CN111763709A - 一种酶底物法大肠菌群检测试剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酶底物法大肠菌群检测试剂及制备方法，酶底物法大肠菌群检测试剂由营养剂、指示剂、细菌生长缓冲剂、无机盐缓冲剂、PH调节剂、选择性抑制剂组成，利用大肠菌群能产生β‑半乳糖苷酶（β‑D‑galactosidase）分解无色底物邻硝基苯‑β‑D‑吡喃半乳糖苷ONPG（Orthonitrophenyl‑β‑D‑galactopyranoside）使培养液呈黄色，根据最大可能数法（MPN法）来计算水中总大肠菌群、粪大肠菌群及大肠埃希氏菌的浓度。本发明以水质大肠菌群检测为目的，以酶底物法原理为核心，通过在酶底物法基础反应物质中添加营养剂、细菌生长缓冲剂、PH调节剂、选择性抑制剂等催化酶底物法反应的物质，使酶底物法检测大肠菌群试剂检测结果灵敏有效，检测效率提高，反应结果显示准确清晰。

Description

一种酶底物法大肠菌群检测试剂的制备方法
技术领域
本发明涉及一种酶底物法大肠菌群检测试剂的制备方法。
背景技术
水体中微生物污染的主要来源是土壤以及人类、动物的排泄物，排泄物中因含有致病微生物，会导致某些肠道传染病的传播，对水体的污染影响较大。实际工作中，我们无法对水体中所有的微生物进行检测，一般选用一种或一类微生物作为指示菌进行检测，以此反映水体微生物污染情况。目前，总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌，作为卫生质量的重要指标，已被广泛应用于水质、食品卫生安全评价中。
根据现有国标中MMO-MUG培养基配方配制的培养基能够同时对水中的总大肠菌群和大肠埃希氏菌进行检测，但整体检测效果不佳，存在反应延后、颜色反应结果显示不清晰、荧光反应分布不均匀、检测结果灵敏度较低等问题。因此，需要开发出一种酶底物法大肠菌群检测试剂，根据酶底物法原理，能够比普通MMO-MUG培养基有更高的灵敏度，更准确的结果，更高的检测效率。
发明内容
本发明为解决现有技术在使用中存在的问题，提供一种可检测大肠菌群、试剂检测结果灵敏有效、检测效率提高、反应结果显示准确清晰的酶底物法大肠菌群检测试剂及制备方法。
本发明解决现有问题的技术方案是：一种酶底物法大肠菌群检测试剂，该检测试剂由营养剂、指示剂、细菌生长缓冲剂、无机盐缓冲剂、PH调节剂、选择性抑制剂组成。所述的营养剂由重量为1.0-8.0g的蛋白胨组成。所述的指示剂由重量为0.2-0.85g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.2-0.82g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成。所述的细菌生长缓冲剂由重量为1.0-8.0g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和6.0-13.0g的N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成。所述的无机盐缓冲剂由重量为1.0-5.0g的硫酸铵、0.2-0.7g的硫酸镁、0.0001-0.01g的硫酸锌和0.001-0.1g的亚硫酸钠组成。所述的PH调节剂由重量为1.0-3.0g的磷酸氢二钾和0.1-0.3g的氢氧化钠组成。所述的选择性抑制剂由重量为0.0002-0.02g的苯甲酸钠组成。
作为进一步的优选，所述的营养剂由重量为2.0-6.0g的蛋白胨组成。
所述的指示剂由重量为0.3-0.65g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.35-0.6g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成。所述的细菌生长缓冲剂由重量为1.5-6.5g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和7.0-12.0g的 N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成。所述的无机盐缓冲剂由重量为1.8-5.5g的硫酸铵、0.3-0.6g的硫酸镁、0.0009-0.0011g的硫酸锌和0.0095-0.012g的亚硫酸钠组成。所述的PH调节剂由重量为1.3-2.6g的磷酸氢二钾和0.13-0.28g的氢氧化钠组成。所述的选择性抑制剂由重量为0.0012-0.028g的苯甲酸钠组成。
作为进一步的优选，所述的营养剂由重量为3.0-5.0g的蛋白胨组成。
所述的指示剂由重量为0.3-0.5g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.35-0.5g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成。所述的细菌生长缓冲剂由重量为1.5-5.0g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和7.0-10.0g的 N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成。所述的无机盐缓冲剂由重量为1.8-3.0g的硫酸铵、0.3-0.5g的硫酸镁、0.0009-0.001g的硫酸锌和0.0095-0.01g的亚硫酸钠组成。所述的PH调节剂由重量为1.3-2.0g的磷酸氢二钾和0.13-0.2g的氢氧化钠组成。所述的选择性抑制剂由重量为0.0012-0.02g的苯甲酸钠组成。
作为进一步的优选，所述的营养剂由重量为5.0-6.0g的蛋白胨组成。
所述的指示剂由重量为0.5-0.65g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.5-0.6g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成。所述的细菌生长缓冲剂由重量为5.0-6.5g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和10.0-12.0g的 N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成。所述的无机盐缓冲剂由重量为3.0-5.5g的硫酸铵、0.5-0.6g的硫酸镁、0.001-0.0011g的硫酸锌和0.001-0.012g的亚硫酸钠组成。所述的PH调节剂由重量为2.0-2.6g的磷酸氢二钾和0.2-0.28g的氢氧化钠组成。所述的选择性抑制剂由重量为0.002-0.028g的苯甲酸钠组成。
作为进一步的优选，所述的营养剂由重量为5.0g的蛋白胨组成。
所述的指示剂由重量为0.5g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.5g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成。所述的细菌生长缓冲剂由重量为5.0g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和10.0g的 N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成。所述的无机盐缓冲剂由重量为3.0g的硫酸铵、0.5g的硫酸镁、0.001g的硫酸锌和0.01g的亚硫酸钠组成。所述的PH调节剂由重量为2.0g的磷酸氢二钾和0.2g的氢氧化钠组成。所述的选择性抑制剂由重量为0.002g的苯甲酸钠组成。
本发明还公开了一种酶底物法大肠菌群检测试剂的制备方法，步骤如下，
步骤1，将指示剂研磨为粉末，要求粉末粒度小于60目，所述的指示剂由重量为0.2-0.85g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.2-0.82g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成。
步骤2，将细菌生长缓冲剂、无机盐缓冲剂、PH调节剂分别研磨成小于40目的粉末，所述的细菌生长缓冲剂由重量为1.0-8.0g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和6.0-13.0g的 N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成。
所述的无机盐缓冲剂由重量为1.0-5.0g的硫酸铵、0.2-0.7g的硫酸镁、0.0001-0.01g的硫酸锌和0.001-0.1g的亚硫酸钠组成。
所述的PH调节剂由重量为1.0-3.0g的磷酸氢二钾和0.1-0.3g的氢氧化钠组成。
步骤3，将指示剂与营养剂混合均匀，得到指示剂与营养剂混合粉末，所述的营养剂由重量为1.0-8.0g的蛋白胨组成。
步骤4，在上述混合粉末中加入选择性抑制剂，细菌生长缓冲剂、无机盐缓冲剂、PH调节剂混合粉末，连续搅拌混合均匀后，即为酶底物法大肠菌群检测试剂，所述的选择性抑制剂由重量为0.0002-0.02g的苯甲酸钠组成。
作为进一步优选，所述的营养剂由重量为2.0-6.0g的蛋白胨组成。
所述的指示剂由重量为0.3-0.65g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.35-0.6g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成。
所述的细菌生长缓冲剂由重量为1.5-6.5g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和7.0-12.0g的 N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成。
所述的无机盐缓冲剂由重量为1.8-5.5g的硫酸铵、0.3-0.6g的硫酸镁、0.0009-0.0011g的硫酸锌和0.0095-0.012g的亚硫酸钠组成。
所述的PH调节剂由重量为1.3-2.6g的磷酸氢二钾和0.13-0.28g的氢氧化钠组成。
所述的选择性抑制剂由重量为0.0012-0.028g的苯甲酸钠组成。
作为进一步优选，所述的营养剂由重量为3.0-5.0g的蛋白胨组成。
所述的指示剂由重量为0.3-0.5g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.35-0.5g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成。
所述的细菌生长缓冲剂由重量为1.5-5.0g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和7.0-10.0g的 N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成。
所述的无机盐缓冲剂由重量为1.8-3.0g的硫酸铵、0.3-0.5g的硫酸镁、0.0009-0.001g的硫酸锌和0.0095-0.01g的亚硫酸钠组成。
所述的PH调节剂由重量为1.3-2.0g的磷酸氢二钾和0.13-0.2g的氢氧化钠组成。
所述的选择性抑制剂由重量为0.0012-0.02g的苯甲酸钠组成。
作为进一步优选，所述的营养剂由重量为5.0-6.0g的蛋白胨组成。
所述的指示剂由重量为0.5-0.65g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.5-0.6g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成。
所述的细菌生长缓冲剂由重量为5.0-6.5g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和10.0-12.0g的 N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成。
所述的无机盐缓冲剂由重量为3.0-5.5g的硫酸铵、0.5-0.6g的硫酸镁、0.001-0.0011g的硫酸锌和0.001-0.012g的亚硫酸钠组成。
所述的PH调节剂由重量为2.0-2.6g的磷酸氢二钾和0.2-0.28g的氢氧化钠组成。
所述的选择性抑制剂由重量为0.002-0.028g的苯甲酸钠组成。
作为进一步优选，所述的营养剂由重量为5.0g的蛋白胨组成。
所述的指示剂由重量为0.5g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.5g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成。
所述的细菌生长缓冲剂由重量为5.0g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和10.0g的 N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成。
所述的无机盐缓冲剂由重量为3.0g的硫酸铵、0.5g的硫酸镁、0.001g的硫酸锌和0.01g的亚硫酸钠组成。
所述的PH调节剂由重量为2.0g的磷酸氢二钾和0.2g的氢氧化钠组成。
所述的选择性抑制剂由重量为0.002g的苯甲酸钠组成。
本发明的酶底物法大肠菌群检测试剂及制备方法与现有技术相比较，酶底物法大肠菌群检测试剂由营养剂、指示剂、细菌生长缓冲剂、无机盐缓冲剂、PH调节剂、选择性抑制剂组成，利用大肠菌群能产生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase）分解无色底物邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷ONPG（Orthonitrophenyl-β-D-galactopyranoside）使培养液呈黄色，以及大肠埃希氏菌能产生β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase）分解培养基中的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷MUG（4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide）使培养液在365nm-366nm紫外光下产生荧光的原理，根据最大可能数法（MPN法）来计算水中总大肠菌群、粪大肠菌群及大肠埃希氏菌的浓度。
其有益效果是，以水质大肠菌群检测为目的，以酶底物法原理为核心，通过在酶底物法基础反应物质中添加营养剂、细菌生长缓冲剂、PH调节剂、选择性抑制剂等催化酶底物法反应的物质，使酶底物法检测大肠菌群试剂检测结果灵敏有效，检测效率提高，反应结果显示准确清晰。
本发明酶底物法大肠菌群检测试剂及制备方法制备的试剂的效果如下：
1. 取2.0g、3.0g、4.0g、5.0g蛋白胨，分别与0.5g邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷，0.5g4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷，5.0g N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐，10.0g N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸，3.0g硫酸铵， 0.5g硫酸镁，0.001g硫酸锌， 0.01g亚硫酸钠，2.0g磷酸氢二钾，0.2g氢氧化钠，0.002g苯甲酸钠，按上述标准试剂制备流程制备成试剂1(2.0g蛋白胨)、2(3.0g蛋白胨)、3(4.0g蛋白胨)、4(5.0g蛋白胨)，每份试剂取2.7g±0.5g，使用大肠菌群标准阳性菌株大肠埃希氏菌（300-3000个/ml）加入100ml无菌水样中，与国内及国外知名酶底物法试剂进行各时间段检测结果对比，检测结果如下表1：
表1：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
2、取2.7g±0.5g本发明制备方法配制的试剂，与国内及国外知名酶底物法试剂进行检测结果对比，检测对象分别为：加入不同稀释度的阳性菌株大肠埃希氏菌0-1个/ml、1-10个/ml、10-100个/ml的100ml水样，检测结果如下表2：
表2：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
3、取2.7g±0.5g本发明制备方法配制的试剂，加入只含有大肠菌群标准阳性菌株大肠埃希氏菌（300-3000个/ml）的100ml水样中，与国内及国外知名酶底物法试剂进行各时间段检测结果对比，检测结果如下表3：
表3：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
4. 取2.7g±0.5g本发明制备方法配制的试剂，分别加入只含有大肠菌群标准阳性菌株大肠埃希氏菌（300-3000个/ml）、肺炎克雷伯氏菌（300-3000个/ml）与标准阴性菌株铜绿假单胞菌（300-3000个/ml）的三组100ml水样中，与国内及国外知名酶底物法试剂进行检测结果对比，检测结果如下表4：
表4：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
上述检测结果表1、表2、表3证明：
1. 表1检测结果说明酶底物法大肠菌群检测试剂在使用不同比例营养剂时，其显色速率、28小时内显色结果准确性均有较大程度差异，在使用5.0g营养剂时其显色速率、28小时内显色结果能达到最接近真实值。酶底物法大肠菌群检测试剂每一种重要成分及其使用量均是经过重重筛选、无数次的测试才得到的最佳结果。
2. 表2检测结果说明酶底物法大肠菌群检测试剂在对不同浓度阳性菌株进行检测时，检测结果经过24小时生长期后与国内及国外知名酶底物法试剂无明显差异，证实酶底物法大肠菌群检测试剂具有较为可信的检测结果准确度。
3. 表3检测结果说明酶底物法大肠菌群检测试剂在对定量标准阳性菌株进行检测时，在16小时已能基本显示检测结果，20小时检测结果更接近真实值，24小时显示的最终检测结果保持到28小时不会产生变化，其检测效率更优于国内及国外知名的酶底物法试剂，且检测结果具有真实性。
4. 表4检测结果说明酶底物法大肠菌群检测试剂在对各种类定量标准阳性菌株进行检测时，均能得到真实稳定的检测结果，酶底物法大肠菌群检测试剂对所有大肠菌群都具有检测效力，且能有效抑制非目标菌生长，其检测结果符合国家标准要求。
检测结果详情可参照GB5750.12-2006《生活饮用水标准检验方法 微生物指标》与HJ1001-2018《水质 总大肠菌群、粪大肠菌群及大肠埃希氏菌的测试 酶底物法》。
具体实施方式
实施案例1，一种酶底物法大肠菌群检测试剂，该检测试剂由营养剂、指示剂、细菌生长缓冲剂、无机盐缓冲剂、PH调节剂、选择性抑制剂组成。所述的营养剂由重量为1.0-8.0g的蛋白胨组成。所述的指示剂由重量为0.2-0.85g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.2-0.82g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成。所述的细菌生长缓冲剂由重量为1.0-8.0g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和6.0-13.0g的 N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成。所述的无机盐缓冲剂由重量为1.0-5.0g的硫酸铵、0.2-0.7g的硫酸镁、0.0001-0.01g的硫酸锌和0.001-0.1g的亚硫酸钠组成。所述的PH调节剂由重量为1.0-3.0g的磷酸氢二钾和0.1-0.3g的氢氧化钠组成。所述的选择性抑制剂由重量为0.0002-0.02g的苯甲酸钠组成。
实施案例2，一种酶底物法大肠菌群检测试剂，所述的营养剂由重量为2.0-6.0g的蛋白胨组成。
所述的指示剂由重量为0.3-0.65g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.35-0.6g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成。所述的细菌生长缓冲剂由重量为1.5-6.5g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和7.0-12.0g的 N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成。所述的无机盐缓冲剂由重量为1.8-5.5g的硫酸铵、0.3-0.6g的硫酸镁、0.0009-0.0011g的硫酸锌和0.0095-0.012g的亚硫酸钠组成。所述的PH调节剂由重量为1.3-2.6g的磷酸氢二钾和0.13-0.28g的氢氧化钠组成。所述的选择性抑制剂由重量为0.0012-0.028g的苯甲酸钠组成。
实施案例3，一种酶底物法大肠菌群检测试剂，所述的营养剂由重量为3.0-5.0g的蛋白胨组成。
所述的指示剂由重量为0.3-0.5g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.35-0.5g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成。所述的细菌生长缓冲剂由重量为1.5-5.0g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和7.0-10.0g的 N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成。所述的无机盐缓冲剂由重量为1.8-3.0g的硫酸铵、0.3-0.5g的硫酸镁、0.0009-0.001g的硫酸锌和0.0095-0.01g的亚硫酸钠组成。所述的PH调节剂由重量为1.3-2.0g的磷酸氢二钾和0.13-0.2g的氢氧化钠组成。所述的选择性抑制剂由重量为0.0012-0.02g的苯甲酸钠组成。
实施案例4，一种酶底物法大肠菌群检测试剂，所述的营养剂由重量为5.0-6.0g的蛋白胨组成。
所述的指示剂由重量为0.5-0.65g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.5-0.6g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成。所述的细菌生长缓冲剂由重量为5.0-6.5g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和10.0-12.0g的 N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成。所述的无机盐缓冲剂由重量为3.0-5.5g的硫酸铵、0.5-0.6g的硫酸镁、0.001-0.0011g的硫酸锌和0.001-0.012g的亚硫酸钠组成。所述的PH调节剂由重量为2.0-2.6g的磷酸氢二钾和0.2-0.28g的氢氧化钠组成。所述的选择性抑制剂由重量为0.002-0.028g的苯甲酸钠组成。
实施案例5，一种酶底物法大肠菌群检测试剂，所述的营养剂由重量为5.0g的蛋白胨组成。
所述的指示剂由重量为0.5g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.5g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成。所述的细菌生长缓冲剂由重量为5.0g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和10.0g的 N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成。所述的无机盐缓冲剂由重量为3.0g的硫酸铵、0.5g的硫酸镁、0.001g的硫酸锌和0.01g的亚硫酸钠组成。所述的PH调节剂由重量为2.0g的磷酸氢二钾和0.2g的氢氧化钠组成。所述的选择性抑制剂由重量为0.002g的苯甲酸钠组成。
实施案例6，一种酶底物法大肠菌群检测试剂，所述的营养剂由重量为1.0g的蛋白胨组成。
所述的指示剂由重量为0.2g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.2g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成。所述的细菌生长缓冲剂由重量为1.0g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和6.0g的 N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成。所述的无机盐缓冲剂由重量为1.0g的硫酸铵、0.2g的硫酸镁、0.0001g的硫酸锌和0.001g的亚硫酸钠组成。所述的PH调节剂由重量为1.0g的磷酸氢二钾和0.1g的氢氧化钠组成。所述的选择性抑制剂由重量为0.0002g的苯甲酸钠组成。
实施案例7，一种酶底物法大肠菌群检测试剂，所述的营养剂由重量为8.0g的蛋白胨组成。所述的指示剂由重量为0.85g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.82g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成。所述的细菌生长缓冲剂由重量为8.0g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和13.0g的 N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成。所述的无机盐缓冲剂由重量为5.0g的硫酸铵、0.7g的硫酸镁、0.01g的硫酸锌和0.1g的亚硫酸钠组成。所述的PH调节剂由重量为3.0g的磷酸氢二钾和0.3g的氢氧化钠组成。所述的选择性抑制剂由重量为0.02g的苯甲酸钠组成。
实施案例8，一种酶底物法大肠菌群检测试剂，所述的营养剂由重量为6.0g的蛋白胨组成。所述的指示剂由重量为0.65g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.52g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成。所述的细菌生长缓冲剂由重量为5.0g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和10.0g的 N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成。所述的无机盐缓冲剂由重量为3.0g的硫酸铵、0.5g的硫酸镁、0.008g的硫酸锌和0.006g的亚硫酸钠组成。所述的PH调节剂由重量为2.0g的磷酸氢二钾和0.2g的氢氧化钠组成。所述的选择性抑制剂由重量为0.01g的苯甲酸钠组成。
实施案例9，一种酶底物法大肠菌群检测试剂，所述的营养剂由重量为4.0g的蛋白胨组成。所述的指示剂由重量为0.35g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.42g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成。所述的细菌生长缓冲剂由重量为4.5g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和8.0g的 N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成。所述的无机盐缓冲剂由重量为2.0g的硫酸铵、0.3g的硫酸镁、0.005g的硫酸锌和0.006g的亚硫酸钠组成。所述的PH调节剂由重量为2.0g的磷酸氢二钾和0.18g的氢氧化钠组成。所述的选择性抑制剂由重量为0.0008g的苯甲酸钠组成。
本发明还公开了一种酶底物法大肠菌群检测试剂的制备方法，步骤如下，
步骤1，将指示剂研磨为粉末，要求粉末粒度小于60目，所述的指示剂由重量为0.2-0.85g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.2-0.82g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成。
步骤2，将细菌生长缓冲剂、无机盐缓冲剂、PH调节剂分别研磨成小于40目的粉末，所述的细菌生长缓冲剂由重量为1.0-8.0g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和6.0-13.0g的 N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成。
所述的无机盐缓冲剂由重量为1.0-5.0g的硫酸铵、0.2-0.7g的硫酸镁、0.0008-0.0012g的硫酸锌和0.009-0.013g的亚硫酸钠组成。
所述的PH调节剂由重量为1.0-3.0g的磷酸氢二钾和0.1-0.3g的氢氧化钠组成。
步骤3，将指示剂与营养剂混合均匀，得到指示剂与营养剂混合粉末，所述的营养剂由重量为1.0-8.0g的蛋白胨组成。
步骤4，在上述混合粉末中加入选择性抑制剂，细菌生长缓冲剂、无机盐缓冲剂、PH调节剂混合粉末，连续搅拌混合均匀后，即为酶底物法大肠菌群检测试剂，所述的选择性抑制剂由重量为0.001-0.003g的苯甲酸钠组成。
作为进一步优选，本发明一种酶底物法大肠菌群检测试剂的制备方法中：
所述的营养剂由重量为2.0-6.0g的蛋白胨组成。
所述的指示剂由重量为0.3-0.65g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.35-0.6g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成。
所述的细菌生长缓冲剂由重量为1.5-6.5g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和7.0-12.0g的 N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成。
所述的无机盐缓冲剂由重量为1.8-5.5g的硫酸铵、0.3-0.6g的硫酸镁、0.0009-0.0011g的硫酸锌和0.0095-0.012g的亚硫酸钠组成。
所述的PH调节剂由重量为1.3-2.6g的磷酸氢二钾和0.13-0.28g的氢氧化钠组成。
所述的选择性抑制剂由重量为0.0012-0.028g的苯甲酸钠组成。
作为进一步优选，本发明一种酶底物法大肠菌群检测试剂的制备方法中：
所述的营养剂由重量为3.0-5.0g的蛋白胨组成。
所述的指示剂由重量为0.3-0.5g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.35-0.5g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成。
所述的细菌生长缓冲剂由重量为1.5-5.0g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和7.0-10.0g的 N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成。
所述的无机盐缓冲剂由重量为1.8-3.0g的硫酸铵、0.3-0.5g的硫酸镁、0.0009-0.001g的硫酸锌和0.0095-0.01g的亚硫酸钠组成。
所述的PH调节剂由重量为1.3-2.0g的磷酸氢二钾和0.13-0.2g的氢氧化钠组成。
所述的选择性抑制剂由重量为0.0012-0.02g的苯甲酸钠组成。
作为进一步优选，本发明一种酶底物法大肠菌群检测试剂的制备方法中：所述的营养剂由重量为5.0-6.0g的蛋白胨组成。
所述的指示剂由重量为0.5-0.65g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.5-0.6g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成。
所述的细菌生长缓冲剂由重量为5.0-6.5g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和10.0-12.0g的 N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成。
所述的无机盐缓冲剂由重量为3.0-5.5g的硫酸铵、0.5-0.6g的硫酸镁、0.001-0.0011g的硫酸锌和0.001-0.012g的亚硫酸钠组成。
所述的PH调节剂由重量为2.0-2.6g的磷酸氢二钾和0.2-0.28g的氢氧化钠组成。
所述的选择性抑制剂由重量为0.002-0.028g的苯甲酸钠组成。
作为进一步优选，本发明一种酶底物法大肠菌群检测试剂的制备方法中：所述的营养剂由重量为5.0g的蛋白胨组成。
所述的指示剂由重量为0.5g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.5g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成。
所述的细菌生长缓冲剂由重量为5.0g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和10.0g的 N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成。
所述的无机盐缓冲剂由重量为3.0g的硫酸铵、0.5g的硫酸镁、0.001g的硫酸锌和0.01g的亚硫酸钠组成。
所述的PH调节剂由重量为2.0g的磷酸氢二钾和0.2g的氢氧化钠组成。
所述的选择性抑制剂由重量为0.002g的苯甲酸钠组成。
本发明一种酶底物法大肠菌群检测试剂的制备方法中，营养剂、指示剂、细菌生长缓冲剂、无机盐缓冲剂、PH调节剂、选择性抑制剂，可采用一种酶底物法大肠菌群检测试剂任意一实施案例的组分含量。
本发明各实施案例中的数据为优选，在本发明思想之内的数据、组分的同等置换，都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种酶底物法大肠菌群检测试剂，其特征在于：该检测试剂由营养剂、指示剂、细菌生长缓冲剂、无机盐缓冲剂、PH调节剂、选择性抑制剂组成， 所述的营养剂由重量为1.0-8.0g的蛋白胨组成； 所述的指示剂由重量为0.2-0.85g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.2-0.82g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成； 所述的细菌生长缓冲剂由重量为1.0-8.0g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和6.0-13.0g的 N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成； 所述的无机盐缓冲剂由重量为1.0-5.0g的硫酸铵、0.2-0.7g的硫酸镁、0.0001-0.01g的硫酸锌和0.001-0.1g的亚硫酸钠组成； 所述的PH调节剂由重量为1.0-3.0g的磷酸氢二钾和0.1-0.3g的氢氧化钠组成； 所述的选择性抑制剂由重量为0.0002-0.02g的苯甲酸钠组成。
2.如权利要求1所述的酶底物法大肠菌群检测试剂，其特征在于： 所述的营养剂由重量为2.0-6.0g的蛋白胨组成； 所述的指示剂由重量为0.3-0.65g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.35-0.6g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成； 所述的细菌生长缓冲剂由重量为1.5-6.5g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和7.0-12.0g的 N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成； 所述的无机盐缓冲剂由重量为1.8-5.5g的硫酸铵、0.3-0.6g的硫酸镁、0.0009-0.0011g的硫酸锌和0.0095-0.012g的亚硫酸钠组成； 所述的PH调节剂由重量为1.3-2.6g的磷酸氢二钾和0.13-0.28g的氢氧化钠组成； 所述的选择性抑制剂由重量为0.0012-0.028g的苯甲酸钠组成。
3.如权利要求1或2所述的酶底物法大肠菌群检测试剂，其特征在于： 所述的营养剂由重量为3.0-5.0g的蛋白胨组成； 所述的指示剂由重量为0.3-0.5g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.35-0.5g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成； 所述的细菌生长缓冲剂由重量为1.5-5.0g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和7.0-10.0g的 N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成； 所述的无机盐缓冲剂由重量为1.8-3.0g的硫酸铵、0.3-0.5g的硫酸镁、0.0009-0.001g的硫酸锌和0.0095-0.01g的亚硫酸钠组成； 所述的PH调节剂由重量为1.3-2.0g的磷酸氢二钾和0.13-0.2g的氢氧化钠组成； 所述的选择性抑制剂由重量为0.0012-0.02g的苯甲酸钠组成。
4.如权利要求1或2所述的酶底物法大肠菌群检测试剂，其特征在于： 所述的营养剂由重量为5.0-6.0g的蛋白胨组成； 所述的指示剂由重量为0.5-0.65g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.5-0.6g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成； 所述的细菌生长缓冲剂由重量为5.0-6.5g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和10.0-12.0g的 N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成； 所述的无机盐缓冲剂由重量为3.0-5.5g的硫酸铵、0.5-0.6g的硫酸镁、0.001-0.0011g的硫酸锌和0.001-0.012g的亚硫酸钠组成； 所述的PH调节剂由重量为2.0-2.6g的磷酸氢二钾和0.2-0.28g的氢氧化钠组成； 所述的选择性抑制剂由重量为0.002-0.028g的苯甲酸钠组成。
5.如权利要求1所述的酶底物法大肠菌群检测试剂，其特征在于： 所述的营养剂由重量为5.0g的蛋白胨组成； 所述的指示剂由重量为0.5g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.5g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成； 所述的细菌生长缓冲剂由重量为5.0g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和10.0g的 N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成；所述的无机盐缓冲剂由重量为3.0g的硫酸铵、0.5g的硫酸镁、0.001g的硫酸锌和0.01g的亚硫酸钠组成； 所述的PH调节剂由重量为2.0g的磷酸氢二钾和0.2g的氢氧化钠组成； 所述的选择性抑制剂由重量为0.002g的苯甲酸钠组成。
6.一种酶底物法大肠菌群检测试剂的制备方法，其特征在于：步骤如下， 步骤1，将指示剂研磨为粉末，要求粉末粒度小于60目，所述的指示剂由重量为0.2-0.85g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.2-0.82g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成； 步骤2，将细菌生长缓冲剂、无机盐缓冲剂、PH调节剂分别研磨成小于40目的粉末，所述的细菌生长缓冲剂由重量为1.0-8.0g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和6.0-13.0g的 N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸； 所述的无机盐缓冲剂由重量为1.0-5.0g的硫酸铵、0.2-0.7g的硫酸镁、0.0001-0.01g的硫酸锌和0.001-0.1g的亚硫酸钠组成； 所述的PH调节剂由重量为1.0-3.0g的磷酸氢二钾和0.1-0.3g的氢氧化钠组成； 步骤3，将指示剂与营养剂混合均匀，得到指示剂与营养剂混合粉末，所述的营养剂由重量为1.0-8.0g的蛋白胨组成； 步骤4，在上述混合粉末中加入选择性抑制剂，细菌生长缓冲剂、无机盐缓冲剂、PH调节剂混合粉末，连续搅拌混合均匀后，即为酶底物法大肠菌群检测试剂，所述的选择性抑制剂由重量为0.0002-0.02g的苯甲酸钠组成。
7.如权利要求6所述的酶底物法大肠菌群检测试剂的制备方法，其特征在于： 所述的营养剂由重量为2.0-6.0g的蛋白胨组成； 所述的指示剂由重量为0.3-0.65g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.35-0.6g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成； 所述的细菌生长缓冲剂由重量为1.5-6.5g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和7.0-12.0g的N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成； 所述的无机盐缓冲剂由重量为1.8-5.5g的硫酸铵、0.3-0.6g的硫酸镁、0.0009-0.0011g的硫酸锌和0.0095-0.012g的亚硫酸钠组成； 所述的PH调节剂由重量为1.3-2.6g的磷酸氢二钾和0.13-0.28g的氢氧化钠组成； 所述的选择性抑制剂由重量为0.0012-0.028g的苯甲酸钠组成。
8.如权利要求6或7所述的酶底物法大肠菌群检测试剂的制备方法，其特征在于： 所述的营养剂由重量为3.0-5.0g的蛋白胨组成； 所述的指示剂由重量为0.3-0.5g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.35-0.5g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成； 所述的细菌生长缓冲剂由重量为1.5-5.0g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和7.0-10.0g的N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成； 所述的无机盐缓冲剂由重量为1.8-3.0g的硫酸铵、0.3-0.5g的硫酸镁、0.0009-0.001g的硫酸锌和0.0095-0.01g的亚硫酸钠组成； 所述的PH调节剂由重量为1.3-2.0g的磷酸氢二钾和0.13-0.2g的氢氧化钠组成； 所述的选择性抑制剂由重量为0.0012-0.02g的苯甲酸钠组成。
9.如权利要求6或7所述的酶底物法大肠菌群检测试剂的制备方法，其特征在于： 所述的营养剂由重量为5.0-6.0g的蛋白胨组成； 所述的指示剂由重量为0.5-0.65g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.5-0.6g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成；所述的细菌生长缓冲剂由重量为5.0-6.5g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和10.0-12.0g的 N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成； 所述的无机盐缓冲剂由重量为3.0-5.5g的硫酸铵、0.5-0.6g的硫酸镁、0.001-0.0011g的硫酸锌和0.001-0.012g的亚硫酸钠组成； 所述的PH调节剂由重量为2.0-2.6g的磷酸氢二钾和0.2-0.28g的氢氧化钠组成； 所述的选择性抑制剂由重量为0.002-0.028g的苯甲酸钠组成。
10.如权利要求6或7所述的酶底物法大肠菌群检测试剂的制备方法，其特征在于： 所述的营养剂由重量为5.0g的蛋白胨组成； 所述的指示剂由重量为0.5g的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和0.5g的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）组成； 所述的细菌生长缓冲剂由重量为5.0g的N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐和10.0g的 N-2羟乙基哌嗪-N-乙磺酸组成； 所述的无机盐缓冲剂由重量为3.0g的硫酸铵、0.5g的硫酸镁、0.001g的硫酸锌和0.01g的亚硫酸钠组成； 所述的PH调节剂由重量为2.0g的磷酸氢二钾和0.2g的氢氧化钠组成； 所述的选择性抑制剂由重量为0.002g的苯甲酸钠组成。
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