CN111744011A - 一种聚乙二醇衍生物形成的胶束在光动力治疗药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种聚乙二醇衍生物形成的胶束在光动力治疗药物中的用途，属于类脂分子技术领域。所述聚乙二醇衍生物分散在溶剂中可以形成胶束，所述胶束可以用于实现对光动力治疗药物的高效包裹、递送和释放。所述聚乙二醇衍生物形成的胶束具有高的组织穿透性、长效稳定性和可控的释放性能。特别地，所述的聚乙二醇衍生物含有磷脂类结构，使其具有突出的生物相容性。

Description

一种聚乙二醇衍生物形成的胶束在光动力治疗药物中的用途
技术领域
本发明涉及一种聚乙二醇衍生物形成的胶束在光动力治疗药物中的用途，属于类脂分子技术领域。
背景技术
光动力治疗药物(Photodynamic Therapy,PDT)是一种针对肿瘤等血管增生性病变组织的选择性治疗技术。光动力治疗药物的核心是光敏剂，当其富集于病灶后，在匹配吸收波长的激光作用下，生成活性很强的单线态氧，产生细胞毒性作用，进而导致细胞死亡。由于光动力学治疗对靶组织及损伤程度具有选择性，可减少对正常组织的损伤，目前已经用于临床肿瘤的辅助治疗，该疗法是继手术、放疗、化疗和免疫治疗之后的又一种肿瘤疗法。常见的光动力治疗药物的核心分子为卟啉、酞菁、竹红菌素等。这些分子核心结构是大的共轭分子，难溶于水。
为了提高药物制剂的水溶性，对PDT药物的核心结构周围增加水溶性基团，如羧基、磺酸基、胺基改性，增加其水中溶解度提高光动力治疗药物的给药效率和疗效。通过增加亲水基团的方式改进核心结构需要避免对吸收光谱的影响。针对光动力治疗药物在水溶液中的低溶解性，可通过无机盐载体增溶、脂质体包裹或形成高分子胶束等方法提高在水溶液中的溶解度。采用纳米技术增溶后的纳米载体药物降低药物在体内传输过程中的毒性，避免酶降解和其他非特异性蛋白质结合产生的损耗。而且，纳米载体药物具有强化的渗透和保持效应(EPR效应)，能够将药物输送到病灶组织富集，提高治疗效果。以类脂分子为组成材料的纳米载药体系的突出优点在于：其一，它是以天然磷脂分子为基础载体材料，生理相容性好，可以在体内生物降解且没有免疫反应。其二，纳米载体体系增强光动力治疗药物在体内的稳定性，使其免受机体酶和免疫系统的降解。
含有亲水基团和亲油基团的表面活性剂在溶液中达到及超过特定浓度后，分子自动缔合成胶体大小的聚集体微粒称为胶束，该特定浓度称为临界胶束浓度(CMC)。当表面活性剂超过临界胶体浓度后，在溶液中自发形成胶束，并且与游离的表面活性剂分子处于动态平衡状态。
胶束的结构特征是双亲性表面活性剂分子的单层聚集体，多为球状，在特定的分子结构下还可以形成柱状。由于胶束不含有双分子层结构，也不具备内囊空腔，因而具有小于脂质体的结构尺寸。单脂肪链表面活性剂形成的胶束水合半径通常为2nm到20nm，小于脂质体尺寸的下限，对皮肤和组织的穿透性更强。胶束的疏水性内核使其能够包裹水相中难溶的疏水性化合物。而胶束在溶液中处于动态平衡的特点，使其能够迅速释放难溶的有效成分，可用于药物的递送体系。与脂质体递送体系相比，双亲性分子单层分子排列的结构特点使得胶束的稳定性不如脂质体。当胶束接触表皮肤组织后会迅速解体，使得胶束体系包裹的有效成分不能长效释放。胶束体系中的游离表面活性剂会破坏细胞膜，引起生物组织和皮肤的过敏反应。
亲水基团与亲油基团体积相近的双亲性分子容易形成脂质体，而亲水基团体积大于亲油基团的表面活性剂易于形成胶束。常见的单链脂肪酸类表面活性剂通过减小亲油基团体积的方式促进胶束形成。由单脂肪链构成的表面活性剂形成的胶束，亲油基团的缔合作用较弱，胶束中的表面活性剂分子很容易通过动态平衡离开胶束游离在溶液中。因此，单脂肪链表面活性剂通常表现出显著的去污能力，不适合作为疏水性化合物的载体。在生物医药领域中，作为载体的胶束必须具备生物相容性，即，形成胶束的表面活性剂分子能在体内生物降解或无害地排除体外。自然界的类脂分子在生物相容性上具有天然的优势。通常的类脂分子具有双脂肪链，其亲油基团和亲水基团体积相似，易于形成囊泡结构。具有特殊结构的溶血磷脂含有的亲油基团为单链脂肪酸，其体积小于亲水基团的磷酸胆碱，易于形成胶束。
根据胶束的形成原理，可以通过增加表面活性剂的疏水部分的缔合作用来获得稳定的胶束体系。现有技术通过线状双亲性嵌段共聚物的结构设计，使其亲水部分体积大于亲油部分，形成高分子胶束。双亲高分子中大量的亲油基团使胶束稳定性提高，利于在体内循环中保护有效成分。然而大量的亲油和亲水基团使得嵌段共聚物高分子胶束的尺寸更大，水合半径可达100nm以上，降低了组织穿透性。而且共聚物中疏水链的分布和数量难以精确控制，影响了对疏水性化合物释放的动力学的精确调节。在生物医药应用领域，具体地，在药物递送和化妆品相关的疏水性化合物包裹的应用中，常常需要根据使用条件和有效成分结构来灵活调节胶束的尺寸和稳定性，使其同时具有高的生物相容性、组织穿透性、长效稳定性和可控的释放性能。在表面活性剂分子制备中，实现疏水性部分(即亲油基团)和亲水性部分(即亲水基团)的数量和结构精确可调，是获得具有广泛实用性的胶束型载体的切实途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种聚乙二醇衍生物形成的胶束在光动力治疗药物中的用途，所述聚乙二醇衍生物分散在溶剂中可以形成胶束，所述胶束可以用于实现对光动力治疗药物的高效包裹、递送和释放。所述聚乙二醇衍生物形成的胶束具有高的组织穿透性、长效稳定性和可控的释放性能。特别地，所述的聚乙二醇衍生物含有磷脂类结构，使其具有突出的生物相容性。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
一种聚乙二醇衍生物形成的胶束在光动力治疗药物中的用途，所述聚乙二醇衍生物包含含有脂肪链的基团和聚乙二醇，所述含有脂肪链的基团与聚乙二醇通过连接基团连接，其中所述含有脂肪链的基团中的至少一个基团是磷脂类基团。
根据本发明，所述胶束在光动力治疗药物的包覆或递送中的用途。
根据本发明，所述光动力治疗药物为在光激发下产生活性氧物质的光敏剂，所述光敏剂包括卟啉、酞菁、竹红菌素及取代的卟啉、取代的酞菁、取代的竹红菌素；所述取代基团例如为羧基、酯基、氨基、酰胺基、巯基、叠氮基、C4-24烷基、C4-24烯基、C4-24炔基、芳基。
根据本发明，所述光敏剂还可以是卟啉、酞菁与适当的金属离子形成的配合物，优选的配合物金属离子为二价锌、二价铁、二价铜、二价钴、二价镁、二价钙、三价铁、三价铝等。
根据本发明，所述卟啉选自血卟啉、血卟啉单甲醚、二血卟啉醚、原卟啉、苯并卟啉及其衍生物、四羟基苯基二氢卟酚。
所述活性氧物质可选地为三线态氧分子、过氧化合物、氧自由基、过氧自由基、和氧自由基与环境中有机化合物发生链式反应产生的二次自由基。
根据本发明，所述胶束是通过将聚乙二醇衍生物在含水溶液中形成的。
优选地，将聚乙二醇衍生物分散在水溶液中，使其浓度为1-1000倍临界胶束浓度，优选地，浓度为1-200倍临界胶束浓度，更优选地，浓度为1-50倍临界胶束浓度。
根据本发明，形成所述胶束的聚乙二醇衍生物的种类没有特别的限定，示例性地，所述胶束是由一种所述的聚乙二醇衍生物组成的，或者由两种以上所述的聚乙二醇衍生物组合而成的。所述组合可以是二元、三元或多元聚乙二醇衍生物的组合，组合物中的各种聚乙二醇衍生物的质量百分比没有特定的限制只要组合物能够形成胶束。
根据本发明，所述聚乙二醇衍生物的临界胶束浓度是通过本领域已知的方法测试得到的，例如包括电导法、表面张力法、滴体积法、超滤曲线法、单点式超滤法、双点式超滤法、紫外分光光度法、染料吸附法、光散射法、荧光探针法、溶解度法。
本发明还提供一种包覆体系，所述包覆体系包括聚乙二醇衍生物形成的胶束和光动力治疗药物，所述光动力治疗药物位于胶束的内部。
根据本发明，所述光动力治疗药物与聚乙二醇衍生物形成的胶束的摩尔比为0.0001-200:1，优选0.001-100:1，更优选为0.01-50:1，例如为0.005:1、0.01:1、0.02:1、0.05:1、0.1:1、0.2:1、0.3:1、0.4:1、0.5:1、0.8:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、8:1、10:1、12:1、15:1、18:1、20:1、25:1、28:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、80:1、100:1、120:1、150:1、180:1、200:1。
本发明还提供一种制备上述包覆体系的方法，所述方法包括：将含有聚乙二醇衍生物形成的胶束的水溶液与光动力治疗药物接触，制备得到所述的包覆体系。
根据本发明，接触过程中使用机械搅拌、震荡、或超声分散。
根据本发明，所述方法还包括：将所获得的包覆体系进行分离纯化，得到纯化的包覆体系。
根据本发明，所述分离纯化方法例如为降温凝析、高速离心、凝胶渗透色谱、尺寸排阻色谱、半透膜透析等。
本发明还提供一种制备上述包覆体系的方法，包括：将含有聚乙二醇衍生物的有机溶液与光动力治疗药物接触，蒸干溶剂，再加入含水溶液，制备得到所述的包覆体系。
优选地，用含水溶液定容到达到或超过临界胶体浓度。
根据本发明，接触过程中使用机械搅拌、震荡、或超声分散。
根据本发明，所述有机溶液的溶剂的选择和加入量没有特别限制，只要其能够溶解所述聚乙二醇衍生物即可，可选地为醇、醚、酮、酯、酰胺、亚砜、烷烃、环烷烃、芳香烃、氯代烷烃其中之一，或其混合。
本发明还提供一种制剂，所述制剂包括上述的包覆体系。
根据本发明，所述制剂可以是液体制剂或固体制剂。
根据本发明，所述液体制剂包括上述的包覆体系和缓冲溶液。
根据本发明，所述缓冲溶液的加入量为液体制剂总质量的20-99.9wt％，优选30-99wt％，例如为30wt％、35wt％、40wt％、45wt％、50wt％、55wt％、60wt％、65wt％、70wt％、75wt％、80wt％、85wt％、88wt％、90wt％、92wt％、95wt％、98wt％、99wt％。所述包覆体系的加入量为液体制剂总质量的0.01-80wt％，优选为1-70wt％，例如为1wt％、2wt％、5wt％、8wt％、10wt％、12wt％、15wt％、18wt％、20wt％、25wt％、30wt％、35wt％、40wt％、45wt％、50wt％、55wt％、60wt％、65wt％、70wt％。
根据本发明，所述缓冲溶液例如为磷酸缓冲溶液。
根据本发明，所述液体制剂还包括增湿剂。所述增湿剂的加入量为液体制剂总质量的0-30wt％，优选0.01-20wt％，例如0.1-10wt％，如0.1wt％、0.2wt％、0.5wt％、0.8wt％、1wt％、2wt％、5wt％、8wt％、10wt％、12wt％、15wt％、18wt％、20wt％、25wt％、30wt％。
根据本发明，所述增湿剂选自甘油、丁二醇、丙二醇中的至少一种。所述增湿剂的加入是用于增湿和降低水溶液凝固点。
根据本发明，所述液体制剂还包括药物辅剂。所述药物辅剂的加入量为液体制剂总质量的0-10wt％，优选0.01-5wt％，例如0.1-1wt％，如0.01wt％、0.05wt％、0.1wt％、0.2wt％、0.5wt％、0.8wt％、1wt％、2wt％、5wt％、8wt％、10wt％。
根据本发明，所述药物辅剂选自多元醇、电解质中的至少一种。
根据本发明，所述液体制剂的pH值为3-8，优选pH值为5-7.5，更优选pH值为7-7.5。
本发明还提供一种液体制剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
将上述的包覆体系与缓冲溶液混合，任选地加入增湿剂和药物辅剂，制备得到所述液体制剂。
根据本发明，所述固体制剂包括上述的包覆体系。
根据本发明，所述固体制剂还包括增湿剂。
根据本发明，所述增湿剂选自甘油、丁二醇、丙二醇中的至少一种。所述增湿剂的加入量为固体制剂总质量的1-20wt％，如1wt％、2wt％、5wt％、8wt％、10wt％、12wt％、15wt％、18wt％、20wt％。
根据本发明，所述固体制剂还包括药物辅剂，所述药物辅剂选自多元醇、电解质中的至少一种，所述药物辅剂为固体制剂总质量的0.01-10wt％，优选0.1-1wt％，如0.01wt％、0.05wt％、0.1wt％、0.2wt％、0.5wt％、0.8wt％、1wt％、2wt％、5wt％、8wt％、10wt％。
本发明还提供一种固体制剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
将上述的包覆体系与缓冲溶液混合，任选地加入增湿剂和药物辅剂，制备得到液体制剂；对液体制剂进行冷冻干燥处理，制备得到固体制剂。
本发明的有益效果是：
(1)本发明的聚乙二醇衍生物含有磷脂类结构以及多脂肪链，其中疏水性部分(即亲油基团)可以通过改变脂肪链链长、饱和度以及脂肪链数量来调节疏水部分的体积和缔合作用强度，而亲水部分的体积可以通过选择聚乙二醇高分子链长和分支数量来调节，两者协同配合，可以得到不同胶束尺寸的、稳定的胶束。
(2)特别地，本发明的聚乙二醇衍生物实现了小粒径纳米胶束在有机溶剂中稳定存在，克服了常规条件下脂质体和单脂肪链胶束对有机溶剂低耐受的技术问题。
(3)本发明可以根据光动力治疗药物的结构和使用条件，选择合适的聚乙二醇衍生物以形成胶束，从而通过‘自下而上’的策略灵活调整胶束的尺寸和稳定性，高效构建纳米包裹体系，实现胶束对光动力治疗药物的高效包裹、递送和释放。
(4)本发明的聚乙二醇衍生物含有磷脂类结构，具有突出的生物相容性。本发明的聚乙二醇衍生物形成的胶束具有高的组织穿透性、长效稳定性和可控的释放性能。
[术语和解释]
本发明所述“烃基”代表碳原子数为4-40，如8-40饱和或不饱和的脂肪烃，所述不饱和的脂肪烃含有不饱和基团，任选为烯基或炔基，不饱和基团可以是一个或两个以上。优选的，所述烃基为“C4-24烃基”，例如为C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24。
本发明所述的“烷基”代表碳原子数为4-40，如8-40的直链、支链烷基，优选的，所述烷基为“C4-24烷基”；例如，辛烷基、癸烷基、十一烷基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基。
本发明所述的“烯基”代表碳原子数为4-40，如8-40的直链、支链烯基，优选的，双键的数目为1到6的整数。优选的，所述烯基为“C4-24烯基”；例如，辛烯基、癸烯基、十一烯基、十二烯基、十四烯基、十六烯基、十八烯基。
本发明所述的“炔基”代表碳原子数为4-40，如8-40的直链、支链炔基，优选的，三键的数目为1到6的整数。优选的，所述炔基为“C4-24炔基”；例如，辛炔基、癸炔基、十一炔基、十二炔基、十四炔基、十六炔基、十八炔基。
本发明所述的“芳基”应理解为优选表示具有6～36，优选6～20个碳原子的一价芳香性或部分芳香性的单环、双环或三环烃环，优选“C6-14芳基”。术语“C6-14芳基”应理解为优选表示具有6、7、8、9、10、11、12、13或14个碳原子的一价芳香性或部分芳香性的单环、双环或三环烃环，特别是具有6个碳原子的环(“C6芳基”)，例如苯基；或联苯基，或者是具有9个碳原子的环(“C9芳基”)，例如茚满基或茚基，或者是具有10个碳原子的环(“C10芳基”)，例如四氢化萘基、二氢萘基或萘基，或者是具有13个碳原子的环(“C13芳基”)，例如芴基，或者是具有14个碳原子的环(“C14芳基”)，例如蒽基。
本发明所述“氨基”代表基团-N(R7)2，其中，R7相同或不同，独立的选自H、烷基、芳基。
本发明所述的醚基代表基团-OR8，其中，R8独立的选自C1-6烷基、-(CH2-CH2O)n-CH2-CH3(n大于2)；所述醚基例如为甲基醚、乙基醚、丙基醚、异丙基醚、丁基醚、异丁基醚、叔丁基醚、环氧乙烷数为9-12的聚氧乙烯醚基等。
本发明所述的“反应性基团”也可称为“活性基团”，是指具有化学反应性的基团，其可与另一个“反应性基团”形成化学键的官能团。适合的反应性基团在本领域中众所周知，例如可以为：羟基、氨基、羧基、醛基、酮基、酯基、巯基、马来酰亚胺、α-卤代羰基、炔基、烯基、叠氮基、四嗪基。
本发明所述的“连接基团”是指将两个基团连接起来的基团，具体的，如将磷脂类化合物或烃类化合物与所述聚乙二醇连接在一起的基团。
本发明所述的“端基被取代的聚乙二醇”，是指聚乙二醇封端基羟基被其他基团所取代。现有技术中已知有多种端基被取代的聚乙二醇，例如，具有如下封端基团的聚乙二醇：甲氧基、乙氧基、丙氧基，氨基、羧基、炔基、叠氮基等。
本发明所述的“线性聚乙二醇”，是指聚乙二醇的分子链为线状，即含有线性乙烯基醚重复单元以及两个羟基封端基。
本发明所述的“多臂聚乙二醇”，也可称为“多臂PEG多元醇”，是指具有3至10个分支(“臂”)的支化聚(乙二醇)，其封端基为羟基。合适的多臂聚乙二醇包括但不限于树枝状、梳形和星形聚(乙二醇)。通常，可用的多臂聚乙二醇具有大约450至大约200000道尔顿，或大约2000至大约40000道尔顿的分子量。应该认识到，多臂聚乙二醇通常是具有臂长的分布且在一些情况下具有不同臂数物类分布的不均匀混合物。当多臂聚乙二醇具有不同臂数物类的分布时，其可以以该分布中的平均臂数为基础表示。例如，在一个实施方案中，多臂聚乙二醇可以为8-臂星形PEG多元醇，其包含多臂星形PEG多元醇的混合物，其中一些具有少于8个臂，一些具有多于8个臂；但是，该混合物中的多臂星形PEG多元醇具有8个臂的平均值。另外可以使用具有不同臂数和/或不同分子量的多臂PEG多元醇的混合物作为原材料。
本发明所述“磷脂”(Phospholipid)、“磷脂类化合物”、“磷脂类”，是指含有磷酸的脂类，属于复合脂。主要分为甘油磷脂与鞘磷脂两大类，由甘油构成的磷脂称为甘油磷脂；由神经鞘氨醇构成的磷脂，称为鞘磷脂。其结构特点是：具有由磷酸相连的取代基团(含氨碱或醇类)构成的亲水头(hydrophilic head)和由脂肪酸链构成的疏水尾(hydrophobictail)。
本发明所述“甘油磷脂”，又称磷酸甘油酯，主链为甘油-3-磷酸，甘油分子中的另外两个羟基都被脂肪酸所酯化，磷酸基团又可被各种结构不同的小分子化合物酯化后形成各种磷酸甘油酯。每一磷脂可因组成的脂肪酸不同而有若干种。
本发明所述“溶血磷脂”(lysolecithin)是磷脂质的一种，水解磷脂。是磷脂被磷脂酶A1，磷脂酶A2，或磷脂酶B等水解生成的化合物。溶血磷脂按其底物来源可分为溶血磷脂酰胆碱(LPC)，溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)，溶血磷脂酰肌醇(LPI)，溶血磷脂酸(LPA)。由甘油骨架的1位或2位羟基上酰基结合成酯的化合物(磷脂酶A2分解产物或A1分解产物)。
本发明所述“鞘磷脂”(Sphingomyelin)，是指含鞘氨醇或二氢鞘氨醇的磷脂，其分子不含甘油，是一分子脂肪酸以酰胺键与鞘氨醇的氨基相连。鞘氨醇或二氢鞘氨醇是具有脂肪族长链的氨基二元醇。有疏水的长链脂肪烃基尾和两个羟基及一个氨基的极性头。
附图说明
图1为本发明的聚乙二醇衍生物和聚乙二醇衍生物形成的胶束的结构示意图。
图2为本发明实施例使用的光动力治疗药物四苯基卟啉分子结构式。
图3为实施例2的含四苯基卟啉胶束动态激光散射粒径数值分布图。
图4为实施例4的含四苯基卟啉胶束动态激光散射粒径数值分布图。
图5为实施例5的包含四苯基卟啉凝胶色谱柱洗脱曲线图。检测波长280nm。洗脱峰P1为四苯基卟啉胶束，P2为溶液中残余四苯基卟啉与表面活性剂的缔合物。
具体实施方式
<聚乙二醇衍生物及其制备方法>
如前所述，本发明提供了一种聚乙二醇衍生物，所述聚乙二醇衍生物的结构为：PEG-(L1-R1)n，其中，PEG为聚乙二醇基团，L1为二价连接基团，n为2-10之间的整数，R1相同或不同，独立地选自磷脂类基团、C4-40烃基，且其中至少一个R1为磷脂类基团。
在本发明的一个实施方式中，所述聚乙二醇基团选自线性聚乙二醇基团或多臂聚乙二醇基团。
在本发明的一个实施方式中，R1相同或不同，独立的选自磷脂类基团、C4-24烃基，例如磷脂类基团、C4-24烷基、C4-24烯基、C4-24炔基，且其中至少一个R1为磷脂类基团。
在本发明的一个实施方式中，所述磷脂类基团优选为如下式(I)或式(II)所示结构，
Figure BDA0002540059100000081
其中，R2、R3相同或不同，独立的选自C4-40烃基，*代表连接键。
优选地，R2、R3相同或不同，独立的选自C4-24烃基，例如C4-24烷基、C4-24烯基、C4-24炔基。
在本发明的一个实施方式中，所述聚乙二醇衍生物中，所述磷脂类基团为1-10个。
在本发明的一个实施方式中，所述二价连接基团L1是能够将基团R1与聚乙二醇基团PEG连接的任意基团，且二价连接基团L1相同或不同。所述二价连接基团L1含有如下基团：-CO-NH-、-CO-O-、-CS-O-、-NH-CO-NH-、-CO-NH-CO-、-O-、-S-、-S-S-、-NH-、
Figure BDA0002540059100000091
叠氮-炔基环合加成连接基团、四嗪基-烯基环合加成连接基团。
所述二价连接基团L1例如可以为：-CO-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-、-CO-CH2-CH2-CO-NH-、-CH2-CO-NH-CH2-CH2-、-CH2-CO-NH-、-S-S-、
Figure BDA0002540059100000092
在本发明的一个实施方式中，若所述聚乙二醇基团选自线性聚乙二醇基团时，所述二价连接基团L1的数量等于2；若所述聚乙二醇基团选自多臂聚乙二醇基团时，所述二价连接基团L1的数量等于多臂聚乙二醇的臂数。
在本发明的一个实施方式中，所述多臂聚乙二醇基团的臂数为3、4、5、6、7、8、9或10，且臂数与n相同。示例性地，所述多臂聚乙二醇为三臂聚乙二醇、四臂聚乙二醇、五臂聚乙二醇、六臂聚乙二醇、七臂聚乙二醇、八臂聚乙二醇、九臂聚乙二醇或十臂聚乙二醇中的至少一种。
在本发明的一个实施方式中，所述多臂聚乙二醇基团包括聚乙二醇重复单元和支化核心结构，所述支化核心结构选自甘油、缩水甘油醚、乙二醇缩水甘油醚、季戊四醇、二缩水季戊四醇醚、三缩水季戊四醇醚、没食子酸、没食子酸醚或乙二醇没食子酸醚；其中，所述缩水甘油醚为二缩水甘油醚、三缩水甘油醚、四缩水甘油醚、五缩水甘油醚、六缩水甘油醚。
在本发明的一个实施方式中，所述聚乙二醇基团的数均分子量为500-60000Da，优选1000-50000Da，进一步优选为2000-40000Da。
如前所述，本发明还提供一种聚乙二醇衍生物，其通过将如下原料进行反应制备得到：
(a)磷脂类化合物，和(b)端基为Y的聚乙二醇PEG-(Y)n，以及任选的(c)含脂肪链的化合物R4-X1，其中(a)磷脂类化合物中的氨基或羟基与(b)PEG-(Y)n中的Y进行反应，(c)R4-X1中的X1与(b)PEG-(Y)n中的Y进行反应；
其中，PEG为线性聚乙二醇基团或多臂聚乙二醇基团，n为2-10之间的整数；
所述基团Y相同或不同，独立地选自-R5-A，所述A为如下反应性基团：-COOH、氨基、-OH、-SH、-C≡N、-C≡C、-C＝C、N-羟基琥珀酰亚胺酯基、马来酰亚胺基、二硫吡啶基、乙烯砜基、异氰酸酯基、四嗪基；所述R5为不存在或二价连接基团，例如R5-为-CO-C1-6烷基-、-C1-6烷基-、-NH-C1-6烷基-；
所述基团X1相同或不同，独立地选自如下反应性基团：-COOH、氨基、-OH、-SH、-C≡N、-C≡C、-C＝C、N-羟基琥珀酰亚胺酯基、马来酰亚胺基、二硫吡啶基、乙烯砜基、异氰酸酯基、四嗪基的任意一种；
R4为C4-40烃基。
在本发明的一个实施方式中，所述原料(a)为一种或两种以上的磷脂类化合物。所述磷脂类化合物为含有磷酸、以及氨基或羟基的脂类。所述磷脂类化合物中的氨基或羟基与原料(b)中的反应性基团进行反应。
在本发明的一个实施方式中，所述磷脂类化合物可以是天然的，也可以是合成。
示例性地，所述磷脂类化合物例如为甘油磷脂、溶血磷脂、鞘磷脂等。所述甘油磷脂例如为磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)或磷脂酸(PA)；所述溶血磷脂例如为溶血磷脂酰胆碱(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、溶血磷脂酰肌醇(LPI)或溶血磷脂酸(LPA)。
示例性地，所述磷脂酰乙醇胺选自二己酰基磷脂酰乙醇胺、二辛酰基磷脂酰乙醇胺、二癸酰基磷脂酰乙醇胺、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺(DLPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二芥酰基磷脂酰乙醇胺(DEPE)、1,2-二十二碳六烯酰基(DHA)磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(SOPE)；所述溶血磷脂酰乙醇胺选自肉豆蔻酰基溶血磷脂酰乙醇胺(LMPE)、棕榈酰基溶血磷脂酰乙醇胺(LPPE)、硬脂酰基溶血磷脂酰乙醇胺(LSPE)。
在本发明的一个实施方式中，所述原料(b)中，Y是聚乙二醇的封端基，所述原料(b)是现有技术中已经存在具有各种封端基的聚乙二醇，其可以购买也可以自主合成。
在本发明的一个实施方式中，所述原料(b)可为端基被取代的线性聚乙二醇。
在本发明的一个实施方式中，所述原料(b)可为端基被取代的多臂聚乙二醇，示例性地，所述多臂聚乙二醇为三臂聚乙二醇、四臂聚乙二醇、五臂聚乙二醇、六臂聚乙二醇、七臂聚乙二醇、八臂聚乙二醇、九臂聚乙二醇或十臂聚乙二醇中的至少一种。
在本发明的一个实施方式中，所述聚乙二醇数均分子量为500-60000Da，优选1000-50000Da，进一步优选为2000-40000Da。
在本发明的一个实施方式中，所述原料(c)可存在也可不存在。所述原料(c)中的基团X1具有反应性的基团，其可以与原料(b)中基团Y中的反应性基团进行反应，将基团R4与聚乙二醇连接在一起。
所述聚乙二醇衍生物的结构为：PEG-(L1-R1)n，其中，PEG为聚乙二醇基团，L1为连接基团，n为2-10之间的整数，R1相同或不同，独立地选自磷脂类基团、C4-40烃基，且其中至少一个R1为磷脂类基团。
上述聚乙二醇衍生物的制备方法，所述方法包括如下步骤：
将(a)磷脂类化合物、(b)端基为Y的聚乙二醇PEG-(Y)n、以及任选的(c)含脂肪链化合物R4-X1混合，反应得到所述聚乙二醇衍生物。
在本发明的一个实施方式中，将上述原料在溶剂中混合，所述溶剂例如选自N,N-二甲基甲酰胺。
在本发明的一个实施方式中，所述方法包括如下步骤：
(1)将(a)磷脂类化合物和任选的(c)含脂肪链化合物R4-X1溶解于溶剂中，得到混合溶液A；
(2)将(b)端基为Y的聚乙二醇PEG-(Y)n溶解于溶剂中，得到混合溶液B；
(3)将混合溶液A和混合溶液B混合，室温下反应，制备得到所述聚乙二醇衍生物。
在本发明的一个实施方式中，所述方法还可以包括如下步骤：
(1’)将(a)磷脂类化合物溶解于溶剂中，得到混合溶液A；
(2’)将(b)端基为Y的聚乙二醇PEG-(Y)n溶解于溶剂中，得到混合溶液B；
(3’)将混合溶液A和混合溶液B混合，室温下反应，再任选地加入(c)含脂肪链化合物R4-X1，制备得到所述聚乙二醇衍生物。
在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中或步骤(3’)中还包括在反应过程中加入终止试剂，以终止反应的进行。所述终止试剂例如选自水。
在本发明的一个实施方式中，当不存在原料(c)时，原料(a)磷脂类化合物和原料(b)PEG-(Y)n的摩尔比为n:1。
在本发明的一个实施方式中，当存在原料(c)时，原料(a)磷脂类化合物和原料(c)R4-X的摩尔数之和与原料(b)PEG-(Y)n的摩尔比为n:1。
其中，原料(a)磷脂类化合物和原料(c)R4-X的摩尔数比没有特别的定义，保证制备得到的聚乙二醇衍生物至少含有一个磷脂类基团即可。
下文将结合具体实施例对本发明的制备方法做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
下述实施例中所使用的二异丙基乙胺的分子量129Da，生产厂家为北京化工厂。下述实施例中所使用的N,N-二甲基甲酰胺为无水DMF，纯度为分析纯，生产厂家为北京化工厂。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。任选表示所述特征存在或不存在，还表示所述特征一定存在，只是具体选择可以随意。
下述实施例中的聚乙二醇重复单元数示意性地显示为平均数。
下述实施例中使用的1,2二硬脂酸-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE，分子量748Da)购自北京迈瑞达科技有限公司。使用的1,2-二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺(DLPE，分子量579Da)购自杭州新乔生物科技有限公司。
下述实施例中使用的十八胺(分子量270Da)购自上海贤鼎生物科技有限公司。使用的正十二胺(分子量185Da)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
制备例1三脂肪链-聚乙二醇衍生物的合成(1DSPE，1正十八硫醇)
在10毫升圆底玻璃烧瓶中称取50mg DSPE，将其溶于100μL N,N-二甲基甲酰胺中，加入12μL二异丙基乙胺得到溶液(一)。
用2毫升称量瓶称取334mg端基取代的聚乙二醇OPSS-PEG5000-SCM(平均分子量5000Da，端基分别为二硫吡啶基和琥珀酰亚胺羧甲基酯的聚乙二醇，购自北京键凯科技股份有限公司，产品编号A5109)，将其溶于400μL DMF中得到溶液(二)。
将溶液(二)加入具有溶液(一)的圆底烧瓶中混合，磁力搅拌，氮气保护下室温反应4小时。其后，去氮气保护，向反应液中加入100μL 0.5M盐酸溶液，调节pH值为7.0，然后加入30μL的1-十八硫醇(分子量287Da，购自北京百灵威科技有限公司)，继续反应1小时。所得混合液50℃下真空旋干，残留物用DMF定容为500μL，使用针管注射器将定容后的溶液迅速注入到20mL冷无水乙醚(-80℃)中，出现白色沉淀。将含沉淀的无水乙醚溶液置于离心管中离心10分钟，倾去上层乙醚得到白色固体。使用C1-反相高效液相柱层析(YMC-Pack TMS色谱柱，深圳凯米斯科技有限公司，水/乙腈洗脱)，进一步分离纯化。产物经由反相色谱(RP-HPLC)-质谱(电喷雾电离，ESI)检测，显示含有1,2-二硬脂酸-3-磷脂酰乙醇胺-正十八硫醇-聚乙二醇衍生物。色谱峰面积90％。产物-20℃下密封存放，命名为1DSPE-SC18-PEG5k，结构式如下所示：
Figure BDA0002540059100000131
制备例2三脂肪链-聚乙二醇衍生物的合成(1DSPE，1正辛硫醇)
在10毫升圆底玻璃烧瓶中称取50mg DSPE，将其溶于100μL DMF中，加入12μL二异丙基乙胺得到溶液(一)。
用2毫升称量瓶称取334mg端基取代的聚乙二醇MAL-PEG5000-SCM(平均分子量5000Da，端基分别为马来酰亚胺和琥珀酰亚胺羧甲基酯的聚乙二醇，购自北京键凯科技股份有限公司，产品编号A5003)，将其溶于400μL DMF中得到溶液(二)。
向溶液(二)中加入15μL的1-辛硫醇(分子量146，购自北京百灵威科技)，氮气保护下反应1小时。将得到的反应液加入具有溶液(一)的圆底烧瓶中混合，磁力搅拌，氮气保护室温下反应4小时。其后，去氮气保护，加入50μL水终止反应，所得混合液50℃下真空旋干。将旋蒸后的残留物用DMF定容为500μL，使用针管注射器将定容后的溶液迅速注入到20mL冷冻无水乙醚(-80℃)中，出现白色沉淀。含沉淀的无水乙醚溶液置于离心管中离心10分钟，倾去上层乙醚得到白色固体。使用C1-反相高效液相柱层析(YMC-Pack TMS色谱柱，深圳凯米斯科技有限公司，水/乙腈洗脱)，进一步分离纯化。产经由反相色谱(RP-HPLC)-质谱(电喷雾电离，ESI)检测，显示含有1,2-二硬脂酸-3-磷脂酰乙醇胺-1-辛硫醇-聚乙二醇衍生物，色谱峰面积87％。产物-20℃下密封存放，命名为1DSPE-1SC8-PEG5k，具体结构式如下所示。
Figure BDA0002540059100000141
制备例3四脂肪链-聚乙二醇衍生物的合成(2DSPE)
在10毫升圆底玻璃烧瓶中称取100mg DSPE，将其溶于100μL DMF中，加入22μL二异丙基乙胺得到溶液(一)。
用2毫升称量瓶称取134mg双取代聚乙二醇SCM-PEG2000-SCM(平均分子量2000Da，端基均为琥珀酰亚胺酯的聚乙二醇，北京键凯科技股份有限公司，产品编号A4051)，将其溶于无水400μL DMF中得到溶液(二)。
将溶液(二)加入具有溶液(一)的圆底烧瓶中混合，磁力搅拌，氮气保护室温下反应4小时，加入25μL蒸馏水终止反应，所得混合液50℃下真空旋蒸1小时。将烧瓶中残留物用DMF定容为500μL，使用针管注射器将定容后的溶液迅速注入到20mL冷冻无水乙醚(-80℃)中，出现白色沉淀。将含沉淀的无水乙醚溶液置于离心管中5000g下离心10分钟，倾去上层乙醚得到白色固体。产物经由反相色谱(RP-HPLC)-质谱(电喷雾电离，ESI)检测，显示含有双-(1,2-二硬脂酸-3-磷脂酰乙醇胺)-聚乙二醇衍生物，色谱峰面积91％。产物-20℃下密封存放，命名为2DSPE-PEG2k，结构式如下所示：
Figure BDA0002540059100000142
制备例4四脂肪链-聚乙二醇衍生物的合成(2DOPE)
与制备例3相同的步骤，除了溶液(一)中使用98mg二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE，分子量744Da，购自杭州新乔生物科技有限公司)，以及溶液(二)中使用334mg双取代聚乙二醇SCM-PEG5000-SCM(平均分子量5000Da，双端基均为琥珀酰亚胺酯的聚乙二醇，北京键凯科技股份有限公司，产品编号A4013)，产物经由反相色谱(RP-HPLC)-质谱(电喷雾电离，ESI)检测，显示含有双-二油酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇衍生物，色谱峰面积87％。产物-20℃下密封存放，命名为2DOPE-PEG5k，具体结构式如下所示。
Figure BDA0002540059100000151
制备例5六脂肪链-聚乙二醇衍生物的合成(2十八胺，2DSPE)
在10毫升圆底玻璃烧瓶中称取35mg正十八胺(分子量270Da，上海贤鼎生物科技有限公司)，100mg 1,2二硬脂酸-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE，分子量748Da，购自北京迈瑞达科技有限公司)，将其溶于100μLDMF中，加入50μL二异丙基乙胺得到溶液(一)。
用2毫升称量瓶称取1.3g四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺酯(4ARM-PEG-SS-20K，平均分子量20000Da，端基均为琥珀酰亚胺琥珀酸酯的聚乙二醇，购自北京键凯科技股份有限公司，产品编号A7030)，将其溶于400μLDMF中得到溶液(二)。将溶液(二)加入具有溶液(一)的圆底烧瓶中混合，磁力搅拌，氮气保护室温下反应4小时后，加入25μL蒸馏水终止反应，所得混合液50℃下真空旋干。将烧瓶中残留物用DMF定容为500μL，使用针管注射器将定容后的溶液迅速注入到20mL冷冻无水乙醚(-80℃)中，出现白色沉淀。将含沉淀的无水乙醚溶液置于离心管中5000g下离心10分钟，倾去上层乙醚得到白色固体。使用C1-反相高效液相柱层析(YMC-Pack TMS色谱柱，深圳凯米斯科技有限公司，水/异丙醇洗脱)进一步分离纯化，产物经由反相色谱(RP-HPLC)-质谱(电喷雾电离，ESI)检测，显示含有双-(1,2-二硬脂酸-3-磷脂酰乙醇胺)-双-(正十八胺)-聚乙二醇偶联体，色谱峰面积87％。产物-20℃下密封存放，命名为2DSPE-2OA-PEG20k，产物为同分异构混合物，其中一个异构分子式如下所示。
Figure BDA0002540059100000161
制备例6八脂肪链-聚乙二醇衍生物的合成(4DSPE)
称取195mg DSPE，将其溶于100μL DMF中，加入30μL二异丙基乙胺得到溶液(一)。
用2毫升称量瓶称取1.3g四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺基琥珀酸酯4ARM-PEG20k-SS(平均分子量20000Da，4个端基均为琥珀酰亚胺基琥珀酸酯的聚乙二醇，购自北京键凯科技股份有限公司，产品编号A7030)，将其溶于400μL DMF中得到溶液(二)。
将溶液(二)加入具有溶液(一)的圆底烧瓶中混合，磁力搅拌，室温下反应4小时，加入25μL蒸馏水终止反应，所得混合液50℃下真空旋蒸1小时。将烧瓶中残留物用DMF定容为500μL，使用针管注射器将定容后的溶液迅速注入到20mL冷冻无水乙醚(-80℃)中，出现白色沉淀。将含沉淀的无水乙醚溶液置于离心管中离心10分钟，倾去上层乙醚得到白色固体。粗产物用C1-反相高效液相柱层析(YMC-Pack TMS色谱柱，深圳凯米斯科技有限公司，水/异丙醇洗脱)，进一步分离得到纯化。反相色谱(RP-HPLC)-质谱(电喷雾电离，ESI)检测，显示含有四-(1,2-二硬脂酸-3-磷脂酰乙醇胺)-聚乙二醇衍生物，色谱峰面积98％。产物-20℃下密封存放，命名为4DSPE-PEG20k，具体结构式如下所示：
Figure BDA0002540059100000162
制备例7十脂肪链-聚乙二醇衍生物的合成(2DLPE，6正十二胺)
在10毫升圆底玻璃烧瓶中称取20mg DLPE，加入20mg正十二胺(分子量185Da，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，将其溶于100μL DMF中，加入22μL二异丙基乙胺得到溶液(一)。
用2毫升称量瓶称取334mg八臂聚乙二醇琥珀酰亚胺基琥珀酸酯8ARM-PEG20k-SS(平均分子量20000Da，端基为八琥珀酰亚胺基琥珀酸酯的聚乙二醇，购自北京键凯科技股份有限公司，产品编号A10008)，将其溶于400μL DMF中得到溶液(二)。
将溶液(二)加入具有溶液(一)的圆底烧瓶中混合，磁力搅拌，室温下反应8小时，加入25μL蒸馏水终止反应，所得混合液90℃下，真空旋蒸去除溶剂。烧瓶中残留物用10mL氯仿溶解，饱和食盐水洗涤3次，干燥后旋蒸去除氯仿得到浅黄色粗产物。粗产物经由200目硅胶薄层层析分离，洗脱液为氯仿/乙醇/吡啶(体积比90/9.5/0.5)，得到纯化的目标产物(Rf0.45)。电子喷雾电离质谱检测含有二(1,2-二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺)-六(正十二胺)聚乙二醇衍生物，命名为2DLPE-6LA-PEG20k。产物-20℃下密封存放。产物为同分异构体混合物，其中一个异构分子式如下所示：
Figure BDA0002540059100000171
制备例8十二脂肪链-聚乙二醇衍生物的合成(4DLPE，4正十二胺)
与实施例10相同的步骤合成，除了溶液(一)中使用39mg DLPE，和13mg正十二胺(分子量185Da，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。
产物经由200目硅胶薄层层析分离，洗脱液为氯仿/乙醇/吡啶(体积比90/9.5/0.5)，得到纯化目标产物(Rf 0.5)。电子喷雾电离质谱检测含有四(1,2-二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺)-四(正十二胺)聚乙二醇衍生物，命名为4DLPE-4LA-PEG20k。产物-20℃下密封存放，产物为同分异构混合物，其中一个异构分子式如下所示：
Figure BDA0002540059100000181
制备例9十六脂肪链-聚乙二醇衍生物的合成(8DLPE)
在10毫升圆底玻璃烧瓶中156mg DLPE，将其溶于100μL DMF中，加入44μL二异丙基乙胺得到溶液(一)。
用2毫升称量瓶称取1.35g八臂聚乙二醇琥珀酰亚胺基琥珀酸酯8ARM-PEG40k-SS(平均分子量40000Da，端基为琥珀酰亚胺基琥珀酸酯的聚乙二醇，购自北京键凯科技股份有限公司，产品编号A10009)，将其溶于400μL DMF中得到溶液(二)。
将溶液(二)加入具有溶液(一)的圆底烧瓶中混合，磁力搅拌，室温下反应8小时，加入25μL蒸馏水30分钟用于终止反应，所得混合液90℃下，真空旋蒸去除溶剂。烧瓶中残留物用10mL氯仿溶解，饱和食盐水洗涤3次，干燥后旋蒸去除氯仿得到浅黄色粗产物。粗产物经由硅胶柱层析分离，洗脱液为氯仿/乙醇/四氢呋喃(体积比80/10/10)，得到纯化目标产物(Rf 0.3)。质谱检测含有八(1,2-二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺)-聚乙二醇衍生物，命名为8DLPE-PEG40k。产物-20℃下密封存放，具体结构式如下所示：
Figure BDA0002540059100000191
实施例1聚乙二醇衍生物胶束的制备
以制备例6制备的四-(1,2-二硬脂酸-3-磷脂酰乙醇胺)-聚乙二醇衍生物，4DSPE-PEG20k为例，说明用探针稳态荧光发射法测定聚乙二醇衍生物形成的胶束的临界胶束浓度CMC和动态激光散射法测量胶束的水合直径。
将探针芘(Sigma公司产品，金标签，未经进一步纯化)用无水甲醇溶解，配制成1.0×10-4mol/L溶液备用。取5μL芘甲醇溶液，放入一系列5mL容量瓶中，通氮气将甲醇吹干，依次加入5mL不同浓度的4DSPE-PEG20k的水溶液，放入超声浴槽中分散1小时，取1mL样品溶液用于测定芘的荧光发射光谱。荧光光谱用日立HITACHI F-4500型荧光分光光度计检测，激发波长为335nm，狭缝宽度设定为激发波长为5nm，发射波长为2.5nm，检测器偏压为700V。实验温度22±1℃。根据荧光发射光谱，随着表面活性剂浓度增加，芘的第一峰与第三峰荧光强度之比(I1/I3)依次降低，当浓度增大到一定值时曲线发生突变，该处突变表明其所处环境极性的变化，即开始形成4DSPE-PEG20k胶束。因此，第一处突变点对应于4DSPE-PEG20k的临界胶束浓度(CMC)。通过该方法测得4DSPE-PEG20k的CMC值为0.36mg/mL。当4DSPE-PEG20k在水溶液中的浓度大于该值时，即可形成胶束。
配制浓度为1.0mg/mL的4DSPE-PEG20k磷酸盐缓冲溶液50mL，pH值7.4。取1mL溶液进行动态激光散射实验(英国Malvern Instruments公司的Zetasizer Nano ZS ZEN3600)，测得胶束的水合半径为10.7±4.5nm。向溶液中加入50μL乙醇，胶束的粒径数值分布无明显变化。说明在乙醇/磷酸盐缓冲液5％体积比的混合溶液中，由4DSPE-PEG20k制成的胶束可以稳定存在。
实施例2含四苯基卟啉纳米胶束的制备(摩尔比2:1，水溶液震荡法)
将50mg制备例6制备的4DSPE-PEG20k溶于50mL磷酸盐缓冲溶液中，pH值为7.4。称取2.8mg四苯基卟啉(分子量615Da)置于100mL圆底烧瓶中，结构式如附图2。向圆底烧瓶加入50mL 4DSPE-PEG20k的磷酸盐缓冲溶液。通过振荡圆底烧瓶使得四苯基卟啉完全溶解，得到红色溶液。由此制得四苯基卟啉：4DSPE-PEG20k摩尔比为2:1的纳米胶束溶液50mL。取10μL纳米胶束溶液用电喷雾法离子化质谱检测，在分子量为250-3000的范围内检测到四苯基卟啉质量峰(m/z:616.5,[M+H]+)，说明本发明制备的纳米胶束中含有四苯基卟啉。采用动态激光散射来测定本实施例制备的纳米胶束的粒径分布，如图3所示。纳米胶束水合半径峰值为16nm。
实施例3含四苯基卟啉纳米胶束的制备(摩尔比2:1，有机溶剂法)
称取50mg制备例6制备的4DSPE-PEG20k，和2.8mg四苯基卟啉(分子量615Da)一起置于100mL圆底烧瓶中，用25毫升氯仿/甲醇(体积比3:1)溶解，减压下蒸干溶剂，在圆底烧瓶壁上形成4DSPE-PEG20k与四苯基卟啉的浅紫色薄膜。向圆底烧瓶中加入50mL磷酸盐缓冲溶液，pH值7.4。通过振荡圆底烧瓶使得4DSPE-PEG20k与四苯基卟啉的透明薄膜完全溶解于磷酸盐缓冲溶液中。由此制得四苯基卟啉：4DSPE-PEG20k摩尔比为2:1的纳米胶束溶液50mL。
实施例4含四苯基卟啉固态纳米胶束的制备(透析纯化)
通过冻干法将实施例3的含四苯基卟啉的纳米胶束制成固态制剂。为此，量取10mL四苯基卟啉：4DSPE-PEG20k(摩尔比为2：1)胶束磷酸盐缓冲溶液，装入截留分子量为50000Da的透析袋中，在pH值7.4磷酸缓冲盐溶液4℃下透析24小时，得到纯化的装载四苯基卟啉的胶束溶液。纯化的含四苯基卟啉胶束溶液置于50毫升塑料管离心管，将等体积的作为冷冻干燥辅剂的葡萄糖水溶液(0.1克/升)加入到胶束溶液中，液氮急冻所得混合溶液，然后置于冻干机中，高真空(～0.1mPa)室温下(25℃)冷冻干燥48小时，得到紫色固态含有四苯基卟啉的纳米胶束粉末。该粉末在使用时加入水配置成10mL溶液，激光动态散射显示胶束的存在，纳米胶束水合半径峰值为17nm，如图4所示。含四苯基卟啉胶束冻干粉末置于-20℃冰箱中避光保存。
实施例5含四苯基卟啉固态纳米胶束的制备(凝胶色谱柱纯化)
取10mL四苯基卟啉：4DSPE-PEG20k(摩尔比为2：1)胶束磷酸盐缓冲溶液，用蛋白浓缩离心柱(GE Healthcare,Vivaspin 20MWCO 50000)浓缩体积为3mL，装载上凝胶色谱柱
Figure BDA0002540059100000211
200 10/300GL(GE Healthcare,GE28-9909-44)，分离含四苯基卟啉的脂质体。洗脱液为pH 7.4的磷酸盐缓冲液，室温下层析，流速为1mL/min。收集洗脱液，每份1mL，以280nm波长的吸光度变化检测洗脱情况，收集含四苯基卟啉的洗脱液。色谱柱洗脱结果如图5所示。合并收集的洗脱液，纯化的含四苯基卟啉胶束溶液置于50毫升塑料管离心管，将等体积的作为冷冻干燥辅剂的葡萄糖水溶液(0.1克/升)加入到胶束溶液中，液氮急冻所得混合溶液，然后置于冻干机中，高真空(～0.1mPa)室温下(25℃)冷冻干燥48小时，得到紫色固态含有四苯基卟啉的纳米胶束粉末，置于-20℃冰箱中避光保存。
实施例6含正辛烷基链多臂聚乙二醇衍生物胶束的制备
以制备例2制备的1,2-二硬脂酸-3-磷脂酰乙醇胺-1-辛硫醇-聚乙二醇衍生物，1DSPE-1SC8-PEG5k为例，使用实施例1中描述的探针稳态荧光发射法测定多脂肪链多臂聚乙二醇衍生物形成胶束的临界胶束浓度，测得1DSPE-1SC8-PEG5k的临界胶束浓度为7.6mg/mL。当1DSPE-1SC8-PEG5k在水溶液中的浓度大于该值时，即形成胶束。
实施例7含正辛烷基链多臂聚乙二醇衍生物胶束的稳定性和增溶效果
将制备例2制备的1DSPE-1SC8-PEG5k配制成浓度为10.0mg/mL的水溶液(大于CMC浓度)50mL，取1mL溶液进行动态激光散射实验，使用英国Malvern Instruments公司的Zetasizer Nano ZS ZEN3600测得胶束的水合半径为4.1±1.8nm。向溶液中加入30μL乙醇，胶束的粒径数值分布无明显变化。说明在乙醇/水3％体积比的混合溶液中，由含正辛烷基链多臂聚乙二醇衍生物1DSPE-1SC8-PEG5k制成的胶束可以稳定存在。
将探针芘(Sigma公司产品，金标签，未经进一步纯化)用无水甲醇溶解，配制成浓度为1.0×10-3mol/L的芘甲醇溶液，取5μL芘甲醇溶液，放入5mL容量瓶中用甲醇定容为5mL，以此作为芘标准溶液。其后，按照50μL的倍数取出一系列体积递增的芘甲醇溶液放入5mL容量瓶中，通氮气将甲醇吹干，依次加入5mL浓度为10.0mg/mL的1DSPE-1SC8-PEG5k的水溶液，超声分散1小时，取1mL样品溶液测定对芘增溶的紫外－可见光吸收光谱，记录各实验条件下307nm的吸光度，得到与标准溶液的吸光度的比值(A307_M/A307307_0)，通过延长线法测得胶束对芘包裹的饱和浓度为720μM。文献报道室温下芘在水中的溶解度为0.7μM，由此可见，10.0mg/mL的1DSPE-1SC8-PEG5k胶束溶液对芘增溶了1028倍。
实施例8含正十二烷基链多臂聚乙二醇衍生物胶束的制备
以制备例7制备的二(1,2-二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺)-六(正十二胺)聚乙二醇衍生物，2DLPE-6LA-PEG20k为例，使用实施例1中描述的探针稳态荧光发射法测定多脂肪链多臂聚乙二醇衍生物形成胶束的临界胶束浓度，测得2DLPE-6LA-PEG20k的临界胶束浓度为0.53mg/mL。当2DLPE-6LA-PEG20k在水溶液中的浓度大于该值时，即形成胶束。
实施例9含正十二烷基链多臂聚乙二醇衍生物胶束的稳定性和增溶效果
将制备例7制备的2DLPE-6LA-PEG20k配制成浓度为1.0mg/mL的水溶液(大于CMC浓度)50mL，按照实施例1描述的方法，取1mL溶液进行动态激光散射实验，测得胶束的水合半径为9.7±3.6nm。向溶液中加入80μL乙醇，胶束的粒径数值分布无明显变化。说明在乙醇/水8％体积比的混合溶液中，由含十二烷基链多臂聚乙二醇衍生物2DLPE-6LA-PEG20k制成的胶束可以稳定存在。
将制备例7制备的2DLPE-6LA-PEG20k配制成浓度为1.0mg/mL的水溶液(大于CMC浓度)50mL，按照实施例7描述的方法，取1mL样品溶液测定对芘增溶的紫外－可见光吸收光谱，记录各实验条件下307nm的吸光度，得到与标准溶液的吸光度的比值(A307_M/A307307_0)，通过延长线法测得胶束对芘包裹的饱和浓度为68μM。文献报道室温下芘在水中的溶解度为0.7μM，由此可见，1.0mg/mL的2DLPE-6LA-PEG20k胶束溶液对芘增溶了97倍。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种聚乙二醇衍生物形成的胶束在光动力治疗药物的包覆或递送中的用途，所述聚乙二醇衍生物包含含有脂肪链的基团和聚乙二醇基团，所述含有脂肪链的基团与聚乙二醇基团通过连接基团连接，其中所述含有脂肪链的基团中的至少一个基团是磷脂类基团。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述聚乙二醇衍生物的结构为：PEG-(L1-R1)n，其中，PEG为聚乙二醇基团，L1为二价连接基团，n为2-10之间的整数，R1相同或不同，独立地选自磷脂类基团、C4-40烃基，且其中至少一个R1为磷脂类基团。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述磷脂类基团为如下式(I)或式(II)所示结构，
Figure FDA0002540059090000011
其中，R2、R3相同或不同，独立的选自C4-40烃基，*代表连接键。
4.根据权利要求2或3所述的用途，其中，所述连接基团L1相同或不同，所述连接基团L1含有如下基团：-CO-NH-、-CO-O-、-CS-O-、-NH-CO-NH-、-CO-NH-CO-、-O-、-S-、-S-S-、-NH-、
Figure FDA0002540059090000012
叠氮-炔基环合加成连接基团、四嗪基-烯基环合加成连接基团。
5.根据权利要求2-4任一项所述的用途，其中连接基团L1为：-CO-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-、-CO-CH2-CH2-CO-NH-、-CH2-CO-NH-CH2-CH2-、-CH2-CO-NH-、-S-S-、
Figure FDA0002540059090000013
6.根据权利要求2-5任一项所述的用途，其中，PEG为线性聚乙二醇基团或多臂聚乙二醇基团，所述多臂聚乙二醇基团为三臂聚乙二醇基团、四臂聚乙二醇基团、五臂聚乙二醇基团、六臂聚乙二醇基团、七臂聚乙二醇基团、八臂聚乙二醇基团、九臂聚乙二醇基团或十臂聚乙二醇基团；所述多臂聚乙二醇基团包括聚乙二醇重复单元和支化核心结构，所述支化核心结构选自甘油、缩水甘油醚、乙二醇缩水甘油醚、季戊四醇、二缩水季戊四醇醚、三缩水季戊四醇醚、没食子酸、没食子酸醚或乙二醇没食子酸醚。
7.一种包覆体系，其中，所述包覆体系包括权利要求1-6任一项中所述的聚乙二醇衍生物形成的胶束和光动力治疗药物，所述光动力治疗药物位于胶束的内部。
8.根据权利要求7所述的包覆体系，其中，所述光动力治疗药物为在光激发下产生活性氧物质的光敏剂，所述光敏剂包括：卟啉、酞菁、竹红菌素、取代的卟啉、取代的酞菁、或取代的竹红菌素；所述取代基团例如为羧基、酯基、氨基、酰胺基、巯基、叠氮基、C4-24烷基、C4-24烯基、C4-24炔基、芳基；或者，
所述光敏剂是卟啉或酞菁与金属离子形成的配合物，所述金属离子为二价锌、二价铁、二价铜、二价钴、二价镁、二价钙、三价铁、三价铝。
9.一种制备权利要求7或8所述的包覆体系的方法，所述方法包括：将含有聚乙二醇衍生物形成的胶束的水溶液与光动力治疗药物接触，制备得到所述的包覆体系；
或者，所述方法包括：将含有聚乙二醇衍生物的有机溶液与光动力治疗药物接触，蒸干溶剂，再加入含水溶液，制备得到所述的包覆体系。
10.一种制剂，其中，所述制剂包括权利要求7或8所述的包覆体系；所述制剂是液体制剂或固体制剂。
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