KR20210102776A - 무세포 유전물질 분리, 농축 및 증폭을 위한 다기능 미세유체장치 및 이를 이용한 검출방법 - Google Patents

무세포 유전물질 분리, 농축 및 증폭을 위한 다기능 미세유체장치 및 이를 이용한 검출방법 Download PDF

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이종민
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Abstract

본 발명은 무세포 유전물질 (cell-free DNA, cfDNA) 분리, 농축 및 증폭을 위한 다기능 미세유체장치 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 미세유체 장치는 적은 양의 시료에서도 cfDNA를 짧은 시간내에 높은 농도로 농축하고 검출할 수 있어, 의학 분야에서 환자의 질병 감염 여부를 판단하기 위한 바이오 마커로 암의 조기 진단뿐 아니라 다양한 질병 진단의 전처리 과정에 활용될 수 있다.

Description

무세포 유전물질 분리, 농축 및 증폭을 위한 다기능 미세유체장치 및 이를 이용한 검출방법 {Multifunctional microfluidic apparatus for cfDNA separation, concentration and amplification and detection method using the same}
본 발명은 무세포 유전물질 (cell-free DNA, cfDNA) 분리, 농축 및 증폭을 위한 다기능 미세유체장치 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 적은 양의 시료에서도 cfDNA를 짧은 시간내에 높은 농도로 농축하고 검출할 수 있는 미세유체장치 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것이다.
유방암 등의 암을 모니터링하기 위한 방법으로 액체 생검이 있으며, 액체 생검은 혈액의 혈장 내에 포함된 무세포 암 DNA (cell free tumor DNA)를 검출하는 방법을 통해서 실행될 수 있다. 액체 생검은 조직 생검으로는 확인할 수 없는 종양을 확인할 수도 있다는 점에서 의학적으로 많은 관심을 받고 있다.
무세포 DNA (cell-free DNA, cfDNA)는 순환하는 혈장, 소변 또는 인간의 다른 체액을 통해 검출될 수 있다. 일반적으로, cfDNA는 혈장 내에서 소낭에 둘러싸인 상태로 제공되며, 히팅과 버퍼를 이용하여 주변 온도를 약 50~65℃까지 올리고 단백질을 녹임으로써 소낭 내의 cfDNA를 추출할 수가 있다. 버퍼로는 프로테아제 (Protease) 및 화학 변성제 (Denaturing agent)을 포함하는 것을 사용할 수 있으며, 히팅 온도로는 약 50~65℃까지 올림으로써, 혈장 안의 다양한 혈장단백질들과 함께 엑소좀이라는 미세 소낭의 막을 제거할 수 있다. 미세 소낭 안에는 cfDNA가 존재하므로, 미세소낭의 막을 없애 cfDNA를 추출하고 단백질 불순물들을 제거하여 검출농도와 순도를 높일 수 있다.
분리된 cfDNA는 극성을 가지기 때문에, 특정 극성으로 몰리는 특성을 가지며, 이러한 특성을 이용해 자성 비드 (beads)와 혼합하여 cfDNA를 선택적으로 분리시킬 수 있다. 이에 따라, 자기장 내에서 자성 비드와 함께 cfDNA를 검출할 수 있다.
cfDNA를 검출하기 위해서, 종래에는 원심분리기, 오븐, 교반기 같은 실험실 단위의 기기들이 필요하였고, 그만큼 cfDNA를 검출하기까지의 시간이 길다는 단점을 가지고 있었다. 최근에는 이러한 단점을 극복하고자 미세유체장치 기술을 이용하여 cfDNA를 검출하는 기술들이 개발되고 있다. 이러한 배경에서 새로운 cfDNA 검출 방법이 등장하였고, 이는 크게 원심력을 이용한 디스크 형태의 방법과 미세유체장치를 사용한 방법으로 나눌 수 있다.
하지만, 원심력을 이용한 디스크 형태의 방법의 경우 적은 양의 샘플로도 cfDNA를 얻을 수 있으나, 원심력으로 인한 압력이 높아 적혈구가 터져버리는 현상이 발생하는 문제점이 존재하였으며, 기존의 미세유체장치를 사용하는 방법은 탈기 (Degassing) 등의 추가작업 또는 미세유체장치 외의 파워 서플라이 등의 별도의 장비가 필요하다.
이에 본 발명자들은 유입부, 배출부, 분리채널, 혼합채널을 포함하는 미세유체장치를 제작하였고, 본 발명에 따른 미세유체장치는 적혈구 손상시키지 않으면서 시료내에서 무세포 유전물질 (Cell-free DNA, cfDNA)을 별도의 장비 없이 간단하게 검출하고, 농축할 수 있는 효과가 월등히 우수한 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 미세유체장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 시료내에서 무세포 유전물질을 검출하는 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 무세포 유전물질 (cell-free DNA, cfDNA) 분리, 농축 및 증폭을 위한 다기능 미세유체장치 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 미세유체장치는 시료내의 무세포 유전물질을 높은 농도로 검출할 수 있는 효과를 나타낸다.
본 발명자들은 이에 본 발명에 따른 미세유체장치는 적혈구의 용혈(溶血) 없이 시료내에서 적혈구를 분리하는 동시에, 무세포 유전물질을 농축 및 검출할 수 있는 것을 확인하였다.
본 발명의 일 양태는, 무세포 유전물질을 포함하는 제1시료가 유입되는 제1유입부; 일정 직경을 가지는 제1분리채널섹터 및 상기 일정 직경보다 큰 직경을 가지는 제2분리채널섹터를 각각 하나 이상 포함하고, 제1시료가 유입되어 통과되는 분리채널; 유입된 제1시료 중 분리채널에 의해 분리되는 분리시료가 통과하는 배출로, 및 유입된 제1시료에서 분리시료가 분리된 정제시료가 통과하는 연결로를 포함하는 제1배출부; 자성 비드를 포함하는 제2시료가 유입되는 제2유입부; 정제시료와 제2시료가 혼합시료를 이루며 통과하며, 적어도 일 지점에서 변곡되는 혼합채널; 및 혼합채널과 연통되어 상기 자성 비드를 포함하는 유체가 배출되는 제2배출부;를 포함하는, 미세유체장치이다.
본 발명에 따른 미세유체장치에는 질병에 감염되었거나 감염되었을 것으로 예상되는 개체에서 수득한 시료가 유입될 수 있다.
시료는 질병에 감염된 환자 또는 감염되었을 것으로 예상되는 환자에서 얻어진 검체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 종양 또는 암이 발생되거나, 발생이 예상되는 환자에서 얻어진 검체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
검체는 검사 대상이 되는 개체로부터 얻어지는 생물학적 시료로, 예를 들어, 생검, 배양 세포, 타액, 피부 조직, 혈액, 분변 및 소변으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
제1분리채널섹터 및 제2분리채널섹터는, 이의 형상이 특별히 한정되는 것은 아니나, 예를 들어, 제1분리채널섹터는 선형일 수 있고, 제2분리채널섹터는 마름모 형상일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 하나 이상의 제1분리채널섹터는 동일한 축의 직선상에 나란히 배치될 수 있다.
제1분리채널섹터의 직경은 적혈구보다 클 수 있으며, 분리채널내에서 시료가 유동할 때 적혈구는 유체의 관성효과에 의해 제1분리채널섹터를 따라 정렬될 수 있다. 그리고, 정렬된 적혈구는 제1배출부의 배출로를 통해 분리될 수 있다.
한편, 적혈구에 비해 상대적으로 매우 작은 크기를 갖는 무세포 유전물질은 관성효과에 의해 채널내에서 정렬되기 어렵고, 채널내에 무작위하게 분포될 수 있으며, 이에 따라 적혈구와 분리될 수 있다.
이와 같이, 분리채널은 제1분리채널섹터 및 제2분리채널섹터을 통해 분리채널 내부로 유입된 시료의 적혈구를 용혈현상없이 선별적으로 분리할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 분리채널과 제1배출부 사이에 연결부가 배치될 수 있고, 연결부의 직경은 제1배출부를 향할수록 증가할 수 있다.
제1배출부의 배출로는 정렬된 적혈구를 배출구로 운반할 수 있는 구조면 이를 한정하지 않으나, 예를 들어, 제1분리채널섹터가 형성하는 축의 직선상에 나란히 배치될 수 있다.
제1분리채널섹터를 따라 정렬된 적혈구는 연결부의 중심을 따라 이동하여 배출로를 통해 배출구로 운반되며, 정렬되지 않고 무질서하게 존재하는 무세포 유전물질은 연결로를 통해 제2유입부 및 혼합채널을 향해 운반될 수 있다.
본 발명에 따른 미세유체장치의 혼합채널은, 적어도 일 지점에서 변곡될 수 있다. 그리고, 혼합채널은 변곡되는 지점을 통해 혼합시료의 직선 흐름을 방해하고, 인위적인 흐름을 형성하여 혼합시료 내의 무세포 유전물질과 자성 비드의 충돌을 유도하여 무세포 유전물질과 자성 비드의 결합을 보다 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 혼합채널은 혼합시료의 흐름방향을 변곡시키는 하나 이상의 변곡부를 포함하는 제1혼합영역을 하나 이상 포함할 수 있다.
변곡부는 변곡부의 벽면이 직각, 예각, 또는 둔각을 형성하도록 배치되는 변곡부일 수 있고, 또는 곡선형 형상인 변곡부일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 제1혼합영역은 변곡부를 통해 혼합시료의 흐름방향을 변곡시키고, 혼합시료의 흐름방향이 변곡됨에 따라 혼합시료 내의 무세포 유전물질과 자성 비드의 충돌 빈도 및 횟수가 증가할 수 있다. 그리고, 상기 과정에 의해 자성 비드와 결합하는 무세포 유전물질 비율이 높아질 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 제1혼합영역은 미세구조체를 포함할 수 있고, 미세구조체는 혼합시료의 흐름방향을 하나 이상의 갈래로 분할하도록 혼합시료가 통과하는 경로에 배치되는 것일 수 있다.
미세구조체는 혼합시료의 흐름방향을 하나 이상의 갈래로 분할하거나 흐름을 방해하는 형상이면 이를 한정하지 않으나, 예를 들어, 삼각형 형상, 물방울 형상 또는 일면이 곡선형인 삼각형 형상일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 변곡부 중 하나 이상은 곡선형일 수 있다.
곡선형 변곡부는 미세 구조체와 함께 직선방향의 혼합시료의 흐름방향을 곡선형으로 제한할 수 있다. 이에 따라 직선방향으로 유동하던 혼합시료가 변곡부를 통해 곡선으로 유동하게 되면서 혼합이 일어나 혼합시료 내의 무세포 유전물질과 자성 비드의 충돌 빈도 및 횟수가 증가될 수 있다. 또한, 곡선으로 유동하는 혼합시료의 흐름은 미세구조체 및 곡선형 변곡부를 통과한 후, 미세구조체에 의해 분할된 다른 혼합시료의 흐름과 합류하면서 추가적인 혼합이 발생할 수 있고, 이에 따라 자성 비드와 결합하는 무세포 유전물질의 양이 더욱 증가할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 제1혼합영역은 서로 연결되는 복수의 단위구조를 포함하고, 단위구조는, 제1곡선변곡부, 제2곡선변곡부, 제1변곡부, 제2변곡부를 포함하며, 제1곡선변곡부 및 제1변곡부 사이에는 제1미세구조체가 배치되고, 제2곡선변곡부 및 제2변곡부 사이에는 제2미세구조체가 배치될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 혼합채널은 제1혼합영역과 연통되는 제2혼합영역을 하나 이상 더 포함하고, 제2혼합영역의 일부는 삼각형 형상일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 제1혼합영역 및 제2혼합영역은 교번적으로 배치될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 미세유체장치는 자성 수집부를 포함할 수 있고, 자성 수집부는 제2배출부와 연통될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 제2배출부는 자성 수집부를 포함할 수 있다.
자성 수집부는 제2배출부 내에, 또는 제2배출부에 인접하게 배치될 수 있으며, 자성을 이용하여 혼합시료 내에서 자성 비드를 포집할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는, 무세포 유전물질을 포함하는 제1시료를 분리채널에 공급하여 제1시료에서 적혈구를 분리하는 분리 단계; 적혈구가 분리된 유체를 자성비드를 포함하는 제2시료와 혼합하여 혼합시료를 형성하고, 적어도 일 지점에서 변곡되는 혼합채널을 통과시켜 유전물질과 자성 비드를 혼합하는 혼합 단계; 및 혼합채널의 출구에서 자성 수집부를 통해 혼합 시료로부터 자성비드를 수집하는 수집단계;를 포함하고, 분리채널은 일정 직경을 가지는 제1분리채널섹터, 및 일정 직경보다 큰 직경을 가지는 제2분리채널섹터를 각각 하나 이상 포함하는, 검출방법이다.
본 발명에 따른 분리단계에서, 통과되는 제1시료의 유속은 50 μl/min, 50 내지 100 μl/min, 100 내지 150 μl/min, 또는 150 μl/min 이상일 수 있고, 예를 들어, 분리채널을 통과하는 제1시료내의 적혈구 용혈현상을 고려하여 50 μl/min 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 제1시료는 폴리에틸렌 옥사이드 (polyethylene oxide; PEO)를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 제1시료는 폴리에틸렌 옥사이드를 500 내지 750 ppm, 750 내지 1000 ppm 1000 내지 1250 ppm, 1250 내지 1500 ppm, 1500 내지 1750 ppm, 1750 내지 2000 ppm, 1750 ppm 내지 2250 ppm일 수 있고, 예를 들어, 2000 ppm일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 혼합단계에서, 통과되는 혼합시료의 유속은 25 내지 50 μl/min, 50 내지 100 μl/min, 100 내지 150 μl/min, 또는 150 μl/min 이상일 수 있고, 예를 들어, 혼합채널 내에서의 무세포 유전물질과 자성 비드의 혼합율을 고려하여 25 μl/min 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 일 구현예에서, 혼합채널은, 혼합시료의 흐름방향을 변곡시키는 하나 이상의 변곡부를 포함하는 제1혼합영역;을 하나 이상 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 하나 이상의 제1분리채널섹터는 동일한 축의 직선상에 나란히 배치될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 제1혼합영역은 미세구조체를 포함하고, 미세구조체는 혼합시료의 흐름방향을 하나 이상의 갈래로 분할하도록 혼합시료가 통과하는 경로에 배치될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 변곡부 중 하나 이상은 곡선형일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 혼합채널은, 제1혼합영역과 연통되는 제2혼합영역을 하나 이상 더 포함하고, 제2혼합영역의 일부는 삼각형 형상일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 제1혼합영역 및 제2혼합영역은 교번적으로 배치될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 제2분리채널섹터는 마름모 형상일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 분리채널과 제1배출부 사이에 연결부가 배치되고, 연결부의 직경은 제1배출부를 향할수록 증가할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 미세유체장치는 자성 수집부를 포함할 수 있고, 자성 수집부는 제2배출부와 연통될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 제2배출부는 자성 수집부를 포함할 수 있다.
본 발명은 무세포 유전물질 (cell-free DNA, cfDNA) 분리, 농축 및 증폭을 위한 다기능 미세유체장치 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 미세유체 장치는 적은 양의 시료에서도 cfDNA를 짧은 시간내에 높은 농도로 농축하고 검출할 수 있어, 의학 분야에서 환자의 질병 감염 여부를 판단하기 위한 바이오 마커로 암의 조기 진단뿐 아니라 다양한 질병 진단의 전처리 과정에 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체장치의 상면도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체장치의 분리채널을 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체장치의 분리채널 및 제1배출부를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체장치의 제1혼합영역을 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 제1혼합영역의 단위구조를 세부적으로 설명하기 위한 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체장치의 제2혼합영역을 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체장치가 분리채널을 통해 적혈구를 모사하는 폴리머 비드를 채널 중심을 따라 정렬하는 실험결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 일 실시예에 따른 미세유체장치에 유입된 시료의 폴리머비드가 유속 및 폴리에틸렌 옥사이드 (Polyethylene oxide; PEO)의 농도에 따라 분리채널 내부에서 정렬되는 정도를 실험한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체장치로 유입된 시료의 유속 및 폴리에틸렌 옥사이드 농도에 따른 분리 효율을 나타낸 그래프이다.
도 10은 시료의 유속 및 폴리에틸렌 옥사이드의 농도에 따라 일 실시예에 따른 미세유체장치의 혼합영역에서 폴리머 비드와 무세포 유전물질이 원할히 혼합된 결과 (우측)와 원할히 혼합되지 못한 결과 (좌측)를 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체장치로 유입된 시료의 유속 및 폴리에틸렌 옥사이드 농도에 따른 혼합효율을 나타낸 그래프이다.
도 12는 일 실시예에 따른 미세유체장치의 혼합채널의 각 부분에서 미세유체장치 내로 유입된 시료가 혼합되는 정도를 나타내는 도면이다.
도 13은 형광분석 장비를 통해 일 실시예에 따른 미세유체장치에 유입된 DNA 샘플의 미세유체장치 유입 시의 DNA 농도와 미세유체장치 통과 후 DNA 농도를 나타낸 그래프이다.
도 14는, 일 실시예에 따른 미세유체장치를 통해 분리된 시료의 DNA 양을 PCR로 측정한 도면이다.
도 15는, 일 실시예에 따른 미세유체장치를 통해 분리된 시료의 DNA를 PCR 및 Geldoc을 통해 확인한 도면이다.
이하 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명하지만, 본 발명이 실시예에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 참고로, 본 설명에서 동일한 번호는 실질적으로 동일한 요소를 지칭하며, 상기 규칙 하에서 다른 도면에 기재된 내용은 인용하여 설명할 수 있고, 당업자에게 자명하다고 판단되거나 반복되는 내용은 생략될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체장치(100)의 상면도이다.
도 1을 참조하면, 일 실시예에 따른 미세유체장치(100)는 제1유입부(110), 분리채널(120), 제1배출부(130), 제2유입부(140), 혼합채널(150) 및 제2배출부(160)를 포함할 수 있다.
제1유입부(110)는 무세포 유전물질, 즉 cfDNA를 포함하는 제1시료가 유입되는 곳으로, 외부의 소스와 연결되거나 동일 미세유체장치 내에서 히팅과 버퍼를 통과한 상태의 혈장과 바로 연결될 수 있다.
또한, 도 1에는 제1유입부(110)가 원형으로 나타나 있으나, 시료가 유입될 수 있는 형상이면, 이에 한정되지 않고 자유롭게 설계될 수 있다.
분리채널(120)은 제1유입부(110)와 제1배출부(130)의 사이에 배치될 수 있으며, 제1유입부(110)와 연통하여 제1유입부(110)로 유입된 제1시료가 분리채널(120)을 통과할 수 있고, 제1배출부(130)와도 연통되어 분리채널(120)을 통과한 제1시료가 제1배출부(130)를 향해 운반될 수 있다.
제1배출부(130)는 제1유입부(110)를 통해 유입된 제1시료 중 분리채널(120)에 의해 분리되는 분리시료가 통과하는 배출로(132), 제1유입부(110)를 통해 유입된 제1시료에서 분리시료가 분리된 정제시료가 통과하는 연결로(132) 및 분리시료가 미세유체장치(100)의 외부로 배출되는 제1분리구(131)를 포함할 수 있다.
제2유입부(140)는 미세관(180)을 통해 제1배출부(130)와 연통될 수 있고, 제2유입부(140)를 통해 자성 비드를 포함하는 제2시료가 미세유체장치(100)내로 유입될 수 있다. 제2유입부(140)는 혼합채널(150)과 연통될 수 있고, 제2유입부(140)에 배치된 채널을 통하여 정제시료와 제2시료를 모두 혼합채널(150)로 안내할 수 있다.
혼합채널(150)은 정제시료와 제2시료가 혼합시료를 이루며 통과할 수 있고, 적어도 일 지점에서 변곡될 수 있다. 혼합채널(150)의 변곡되는 지점에 의해 혼합채널(150) 내를 유동하는 혼합시료의 흐름방향이 직선 방향에서 다른 방향으로 변화하게 되어 혼합시료의 자성 비드와 무세포 유전물질이 충돌이 유도되고, 이에 따라, 자성 비드에 결합하는 무세포 유전물질의 양이 증가될 수 있다.
혼합채널(150)은 혼합시료의 흐름방향을 변곡시키는 하나 이상의 변곡부를 포함하는 제1혼합영역(151)을 포함할 수 있다. 그리고, 혼합채널(150)은 제1혼합영역(151)과 연통되는 제2혼합영역(152)을 하나 이상 포함할 수 있다.
제1혼합영역(151) 및 제2혼합영역(152)은 도 1에 도시된 것과 같이 서로 평행하게 배치될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 예를 들어, 동일한 축을 이루며 일렬로 배치될 수 있다.
제1혼합영역(151) 및 제2혼합영역(152)은 교번적으로 배치될 수 있다. 예를 들어, 도 1에 도시된 바와 같이 혼합시료가 제1혼합영역(151)을 통과하고 제2혼합(152)을 통과하게끔 제1혼합영역(151)-제2혼합영역(152)-제1혼합영역(151)의 순서로 배치될 수 있다.
제2배출부(160)는 자성수집부(미도시)와 연통되거나 자성수집부를 포함할 수 있으며, 혼합시료 중 수집되지 않은 나머지를 외부로 배출하거나 특정 저장소에 수집되도록 할 수 있다.
자성 수집부에는 자기장이 형성되어 자성 비드를 수집할 수 있다. 자성 수집부에는 자기장을 형성하기 위해 영구 자석 또는 전자석 등이 배치될 수 있다. 자성 수집부에는 혼합채널(150)을 통해 무세포 유전물질이 결합된 자성 비드가 제공될 수 있고, 자성 비드를 이용하여 수집된 무세포 유전물질을 분석하여 암의 진단 등 다양한 질병 진단의 전처리 과정에 활용할 수 있다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체장치의 분리채널을 나타낸 도면이고, 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체장치의 분리채널 및 제1배출부를 나타낸 도면이다.
도 2 및 도 3을 참조하면, 분리채널(120)은 일정 직경을 가지는 제1분리채널섹터(121) 및 일정 직경보다 큰 직경을 가지는 제2분리채널섹터(122)를 각각 하나 이상 포함하고, 제1유입부(110)에서 유입되는 제1시료가 유입되어 통과될 수 있다.
제1분리채널섹터(121)는 선형으로 형성될 수 있고, 제1분리채널섹터(122) 내를 통과하는 적혈구의 직경보다 큰 직경을 갖는 것일 수 있다.
또한, 하나 이상의 제1분리채널섹터(121)는 도 1 및 도 2에 도시된 것과 같이, 동일한 축의 직선상에 나란히 위치할 수 있다.
제2분리채널섹터(122)는 제1분리섹터(121)와 연통될 수 있고, 제1분리채널섹터(121)의 모든 직경보다 큰 직경을 가지면서 마름모 형상일 수 있다.
제1분리채널섹터(121)와 제2분리채널섹터(122)는 교번적으로 배치될 수 있다.
분리채널내(120)로 유입된 제1시료의 적혈구는 제1분리채널섹터(121)에서 제1시료의 유속 및 이로 인한 유체내 관성효과 (Inertial effect) 즉, 관성집중 (Inertial focusing) 및 관성정렬 (Inertial ordering) 현상이 발생하여 적혈구의 대부분은 선형으로 정렬되면서 제1분리채널섹터(121)를 통과할 수 있다.
이후, 적혈구가 제2분리채널섹터(122) 내를 유동할 때, 정렬된 적혈구는 관성효과에 의해 대부분이 제2분리채널섹터(122)의 중앙부에 위치하면서 통과하게 된다. 그리고, 적혈구는 다시 제1분리채널섹터(121)를 통과하게 되고, 제1분리채널섹터(121)를 통과하면서 제1분리채널섹터의 중심을 따른 정렬이 강화된다. 이때, 제1분리채널섹터(121)에 의한 반복적인 적혈구 정렬에 의해 제1분리채널섹터(121)를 거칠 수록 더 높은 비율의 적혈구가 분리채널의 중심부(123)에 위치하여 유동하게 된다. 그리고, 상기 과정이 반복됨에 따라, 도 7에 도시된 것과 같이 제1배출부(130)에 근접할수록 분리채널의 중심부(123)를 따라 유동하는 적혈구의 비율이 증가하게 된다.
한편, 무세포 유전물질은 적혈구에 비해 그 크기가 매우 작으며, 제1분리채널섹터(121)의 직경은 무세포유전물질의 크기에 비해 상대적으로 매우 크기 때문에 적혈구와 같은 관성효과가 발생하지 않아 채널내 정렬이 발생하지 않고 무질서하게 위치하게 된다. 따라서, 제1배출부(130)와 인접한 분리채널의 중심부(123)에는 적혈구의 비율이 중심부 이외의 부분에 비해 매우 높은데 반하여, 무세포 유전물질은 분리채널 전체에 산재해 있으며 특정 부분에 집중되어 존재하지 않는다. 따라서, 정렬된 적혈구의 대부분은 배출로(132)를 향하게 되고 배출로를 통과하는 시료의 적혈구 비율은 연결로(133)를 통과하는 시료의 적혈구 비율에 비해 매우 높으며, 이에 따라 배출구(131)에서 적혈구를 제1시료로부터 선별적으로 분리할 수 있다.
그리고, 도 3에 도시된 것과 같이 분리채널의 중심부(123)를 따라 정렬된 적혈구는 그대로 연결부(170)의 중심부를 통과하고, 배출로(132)를 거쳐 배출구(131)로 운반될 수 있다. 그리고, 운반된 적혈구는 배출구(131)에서 제1시료로부터 분리될 수 있다. 이때, 연결부(170)의 직경(폭)은 제1배출부(130)를 향할 수록 증가함에 따라 정렬된 적혈구를 포함하는 분리시료를 배출로(132) 및 배출구(131)로 운반하면서도, 분리시료가 분리된 정제시료를 가장자리를 통해 연결로(133)로 원할하게 운반하는 것이 가능하다.
이처럼 분리채널(120)은 유체의 관성효과에 의해 적혈구를 정렬시켜 분리하므로 적혈구 분리효율이 우수하면서도, 원심력 또는 구심력 등의 필요이상의 외력이 적혈구에 가해져 적혈구가 용혈되어 미세유체장치에 유입된 시료가 오염되는 것을 방지할 수 있다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체장치의 제1혼합영역을 나타낸 도면이고, 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 제1혼합영역의 단위구조를 세부적으로 설명하기 위한 도면이다.
도 4 내지 도 5를 참조하면 제1혼합영역(151)은 혼합시료의 흐름방향을 변곡시키는 하나 이상의 변곡부(153a, 153b, 153c, 153d)를 포함할 수 있다.
그리고, 변곡부 (153a, 153b, 153c, 153d) 중 하나 이상은 곡선형일 수 있다.
또한, 제1혼합영역(151)은 미세구조체(154, 154a, 154b)를 하나 이상 포함할 수 있고, 미세구조체(154, 154a, 154b)는 혼합시료의 흐름방향을 하나 이상의 갈래로 분할하도록 혼합시료가 통과하는 경로에 배치될 수 있다.
예를 들어, 도 5에 도시된 바와 같이, 제1혼합영역(151)은 서로 연결되는 복수의 단위구조(152)를 포함할 수 있고, 단위구조(152)는 제1곡선변곡부(153a), 제2곡선변곡부(153b), 제1변곡부(153c), 제2변곡부(153d)를 포함할 수 있고, 제1곡선변곡부(153a) 및 제1변곡부(153c)사이에는 제1미세구조체(154a)가 배치되고, 제2곡선변곡부(153b) 및 제2변곡부(153d)사이에는 제2미세구조체(154b)가 배치될 수 있다. 그리고, 제1변곡부(153c) 및 제2변곡부(153d)는 필요에 따라 벽면이 직각, 예각, 또는 둔각을 형성하도록 배치될 수 있다.
제1혼합영역(151)은 변곡부(153a, 153b, 153c, 153d) 및 미세구조체(154a, 154b)를 통해 이를 통과하는 혼합시료 내의 자성 비드와 무세포 유전물질의 충돌 빈도 및 횟수를 증가시켜, 무세포 유전물질과 자성 비드의 결합 비율을 상승시킬 수 있다.
구체적으로, 제1혼합영역(151)을 통해 유동하는 혼합시료는 단위구조(152)의 변곡부(153a, 153b, 153c, 153d)를 통과하게 된다. 이때, 유동하는 혼합시료의 일부는 제1곡선변곡부(153a) 및 제1변곡부(153c)사이에 배치된 제1미세구조체(154a)에 충돌하면서 혼합시료내의 자성 비드와 무세포 유전물질의 이동 방향이 변하고 이에 의해 자성 비드-무세포 유전물질의 결합이 촉진될 수 있다. 또한, 혼합시료는 제1미세구조체(154a)에 의해 흐름방향이 제한되어 하나 이상의 갈래로 분할되어 유동할 수 있다. 예를 들어, 도 5에 도시된 것과 같이 혼합시료는 제1미세구조체(154a)의 혼합시료가 유입되는 측에서 두 갈래로 분할되어 제1미세구조체(154a), 제1곡선변곡부(153a), 제1변곡부(153c)를 통과할 수 있다. 여기서, 제1미세구조체-제1곡선변곡부 방향(10)으로 유동하는 혼합시료는 제1미세구조체(154a) 및 제1곡선변곡부(153a)에 의해 본래의 흐름방향이 변경되어 곡선으로 유동하게 되고, 흐름방향이 변경되는 과정에서 혼합이 발생할 수 있다. 마찬가지로, 제1미세구조체-제1변곡부 방향(20)으로 유동하는 혼합시료도 제1미세구조체(154a) 및 제1변곡부(153c)에 의해 본래의 흐름방향이 변경되면서 혼합이 발생할 수 있다. 그리고, 제1미세구조체-제1곡선변곡부 방향(10)으로 유동한 혼합시료는 제1미세구조체-제1변곡부 방향(20)으로 유동한 혼합시료와 제1미세구조체(154a)의 후방에서 합류하면서 추가적인 혼합이 발생하게 된다. 그리고, 전술한 과정이 제2미세구조체(154b), 제2곡선변곡부(154b) 및 제2변곡부(154d) 근처에서도 동일하게 반복됨에 따라, 자성 비드와 무세포 유전물질의 결합이 촉진되고, 자성 비드에 결합된 무세포 유전물질의 양이 증가할 수 있다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체장치의 제2혼합영역을 나타낸 도면이다.
도 1 및 도 6을 참조하면, 제2혼합영역(155)은 제1혼합영역(151)과 연통될 수 있고, 제2혼합영역(155)의 일부는 삼각형 형상 또는 톱날형일 수 있다.
제2혼합영역(155)은 제1혼합영역(151)에서 결합되지 않은 무세포 유전물질과 자성 비드를 추가적으로 결합시킬 수 있다. 그리고, 제2혼합영역(155)의 구조 중 일부가 삼각형 형상 또는 톱날형일 수 있어, 제2혼합영역(155)에는 상대적으로 폭이 좁은 영역과 폭이 넓은 영역이 존재할 수 있다. 이에 따라, 제2혼합영역(155)은 혼합시료를 전체적으로는 직선 방향으로 통과시키나, 혼합시료가 통과하는 영역의 폭의 차이로 인해, 폭이 넓어지는 부분에서는 항력에 의해 유체내 입자인 자성 비드와 무세포 물질이 가속되어 와동을 형성할 수 있다. 따라서, 제2혼합영역(155)을 통과하는 시료의 속도가 부분적으로 변화하고 와동에 의해 혼합시료가 추가적인 혼합될 수 있다.
이와 같이, 상술한 과정에 따라 혼합채널(150)에서 무세포 유전물질과 자성 비드의 결합이 증가하게 됨에 따라, 제2배출부(160)를 통해 검출되는 자성비드와 결합한 무세포 유전물질이 증가할 수 있으며, 일 실시예에 따른 미세유체장치(100)에 유입되는 제1시료에 비해 미세유체장치(100)를 통해 검출되는 시료의 무세포 유전물질 농도가 증가될 수 있다.
실시예 1: 미세유체장치의 분리효율 평가
혈액을 모사한 샘플용액과 500ppm, 1000ppm, 2000ppm 농도의 Polyethylene oxide (PEO)를 각각 혼합하여 시린지 펌프 (Syringe pump)를 이용해 미세유체장치의 제1유입부에 주입하였다. 이때, 샘플용액은 실제 혈액 내의 가장 작은 적혈구 입자 크기를 고려하여 7μm의 폴리머 비드를 포함하는 샘플을 사용하였다.
그리고, 주입된 유체의 유속을 각각 50μl/min, 100μl/min, 150μl/min으로 설정하여, 분리채널내에서 유체 이동시, 각 조건에 따른 입자들의 행동양상을 관찰하였다.
실험결과, 도 7에서 확인할 수 있듯이, 유체가 미세유체장치의 분리채널을 통과함에 따라 7μm의 폴리머 비드들은 채널 중심으로 정렬이 발생하는 것을 확인하였다. 그리고, 이때 크기가 작은 cfDNA는 채널내 정렬이 발생하지 않고 무작위하게 분포되어 있을 것으로 예측된다. 따라서, 상기 실험결과로부터 본 발명에 따른 미세유체장치는 분리영역의 특징적인 구조만을 통해 시료내의 적혈구를 용혈현상 없이 정밀하게 분리시킬 수 있을 것이 예상된다.
또한, 도 8 내지 도 9에서 확인할 수 있듯이, PEO 용액의 농도가 높을수록, 그리고, 유속이 빠를수록 분리효율이 증가하는 것을 확인하였다. 다만, 혈액내의 적혈구의 용혈현상을 고려하면 2000ppm 농도 이상의 PEO 용액을 사용하여 50μl/min 유속으로 분리영역을 통과시키는 것이 용혈현상 없이 우수한 정밀도로 시료내에서 적혈구를 분리할 수 있을 것으로 생각된다.
실시예 2: 미세유체장치의 혼합효율 평가
미세유체장치의 제2유입부에 바인딩 버퍼 (Binding buffer), 자성입자를 모사하기 위한 2μm의 형광폴리머 비드와 500ppm, 1000ppm, 2000ppm 각 농도의 PEO용액를 주입시키고, 주입된 유체를 미세유체장치의 혼합채널에 통과시켰다.
그리고, 주입된 유체의 유속을 각각 25μl/min, 50μl/min, 100μl/min, 150μl/min으로 설정하여, 혼합채널내에서 각 PEO 용액의 농도 및 전체 유체의 유속에 따른 혼합효율을 측정하였고, 실험결과, PEO 용액의 농도 및 유속이 증가할수록 혼합 효율이 증가함을 확인하였으며, 2000ppm 농도의 PEO 용액을 사용하면서 25 μl/min의 유속으로 혼합채널내에서 유체를 유동시킬 때의 혼합효율이 매우 우수하였다.
이후, 자성입자, 샘플용액, 2000ppm 농도의 PEO 용액을 혼합채널에 주입하고, 25μl/min 유속에서 주입한 유체의 혼합채널 통과에 따른 혼합양상을 확인하였다.
실험결과, 도 12에서 확인할 수 있듯이, 미세유체장치의 혼합채널을 통과할수록 혼합채널의 구조에 의해 샘플용액과 자성입자가 원할하게 혼합되는 것을 확인하였다.
실시예 3: 미세유체장치의 DNA 검출 및 농축능 평가
본 발명에 따른 미세유체장치의 cfDNA 검출 및 증폭효과를 평가하기 위해 DNA 샘플용액, 자성입자, PEO 용액을 미세유체장치에 주입하고, LS-55 형광분석 장비 (PerkinElmer, USA)를 통해 미세유체장치 주입 전과 후의 형광 강도를 분석하였다.
이후, 50ng/ml 및 200ng/ml 농도의 DNA 샘플용액을, 자성입자, PEO 용액과 함께 미세유체장치에 주입하고, 검출한 DNA를 PCR 증폭 후 Geldoc을 통해 DNA의 검출여부 및 증폭여부를 확인하였다.
형광 강도 분석결과, 도 13에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따른 미세유체장치를 통해 약 2.9배 이상 DNA를 농축할 수 있음을 확인하였다. 또한, 도 14 내지 도 15에서 확인할 수 있듯이 50ng/ml 및 200ng/ml 농도의 DNA시료에서 모두 DNA를 검출할 수 있었으며, 이에 따라 본 발명에 따른 미세유체장치는 DNA를 농축시키는 효과가 우수함을 확인하였다.

Claims (14)

  1. 무세포 유전물질을 포함하는 제1시료가 유입되는 제1유입부;
    일정 직경을 가지는 제1분리채널섹터 및 상기 일정 직경보다 큰 직경을 가지는 제2분리채널섹터를 각각 하나 이상 포함하고, 상기 제1시료가 유입되어 통과되는 분리채널;
    상기 유입된 제1시료 중 상기 분리채널을 통해 분리되는 분리시료가 통과하는 배출로, 및 상기 유입된 제1시료에서 상기 분리시료가 분리된 정제시료가 통과하는 연결로를 포함하는 제1배출부;
    자성 비드를 포함하는 제2시료가 유입되는 제2유입부;
    상기 정제시료와 상기 제2시료가 혼합시료를 이루며 통과하며, 적어도 일 지점에서 변곡되는 혼합채널; 및
    상기 혼합채널과 연통되어 상기 자성 비드를 포함하는 유체가 배출되는 제2배출부;
    를 포함하는, 미세유체장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 혼합채널은, 상기 혼합시료의 흐름방향을 변곡시키는 하나 이상의 변곡부를 포함하는 제1혼합영역;
    을 하나 이상 포함하는, 미세유체장치.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제1혼합영역은 미세구조체를 포함하고,
    상기 미세구조체는 상기 혼합시료의 흐름방향을 하나 이상의 갈래로 분할하도록 상기 혼합시료가 통과하는 경로에 배치되는 것인, 미세유체장치.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 변곡부 중 하나 이상은 곡선형인 것인, 미세유체장치.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 혼합채널은, 상기 제1혼합영역과 연통되는 제2혼합영역을 하나 이상 더 포함하고,
    상기 제2혼합영역의 일부는 삼각형 형상인, 미세유체장치.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 제1혼합영역 및 상기 제2혼합영역은 교번적으로 배치되는 것인, 미세유체장치.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 제2분리채널섹터는 마름모 형상인, 미세유체장치.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 분리채널과 상기 제1배출부 사이에 연결부가 배치되고,
    상기 연결부의 직경은 상기 제1배출부를 향할수록 증가하는, 미세유체장치.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 제2배출부는 자성 수집부를 포함하는, 미세유체장치.
  10. 무세포 유전물질을 포함하는 제1시료를 분리채널에 공급하여 제1시료에서 적혈구를 분리하는 분리 단계;
    적혈구가 분리된 유체를 자성비드를 포함하는 제2시료와 혼합하여 혼합시료를 형성하고, 적어도 일 지점에서 변곡되는 혼합채널을 통과시켜 유전물질과 자성 비드를 혼합하는 혼합 단계; 및
    상기 혼합채널의 출구에서 자성 수집부를 통해 상기 혼합 시료로 부터 상기 자성비드를 수집하는 수집단계;
    를 포함하고,
    상기 분리채널은 일정 직경을 가지는 제1분리채널섹터, 및 상기 일정 직경보다 큰 직경을 가지는 제2분리채널섹터를 각각 하나 이상 포함하는, 검출방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 혼합채널은, 상기 혼합시료의 흐름방향을 변곡시키는 하나 이상의 변곡부를 포함하는 제1혼합영역;
    을 하나 이상 포함하는, 검출방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 제1혼합영역은 미세구조체를 포함하고,
    상기 미세구조체는 상기 혼합시료의 흐름방향을 하나 이상의 갈래로 분할하도록 상기 혼합시료가 통과하는 경로에 배치되는 것인, 검출방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 변곡부 중 하나 이상은 곡선형인 것인, 검출방법.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 혼합채널은, 상기 제1혼합영역과 연통되는 제2혼합영역을 하나 이상 더 포함하고,
    상기 제2혼합영역의 일부는 삼각형 형상인, 검출방법.
KR1020200017237A 2020-02-12 2020-02-12 무세포 유전물질 분리, 농축 및 증폭을 위한 다기능 미세유체장치 및 이를 이용한 검출방법 KR20210102776A (ko)

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CN115178199A (zh) * 2022-05-31 2022-10-14 清华大学 无源微流控微反应器以及微流控芯片
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