL。
通用程序3–制备带负电荷的AgNC(85)和AgNO(90)
典型地，将1mL的乙醇添加至AgNC溶液(0.1mL，1.2x 1011颗粒/mL)中，接着离心，丢弃上清液。然后将AgNC再分散于1.5mL的IPA/乙醇(1:1，v/v)中并且使其在500rpm下在25℃下搅拌。然后将11-巯基十一烷酸(11-MUA，0.05mL，0.1mM)在IPA中的溶液滴加至AgNC的搅拌溶液中并且使反应混合物在室温下搅拌4hr。然后将反应混合物通过搅拌去除并且在6500rpm下离心4.5min以去除上清液。将该过程再重复一次，并且将AgNC用11-MUA在IPA中的新鲜溶液温育另外3hr。此后，将所得溶液离心，去除上清液。然后将AgNC分散于1.5mL的IPA/乙醇(1:1，v/v)中，超声处理并且离心。将该过程重复两次并且将所得带负电荷的AgNC(80)在氮气环境中储存以防止氧化。还进行ζ电位测量以确保AgNC是带负电荷的。
对于四种单独的AgNO溶液(0.1mL，1.2x 1011颗粒/mL)，使用11-MUA(0.1mL，10mM)在IPA中的溶液重复以上合成过程以得到带负电荷的AgNO(90)。AgNO的ζ电位被确定为约-27mV。
对于用11-MUA官能化的初始批次的AgNC和AgNO，测量ζ电位，其中将样品分别分散于水和乙醇中(表1)。此外，AgNC和AgNO在水和乙醇中的SEM图像如图2a-d中所示。
表1.分别在水和乙醇中的初始批次的AgNC和AgNO的ζ电位测量
Figure GDA0002655633560000321
通用程序4–用4-巯苯基硼酸(4-MPBA)官能化AgNC
用4-MPBA官能化AgNC与如描述于“通用程序3”中的程序相同，除了11-MUA(0.05mL，0.1mM)在IPA中的溶液用4-MPBA(0.05mL，0.1mM)在IPA中的溶液替换。
典型地，将1mL的乙醇添加至AgNC溶液(0.1mL，1.2x 1011颗粒/mL)中，接着离心，丢弃上清液。然后将AgNC再分散于1.5mL的IPA/乙醇(1:1，v/v)中并且使其在500rpm下在25℃下搅拌。将4-MPBA(0.05mL，0.1mM)在IPA中的溶液滴加至AgNC的搅拌溶液中并且使反应混合物在室温下搅拌4hr。然后将反应混合物通过搅拌去除并且在6500rpm下离心4.5min以去除上清液。将该过程再重复一次，并且将AgNC用4-MPBA在IPA中的新鲜溶液温育另外3hr。此后，将所得溶液离心，去除上清液。然后将AgNC分散于1.5mL的IPA/乙醇(1:1，v/v)中，超声处理并且离心。将该过程重复两次并且将所得官能化的AgNC在氮气环境中储存以防止氧化。在随后的实施例中，将合成后原样的有机硼酸官能化的AgNC表示为“AgNC/4-MBPA”。
AgNC上的有机硼酸官能允许将尿代谢物(例如THC和孕甾烷)捕获至AgNC的表面上。这通过使THC和孕甾烷上的羟基与有机硼酸在碱性条件下进行缩合反应以形成于溶液中的硼酸酯来完成(图14a，c和d)。
如在以下计算中示出的估算4-MPBA在AgNC表面上的密度。
AgNC的边长＝128.9nm
AgNC的表面积＝6x(128.9nm)2＝99,810.4nm2
4-MPBA分子的估算的表面积(衍生自模拟)＝0.34nm2
4-MPBA分子在AgNC表面上的数目(假定完全覆盖)＝99810.4/0.34＝293,560个分子
通用程序5–硅衬底的表面官能化
典型地，将硅(Si)衬底10用H2SO4/H2O2的混合物清洁20或经受氧等离子体处理30持续5min(图3a)。然后将经处理的衬底40浸没在具有3-氨基丙基三乙氧基硅烷(按体积计2％)的无水甲苯溶液50中持续5min以使Si衬底官能化。随后，将胺封端的Si衬底60用无水甲苯和甲醇冲洗，接着用N2气吹干以去除任何配体和溶剂。然后将官能化的衬底浸没在pH5的盐酸溶液(70)中持续另外5min以进一步使衬底表面质子化并且致使其带正电荷。然后使所得衬底80保持在氮气环境中用于进一步使用。各种经处理的衬底40、60和80的静态接触角被确定并且如图3b中所示。
通用程序6–合成银纳米球(AgNS)
根据在Chem.Mater.2014,26,2836-2846中描述的方法进行AgNS的合成。典型地，制备含有5mM的柠檬酸钠和0.1mM的鞣酸的100mL水溶液，并且在剧烈搅拌下在三颈圆底烧瓶中加热15min。然后将1mL的AgNO3(25mM)添加到该沸腾溶液中。溶液立即变成亮黄色。将所得AgNS通过离心(10,000g至18,000g，取决于其尺寸)进行纯化以便去除过量TA，并且在样品表征之前再分散于Milli-Q-水或柠檬酸钠溶液(2.2mM)中。AgNS的ζ电位被确定为-30mV并且AgNS的尺寸是大约41nm(图19a和b)。
实施例1.制造和表征超疏水性衬底
初始批次的超疏水性衬底107
制造初始批次的超疏水性衬底107
通过将带正电荷的Si衬底80(来自“通用程序5”的制备后原样的)浸没到2mL的带负电荷的水性Ag纳米颗粒混合物中持续100min进行静电自组装，该水性Ag纳米颗粒混合物由AgNO(85)和AgNC(90)以5:1的颗粒比构成(图4a)。经由静电吸引发生自组装，其中Ag纳米颗粒上的11-MUA层95的COO-官能结合至衬底80的NH3 +末端。这个自组装方法产生Ag纳米颗粒的单层。将二元自组装的衬底从水性Ag纳米颗粒混合物中去除，用乙醇冲洗并且使用N2气体吹干两次。
然后经由热蒸发分别以0.1和
Figure GDA0002655633560000351
将所得衬底涂覆2nm的Cr、接着是25nm的Ag的金属层(100)。这有助于改进二元Ag纳米颗粒至衬底80上的粘附。然后将衬底浸没于1H,1H,2H,2H-全氟癸烷硫醇(PFDT)105(5mM，在1:1乙醇/己烷中，v/v)的溶液中过夜以得到超疏水性衬底107。
为了产生在随后SERS测量中的干净的光谱背景，将衬底浸入5mM的PFDT溶液中15hr，用乙醇洗涤并且吹干至少六次以去除过量PFDT溶液。在每个浸入循环之后，将溶液用新鲜PFDT溶液替换。观察到，衬底的SERS背景噪声随着45hr的较长的浸没时间而减少(图6)。
用PFDT官能化衬底对其疏水性的影响
测量衬底103和107的静态接触角以确定用PFDT涂覆衬底对其疏水性的影响。在用Ag纳米颗粒温育20min和40min之后，确定两种衬底的静态接触角，并且示于表2中。
表2.用PFDT官能化的衬底和没有官能化的衬底的静态接触角
Figure GDA0002655633560000361
衬底80在Ag纳米颗粒混合物(85+90)中的温育时间对衬底107的疏水性的影响
为了研究衬底80在Ag纳米颗粒悬浮液中的温育时间对衬底的疏水性的影响，用20至120min的不同温育时间重复上述程序以得到各自衬底107。
确定不同温育时间的用Ag纳米颗粒处理的各种衬底107的SEM图像和静态接触角，并且如图5中所示。观察到，用Ag纳米颗粒温育衬底80持续100min得到最高的接触角为163°±1.5°。
还确定了颗粒密度和接触角滞后，并且如表3中所示。观察到，较长的温育时间得出较高的颗粒密度和较低的接触角滞后。
表3.用Ag纳米颗粒温育不同时间的衬底的颗粒密度和接触角滞后
Figure GDA0002655633560000362
与具有单独的AgNC或AgNO相比，具有AgNC和AgNO的二元组合对衬底107的疏水性的影响
为了理解具有AgNC和AgNO的二元组合对衬底的疏水性的影响，根据以上程序合成含有仅AgNC或AgNO的衬底，其中温育时间为100min。
确定衬底的静态接触角和均方根(RMS)表面粗糙度，并且如表4中所示。各自衬底的AFM图像如图7a-c中所示，并且AgNC和AgNO衬底的SEM图像和静态接触角分别示出于图7d和e以及图7f和g中。
表4.与具有单独AgNC或AgNO的衬底相比，具有AgNC和AgNO两者的衬底的静态接触角和RMS表面粗糙度。
样品 静态接触角 RMS表面粗糙度
AgNC和AgNO 163°±1.5° 90nm±6nm
仅AgNC 113°±1.3° 47nm±8nm
仅AgNO 143°±1.4° 103nm±10nm
与亲水性衬底相比，衬底107的液体浓缩效应
根据以上在“衬底的液体浓缩效应”中描述的程序确定衬底107的液体浓缩效应。
将在衬底107和亲水性衬底上的二氧化硅悬浮液的液滴进行比较，观察到，在衬底107上存在液体-固体接触面积的51倍减小(图8a和b)。在干燥衬底107上的液滴后，干燥的接触面积被测量为0.08mm2，其相比干燥之前的接触面积进一步有3.4倍的减小(图8b和d)。另一方面，对于干燥后的亲水性衬底，仅存在1.2倍的接触面积的减小。因此，超疏水性衬底的整体浓缩效应被确定为大约148倍。
因此，在超疏水性衬底107上的分析物样品的接触面积的显著减小可导致将分析物浓缩为对于灵敏检测所要求的较小的面积。
最佳和改进批次的超疏水性衬底109
制造最佳批次的超疏水性衬底109
通过将带正电荷的Si衬底80(来自“通用程序5”的制备后原样的)浸没到2mL的带负电荷的水性Ag纳米颗粒混合物中持续20min进行静电自组装，该水性Ag纳米颗粒混合物包含4:1颗粒比的AgNO(85)和AgNC(90)(图4b)。经由静电吸引发生自组装，其中Ag纳米颗粒上的11-MUA层95的COO-官能结合至衬底80的NH3 +末端。这个自组装方法产生Ag纳米颗粒的单层。将二元自组装的衬底从水性Ag纳米颗粒混合物中去除，用乙醇冲洗并且使用N2气体吹干两次。
然后将衬底浸没于乙醇/己烷(1:1，v/v)中的1H,1H,2H,2H-全氟癸烷硫醇105溶液(PFDT，5mM)中持续72hr。这个步骤允许通过从表面置换11-MUA将PFDT结合至Ag纳米颗粒85和90的暴露表面。这有助于得到对于SERS检测干净的光谱背景。
然后经由热蒸发以
Figure GDA0002655633560000381
将所得衬底涂覆25nm Ag的层(103)以促进二元Ag纳米颗粒至Si的粘附。然后将衬底浸没于乙醇/己烷(1:1，v/v)中的PFDT 105(5mM)中持续至少15hr以实现超疏水性。为了产生在随后SERS测量中的干净的光谱背景，将衬底浸入在乙醇/己烷(1:1，v/v)中的10mM的PFDT中持续一周，其中在每24hr后用新鲜PFDT溶液替换该溶液。
不同的AgNC与AgNO的颗粒比对衬底109的疏水性的影响
为了理解AgNC与AgNO的颗粒比对衬底的疏水性的影响，分别用2:1、1:1、1:2和1:4的AgNC:AgNO的颗粒比重复在“制造最佳批次的超疏水性衬底”中描述的程序。观察到，1:4的AgNC:AgNO比率得出了最高的接触角158°±8°与最高的颗粒密度(图9a和b)
衬底80在Ag纳米颗粒混合物(85+90)中的温育时间对衬底109的疏水性的影响
为了研究衬底80在Ag纳米颗粒悬浮液中的温育时间对衬底的疏水性的影响，用20至100min的不同温育时间重复上述程序以得到各自衬底109。
确定用Ag纳米颗粒处理不同温育时间的各种衬底109的静态接触角和颗粒密度，并且分别如图10a和b中所示。选择20min的浸入时间作为最佳时间，因为这是得到具有一致高的静态接触角的衬底的最短温育时间。在4:1的颗粒比下，颗粒密度被确定为4.4±0.2颗粒/μm2(从SEM图像中计数颗粒的数目估算)。在该颗粒比下，均方根表面粗糙度也是最高的，为116.4±6.2nm。
与具有单独的AgNC或AgNO相比，具有AgNC和AgNO的二元组合对衬底109的疏水性的影响
为了理解具有AgNC和AgNO的二元组合对衬底的疏水性的影响，根据以上程序合成含有仅AgNC或AgNO的衬底，其中温育时间为20min。确定各自衬底109的静态接触角和AFM图像，并且如图11a和b中所示。观察到，二元组合得出最高的静态接触角，为158°±8°。
与亲水性衬底相比，衬底109的液体浓缩效应
根据以上在“衬底的液体浓缩效应”中描述的程序确定衬底109的液体浓缩效应。将二氧化硅悬浮液的液滴在衬底109与亲水性衬底上的干燥的接触面积进行比较，衬底109上的干燥的接触面积是0.13mm2，其显著低于亲水性衬底上的24mm2的面积(图8g和h)。计算的浓缩因子被确定为大约180。
因此，在超疏水性衬底109上的分析物样品的接触面积的显著减小可导致将分析物浓缩为对于灵敏检测所要求的较小的面积。
含有AgNS和AgNO的二元组合的超疏水性衬底
根据以上对于超疏水性衬底109描述的方法合成AgNS/AgNO超疏水性衬底，除了用AgNS替换AgNC外。
首先通过将带正电荷的Si衬底浸没于2mL的带负电荷的水性Ag纳米颗粒混合物中持续40min进行静电自组装，该水性Ag纳米颗粒混合物包含2:1颗粒比的AgNO和AgNS(每个颗粒部分含有1.2x 1011颗粒/mL)。将二元自组装的衬底从水性Ag纳米颗粒混合物中去除，用乙醇冲洗并且使用N2气体吹干两次。然后将衬底浸入到PFDT溶液(5mM)的溶液中持续72hr以替换Ag纳米颗粒的表面上的11-MUA配体和柠檬酸钠。
然后经由热蒸发以
Figure GDA0002655633560000401
将所得衬底涂覆25nm Ag的层以促进二元Ag纳米颗粒至Si的粘附。然后将衬底浸没于乙醇/己烷(1:1，v/v)中的PFDT(5mM)中持续至少15hr以实现超疏水性。
通过SEM表征合成后原样的衬底，其中确定静态接触角和颗粒密度(图19c和d)。使用去离子水的液滴(4μL)确定静态接触角，并且获得150.2°±1.0°的值。
实施例2.使用初始超疏水性衬底107的孕甾烷、对氨基苯胂酸和罗沙胂的SERS检测
为了验证衬底107的性能，使用这些衬底进行尿代谢物和毒素的直接SERS检测。
选择5β-孕甾烷-3α,20α-二醇葡糖苷酸(孕甾烷)(其被认为是确定自然流产中的重要的尿代谢物)作为该实验的尿代谢物。首先制备孕甾烷(1x 10-6M)的水溶液，接着是用去离子水的一系列10倍连续稀释以得到各种浓度(1x 10-7M至1x 10-9M)的稀释溶液。然后将孕甾烷溶液的1μL液滴滴铸到衬底107上用于通过SERS分析。在激光照射(波长，532nm；功率，0.06mW)和采集时间为10s下，在干燥液滴后获得SERS光谱。
各种浓度的孕甾烷在衬底107上的SERS光谱如图13a中所示。在614cm-1下的峰强度用于获得如图13b中所示的校正曲线。观察到，由于孕甾烷，可在低至1nM的浓度下检测到SERS信号。这代表了使用孕甾烷本身的SERS光谱的强度直接检测和量化超疏水性衬底107上的孕甾烷的方法。
类似地，延伸SERS检测以检测超痕量毒素像对氨基苯胂酸和罗沙胂。首先，通过将固体溶解于10mL去离子水中制备对氨基苯胂酸和罗沙胂的水溶液(1x 10-3M)。在这之后是用去离子水的一系列10倍连续稀释，以得出各种浓度(1x 10-4M至1x 10-9M)的稀释溶液。将溶液的1μL液滴滴铸到衬底107上用于通过SERS分析。在与以上描述的相同参数下，在干燥液滴后获得SERS光谱并且分别如图13c和d中所示。将对氨基苯胂酸和罗沙胂的SERS光谱进行分析并且相应地如表5中所示进行分配。
对于对氨基苯胂酸，在1131cm-1和783cm-1下的峰强度随着浓度减小而减小，并且这与罗沙胂相似，其中1355cm-1下的峰强度示出了随浓度减小的类似的趋势(表6)。
表5.对氨基苯胂酸和罗沙胂的SERS信号的分配
Figure GDA0002655633560000421
表6.对氨基苯胂酸和罗沙胂在各种浓度下的各自峰强度
Figure GDA0002655633560000422
实施例3.与单独的衬底109和超疏水性二氧化硅珠阵列的SERS分析增强因子相比，确定当与AgNC/4-MPBA一起使用时的最佳超疏水性衬底109的SERS分析增强因子(AEF)
SERS衬底的AEF是对于SERS检测的其性能的重要指示。因此，使用亚甲蓝作为分析物，确定和比较单独的超疏水性衬底109，和与AgNC/4-MPBA一起使用时的超疏水性衬底109，以及超疏水性二氧化硅珠阵列的AEF。
实验程序
对于使用具有AgNC/4-MPBA的超疏水性衬底109获得的SERS光谱，将含有亚甲蓝(1×10-7M至1×10-14M)和AgNC/4-MPBA(～1.2×107颗粒)的1μL液滴滴铸到衬底109上并且在记录SERS光谱之前使其干燥。虽然4-MPBA不能结合至亚甲蓝，但是由于在干燥过程期间在相邻AgNC颗粒之间的空间中的亚甲蓝分子的物理捕获，并且由于来自超疏水性衬底109的浓缩效应，亚甲蓝的SERS增强仍然可以发生。
类似地，对于使用单独的衬底109或二氧化硅珠阵列获得的SERS光谱，将亚甲蓝溶液(1×10-3M至1×10-11M)的1μL液滴滴铸到衬底(单独的衬底109或二氧化硅珠阵列)上并且在记录SERS光谱之前使其干燥。
对于正常拉曼信号测量，使用1μL亚甲蓝溶液(10-3M)的液滴在Si衬底10上取得亚甲蓝的拉曼光谱。1s和100s的采集时间分别地用于取得SERS和拉曼光谱。
通过首先将硅衬底80浸入二氧化硅珠的水性悬浮液(1wt％)中持续10min来制造超疏水性二氧化硅珠阵列。然后将这种衬底在氮气流下吹干，接着用PFDT(5mM)官能化过夜。
结果与讨论
根据以下公式确定量化在超疏水性SERS衬底上吸附的分析物分子的SERS增强的分析增强因子(AEF)。
AEF＝[ISERS/I拉曼]x[C拉曼/CSERS]，
其中：
ISERS是使用SERS衬底在最低浓度下记录的SERS信号的强度；
CSERS是使用SERS衬底测量的分析物的相应浓度；
I拉曼是在最低浓度下普通拉曼信号(没有SERS衬底)的强度；并且
C拉曼是用于普通拉曼检测(没有SERS衬底)的测量的分析物的相应浓度。
在对于超疏水性二氧化硅珠阵列、单独的超疏水性衬底109以及当与AgNC/4-MPBA一起使用时的超疏水性衬底109，各个衬底的检测限分别是10-6、10-11和10-14M的基础上，计算AEF。
虽然任何其他分析物可以用于确定SERS衬底的AEF，但是该实施例的AEF基于亚甲蓝的1628cm-1带(归因于C＝C拉伸)处的强度进行计算。
确定各种衬底的AEF并且如图12a-c中所示。观察到，对于单独的超疏水性衬底109的AEF实现了
2.4x 109的AEF，其远远优于超疏水性二氧化硅珠阵列的5.0x 102的AEF。
此外，使用AgNC/4-MPBA与衬底109进一步增强了SERS信号强度，实现了2.4x 1012的AEF(图12c)。这分别比超疏水性二氧化硅珠阵列和衬底109的AEF高大约1010倍和103倍。除了通过超疏水性衬底109提供的SERS增强外，使用AgNC提供了另外的等离子体表面(和“热点”)以进一步增强夹在衬底109与AgNC之间的分析物的SERS信号。因此，AgNC/4-MPBA提供了“镜象效应”以增强衬底的AEF，这给出了较高的SERS灵敏度用于检测。
实施例4.使用具有AgNC/4-MPBA的超疏水性衬底109来对孕甾烷和/或THC进行SERS量化
施加AgNC/4-MPBA与超疏水性衬底109的组合以检测和量化感兴趣的尿代谢物。目标尿代谢物是5β-孕甾烷-3α,20α-二醇葡糖苷酸125(孕甾烷)和四氢可的松120(THC)，其中这两种代谢物在孕妇的尿样品中的浓度已经被确定充当用于自然流产的可能性的预测指标(参见PCT公开号WO 2018/199849)。
尿是由许多代谢物组成的复杂生物基质，其可能潜在地干扰尿样品中孕甾烷和THC的SERS检测和量化。鉴于此，在使用超疏水性SERS衬底109用于测量和分析之前，关键的是分离溶液中的目标尿代谢物。THC 120和孕甾烷125两者都含有多重羟基官能团(-OH)，这些官能团在碱性条件下可以与有机硼酸130(4-MBPA)进行缩合反应，被接枝在AgNC表面135上以形成在溶液中的硼酸酯(图14a)。然后可以将具有捕获的代谢物的AgNC/4-MPBA分离并滴铸到超疏水性衬底109上用于较高的SERS灵敏度(通过利用具有AgNC和衬底109两者的“镜象效应”)。
实验程序
对于纯孕甾烷和THC首先进行单独的SERS实验。将10μL的孕甾烷或THC溶液(10-4-10-9M)与AgNC/4-MPBA(～0.2mg/mL)在pH 11的KOH水溶液中混合，超声处理，并然后允许反应持续3hr。在3hr后，将混合物在8000rpm下离心10min。去除上清液，并且将产物再分散于10μL pH 11溶液中。在滴铸在超疏水性衬底109上之前，将这个过程重复两次并然后允许在环境条件下干燥。使用532nm的激光激发波长、在0.2mW和1s采集时间下收集拉曼光谱。
在进行样品的分析之前，运行衬底109的背景扫描。这是为了确保不存在由11-MUA引起的干扰信号。仅当拉曼光谱的基线是平坦且无特征时，进行真实样品的分析。
对于多元测量，使用0.1mM储备溶液制备不同浓度比率的孕甾烷:THC，其中比率范围是90-100％。例如，为了制备用于测量的90％孕甾烷:THC溶液，将90μL的孕甾烷与10μL的THC混合，并且然后允许这种混合物与AgNC/4-MPBA在与更早描述的相同条件下反应。还遵循与以上描述的相同的实验参数进行SERS测量。
数据分析
主要组分分析(PCA)
为了改进检测方法的稳健性和可靠性，高光谱SERS测量用于产生超过2000个SERS光谱/测量。尽管建立基于大量数据集的检测方法是统计学上更可靠的，但是手动分析光谱将具有挑战性且不切实际。此外，与孕甾烷(125)和THC(120)结合时的4-MPBA(130)的光谱变化跨越浓度范围是不激烈的并且受限于特定光谱范围(图15a和b)。
因此，主要组分分析(PCA)用于分析提取的SERS光谱，区分和分类特定至跨越整个测量光谱范围的4-MPBA、4-MPBA-孕甾烷和4-MPBA-THC的光谱特征。PCA是分析大数据集的标准统计学程序，并且可商购的软件(Panorama)用于进行PCA。
典型地，分别地将AgNC/4-MPBA(pH 11下)、用THC温育的AgNC/4-MPBA以及用孕甾烷温育的AgNC/4-MPBA的25个未处理的光谱输入到软件中(总共75个光谱)。应用标准正态变量校正和Savitzky-Golay导数算法来减少光谱噪声并消除背景信号的干扰。在PCA分析期间，选择实验上测量的整个光谱范围，并且应用两种PC，这使光谱识别的精确度能够为至少98％。
偏最小二乘(PLS)回归
此外，偏最小二乘回归(PLS)用于测试不同浓度的孕甾烷和THC的SERS测量的预测能力。这通过建立单独的尿代谢物的标准校正曲线来完成。对于纯分析物，对于每个测量的浓度输入25个光谱，导致对于每种分析物使用150个光谱以获得在10-4-10-9M之间的校正曲线。
应用标准正态变量校正和Savitzky-Golay导数算法来减少光谱噪声并消除干扰。在分析期间，选择实验上测量的整个光谱范围，并采用了合适数目的加载向量来提供最小的交叉验证均方根误差(RMSECV)。三个加载向量用于涉及孕甾烷的光谱并且两个用于THC。基于两种考虑选择最小数目的加载向量：(1)使过度拟合的可能性减到最小(即合并机会相关性和噪声组分)；和(2)实现与最小的RMSECV的偏差<5％。
结果与讨论
在分别用THC和孕甾烷温育后，观察到4-MPBA的SERS光谱的显著光谱变化(图14b)。值得注意地，AgNC/4-MPBA示出了在1182cm-1和1328cm-1下的特征4-MPBA振动模式，其分别对应于芳香族C-H弯曲和有机硼酸的拉伸模式(δBO+νCB)。在与THC和孕甾烷相互作用时，SERS光谱示出了主要在两个光谱范围(即范围(i)和(ii))中的急剧变化。
对于范围(i)，4-MPBA 130的芳香族C-H弯曲峰对于THC 120和孕甾烷125两者变宽(图14c)，而在范围(ii)中，分别对于THC 120和孕甾烷125，δBO+νCB的强度大幅减小并且从1328cm-1至～1332cm-1以及至～1333cm-1蓝移(图14d)。降低的SERS强度可能是由于通过尿代谢物120和125，结合至4-MPBA 130上时，对B-O和C-B键的限制。光谱变化的实验观察结果也得到了理论模拟光谱的证实(图14c和d)。这些变化清楚地确认了通过AgNC/4-MPBA成功捕获呈其纯形式的尿代谢物，并且孕甾烷125与THC 120至4-MPBA 130上的结合之间的光谱变化的差异允许这种检测方法选择性地区分这两种代谢物。因此，通过检测在结合至THC和/或孕甾烷时的4-MPBA的光谱变化，使用与AgNC/4-MPBA协同的超疏水性衬底109允许对目标代谢物进行间接SERS检测和量化。在这种情况下，4-MPBA有效地充当捕获剂和拉曼信使两者，以反映在结合至分析物上时化学键的变化。
图15c示出了单独-测量的4-MPBA、4-MPBA-孕甾烷和4-MPBA-THC的PCA-加工的SERS数据的代表性2D图。通过使用两种主要组分(PC)以分解各种SERS光谱，SERS光谱可以被分类为三种不同的簇，分别由单独的4-MPBA、具有孕甾烷的4-MPBA和具有THC的4-MPBA产生。这两种PC解决了所有三个光谱数据集之中的净差异的98.1％。对于孕甾烷的量化，图15d示出了4-MPBA-孕甾烷的PLS回归，其中预测精确度超过99％并且检测限为1nM。类似地，图15e示出了4-MPBA-THC的PLS回归，其中预测精确度超过99％并且检测限为1nM。
此外，还建立了用于孕甾烷和THC两者的同时多元分析的PLS预测模型。两种尿代谢物的多元分析具有实际重要性，因为两种代谢物存在于真实患者的样品中，并且两种代谢物的丰度的比率是确定自然流产风险的重要因子。
为了产生PLS预测模型，从具有各种比率的孕甾烷:THC的混合物中收集SERS信号。特定比率的孕甾烷和THC允许与AgNC/4-MPBA反应，接着如在以上实验程序中讨论的随后进行纯化。比率范围是90％至100％的孕甾烷，这对应于真实患者的样品中孕甾烷的生理学相关水平。图15f示出了使用九个加载向量建立的用于多元测量的PLS模型。该多元模型的预测精确度是大约98.5％，突出了其预测来自SERS测量的孕甾烷和THC两者的相对丰度的能力。
实施例5.使用具有AgNC/4-MPBA的超疏水性衬底109对人造尿样品中的孕甾烷和/或THC进行SERS量化
如在实施例4中讨论的实验方案和结果涉及在不存在复杂样品基质(其存在于真实尿样品中)的情况下检测代谢物。因此，为了研究更现实的样品基质中的本发明的适用性，将检测方法延伸至人造尿中的检测。
实验程序
人造尿的制备和掺加
人造尿允许在受控条件下模拟实际尿，其中可以相应地调节各种组分的相对丰度。首先，通过混合24.2g尿素、10.0g氯化钠、6.0g磷酸二氢钾、6.4g磷酸钠在100mL的去离子水中制备人造尿。
然后将特定比率的孕甾烷和THC添加至这种人造尿样品中以获得标准校正曲线，并且模拟与稳定的妊娠和流产相关的样品。用于该实施例的孕甾烷和THC的储备溶液的浓度是1nM。为了使人造尿掺有不同比率的孕甾烷和THC用于多元测量，将10μL的孕甾烷和/或THC溶液添加到90μL的人造尿中，其中孕甾烷的比率范围是90-100％。例如，为了使人造尿掺有90％孕甾烷，将9μL的孕甾烷和1μL的THC添加至90μL的人造尿中。
基于先前研究，稳定的妊娠对应于76:1的孕甾烷:THC比率(98.7％的孕甾烷)，然而自然流产对应于38:1的比率(97.4％的孕甾烷)。因此，该实施例中使用的孕甾烷:THC的浓度范围覆盖孕甾烷和THC的生理浓度。
ZIPTIP预处理人造尿样品
ZIPTIP是可商购的填充有C-18树脂的迷你柱，其常规地用于脱盐、浓缩和纯化生物样品。在样品预处理之前，将ZIPTIP柱通过用20μL的甲醇和20μL的去离子水洗脱进行活化。
然后将10μL的掺加的人造尿样品通过ZIPTIP柱210洗脱并然后用10μL的水(220)洗涤以去除盐225(图16a)。然后将10μL的甲醇(230)用于从柱中洗脱分析物235。然后蒸发甲醇溶剂，并且将过滤的样品溶解于10μL的pH 11的KOH水溶液(236)中以形成样品238。
用AgNC/4-MPBA处理样品用于SERS检测
然后将样品分析物238与AgNC/4-MPBA(0.2mg/mL，10μL)混合，超声处理，并允许反应持续3hr(图16b)。在3hr后，将混合物在8000rpm下离心10min。去除上清液，并且将产物再分散于10μL的pH 11的KOH水溶液中。在滴铸在超疏水性衬底109上用于SERS检测之前，将该过程重复两次。通过将样品滴铸到衬底109的不同位置上以获得平均读数来制备最少三种单独的样品。将SERS光谱收集并且用于化学统计分析240。
数据分析
对SERS光谱进行主要组分分析(PCA)和偏最小二乘(PLS)分析，其中使用与实施例4中描述的相同的方案分析来自每种模拟条件的25个光谱。
PLS分析用于建立人造尿中的分析物的多元检测的标准校正曲线，其中PLS模型确立了掺加的人造尿中的90-100％的孕甾烷。
结果与讨论
图17a示出了衍生自掺有各种浓度的孕甾烷的人造尿样品的PLS预测模型。对于测试范围的孕甾烷浓度观察到良好的线性相关性，具有＞97％的高精确度，指示实验方案和数据分析方法可以应用于人造尿样品，没有损失精确度。
还进行模拟的稳定妊娠和模拟的自然流产样品的PCA分析(使用两种PC以分解各种SERS光谱)。SERS光谱被分类为两种不同的簇，分别地对应于稳定妊娠和自然流产(图17b)，其中预测结果分别为98.9±0.3％和97.2±0.8％。两种PC解决了两个光谱数据集之中的净方差的89.8％。各种比率的孕甾烷:THC(90-100％)的SERS光谱如图17c中所示。对应于稳定妊娠(98.7％的孕甾烷)和流产(97.4％的孕甾烷)的SERS光谱如图17d中所示。
PLS回归还精确地预测了孕甾烷在两种模拟的尿样品中的相对量(图17e)。对于具有76:1的孕甾烷:THC比率的模拟的稳定妊娠样品，理论孕甾烷百分比是98.9％并且当前模型的PLS预测精确度对应于98.9±0.3％，具有非常窄的误差窗口。对于具有38:1的孕甾烷:THC比率的模拟的自然流产样品，理论孕甾烷百分比是97.3％并且PLS预测精确度对应于97.2±0.8％，具有非常窄的误差窗口。因此，显然实验和分析方法可以成功地应用于人造尿样品，没有任何精确度的损失。
实施例6.使用具有AgNC/4-MPBA的超疏水性衬底109对实际尿样品中的孕甾烷和/或THC进行SERS量化
为了进一步证明当前实验方案和分析方法在自然流产的诊断中的适用性，实际尿样品用于该实施例中。
首先使用从非孕妇收集的尿样品建立标准校正曲线，其中血清孕酮水平是1.01nmol/L。这些尿样品掺有特定比率的孕甾烷和THC，并且接着进行标准ZIPTIP处理，与AgNC/4-MPBA反应，通过离心纯化，SERS测量和分析(如实施例4和5中所描述的)。孕甾烷和THC的储备溶液的浓度是0.1nM。因为校正曲线高度取决于该特定分析物的SERS-响应，所以制备每种使用的分析物的新校正曲线。也优选制备每种衬底的新校正曲线用于量化的更好精确度。
对于表示稳定妊娠和自然流产的尿样品，基于患者的血清孕酮水平选择六种尿样品，其中通过LC/MS确定她们尿样品中孕甾烷:THC丰度比率(表7)。稳定妊娠的患者的血清孕酮水平分别是74.88、106.45和64.42nmol/L，其中她们尿样品中的相应孕甾烷:THC丰度比率被分别确定为98.7、99.3和99.1％。自然流产样品的患者的血清孕酮水平分别是7.72、8.9和15.42nmol/L，其中她们尿样品中的相应孕甾烷:THC丰度比率被分别确定为94.1、93.1和93.6％。对这些尿样品进行标准ZIPTIP处理，与AgNC/4-MPBA反应，通过离心纯化，测量和分析(如实施例5中所描述的)。
图18a示出了衍生自掺有各种浓度的孕甾烷的实际未孕尿样品的PLS预测模型。对于测试的孕甾烷浓度范围观察到良好的线性相关性，具有＞99％的高精确度，指示当前的实验方案和数据分析方法可以应用于实际尿样品，没有损失精确度。掺有不同孕甾烷浓度的非孕妇尿的SERS光谱，以及来自孕妇的真实尿样品的SERS光谱分别地如图18b和c中所示。还将PCA簇集应用于两种真实尿样品，一种自然流产(M1)并且另一种成功生产(S1)，每种使用25个未处理的光谱(图18d)。
此外，PLS回归还精确地预测了孕甾烷在实际尿样品中的相对量。对于具有98.7、99.3和99.3％的孕甾烷:THC比率的对应于稳定妊娠的尿样品，使用当前模型的PLS预测给出各自浓度为101.3±0.2、99.2±0.2、98.6±0.7％，具有非常窄的误差窗口(表7)。对于具有94.1、93.1和93.6％的孕甾烷:THC比率的对应于自然流产的样品，当前模型给出各自浓度为96.9±0.8、94.8±0.5和94.7±0.6％，也具有非常窄的误差窗口(表7)。
由于SERS测量与从LC/MS测量获得的已知读数相关性非常好，因此显然，本发明可以实现来自尿的尿代谢物的即时无创检测，其可以充当自然流产的无创性诊断。此外，这种能力最明显地体现在具有不同水平的尿胆素的实际尿样品中(如定性地观察到尿颜色的差异)。即使在不同量的尿胆素存在下，对流产风险的PLS预测的精确度的影响也很小。
表7.对于成功生产的患者(S1-S3)以及对于遭受自然流产的患者(M1-M3)，比较如从PLS预测模型确定的孕甾烷百分比与通过LC/MS确定的孕甾烷百分比
Figure GDA0002655633560000531
Figure GDA0002655633560000541

Claims (27)

1.一种适合于在表面增强拉曼散射中使用的复合超疏水性材料，所述材料包含：
衬底层，所述衬底层包含一组带正电荷的或带负电荷的官能团；
在所述衬底层的顶部上的金属纳米颗粒涂层，所述金属纳米颗粒涂层包含一组带负电荷的或带正电荷的官能团；
在所述金属纳米颗粒涂层的顶部上的金属层；以及
在所述金属层的顶部上的第一超疏水性层，其中：
所述金属纳米颗粒涂层包含第一组和第二组金属纳米颗粒，其中所述第一组金属纳米颗粒具有比所述第二组的直径小0.1至90％的直径；
所述第一组金属纳米颗粒的金属是金和/或银；
所述第二组金属纳米颗粒的金属是金和/或银；并且
所述衬底层和金属纳米颗粒涂层上的带电荷的官能团彼此电子地互补，其中
所述第一组金属纳米颗粒是纳米立方体，并且所述第二组金属纳米颗粒是纳米八面体，
其中每种超疏水性材料是具有显示大于150°的与水的静态接触角的一个或多个表面的材料。
2.根据权利要求1所述的复合超疏水性材料，其中：
所述衬底层的表面上的金属纳米颗粒涂层的密度是2至20颗粒/μm2；和/或
所述复合材料进一步包含夹在所述金属纳米颗粒涂层与所述金属层之间的第二超疏水性层。
3.根据权利要求1所述的复合超疏水性材料，其中：
所述第一组纳米颗粒具有的平均直径为10至250nm；和/或
所述第二组纳米颗粒具有的平均直径为250至1,000nm。
4.根据权利要求1所述的复合超疏水性材料，其中：
(ia)所述第一组金属纳米颗粒具有的直径比所述第二组的直径小0.2至60％；和/或
(iia)所述复合材料具有的均方根表面粗糙度为30至150nm；和/或
(iiia)所述复合材料上的所述第二组纳米颗粒中的颗粒的总数目比所述第一组纳米颗粒中的颗粒的总数目是1:10至10:1。
5.根据权利要求1所述的复合超疏水性材料，其中，所述衬底层上的所述带电荷的官能团的组是带正电荷的，并且所述金属纳米颗粒涂层上的所述带电荷的官能团是带负电荷的。
6.根据权利要求5所述的复合超疏水性材料，其中：
所述衬底层上的所述带正电荷的官能团的组是铵离子；和/或
所述第一组金属纳米颗粒和第二组金属纳米颗粒上的所述带负电荷的官能团的组是羧酸根离子或醇盐离子。
7.根据权利要求1所述的复合超疏水性材料，其中，所述衬底层上的所述带电荷的官能团的组是带负电荷的，并且所述金属纳米颗粒涂层上的所述带电荷的官能团是带正电荷的。
8.根据权利要求7所述的复合超疏水性材料，其中：
所述衬底层上的所述带负电荷的官能团的组是羧酸根离子或醇盐离子；和/或
所述第一组金属纳米颗粒和第二组金属纳米颗粒上的所述带正电荷的官能团的组是铵离子。
9.根据权利要求2所述的复合超疏水性材料，其中：
(ib)所述金属层是5至53nm厚；和/或
(iib)所述金属层包含银层、金层或者银和金层；和/或
(iiib)通过在所述金属纳米颗粒涂层中的纳米颗粒之间的间隙在所述金属层与所述衬底层之间存在直接附接；和/或
(ivb)所述第一超疏水性层包含未取代的或被一个或多个氟基团取代的C10至C20硫醇；和/或
(vb)所述第二超疏水性层包含未取代的或被一个或多个氟基团取代的C10至C20硫醇。
10.根据权利要求2所述的复合超疏水性材料，其中：
(aa)所述第一超疏水性层包含由1-十二烷硫醇、1-十六烷硫醇和1H,1H,2H,2H-全氟癸烷硫醇组成的组中的一种或多种；和/或
(bb)所述第二超疏水性层包含由1-十二烷硫醇、1-十六烷硫醇和1H,1H,2H,2H-全氟癸烷硫醇组成的组中的一种或多种。
11.根据权利要求1所述的复合超疏水性材料，其中，所述第一和第二组纳米颗粒是银纳米颗粒。
12.一种部件试剂盒，包含：
(ai)如权利要求1至11中任一项所述的复合超疏水性材料；以及
(bi)尿分析配制品，所述尿分析配制品包含涂覆有包含硫醇基团的有机硼酸的银和/或金纳米颗粒。
13.如权利要求1至11中任一项所述的复合超疏水性材料在用于制备预测自然流产风险增加的试剂盒的用途，所述用途包括：
(a)提供包含从受试者获得的尿样品的非盐组分的水溶液；
(b)使所述水溶液与包含涂覆有包含硫醇基团的有机硼酸的银和/或金纳米颗粒的尿分析配制品反应持续第一时间段以提供络合样品；
(c)将所述络合样品放置到如权利要求1至11中任一项所述的复合超疏水性材料上并且通过蒸发来去除水以提供干燥的样品；以及
(d)对所述干燥的样品进行拉曼光谱分析以确定孕甾烷和四氢可的松的丰度，并且然后基于下式预测自然流产的风险：
Figure FDA0003893212820000041
其中低于阈值的值指示自然流产风险增加。
14.根据权利要求13所述的用途，其中，所述用途的步骤(a)中提供的水溶液是通过以下步骤获得的：
(i)将从受试者获得的包含盐和非盐组分的尿样品添加到反相柱中以提供加载柱；
(ii)通过用水洗脱从所述加载柱中去除所述盐组分，然后通过用C1-4醇洗脱从所述加载柱中去除并分离所述非盐组分并然后去除所述C1-4醇；以及
(iii)将水溶液添加至所述分离的非盐组分中以提供所述步骤(a)的水溶液。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的用途，其中，所述拉曼光谱学使用532nm的激光激发波长、使用0.01至1mW的激光功率以及1至60秒的采集时间进行。
16.一种制造适合于在表面增强拉曼散射中使用的复合超疏水性材料的方法，所述方法包括：
(ia)提供金属涂覆的复合材料，所述金属涂覆的复合材料包含：
衬底层，所述衬底层包含一组带正电荷的或带负电荷的官能团；
在所述衬底层的顶部上的金属纳米颗粒涂层，所述金属纳米颗粒涂层包含一组带负电荷的或带正电荷的官能团，其中所述金属纳米颗粒涂层包含第一组和第二组金属纳米颗粒，其中所述第一组金属纳米颗粒具有比所述第二组的直径小0.1至90％的直径；以及
在所述金属纳米颗粒涂层的顶部上的金属层；以及
(ib)将所述金属涂覆的复合材料浸入包含超疏水性材料的溶液中以在所述金属层的顶部上形成超疏水性层，从而形成所述复合超疏水性材料，其中：
所述第一组金属纳米颗粒的金属是金和/或银；
所述第二组金属纳米颗粒的金属是金和/或银；并且
所述衬底层和金属纳米颗粒涂层上的带电荷的官能团彼此电子地互补，其中
所述第一组金属纳米颗粒是纳米立方体，并且所述第二组金属纳米颗粒是纳米八面体，
其中每种超疏水性材料是具有显示大于150°的与水的静态接触角的一个或多个表面的材料。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述金属涂覆的复合材料通过以下方式形成：
(A)提供金属纳米颗粒涂覆的衬底，所述金属纳米颗粒涂覆的衬底包含衬底层以及在所述衬底层的顶部上的金属纳米颗粒涂层，所述衬底层包含一组带正电荷的或带负电荷的官能团，所述金属纳米颗粒涂层包含一组带负电荷的或带正电荷的官能团，其中所述金属纳米颗粒涂层包含第一组和第二组金属纳米颗粒；以及
(B)将金属层沉积在所述金属纳米颗粒涂覆的衬底的顶部上。
18.根据权利要求17所述的方法，其中：
(id)所述金属涂覆的复合材料包含夹在所述金属纳米颗粒涂层与所述金属层之间的另外的超疏水性层；和/或
(iid)所述金属层是5至53nm厚；和/或
(iiid)所述金属层包含银层、金层或者银和金层。
19.根据权利要求16所述的方法，其中，所述金属纳米颗粒涂覆的衬底通过使包含一组带正电荷的或带负电荷的官能团的衬底与包括包含一组带负电荷的或带正电荷的官能团的金属纳米颗粒的溶液接触来形成，其中所述金属纳米颗粒包含第一组金属纳米颗粒和第二组金属纳米颗粒。
20.根据权利要求17所述的方法，其中：
(ie)所述第一组纳米颗粒具有的平均直径为10至250nm；和/或
(iie)所述第二组纳米颗粒具有的平均直径为250至1,000nm；和/或
(iiie)所述第一组金属纳米颗粒具有的直径比所述第二组的直径小0.2至60％；和/或
(ive)所述复合材料具有的均方根表面粗糙度为30至150nm；和/或
(ve)所述复合材料上的所述第二组纳米颗粒中的颗粒的总数目比所述第一组纳米颗粒中的颗粒的总数目是1:10至10:1。
21.根据权利要求16所述的方法，其中，所述衬底层上的所述带电荷的官能团的组是带正电荷的，并且所述金属纳米颗粒涂层上的所述带电荷的官能团是带负电荷的。
22.根据权利要求21所述的方法，其中：
所述衬底层上的所述带正电荷的官能团的组是铵离子；和/或
所述第一组金属纳米颗粒和第二组金属纳米颗粒上的所述带负电荷的官能团的组是羧酸根离子或醇盐离子。
23.根据权利要求16所述的方法，其中，所述衬底层上的所述带电荷的官能团的组是带负电荷的，并且所述金属纳米颗粒涂层上的所述带电荷的官能团是带正电荷的。
24.根据权利要求23所述的方法，其中：
所述衬底层上的所述带负电荷的官能团的组是羧酸根离子或醇盐离子；和/或
所述第一组金属纳米颗粒和第二组金属纳米颗粒上的所述带正电荷的官能团的组是铵离子。
25.根据权利要求18所述的方法，其中：
在权利要求16的步骤(ib)中使用的所述超疏水性材料是未取代的或被一个或多个氟基团取代的C10至C20硫醇；和/或
用于形成所述另外的超疏水性层的在权利要求18的步骤(id)中使用的超疏水性材料是未取代的或被一个或多个氟基团取代的C10至C20硫醇。
26.根据权利要求25所述的方法，其中：
在权利要求16的步骤(ib)中使用的所述超疏水性材料选自由1-十二烷硫醇、1-十六烷硫醇和1H,1H,2H,2H-全氟癸烷硫醇组成的组中的一种或多种；和/或
用于形成所述另外的超疏水性层的在权利要求18的步骤(id)中使用的超疏水性材料选自由1-十二烷硫醇、1-十六烷硫醇和1H,1H,2H,2H-全氟癸烷硫醇组成的组中的一种或多种。
27.根据权利要求16所述的方法，其中，所述第一和第二组纳米颗粒是银纳米颗粒。
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