CN111748525A - 绒毛膜癌耐药细胞株的建立方法及其应用 - Google Patents

绒毛膜癌耐药细胞株的建立方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了绒毛膜癌耐药细胞株的建立方法及其应用，该方法包括：人绒毛膜癌细胞JAR株，复苏后用PRMI‑1640培养液于37℃、5％CO2条件下培养；取对数生长期JAR细胞，换新鲜培养液，加入VP16，使其作用浓度为0.1μg/ml药物浓度直至存活细胞能在此浓度稳定生长、传代；适当增加VP16的作用浓度，在37℃、5％CO2条件下继续培养，适时换液，维持药物浓度直至存活细胞能在此浓度稳定生长、传代；重复步骤三直到获得能在3μg/ml VP16中稳定生长、传代及复苏的JAR/VP16细胞株；稳定耐药后，及时冻存该浓度耐药细胞于液氮中。本发明选择药物浓度递增法，特点在于细胞培养的外环境逐渐改变，细胞较易耐受，状态较好，细胞状态较易控制，耐药性能稳定。

Description

绒毛膜癌耐药细胞株的建立方法及其应用
技术领域
本发明涉及医学技术领域，特别是涉及绒毛膜癌耐药细胞株的建立方法及其应用。
背景技术
妊娠滋养细胞疾病是一大类由于滋养细胞异常增生导致的疾病，主要包括：绒癌、葡萄胎、PSTT及着床部位的滋养细胞肿瘤。二十世纪随着化疗药物的开发应用，滋养细胞疾病的治疗取得突飞猛进的进展，绝大多数滋养细胞疾病，甚至绒癌通过化疗均获得较好的治疗效果。然而，近期出现部分耐药性绒癌，对化疗药物耐药，这部分病人诊断后很快发生全身转移，引起病人死亡，其化疗耐药性是目前绒癌治疗的难点。
绒癌通常继发于流产、葡萄胎、足月产之后，因其具有恶性行为，根据NCCN临床实践指南，确诊后需要首选化疗，但部分绒癌显示化疗耐药，患者预后较差，死亡率高。目前化疗多采用联合化疗的方案，即依托泊苷、甲氨蝶呤、放射菌素-D、长春新碱、环磷酰胺(EMA-CO)。在EMA-CO方案中，依托泊苷为一种重要的化疗药物，用于多种肿瘤化疗，作用机理为作用于DNA拓扑异构酶Ⅱ，形成药物-酶-DNA稳定的可逆性复合物，阻碍DNA修复，是一种细胞周期特异性化疗药物。
近年来，肿瘤细胞耐药株已经成为绒癌耐药重要的研究工具，大量研究用其进行肿瘤细胞耐药机制、肿瘤细胞耐药逆转、开发及评价新型抗癌方法。建立耐药细胞株具有重要价值。并且，目前尚未有由绒毛膜癌细胞系建立的耐药细胞株。
发明内容
为了克服上述问题，本发明提供了绒毛膜癌耐药细胞株的建立方法及其应用，本实验选择药物浓度递增法，特点在于细胞培养的外环境逐渐改变，细胞较易耐受，状态较好，细胞状态较易控制，耐药性能稳定；已建立的JAR的依托泊苷耐药株，有助于对于分析绒癌对化疗药物耐药的分子机制研究提供良好的细胞模型，同时助于筛选并发现新的导致绒癌耐药的新靶点。
本发明所采用的技术方案是：
绒毛膜癌耐药细胞株的建立方法，该方法包括：
步骤一：人绒毛膜癌细胞JAR株，复苏后用PRMI-1640培养液于37℃、5％CO2条件下培养；
步骤二：取对数生长期JAR细胞，换新鲜培养液，加入VP16，使其作用浓度为0.1μg/ml药物浓度直至存活细胞能在此浓度稳定生长、传代；
步骤三：适当增加VP16的作用浓度，在37℃、5％CO2条件下继续培养，适时换液，维持药物浓度直至存活细胞能在此浓度稳定生长、传代；
步骤四：重复步骤三直到获得能在3μg/ml VP16中稳定生长、传代及复苏的JAR/VP16细胞株；
步骤五：稳定耐药后，及时冻存该浓度耐药细胞于液氮中。
其中，所述的步骤一中PRMI-1640培养液含10％小牛血清、青霉素100u/ml、链霉素100u/ml。
其中，所述步骤三中每阶段增加VP16量为0.5μg/ml，依次为0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml、2.5μg/ml、3μg/ml。
其中，所述的步骤五中的冻存液由20％小牛血清、10％DMSO、70％PRMI-1640培养液组成。
其中，所述的步骤五中冻存过程逐步降温，采取4℃30分钟→-20℃1小时→-70℃过夜→液氮的顺序进行。
其中，所述的步骤五中冻存细胞的复苏按以下步骤进行：从液氮中取出装有细胞的冻存管，立即放入37℃水浴轻轻摇动，使冻存物在1分钟内解冻；取10ml离心管，将冻存液加入离心管后加入4ml培养液，5000g离心5分钟后弃去上清，用4ml培养基重悬细胞，后将细胞悬液加入25cm2培养皿，加入10ml含有10％小牛血清的培养液；轻微摇动混匀，放入二氧化碳培养箱中，在37℃、5％CO2条件下培养，约24小时细胞贴壁后换新鲜培养液。
本发明还提供了上述绒毛膜癌耐药细胞株的建立方法在研究耐药细胞生物学行为、多药耐药机制、筛选敏感性化疗药物、评价耐药方案等提供细胞模型的应用。
本发明的优点如下：
1、目前建立耐药模型的方法主要有药物浓度递增法与大剂量药物冲击法，本实验选择药物浓度递增法，特点在于细胞培养的外环境逐渐改变，细胞较易耐受，状态较好，细胞状态较易控制，耐药性能稳定。
2、已建立的JAR的依托泊苷耐药株，有助于对于分析绒癌对化疗药物耐药的分子机制研究提供良好的细胞模型，同时助于筛选并发现新的导致绒癌耐药的新靶点。
具体实施方式
下面对本发明作进一步的说明，但本发明并不局限于这些内容。
实施例
绒毛膜癌耐药细胞株的建立方法，该方法包括：
步骤一：人绒毛膜癌细胞JAR株，复苏后用PRMI-1640培养液(含10％小牛血清、青霉素100u/ml、链霉素100u/ml)于37℃、5％CO2条件下培养；
步骤二：取对数生长期JAR细胞，换新鲜培养液，加入VP16，使其作用浓度为0.1μg/ml药物浓度直至存活细胞能在此浓度稳定生长、传代；
步骤三：每阶段增加VP16量为0.5μg/ml，依次为0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml、2.5μg/ml、3μg/ml，在37℃、5％CO2条件下继续培养，适时换液，维持药物浓度直至存活细胞能在此浓度稳定生长、传代；
步骤四：直到获得能在3μg/ml VP16中稳定生长、传代及复苏的JAR/VP16细胞株，历时10个月建立JAR/VP16细胞株；
步骤五：稳定耐药后，及时冻存该浓度耐药细胞于液氮中；冻存液由20％小牛血清、10％DMSO、70％PRMI-1640培养液组成，冻存过程逐步降温，采取4℃30分钟→-20℃1小时→-70℃过夜→液氮的顺序进行；冻存细胞的复苏按以下步骤进行：从液氮中取出装有细胞的冻存管，立即放入37℃水浴轻轻摇动，使冻存物在1分钟内解冻；取10ml离心管，将冻存液加入离心管后加入4ml培养液，5000g离心5分钟后弃去上清，用4ml培养基重悬细胞，后将细胞悬液加入25cm2培养皿，加入10ml含有10％小牛血清的培养液；轻微摇动混匀，放入二氧化碳培养箱中，在37℃、5％CO2条件下培养，约24小时细胞贴壁后换新鲜培养液。
本发明还提供了上述绒毛膜癌耐药细胞株的建立方法在研究耐药细胞生物学行为、多药耐药机制、筛选敏感性化疗药物、评价耐药方案等提供细胞模型的应用。
指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.绒毛膜癌耐药细胞株的建立方法，其特征在于，该方法包括：
步骤一：人绒毛膜癌细胞JAR株，复苏后用PRMI-1640培养液于37℃、5％CO2条件下培养；
步骤二：取对数生长期JAR细胞，换新鲜培养液，加入VP16，使其作用浓度为0.1μg/ml药物浓度直至存活细胞能在此浓度稳定生长、传代；
步骤三：适当增加VP16的作用浓度，在37℃、5％CO2条件下继续培养，适时换液，维持药物浓度直至存活细胞能在此浓度稳定生长、传代；
步骤四：重复步骤三直到获得能在3μg/ml VP16中稳定生长、传代及复苏的JAR/VP16细胞株；
步骤五：稳定耐药后，及时冻存该浓度耐药细胞于液氮中。
2.根据权利要求1所述的绒毛膜癌耐药细胞株的建立方法，其特征在于：所述的步骤一中PRMI-1640培养液含10％小牛血清、青霉素100u/ml、链霉素100u/ml。
3.根据权利要求1所述的绒毛膜癌耐药细胞株的建立方法，其特征在于：所述步骤三中每阶段增加VP16量为0.5μg/ml，依次为0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml、2.5μg/ml、3μg/ml。
4.根据权利要求1所述的绒毛膜癌耐药细胞株的建立方法，其特征在于：所述的步骤五中的冻存液由20％小牛血清、10％DMSO、70％PRMI-1640培养液组成。
5.根据权利要求1所述的绒毛膜癌耐药细胞株的建立方法，其特征在于：所述的步骤五中冻存过程逐步降温，采取4℃30分钟→-20℃1小时→-70℃过夜→液氮的顺序进行。
6.根据权利要求1所述的绒毛膜癌耐药细胞株的建立方法，其特征在于：所述的步骤五中冻存细胞的复苏按以下步骤进行：从液氮中取出装有细胞的冻存管，立即放入37℃水浴轻轻摇动，使冻存物在1分钟内解冻；取10ml离心管，将冻存液加入离心管后加入4ml培养液，5000g离心5分钟后弃去上清，用4ml培养基重悬细胞，后将细胞悬液加入25cm2培养皿，加入10ml含有10％小牛血清的培养液；轻微摇动混匀，放入二氧化碳培养箱中，在37℃、5％CO2条件下培养，约24小时细胞贴壁后换新鲜培养液。
7.根据权利要求1所述的绒毛膜癌耐药细胞株的建立方法在研究耐药细胞生物学行为、多药耐药机制、筛选敏感性化疗药物、评价耐药方案等提供细胞模型的应用。
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