CN111733138A - 一种循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法，包括如下步骤：样本纯化：将全血样本与磁珠混合孵育，磁珠与全血样本中的靶标细胞结合；磁珠孵育后的全血样本经过微流控芯片的纯化结构区去除小于分选临界半径的细胞；细胞聚焦：将步骤（1）纯化后的样本进行细胞聚焦，将大于分选临界半径的细胞聚焦到芯片中央位置，小于分选临界半径的细胞仍保持原路径；磁力分选：将步骤（2）经过细胞聚焦后的样本进行磁珠分选，磁珠结合细胞在磁力架的吸引下分流至磁珠细胞收集口进行收集，非磁珠结合细胞仍保持直线形流入非磁珠细胞收集口流出进行收集。利用本发明，背景细胞清除率高、肿瘤细胞捕获率高、肿瘤细胞成活率高且可实现高通量捕获。

Description

一种循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法
技术领域
本发明涉及一种循环肿瘤细胞分选方法，具体地说是一种利用循环肿瘤细胞高通量磁力分选的微流控芯片进行的循环肿瘤细胞分选方法。
背景技术
肿瘤是当今社会危害人类健康的主要疾病，目前治疗肿瘤的最有效方法为手术切除，但即使接受了手术切除治疗，患者仍具有一定概率肿瘤复发转移的风险，其预后不良的原因之一是癌细胞可以轻易进入并通过血液传播。在手术切除之前，这些患者的血液中可能已经存在该类游离肿瘤细胞。
1896年，澳大利亚学者 Ashworth在 1 例因癌症死亡的患者外周血中发现了类似肿瘤细胞的细胞，并由此提出了循环肿瘤细胞(circulatingtumorcell，简称为CTC)的概念。CTC是指从原发性肿瘤脱离，并进入患者淋巴系统、血液循环的部分癌细胞。这部分细胞在患者接受手术前有可能已经存在于血液循环中，手术操作有可能促使更多的CTC进入血液循环从而加速肿瘤转移。随着近年研究的深入，CTC 的应用逐渐成为抗癌治疗的热点，被人们称为“液体活检”，众多研究发现，CTC 不仅可作为早期诊断肿瘤的新型标志物，亦可以作为术后检测肿瘤复发转移的灵敏指标之一，通过提取研究患者血液中的CTC，有望为患者提供个性的治疗方案，并彻底阻断肿瘤的转移复发途径，同时也是实现CTC体外培养和药敏实验的基础。CTC的捕获具有一定难度，主要难点在于该细胞性质的特殊，CTC的含量极低，细胞本身活性差，难以高效提取并保持足够活性于下一阶段实验。
目前有多种方法来分离患者血液中的CTC，基于原理大致可分为两大类，即阳性富集法和阴性富集法，阳性富集法一般基于抗原-抗体原理，特异性捕获目标CTC，例如美国CellSearch系统，是少数由美国FDA批准的用于CTC提取的系统之一，根据使用靶向上皮细胞粘附的抗体分子（EpCAM）来特异性识别CTC。然而CellSearch系统还存在一些缺陷，例如CellSearch系统无法实现全自动分选以及智能捕获EpCAM阳性细胞，由于CTC在人体内时刻发生着改变，当其发生上皮-间质样变时，其表面EpCAM抗原消失，使依据识别该抗体的CTC提取系统失效，且该种方法提取的细胞通常活性较差，极大限制了后期实验。阴性富集法原理与阳性富集法相反，采取各种手段去除全血中的背景细胞收集剩余细胞即为CTC，例如目前广泛使用的密度梯度离心法进行CTC分离，基于血细胞之间密度的差异，去除全血中红细胞，血小板，白细胞等背景细胞得到CTC，该类方法具有快速、直接、非抗原依赖性及操作简单，可保持提取细胞活性等优点，但同时该方法操作步骤多、提取率及纯度均较低，因为血液样本中一些体积与CTC近似的背景细胞例如白细胞等残留细胞无法精准分离，将会影响后续CTC的培养及药敏实验等研究，因此存在CTC提取效率低，纯度低等缺陷。
在实验研究初期，发明人利用微流控芯片技术，采用确定性侧向位移原理，设计并制造了一种用于循环肿瘤细胞分选的微流控芯片，授权公告号为CN 208604119 U。该微流控芯片具有快速、高效、全程无需离心、细胞损害更小等优点，并在后续的临床实验中，证实了该捕获系统可成功捕获患者外周循环血液中的CTC。但是，发明人在实验研究的过程中也发现该分选设备及方法存在诸多问题。首先，该微流控芯片的主要作用是去除背景细胞，经过该微流控芯片的样本仍需要依赖现有商品化的磁力分选设备进行CTC的分选，从而使得整套系统体积偏大，实验成本偏高，转接管路繁琐；其次，现有的成熟磁珠细胞分选设备结构多为磁柱样结构，在实验中，该结构分选受流量限制，无法短时间内通过大量液体。第三，在分选过程中，由于所有细胞在无序状态下进行磁力分选，分选效率差，且磁柱中会残留一部分细胞，造成CTC的损失；第四，虽然该方法对白细胞、红细胞、血小板的平均清除率较高，但剩余背景细胞相对于CTC数量来讲仍然过大，仍需要提高提取纯度。
综上所述，如何高效、高活性、并且可全面捕获各亚型的CTC已经成为了这一领域发展的瓶颈，故亟需一种新型的CTC分选用微流控芯片及分选方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法，包括如下步骤：
（1）样本纯化：将全血样本与用于分选的磁珠混合孵育，所述磁珠与全血样本中的靶标细胞结合；磁珠孵育后的全血样本经过微流控芯片的纯化结构区去除小于分选临界半径的细胞；
（2）细胞聚焦：将步骤（1）纯化后的样本进行细胞聚焦，将大于分选临界半径的细胞聚焦到芯片中央位置，小于分选临界半径的细胞仍保持原路径；
（3）磁力分选：将步骤（2）经过细胞聚焦后的样本进行磁珠分选，磁珠结合细胞在磁力架的吸引下分流至磁珠细胞收集口进行收集，非磁珠结合细胞仍保持直线形流入非磁珠细胞收集口流出进行收集，从而完成对循环肿瘤细胞的分选。
其中较优地，所述靶标细胞为循环肿瘤血细胞或白细胞。
其中较优地，所述磁珠直径大于5μm小于10μm。
其中较优地，所述步骤（1）中，分选临界半径为5μm。
其中较优地，所述步骤（2）中，分选临界半径为10μm。
其中较优地，所述分选方法利用微流控芯片进行，所述微流控芯片包括进样部、微流控分选区和出样部，所述微流控分选区为封闭的腔式结构，所述进样部和所述出样部分别与所述微流控分选区两端连接；所述进样部包括血液样本进样口和缓冲液进液口；所述出样部包括磁珠细胞收集口（31）和非磁珠细胞收集口；其中，
所述微流控分选区包括三个互相连通的结构区，分别为纯化结构区、细胞聚焦结构区及磁珠分选结构区；所述进样部与纯化结构区首端连接，所述细胞聚焦结构区设于所述纯化结构区及磁珠分选结构区之间，所述磁珠分选结构区尾端与所述出样部连通；
所述步骤样本纯化是通过纯化结构区进行的，所述纯化结构区设有用于去除全血样本中红细胞及血小板的初滤结构，所述纯化结构区还设有废液出口；
所述步骤细胞聚焦是通过细胞聚焦结构区进行的，所述细胞聚焦结构区由两根并排设置且相互独立的聚焦分支通路构成；两根所述聚焦分支通路以所述细胞聚焦结构区的轴线为对称轴相互镜像对称设置，所述聚焦分支通路的顶面外壁为水平顶壁，该顶面的内壁设有若干线型凸棱，各凸棱平行设置且与所述对称轴呈设定角度地倾斜设置；
所述步骤（3）中的磁力分选是通过磁珠分选结构区进行的，所述磁珠分选结构区的两侧对称设有可吸引磁珠的磁铁。
其中较优地，所述各个凸棱与所述对称轴倾斜设置夹有锐角，其中所述锐角朝向于所述磁珠分选结构区。
其中较优地，所述锐角角度为60°～70°。
其中较优地，所述凸棱的条件参数为：d＜Hg≤2d、Ht＞Hg、Dob＞2d≥Lob；所述d为聚焦细胞的直径，Hg为凸棱与底面的垂直距离，Ht为凸棱的高度，Dob为凸棱之间的水平距离，Lob为凸棱的水平宽度。
其中较优地，所述聚焦分支通路的宽度大于等于400μm；长度大于等于1.5cm。
其中较优地，所述细胞聚焦结构区的中心区域对应所述非磁珠细胞收集口，所述中心区域的两侧区域对应所述磁珠细胞收集口，所述中心区域为细胞聚焦结构区的对称轴向两侧延伸至总宽度的1/2区域。
其中较优地，所述聚焦分支通路的底面为平壁；所述聚焦分支通路的两个侧壁与底面的所述平壁垂直。
其中较优地，所述聚焦分支通路首端设有第二栅状结构。
其中较优地，所述纯化结构区由两根并排设置且相互独立的纯化分支通路构成；所述两根纯化分支通路以所述纯化结构区轴线为对称轴相互镜像对称设置；
所述纯化分支通路内部设有微柱阵列，所述微柱阵列与所述纯化分支通路内侧壁之间具有间隙，该间隙形成靶标细胞通路；所述微柱阵列由若干微柱行平行排列构成，所述微柱行由若干微柱排列而成；所述微柱行首端远离所述纯化结构区轴线、尾端靠近所述纯化结构区轴线并按设定角度倾斜设置；所述微柱的径向截面为卵形，所述卵形的直径为28～33μm，所述卵形的对称直径为20～25μm；同一微柱行中，相邻两微柱的卵心距为40～45μm，所述相邻两微柱行之间的最小卵心距为60～65μm。
其中较优地，所述微柱行的倾斜设定角度为1.5～2.5°。
其中较优地，所述纯化分支通路的宽度为1～2mm，所述微柱阵列的长度是3～4cm，高度为20～30μm。
其中较优地，所述血液样本进样口和所述缓冲液进液口同时连接两根纯化分支通路的首端；所述纯化分支通路的首端内还设有栅状结构区。
其中较优地，所述两根纯化分支通路的微柱阵列尾端连接废液出口，所述微柱阵列和废液出口之间还设有栅状结构区；所述靶标细胞通路尾端与细胞聚焦结构区连通。
其中较优地，所述血液样本进样口通过分流进样管与所述纯化结构区微柱阵列首端连通，用于将血液样本通过所述分流进样管分流至所述纯化结构区两侧的微柱阵列内。
其中较优地，所述分流进样管内设有第一栅状结构。
其中较优地，所述磁珠分选结构区为锥形结构由首端至尾端宽度逐渐增加。
其中较优地，所述磁珠分选结构区的长度大于等于4cm；所述磁珠分选区的尾端宽度为首端宽度的3倍。
其中较优地，所述磁珠分选结构区两侧的磁铁的N极靠近所述磁珠分选结构区，S极远离所述磁珠分选结构区。
其中较优地，所述出样部的非磁珠细胞收集口通过非磁珠细胞收集管与所述磁珠分选结构区中央连通；所述磁珠细胞收集口通过磁珠细胞分流管与磁珠分选结构区两侧连通。
其中较优地，所述分选方法利用微流控芯片系统进行，所述微流控芯片系统上述的微流控芯片并联而成。
其中较优地，所述微流控芯片系统中血液进样口及缓冲液进样口为上下叠放双通道结构；纯化结构区的废液出样口与出样通道为上下叠放双通道结构，非磁珠标记细胞出样口和磁珠标记细胞出样口为上下叠放双通道结构。
本发明的优点及有益效果：
（1）本发明可用于多种CTC分选方式，即只需调整磁珠种类即可改变捕获CTC的方式，芯片结构无需改变。使用CTC特异性抗体包被的磁珠，则为阳性富集法特异性捕获CTC，如果使用白细胞特异性抗体包被的磁珠，则为阴性富集法捕获CTC，CTC由非磁珠细胞收集口获得。
（2）本发明利用纯化、聚焦再磁力分选的方法，可以有效去除背景细胞，血液样本进样速度为100μl/min时，对应的PBS缓冲液进液速度100μl/min，此时负性富集模式平均捕获率为85.2±1.2%，正性富集模式捕获率为85.0±1.0%。
（3）本发明中，负性富集模式与正性富集模式无显著差异，平台对白细胞、红细胞、血小板的平均清除率Rr均大于99%。
（4）本发明捕获的肿瘤细胞系细胞，使用细胞计数器观察可见细胞形态完整，胞膜无破损，将捕获细胞再次进行培养，成活率大于90%。有效解决了现有技术捕获率低及捕获的循环肿瘤细胞活性差的问题，为后续实验提供了有力的支撑。
（5）本发明可以实现高通量分选，液体流通量100ul/min时捕获效率最佳，可用进样速度最大约为500 ul/min。
（6）本发明提供的微流控芯片可作为独立功能单元，根据需要进行若干微流控芯片的并联扩展。
（7）本发明中，步骤（2）将经过纯化的无序细胞按分选临界半径大小将目的细胞聚焦与芯片流道中央，使其沿直线路径进入下一磁力分选步骤，该聚焦方法可以提高磁力分选的有效率，使磁珠附着细胞和非磁珠附着细胞分离效果更好，提高CTC纯度。同时可以减小芯片磁力分选结构区的长度和宽度。在阴性富集情况下，聚焦步骤还可以起到二次去除由步骤（1）残留的微量红细胞及血小板。
附图说明
图1为本发明中，微流控芯片的整体结构示意图；
图2为本发明中，微流控芯片的纯化结构区结构示意图；
图3为本发明中，微流控芯片的进样部结构示意图；
图4为图2中，A部的放大图；
图5为本发明中，微流控芯片的微柱结构示意图；
图6为图2中，B部的放大图；
图7为本发明中，微流控芯片的细胞聚焦结构区结构示意图；
图8为图7中，C部的放大图；
图9为本发明中，微流控芯片的细胞聚焦结构区水平顶壁凹凸结构示意图 ；
图10A～图10E为本发明中，微流控芯片的细胞聚焦结构区及磁珠分选结构区实验设计方案示意图；
图11A～图11D为本发明中，微流控芯片的细胞聚焦结构区实验设计方案结构示意图；
图12为本发明中，微流控芯片的荧光显微镜下聚焦效果图；
图13为本发明中，微流控芯片的磁珠分选结构区结构示意图；
图14为本发明中，微流控芯片的出样部结构示意图；
图15为本发明中，微流控芯片的细胞聚焦结构区的凸棱结构示意图；
图16为本发明中，微流控芯片用于循环肿瘤细胞高通量磁力分选的微流控芯片系统结构示意图；
图17为使用细胞计数器观察微流控芯片捕获的肿瘤细胞系细胞图；
图18为利用本发明微流控芯片进行循环肿瘤细胞分选的示意图。
附图标记说明：
进样部1、血液样本进样口11、缓冲液进液口12、分流进样管13、第一栅状结构131；
微流控分选区2；
纯化结构区21、纯化分支通路211、微柱阵列212、内侧壁213、靶标细胞通路214、微柱行215、微柱216、栅状结构区217、废液出口218；
细胞聚焦结构区22、聚焦分支通路221、水平顶壁222、凸棱223、第二栅状结构224；
磁珠分选结构区23、磁铁231；
出样部3、磁珠细胞收集口31、磁珠细胞分流管311、非磁珠细胞收集口32、非磁珠细胞收集管321。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
下述实施例中所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所述的“内”和“外”是相对而言的，“内”一般指更靠近芯片中央轴线一侧，“外”与其相反，为远离轴线的一侧。
实施例1
一种循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法，包括如下步骤：
（1）样本纯化：将全血样本与用于分选的磁珠混合孵育，所述磁珠与全血样本中的靶标细胞结合；磁珠孵育后的全血样本经过微流控芯片的纯化结构区去除小于分选临界半径的细胞；
（2）细胞聚焦：将步骤（1）纯化后的样本进行细胞聚焦，将大于分选临界半径的细胞聚焦到芯片中央位置，小于分选临界半径的细胞仍保持原路径；
（3）磁力分选：将步骤（2）经过细胞聚焦后的样本进行磁珠分选，磁珠结合细胞在磁力架的吸引下分流至磁珠细胞收集口进行收集，非磁珠结合细胞仍保持直线形流入非磁珠细胞收集口流出进行收集，从而完成对循环肿瘤细胞的分选。
本发明中，靶标细胞为循环肿瘤血细胞或白细胞。磁珠直径大于5μm小于10μm。所述步骤（1）中分选临界半径为5μm。所述步骤（2）中分选临界半径为10μm。
上述方法的三个步骤均是利用微流控芯片实现的，步骤（1）的样本纯化步骤是利用下述微流控芯片的纯化结构区21实现的，步骤（2）的细胞聚焦步骤是利用下述微流控芯片的细胞聚焦结构区22实现的，步骤（3）的磁力分选步骤是利用下述微流控芯片的磁珠分选结构区23实现的。
当然，其他符合本发明所述方法的微流控芯片也可以用于本发明。下述微流控芯片为本发明所述方法的最佳适用芯片。
在本发明的实施例中，微流控芯片的具体结构如下：
如图1所示，一种用于循环肿瘤细胞高通量磁力分选的微流控芯片，包括进样部1、微流控分选区2和出样部3。微流控分选区2为封闭的腔式结构，血液样本由该腔式结构流过后进行过滤和分选。因此，进样部1作为血液样本的进样通道，出样部3作为目的细胞出样通道，二者分别与微流控分选区2两端连接。在血液样本进样的同时还需同时注入缓冲液帮助血液样本的流动，因此，进样部1包括血液样本进样口11和缓冲液进液口12。出样部3用于分流不同的收获细胞，因此出样部3包括磁珠细胞收集口31和非磁珠细胞收集口32。患者全血样本经磁珠孵育后由进样部1进入芯片的微流控分选区2内，经微流控分选区2过滤及分选后磁珠细胞及非磁珠细胞分别由出样部3的磁珠细胞收集口31和非磁珠细胞收集口32流出进行收集。
下面将就本发明主要的发明点之一—微流控分选区2进行详细描述。
微流控分选区2由三个结构区构成，三个结构区分别为纯化结构区21、细胞聚焦结构区22及磁珠分选结构区23分别按照由进样部1至出样部3的方向设置，该方向也是样本的流体方向。进样部1与纯化结构区21首端连接，细胞聚焦结构区22首端与纯化结构区21尾端连通，细胞聚焦结构区22的尾端与磁珠分选结构区23首端连通，磁珠分选结构区23尾端与出样部3连通。磁珠孵育的全血样本先经过纯化结构区21纯化，纯化的目的是去除全血样本中的红细胞及血小板等小直径细胞，纯化后的样本进入细胞聚焦结构区22，在细胞聚焦结构区22中会按该通路的分选临界半径将大于分选临界半径的细胞聚焦到芯片中央位置，使其按照直线路径在中央位置流入磁珠分选结构区23，在磁珠分选结构区23，按照直线位置流入的细胞继续按直线位置流入非磁珠细胞收集管321，磁珠结合细胞在流道磁场吸引下由两侧的磁珠细胞收集管流出。
下面对本发明中，纯化结构区21的结构做进一步说明，如图2～图6所示：
纯化结构区21设有用于去除全血样本中红细胞及血小板的初滤结构。纯化结构区21由两根并排设置且相互独立的纯化分支通路211构成；两根纯化分支通路211以纯化结构区21轴线为对称轴相互镜像对称设置；
如图2和图4所示，纯化分支通路211具有底面和顶面，以及垂直于底面和顶面的两侧壁，两纯化分支通路211相邻的侧壁为内侧壁213，相对于内侧壁213的另一侧壁为外侧壁，纯化分支通路211内部设有微柱阵列212，所述微柱阵列212与纯化分支通路211内侧壁213之间具有间隙，该间隙形成靶标细胞通路214；微柱阵列212由若干微柱行215平行排列构成，微柱行215由若干微柱216排列而成；微柱216与纯化分支通路211的顶面和底面固定连接。微柱行215倾斜设置，具体倾斜设置方式为微柱行215首端远离所述纯化结构区21轴线、尾端靠近纯化结构区21轴线并按设定角度倾斜设置，倾斜角度为微柱行215与纯化结构区21轴线之间的角度，也可以理解为微柱行215与靶标细胞通路214之间的夹角。
如图5所示，微柱216的径向截面为卵形，卵形的直径B为28～33μm，卵形的对称直径A为20～25μm；同一微柱行215中相邻两微柱216的卵心距C推荐为40～45μm，所述相邻两微柱行215之间的最小卵心距D为60～65μm。上述数值范围为可行且较佳的数值范围，在本发明的一个实施例中，采用的具体数据为：卵形的直径B推荐范围为31μm，卵形的对称直径A推荐为23μm；同一微柱行215中相邻两微柱216的卵心距C为41μm，相邻两微柱行215之间的最小卵心距D为62μm。
微柱行215的倾斜设定角度为1.5～2.5°。在本发明的一个实施例中，微柱行215倾斜设定角度E为1.7°。在本发明的另一个实施例中，纯化分支通路211的宽度优选为1mm，微柱阵列212的长度是3cm，高度为20μm。根据实际需要，在本发明所述参数范围内也是可行的。
上述微柱216的结构、尺寸、微柱216之间的距离及微柱行215之间的距离决定了该微柱阵列212的分选临界半径为5μm。即大于5μm的细胞会沿阵列向靶标细胞通路214偏转，小于5μm的细胞将会沿原有方向流动，不会改变流动方向。
血液样本进样口11和缓冲液进液口12同时连接两根纯化分支通路211的首端，具体为，血液样本进样口11连接一分流进样管13，分流进样管13为分支结构，分支结构的两端连接纯化结构区21首端的两外侧，用于将血液样本分流至纯化结构区21两侧的微柱阵列212内。缓冲液进液口12与纯化结构区21中央位置连接，缓冲液可通过该进液口流入两纯化分支通路211内，纯化分支通路211的首端内还设有栅状结构区217。栅状结构区217设置的目的是保证流体按照一定方向进入芯片，同时防止异物进入芯片，因此栅状结构区为若干栅栏构成，栅栏与纯化结构区21轴线平行设置，因此可使流体按照与所述轴线平行方向流入纯化结构区21内。
如图6所示，在两根纯化分支通路211的微柱阵列212尾端连接废液出口218，所述微柱阵列212和废液出口218之间还设有栅状结构区217；靶标细胞通路214尾端与细胞聚焦结构区22连通。
如图3所示，分流进样管13内设有第一栅状结构131，第一栅状结构131和栅状结构区217设计目的是一样的，第一栅状结构131设置在分流进样管13内，主要保证样本流入过程中流体细胞的流入方向按设定方向流动，以及防止异物进入芯片。
下面对本发明中，细胞聚焦结构区22的结构做进一步说明，如图7～图9所示：
在本发明中，三个结构区域密切相关。第二结构区域—细胞聚焦结构区22主要依靠细胞等球体流经特定形状流道后路径发生偏移并最终稳定于某一位置的原理，旨在将通过前结构区域后流道杂乱的白细胞及CTC细胞聚焦于芯片流道中央，并沿直线稳定流入下一结构区域，达到聚焦效果。该部分结构设计与第三结构区域—磁珠分选结构区23设计呼应，具体呼应为：细胞聚焦结构区22的中心区域对应所述非磁珠细胞收集口32，所述中心区域的两侧区域对应所述磁珠细胞收集口31，所述中心区域为所述对称轴向两侧延伸至总宽度的1/2区域。如果取消第二结构，将会产生①由第一结构区—纯化结构区21分选后的细胞将杂乱的进入第三结构区并由最终细胞收集口流出，每个收集口得到的均为混合细胞，无法完成磁力分选。②该结构聚焦效果直接影响第三结构区的长度与宽度。聚焦效果越好，非磁珠附着细胞与磁珠附着细胞分离效果越明显，第三结构区域所需流道长度越短，所需流道宽度越窄。③在阴性富集模式下，该结构还起到二次去除由纯化结构区21残留的微量红细胞及血小板作用，因其直径小无法被该结构区域聚焦，最终由磁珠细胞收集口31流出，不会影响由非磁珠细胞收集口32流出的CTC的纯度。
细胞聚焦结构区22由两根并排设置且相互独立的聚焦分支通路221构成；两根所述聚焦分支通路221以所述细胞聚焦结构区22的轴线为对称轴相互镜像对称设置。如图9所示，聚焦分支通路221的顶面的外壁为水平顶壁222，顶面的内壁向底面方向设有若干凸出的凸棱223，凸棱为矩形片状凸棱，各凸棱之间平行设置且与细胞聚焦结构区22的对称轴之间夹有锐角α，锐角α朝向磁珠分选结构区23。α角度推荐为60°～70°。在本发明的实施例中，锐角α角度为70°。上述结构的参数直接影响细胞聚焦效果，如图15所示，本发明的一个实施例中凸棱的参数：d＜Hg≤2d、Ht＞Hg、Dob＞2d≥Lob；所述d为聚焦细胞的直径，Hg为凸棱与底面的垂直距离，Ht为凸棱的高度，Dob为凸棱之间的水平距离，Lob为凸棱的水平宽度。此处所述的水平距离为水平线距离。
在本发明的实施例中，d为10μm、Hg＝20μm、Ht＝25μm、Lob为20μm、Dob为50μm。如图8所示，聚焦分支通路221的宽度理论应大于等于400μm，即细胞聚焦结构区22整体宽度大于等于800μm。在本发明的实施例中，聚焦分支通路221的宽度为600μm，W为1200；长度理论上是越长越好。为了减小体积，本发明的实施例中采用长度为1.5cm。
上述聚焦分支通路221的结构及参数可按细胞的大小进行聚焦和分流，聚焦分支通路221的细胞分选临界直径为10μm，大于10μm的细胞将会聚焦到聚焦分支通路221的内侧，所述内侧为两聚焦分支通路221相邻一侧，其他细胞，即小于10μm的细胞仍然按原路径行驶，且最终根据细胞直径大小的不同将目的细胞稳定于固定位置流出该结构区域。聚焦分支通路221的底面为平壁，两个侧壁与底面垂直。
上述两聚焦分支通路221对称设置，可在聚焦分流细胞的同时满足样本高通量流过。在研发初期，第二个结构区域设计为细胞聚焦区域，目的是将经过纯化结构区21后的细胞按细胞直径大小将大直径细胞尽可能排成一列直线或汇集于一个区域。
如图10A～图10E所示，最初设计为模仿流式细胞仪，设置狭长流道，让细胞经过狭窄管道后喷射流出，从而使细胞形成一规则流束。最初方案设置为15μm，高度30μm，但经过实验发现，此类结构在低流量时可很好发挥作用，但随着进样速度不断提高，进样速度约为80μL/min时，狭窄管道所承受的压力明显高于其他部分而使芯片结构爆裂，无法满足分选CTC高通量的要求。而采用本发明提供的结构方案后，仅就该结构来说，最快流速可高达1ml/min而不爆裂，进样速度较前设计快约12.5倍。
如图11A～图11D所示，发明人进一步对聚焦结构进行设计，设计为顶面的外壁为水平顶壁，顶面的内壁向底面方向设有若干凸出的凸棱，凸棱为矩形片状凸棱，各凸棱之间平行设置。悬浮细胞在上述微结构诱导的压力场影响下运动，通过利用微通道中的倾斜障碍物，产生垂直于流体流动方向的横向压力梯度，使得微粒可以沿着由梯度引起的横向流偏转和排列，利用该原理，实现某一直径细胞的聚焦效果。图11A为倾斜设置的凸棱，其倾斜后夹有锐角，锐角朝向磁珠分选结构区23。图11B和图11C为鱼骨结构，鱼骨结构为两具有凸棱的顶壁对称连接设置，两顶壁具有夹角。图11B的夹角朝向磁珠分选结构区23。图11C的夹角朝向初滤通路。图11D为本发明所提供的最终保护结构。对各结构考核的要求为，当细胞流经该结构时，会向芯片中央聚集，且最终根据细胞直径大小稳定于芯片固定位置流出该结构，实现细胞聚焦作用，且聚焦效果与样本流速无关，可实现设备高通量要求，且还可间接实现红细胞及血小板的二次去除。
图11A为满足功能的最基本结构，但为了增加通量提高效率，需要将该结构扩展为镜像双通道，因此设计了图11B和图11C两种方案。但实验发现，这两种结构在进样时，在芯片中央的液体流动方式不同于单独结构，细胞更倾向于向芯片两侧聚集，无法达到将细胞聚集于芯片中央的目的。因此，发明人在图11B的基础上，将进入芯片的流体分为单独的两部分，彼此互不干涉，如图12所示，荧光显微镜下使用15um红色微球和5um绿色微球进样，轨迹图片如图12所示，可见红色微球（图中R所示）聚焦到通路中央位置，稳定流出该结构区域，绿色微球（图中G位置）按原路径流出，实验证明本发明提供的方案可以达到非常好的聚焦效果，将第一结构区纯化后杂乱的细胞按大小进行目的细胞的聚焦，优秀的聚焦效果增加了非磁珠附着细胞与磁珠附着细胞分离效果，由此可减小第三结构区域所需流道长度及所需流道宽度。优秀的聚焦效果，在阴性富集模式下，还起到了二次去除由纯化结构区21残留的微量红细胞及血小板作用，因其直径小无法被该结构区域聚焦，最终由磁珠细胞收集口31流出，不会影响由非磁珠细胞收集口32流出的CTC的纯度。
细胞聚焦结构区22首端设有第二栅状结构224，第二栅状结构224为栅柱，栅柱的径向截面为长方形或跑道形，在本发明的实施例中为跑道形，即长方形的长轴两端为圆弧端，所述长轴与所述细胞聚焦结构区22的长轴平行设置，此结构的目的是保证样本流入过程中流体细胞的流入方向按栅柱设定方向流动。
下面对本发明中，磁珠分选结构区23的结构做进一步说明，如图13所示：
第三结构区域—磁珠分选结构区23应满足两大主要要求，第一应尽可能减慢细胞流速，提供足够细胞发生偏转的时间，因此需要尽可能加宽该区域流道宽度；第二为使细胞分别进入不同出样口达到分选目的，该区域设计要保证从第二阶段流出的细胞沿原有路径继续沿直线前进，不能改变原有流道。
磁珠分选结构区23的目的在于将从前区域流出的聚焦后的细胞施加磁力后，使被磁珠附着的细胞改变流向，从而完成目标细胞的分离。此部分流道结构要求在不施加磁场的情况下，通过的细胞不能因流道原因改变流动路径，即保持直线运动，且尽可能让细胞流动速度减慢获得足够偏转时间。具体结构见图10A至图10E，发明人设计了多种流道结构以验证每种流道的效果，该部分难点在于，想要增加流道宽度，势必引起流道内流束方向变化，如何选取由狭窄流道过渡为较宽流道的设计方案成为难点。为此发明人尝试了多种设计方案: 图10A、图10C和图10E为单侧增宽型流道，区别在于图10A为缓慢增宽，图10C和图10E为迅速增宽，经过实验发现，细胞通过该两种方式进入流道，均会改变流道向增宽侧偏移，且沿流道垂直方向上混乱排列，无法达到要求，该设计方式失败。图10B和图10D为双侧增宽型流道，其中图10B为缓慢增宽，图10D为迅速增加。但通过实验发明人发现，此设计方式，只能保证由原先流道中部流入的细胞沿直线减速前进，但位于边缘的细胞仍会分别向两侧改变流动方向，最终形成大致三条流束，因此该实验方式也无法满足设计要求。
在观察以上实验数据的基础上，发明人发现流道宽度变化剧烈程度会严重影响细胞流动路径。因此，发明人采取喇叭状流道设计，流道逐渐增宽，出口处大致为入口处的3倍宽度，经实验发现，该设计可保证流入细胞，大致沿直线运动，且具有明显减速效果。此方案为最佳方案。
具体方案如图13所示，磁珠分选结构区23的形状为锥形结构，俯视图类似于喇叭形，由首端至尾端宽度逐渐增加。磁珠分选结构区23的长度理论上是越大越好，但为了在不影响效果的同时尽可能减小体积，本发明的实施例设计为4cm；磁珠分选区的尾端宽度为首端宽度的3倍。
在本发明的实施例中，磁珠分选结构区23的两侧对称设有可吸引磁珠的磁铁231。在本发明的优选实施例中，磁铁231采用钕磁铁，该材料具有磁力强，成本低，加工工艺成熟且较易获得等优点。磁铁231位于磁珠分选结构区23外部，两磁铁231均是N极靠近磁珠分选结构区23，S极远离磁珠分选结构区23。所述磁铁231为镂空的矩形磁铁框。
上述方案的优势在于：（1）在不施加磁场的情况下，使细胞保持直线运动。（2）流道具有足够长度，使受到磁力作用的细胞有足够距离从芯片中央偏移至芯片外侧。
下面对本发明中，出样部3的具体结构描述如下，如图14所示：
如图14所示，出样部3包括磁珠细胞收集口31和非磁珠细胞收集口32，磁珠细胞收集口31通过磁珠细胞分流管311与磁珠分选结构区23的两外侧连通。磁珠细胞分流管311为U型结构，两端部连接磁珠分选结构区23，此结构可以将磁铁231吸引的磁珠结合细胞通过磁珠细胞分流管311分流后由磁珠细胞收集口31流出进行收集。非磁珠细胞收集口32通过非磁珠细胞收集管321与所述磁珠分选结构区23中央连通，用于收集没有与磁珠结合的细胞。
如图16所示，针对不同的分选需求，微流控芯片还可以作为独立的功能单元，多个功能单元并联，提高分选速度，增加分选通量。为了减小体积并实现高通量，在并联结构中，血液进样口及缓冲液进样口可以设计为上下叠放双通道；纯化结构区21的废液出样口与出样通道也可以设计为上下叠放双通道结构，非磁珠标记细胞出样口和磁珠标记细胞出样口也可以设计为上下叠放双通道结构。
上面为本发明提供的微流控芯片的结构说明。利用本发明提供的微流控芯片可以实现高通量肿瘤细胞分选。
如图18所示，图中s1、s2和s3分别代表本发明方法的三个步骤。RBC为红细胞，PLT为血小板，WBC为白细胞，CTC为循环肿瘤细胞。图中a为缓冲液，b为磁珠孵育的全血样本，c为含有红细胞和血小板的废液，d为收集的磁力细胞，e为收集的非磁力细胞。
（s1）将全血样本与用于分选的磁珠混合孵育，所述磁珠与靶标细胞结合；与磁珠孵育后的全血样本通过所述血液样本进样口11进入所述芯片，通过分流进样管13分流至两纯化分支通路211的微柱阵列212内，同时缓冲液通过所述缓冲液进液口12同时进入所述纯化分支通路211内；所述样本流经微柱阵列212时，大于分选临界半径的细胞与所述微柱碰撞发生侧向位移向靶标细胞通路214一侧汇聚流入所述细胞聚焦结构区22内；小于分选临界半径的细胞与所述微柱216发生碰撞后不发生侧向位移，按原路径流过所述微柱阵列212后通过所述废液出口218流出芯片；
（s2）经过所述纯化结构区21后的样本继续流入所述细胞聚焦结构区22的两根聚焦分支通路221内，利用样本流过所述水平顶壁222的凸棱结构产生的流体压力驱动大于分选临界半径的细胞聚焦到芯片中央位置保持直线形流入所述磁珠分选结构区23内；小于分选临界半径的细胞仍保持原路径流入所述磁珠分选结构区23内；
（s3）经过所述细胞聚焦结构区22后的样本继续流入所述磁珠分选结构区23，依靠所述磁珠分选结构区23两侧的磁铁231构建的流道磁场吸引磁珠结合细胞由磁珠细胞分流管311分流至磁珠细胞收集口31进行收集，非磁珠结合细胞仍保持直线形流入非磁珠细胞收集管321，由非磁珠细胞收集口32流出进行收集，从而完成对循环肿瘤细胞的分选。
所述靶标细胞为循环肿瘤血细胞或白细胞。
本发明提供的微流控芯片可适用于多种CTC分选方式，即只需调整磁珠种类即可改变捕获CTC的方式，芯片结构无需改变。例如，使用CTC特异性抗体包被的磁珠，则该微流控芯片为阳性富集法特异性捕获CTC，且CTC由磁珠细胞收集口31获得；如果使用白细胞特异性抗体包被的磁珠，则该微流控芯片为阴性富集法捕获CTC，CTC由非磁珠磁暴收集口获得。
为了实现第三个结构区域—磁珠分选结构区23的磁力分选，选择一款合适的磁珠也十分重要，目前市场上各个品牌有不同直径的磁珠可供选择，太小的磁珠在磁场中无法提供足够的力使细胞偏转，而过大的磁珠则可能受力过强而使附着细胞破裂或堵塞流道。发明人试验了直径1μm，2μm，5μm和10μm的磁珠，最终实验结果表明，选用直径≥5μm且≤10μm的磁珠可较好达到实验目的。
本发明的具体实验数据如下：
1.实验方法：
微流控芯片的性能验证包括捕获效率及最佳进样速度实验和背景细胞的清除率实验。最后使用细胞计数器观察细胞形态，胞膜有无破损，将捕获细胞再次进行培养，计算成活率。
本部分研究选用肝癌细胞系HepG2，加入健康人体外周血中模拟CTC，为了方便计数，该类细胞经慢病毒转染使其表达绿色萤光蛋白（green fluorescent protein ，GFP）。需要的人体外周血来源于健康志愿者。所有志愿者均签写书面知情同意书，并通过伦理委员会授权，遵守赫尔辛基宣言。
（1）捕获效率及最佳进样速度实验：
全血用PBS稀释10倍以防止通道阻塞。然后将肿瘤细胞系细胞掺入稀释的血液样品中，调节浓度为1×102个/ ml，并按照说明加入直径5um的磁珠进行孵育（阴性富集模式可选用CD45磁珠及CD16磁珠联合使用，阳性富集模式可选择EpCAM磁珠）将样品和缓冲液分别以不同的流速注入样品和缓冲液入口，使用荧光显微镜计数出样口肿瘤细胞系细胞以选择最佳流速，然后发明人使用等式计算最佳回收效率R（阴性富集模式下R＝C1V1/（C1V1 + C2V2+C3V3）；阳性富集模式下R＝C2V2/（C1V1 + C2V2+ C3V3），其中C1和V1表示非磁珠标记细胞出样通道的浓度和溶液体积，C2和V2表示磁珠标记细胞出样通道的浓度和溶液体积，C3和V3表示废液流出通道的浓度和溶液体积。重复若干次。
（2）背景细胞的清除率：
为了测试平台在去除血细胞（主要是红细胞，血小板，白细胞）方面的表现，发明人将肿瘤细胞系细胞加入10倍稀释的全血中，调整其浓度1×102个细胞/ ml，并在最佳流速下进行处理。在装置稳定运行后，发明人使用公式分别计算每种背景细胞清除率Rr（阴性富集模式下：Rr＝（C4V4-C1V1）/C4V4；阳性富集模式下：Rr＝（C4V4-C2V2）/C4V4），其中C1和V1分别表示非磁珠标记细胞出样通道的细胞浓度和溶液体积，C2和V2表示磁珠标记细胞出样通道的浓度和溶液体积，C4和V4表示起始样品的浓度和溶液体积）。重复若干次。
2.统计学方法：
在本研究中，使用SPSS（版本22.0; IBM Corp.，Armonk，NY，USA）进行所有统计分析，不同进样速度条件下捕获率采用方差分析，以不同进液速度为X轴，以平均捕获率为Y轴，使用GraphPad Prism 6.0（GraphPad Software，La Jolla，CA，USA）绘制统计图；在最佳进液速度条件下掺入不同浓度捕获效率组间比较用完全随机方差分析；初始掺入不同肿瘤细胞系细胞数与平台平均捕获数行简单直线回归分析，以初始掺入肿瘤细胞系细胞数为X轴以平均捕获肿瘤细胞系细胞数为Y轴使用GraphPad Prism 6.0（GraphPad Software，La Jolla，CA，USA）图绘制简单直线方程图。背景细胞清除率实验，白细胞、血小板及红细胞的清除率采用均值±标准差描述。P<0.05被认为具有统计学意义。
3.结果：
（1）捕获效率及最佳进样速度实验：
根据多项研究证实，微流控芯片在分选细胞时，CTC富集回收效率受进样速度影响，故找到最佳进样速度并计算出最高回收率为该平台最重要的参数。
发明人首先规定不同血液样本进样速度，由慢到快依次为，20μl/min、60μl/min/、100μl/min、200μl/min、300μl/min、/500μl/min、800μl/min、1200μl/min，按照血液样本液平面和缓冲液液平面位于芯片中央的原则，在实验中发明人测的对应的缓冲液进样速度与样本液相同。
在实验中，发明人发现：随着进样速度增加，平台对HepG2-GFP细胞捕获率逐渐下降，为了平衡HepG2-GFP细胞捕获率及实验所需时间的关系，最终选取血液样本最佳进样速度为100μl/min，对应的PBS缓冲液进液速度100μl/min，此时负性富集模式平均捕获率为85.2±1.2%，正性富集模式捕获率为85.0±1.0%，为该平台最佳捕获效率。
（2）背景细胞的清除率：
发明人按照前述方法，以健康志愿者血样稀释后掺入HepG-2浓度为1×102个/ml作为测试样本，血液样本最佳进样速度为100μl/min，对应的PBS缓冲液进液速度100μl/min，在平台充满血样正常工作状态下，计算进样口和最终样本收集出口的体积和其中的血细胞浓度，检测平台对血细胞去除效果，经过计算，负性富集模式与正性富集模式无显著差异，平台对白细胞、红细胞、血小板的平均清除率Rr均大于99%。
（3）细胞活率：如图17所示，芯片捕获的肿瘤细胞系细胞，使用细胞计数器观察可见细胞形态完整，胞膜无破损，将捕获细胞再次进行培养，成活率大于90%。

Claims (26)

1.一种循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）样本纯化：将全血样本与用于分选的磁珠混合孵育，所述磁珠与全血样本中的靶标细胞结合；磁珠孵育后的全血样本经过微流控芯片的纯化结构区去除小于分选临界半径的细胞；
（2）细胞聚焦：将步骤（1）纯化后的样本进行细胞聚焦，将大于分选临界半径的细胞聚焦到芯片中央位置，小于分选临界半径的细胞仍保持原路径；
（3）磁力分选：将步骤（2）经过细胞聚焦后的样本进行磁珠分选，磁珠结合细胞在磁力架的吸引下分流至磁珠细胞收集口进行收集，非磁珠结合细胞仍保持直线形流入非磁珠细胞收集口流出进行收集，从而完成对循环肿瘤细胞的分选。
2.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法，其特征在于：
所述靶标细胞为循环肿瘤血细胞或白细胞。
3.如权利要求1的所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法，其特征在于：
所述磁珠直径大于5μm小于10μm。
4.如权利要求1的所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法，其特征在于：
所述步骤（1）中，分选临界半径为5μm。
5.如权利要求1的所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法，其特征在于：
所述步骤（2）中，分选临界半径为10μm。
6.如权利要求1至5中任意一项所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法，其特征在于利用微流控芯片进行；
所述微流控芯片包括进样部（1）、微流控分选区（2）和出样部（3），所述微流控分选区（2）为封闭的腔式结构，所述进样部（1）和所述出样部（3）分别与所述微流控分选区（2）两端连接；所述进样部（1）包括血液样本进样口（11）和缓冲液进液口（12）；所述出样部（3）包括磁珠细胞收集口（31）和非磁珠细胞收集口（32）；其特征在于：
所述微流控分选区（2）包括三个互相连通的结构区，分别为纯化结构区（21）、细胞聚焦结构区（22）及磁珠分选结构区（23）；所述进样部（1）与纯化结构区（21）首端连接，所述细胞聚焦结构区设于所述纯化结构区（21）及磁珠分选结构区之间，所述磁珠分选结构区（23）尾端与所述出样部（3）连通；
所述步骤（1）样本纯化是通过纯化结构区（21）进行的，所述纯化结构区（21）设有用于去除全血样本中红细胞及血小板的初滤结构，所述纯化结构区（21）还设有废液出口（218）；
所述步骤（2）细胞聚焦是通过细胞聚焦结构区（22）进行的，所述细胞聚焦结构区（22）由两根并排设置且相互独立的聚焦分支通路（221）构成；两根所述聚焦分支通路（221）以所述细胞聚焦结构区（22）的轴线为对称轴相互镜像对称设置，所述聚焦分支通路（221）的顶面外壁为水平顶壁（222），该顶面的内壁设有若干线型凸棱（223），各凸棱（223）平行设置且与所述对称轴呈设定角度地倾斜设置；
所述步骤（3）磁力分选是通过磁珠分选结构区（23）进行的，所述磁珠分选结构区（23）的两侧对称设有可吸引磁珠的磁铁（231）。
7.如权利要求6所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法，其特征在于：
所述各个凸棱（223）与所述对称轴倾斜设置夹有锐角，其中所述锐角朝向于所述磁珠分选结构区（23）。
8.如权利要求7所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法，其特征在于：
所述锐角角度为60°～70°。
9.如权利要求8所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法，其特征在于：
所述凸棱（223）的条件参数为：d＜Hg≤2d、Ht＞Hg、Dob＞2d≥Lob；所述d为聚焦细胞的直径，Hg为凸棱（223）与底面的垂直距离，Ht为凸棱（223）的高度，Dob为凸棱（223）之间的水平距离，Lob为凸棱（223）的水平宽度。
10.如权利要求6所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法，其特征在于：
所述聚焦分支通路（221）的宽度大于等于400μm；长度大于等于1.5cm。
11.如权利要求6所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法，其特征在于：
所述细胞聚焦结构区（22）的中心区域对应所述非磁珠细胞收集口（32），所述中心区域的两侧区域对应所述磁珠细胞收集口（31），所述中心区域为细胞聚焦结构区（22）的对称轴向两侧延伸至总宽度的1/2区域。
12.如权利要求6所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法，其特征在于：
所述聚焦分支通路（221）的底面为平壁；所述聚焦分支通路（221）的两个侧壁与底面的所述平壁垂直。
13.如权利要求6所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法，其特征在于：
所述聚焦分支通路（221）首端设有第二栅状结构（224）。
14.如权利要求6所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法，其特征在于：
所述纯化结构区（21）由两根并排设置且相互独立的纯化分支通路（211）构成；所述两根纯化分支通路（211）以所述纯化结构区（21）轴线为对称轴相互镜像对称设置；
所述纯化分支通路（211）内部设有微柱阵列（212），所述微柱阵列（212）与所述纯化分支通路（211）内侧壁（213）之间具有间隙，该间隙形成靶标细胞通路（214）；所述微柱阵列（212）由若干微柱行（215）平行排列构成，所述微柱行（215）由若干微柱（216）排列而成；所述微柱行（215）首端远离所述纯化结构区（21）轴线、尾端靠近所述纯化结构区（21）轴线并按设定角度倾斜设置；所述微柱（216）的径向截面为卵形，所述卵形的直径为28～33μm，所述卵形的对称直径为20～25μm；所述同一微柱行（215）中，相邻两微柱（216）的卵心距为40～45μm，所述相邻两微柱行（215）之间的最小卵心距为60～65μm。
15.如权利要求14所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法，其特征在于：
所述微柱行（215）的倾斜设定角度为1.5～2.5°。
16.如权利要求14所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法，其特征在于：
所述纯化分支通路（211）的宽度为1～2mm，所述微柱阵列（212）的长度是3～4cm，高度为20～30μm。
17.如权利要求14所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法，其特征在于：
所述血液样本进样口（11）和所述缓冲液进液口（12）同时连接两根纯化分支通路（211）的首端；所述纯化分支通路（211）的首端内还设有栅状结构区（217）。
18.如权利要求14所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法，其特征在于：
所述两根纯化分支通路（211）的微柱阵列（212）尾端连接废液出口（218），所述微柱阵列（212）和废液出口（218）之间还设有栅状结构区（217）；所述靶标细胞通路（214）尾端与细胞聚焦结构区（22）连通。
19.如权利要求6所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法，其特征在于：
所述血液样本进样口（11）通过分流进样管（13）与所述纯化结构区（21）微柱阵列（212）首端连通，用于将血液样本通过所述分流进样管（13）分流至所述纯化结构区（21）两侧的微柱阵列（212）内。
20.如权利要求19所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法，其特征在于：
所述分流进样管（13）内设有第一栅状结构（131）。
21.如权利要求6所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法，其特征在于：
所述磁珠分选结构区（23）为锥形结构由首端至尾端宽度逐渐增加。
22.如权利要求6所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法，其特征在于：
所述磁珠分选结构区（23）的长度大于等于4cm；所述磁珠分选区的尾端宽度为首端宽度的3倍。
23.如权利要求6所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法，其特征在于：
所述磁珠分选结构区（23）两侧的磁铁（231）的N极靠近所述磁珠分选结构区（23），S极远离所述磁珠分选结构区（23）。
24.如权利要求6所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法，其特征在于：
所述出样部（3）的非磁珠细胞收集口（32）通过非磁珠细胞收集管（321）与所述磁珠分选结构区（23）中央连通；所述磁珠细胞收集口（31）通过磁珠细胞分流管（311）与磁珠分选结构区（23）两侧连通。
25.如权利要求1至5中任意一项所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法，其特征在于利用微流控芯片系统进行，所述微流控芯片系统由权利要求6至24中任意一项所述的微流控芯片并联而成。
26.如权利要求25所述的循环肿瘤细胞高通量磁力分选方法，其特征在于：
所述微流控芯片系统中，血液进样口及缓冲液进样口为上下叠放双通道结构；纯化结构区（21）的废液出样口与出样通道为上下叠放双通道结构，非磁珠标记细胞出样口和磁珠标记细胞出样口为上下叠放双通道结构。
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