CN111729664A - 一种负载型纳米氧化锌及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种负载型纳米氧化锌及其制备方法和应用。所述负载型纳米氧化锌的载体为氧化铝，其中ZnO占总质量的9％‑11％；ZnO@Al2O3颗粒的粒径为3‑5μm，表面为长度400‑500nm的针状氧化锌。水热法制备，工艺简单。所述负载型纳米氧化锌同时具备杀灭细菌和灭活抗生素抗性基因，抑制可见光下修复的作用。所述负载型纳米氧化锌不仅方便回收，也能避免团聚便于分散，更重要的是纳米颗粒无法进入水生生物体内产生毒害作用。以紫外照射下的ZnO@Al2O3为灭菌体系，灭菌温度5‑40℃；紫外照射时间3‑240min，ZnO@Al2O3剂量为10‑250mg/L。提高了灭菌的有效性和持久性。同时，本发明针对负载型纳米氧化锌杀灭抗生素抗性细菌和灭活抗生素抗性基因的机理建立了模型，为氧化锌在灭菌方面的实际应用提供理论支持。

Description

一种负载型纳米氧化锌及其制备和应用
技术领域
本发明属于环境污染控制技术领域，尤其是涉及一种负载型纳米氧化锌及其制备和应用。
背景技术
由抗生素滥用产生的抗生素抗性污染，已经成为一种重要的环境污染问题。抗生素抗性污染包括抗生素抗性细菌(ARBs)和抗性基因(ARGs)。目前，人们发现ARBs和ARGs广泛存在于各个环境介质中，即使在很多未检测到抗生素的地方也发现了抗生素抗性污染。抗生素抗性污染持续和广泛分布的重要原因是ARGs的垂直转移和水平转移。所以，如何有效地治理环境中抗生素抗性污染是当前需要解决的重要环境问题。
传统的消毒灭菌技术主要包括氯化物、臭氧和紫外(UV)灭菌三种方法。然而紫外灭菌不仅能够灭活抗生素抗性细菌(ARBs)，而且还可以灭活抗生素抗性基因(ARGs)。但是紫外灭菌后还存在着光复活风险，即在处理后的体系中出现了抗生素抗性细菌数量回升的现象。因此，针对目前ARBs和ARGs广泛分布的现状，研发环保高效的协同灭活ARBs和ARGs技术是目前亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明创造旨在提出一种负载型纳米氧化锌，以解决现有技术中存在的问题。
为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：
一种负载型纳米氧化锌，载体为氧化铝，具体表示为ZnO@Al2O3，其中ZnO占总质量的9％- 11％；ZnO@Al2O3颗粒的粒径为3-5μm，所述ZnO@Al2O3颗粒的表面为长度400-500nm的针状氧化锌。
本发明的另一目的是提供所述负载型纳米氧化锌的制备方法，利用大孔径有机模板制备 Al2O3颗粒后，以Zn(NO3)2·6H2O和无水Na2C2O4为原料合成ZnO的前体物质；将所述Al2O3模板和ZnO前体高温水热，即得所述负载型纳米氧化锌。
具体包括如下工艺步骤：
S1.制备模板：将14-17g环氧树脂、16-20g聚乙二醇在加热条件下强烈搅拌，待全部融化后迅速加入3-5g二乙烯三胺，并迅速倒入模具中，在65-75℃下固化反应2-4h，生成具有大孔径的有机固体模板，并在常温下干燥22-26h，将所述模板裁剪成块状颗粒。
其中，所述聚乙二醇选自聚乙二醇1000和聚乙二醇2000中的至少一种。
S2.模板法制备Al2O3颗粒：将4.5-5.8g Al(NO3)3溶解于100mL去离子水后，并缓慢滴加到100mL的壳聚糖的乙酸溶液中，加入5g步骤S1所得模板颗粒。搅拌混合物一定时间后，一边搅拌一边逐滴滴加氨水，至pH为8-9。作为优选操作，在pH稳定后，继续搅拌一段时间。
所得溶液加热老化，随后真空抽滤，收集滤膜上的白色固体颗粒，用去离子水清洗，高温干燥。将干燥后的颗粒用500℃煅烧，研磨煅烧后的产物，即得到以大孔径有机固体为模板的Al2O3颗粒。
优选的，所述壳聚糖的乙酸溶液的质量浓度为0.5％。
S3.合成ZnO的前体物质：取研磨过的3.2-3.8g Zn(NO3)2·6H2O和研磨过的1.2-1.8g 无水Na2C2O4混合，研磨至所述混合物成为粘稠物后继续研磨10min。使用去离子水溶解所述粘稠物后离心5min，反复清洗粘稠物直至离心上清液电导率低于20μS/cm，然后使用无水乙醇离心洗去多余的水分。将下层沉淀物高温干燥一定时间，优选80℃下干燥6h；研磨后即得ZnO前体物质ZnC2O4·2H2O；
S4.水热法合成ZnO@Al2O3：取0.4-0.6g粉末状Al2O3和0.1-0.2g ZnC2O4·2H2O至水热反应釜中，并加入去离子水，混合均匀后在180-220℃下反应5-7h。反应结束后对反应产物进行清洗、干燥和研磨，即得ZnO@Al2O3复合材料。
本发明的又一目的是提供将所述负载型纳米氧化锌用于杀灭细菌的方法，尤其是针对携带抗生素抗性基因的细菌，更进一步的，针对携带RP4质粒的抗生素抗性细菌。所述杀灭细菌的方法中，以紫外照射下的ZnO@Al2O3为灭菌体系，灭菌温度5-40℃，优选25-37℃；紫外照射时间3-240min，优选3-5min；ZnO@Al2O3剂量为10-250mg/L，优选100-200mg/L。进一步地，以PBS溶液作为灭菌体系的细菌分散剂。所述负载型纳米氧化锌同时抑制了细菌紫外灭活后的光修复。
本发明的又一目的是提供将所述负载型纳米氧化锌用于灭活抗生素抗性基因的方法，尤其是针对RP4质粒携带的tetA、aphA和blaTEM-1，以及traF和korA。所述灭活抗生素抗性基因的方法与所述将负载型纳米氧化锌用于杀灭细菌的方法相同。其中，灭菌温度5-40℃，优选25-37℃；紫外照射时间3-240min，优选120-240min；ZnO@Al2O3剂量为10-250mg/L，优选100-200mg/L。
相对于现有技术，本发明所述的一种负载型纳米氧化锌及其制备和应用具有以下优势：
1.本发明提供的负载型纳米氧化锌，将针状纳米氧化锌负载于粒径相对较大的Al2O3载体上面，氧化铝在自然条件下十分稳定，具备耐酸碱、耐氧化、不聚集、极难水溶、以及不易与金属和有机物等发生反应等特点，而且氧化铝在常温下不导电，因此不会发生除氧化锌光催化反应以外的副反应，是纳米氧化锌理想的载体。该结构具有较大的比表面积和理想的颗粒粒径，制备工艺简单，且作为灭菌剂的使用过程中环保无污染。
2.将本发明所述的负载型纳米氧化锌用于灭菌，克服了现有技术中存在的纳米灭菌剂进入水体后会发生团聚现象，在水体中的存在状态以及团聚速度和团聚粘度受水质影响很大的问题。负载到较大粒径Al2O3载体上的纳米ZnO不仅方便回收，也能避免团聚便于剂分散，更重要的是纳米颗粒无法进入水生生物体内产生毒害作用。
3.将本发明所述的负载型纳米氧化锌用于灭菌，能够同时处理ARBs和ARGs，抑制光修复。ARGs的水平转移是ARGs传播的主要途径。ARGs可与质粒、转座子等移动遗传因子相结合，不仅能使同种属细菌从抗性菌种中获得ARGs，也能使不同种属细菌从抗性菌种中获得 ARGs。因此ARGs的水平转移是ARBs和ARGs在环境中甚至在无抗生素残留的环境中，检测到抗生素抗性广泛分布的重要原因。因此，针对ARGs的处理能够更彻底地解决抗生素抗性污染的问题。本发明利用所述的负载型纳米氧化锌，不仅在短时间内能灭活ARBs，抑制其在可见光下的修复，也可以使ARBs携带的ARGs失活，提高了灭菌的有效性和持久性，适用范围更加广泛。
4.本发明建立了UV和纳米氧化锌复合去除抗生素抗性污染的过程模型，处理过程中细菌细胞膜结构受到破坏，破坏机理类似“地毯模型”。即氧化锌接受光能后生成活性氧(ROSs)，破坏了细菌细胞膜，导致胞内酶释放，但随反应进行氧化锌释放出锌离子，使细胞膜破损点通过静电作用重新聚合。所述模型能进一步解释氧化锌灭菌机理并且为氧化锌在灭菌方面的实际应用提供理论支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中制备的ZnO@Al2O3颗粒的SEM电镜图。
图2为本发明实施例1中制备的ZnO@Al2O3颗粒的EDS能谱元素分析图。
图3为本发明实施例1中Zn@Al2O3颗粒在波数500-4000cm-1范围内的FTIR特征光谱图。
图4为本发明实施例1中Al2O3和ZnO@Al2O3的固体紫外可见漫反射光谱。
图5为本发明实施例2中不同灭菌体系中细菌存活数量随UV照射时间的变化曲线。
图6为本发明实施例2中不同灭菌温度下，不同ZnO@Al2O3剂量对RP4-E.coli进行灭菌 15min后暴露于可见光下细菌存活数量随可见光照射时间的变化。
图7为本发明实施例3中不同灭菌体系在不同UV时间照射后的暴露于可见光720min的细菌存活数量的变化。
图8为本发明实施例4中以DMPO为捕获剂的UV-ZnO@Al2O3灭菌体系的EPR谱图。
图9为本发明实施例4中以RP4-E.coli为研究对象，不同剂量的UV-ZnO@Al2O3灭菌体系自由基对不同灭菌实验中细菌细胞膜通透性的作用。
图10为本发明实施例4中细胞膜透过性检测中检测Zn离子浓度随灭菌时间变化。
图11为本发明UV-ZnO@Al2O3在细胞和基因水平上治理抗生素抗性的机理示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例1 ZnO@Al2O3颗粒的制备及表征
具体制备步骤为：
S1.制备模板：将16g环氧树脂、18g聚乙二醇1000和14g聚乙二醇2000在加热条件下强烈搅拌，待全部融化后迅速加入4g二乙烯三胺，并迅速倒入聚四氟乙烯方形模具中，在70℃下固化反应3h，生成具有大孔径的有机固体模板，并在常温下干燥24h。将所述模板裁剪成约1cm×1cm×1cm的块状颗粒，用于Al2O3的制备。
S2.模板法制备Al2O3颗粒：将5.625g Al(NO3)3溶解于100mL去离子水后，并缓慢滴加到100mL的0.5wt％壳聚糖的乙酸溶液中，加入5g的S1中所得模板颗粒。搅拌混合物 1h后，一边搅拌一边逐滴滴加氨水，溶液中开始出现乳白色胶体物质，至pH为8-9。待pH 稳定后，继续搅拌30min。
将所得反应完全的溶液置于70℃老化1h，随后真空抽滤过0.45μm滤膜，收集滤膜上的白色固体颗粒，用去离子水清洗三次，并在80℃下干燥24h。将干燥后的颗粒用500℃煅烧，研磨煅烧后的产物，即得到以大孔径有机固体为模板的Al2O3颗粒。
S3.合成ZnO的前体物质：取3.655g Zn(NO3)2·6H2O和1.646g无水Na2C2O4分别研磨10min后混合，继续研磨10min至所述混合物成为粘稠物后再研磨10min。使用去离子水溶解所述粘稠物后在5000rpm转速下离心5min，反复清洗粘稠物直至离心上清液电导率低于20μS/cm，然后使用无水乙醇离心清洗3次，洗去多余的水分，倾倒上清液，沉淀在80℃下干燥6h后磨细，得到ZnO前体物质ZnC2O4·2H2O。
S4.水热法合成ZnO@Al2O3：取0.5g粉末状Al2O3和0.116g ZnC2O4·2H2O至50mL聚四氟乙烯高压水热反应釜中，并加入30mL去离子水，混合均匀后在220℃下反应6h。反应结束后对反应产物进行清洗、干燥和研磨，即得10wt％ZnO负载量的ZnO@Al2O3复合材料。
使用XL-30ESEM FEG型Scanning Electron Microscope观察复合材料的表面结构和形貌，并用该仪器上配备的OXFORD INSTRUMENTS X-MAX测定复合材料元素组成和比例。
如图1所示，为上述方法制得ZnO@Al2O3颗粒的SEM电镜图。从图1中可以看出，ZnO@Al2O3是尺寸略小于5μm的颗粒状材料，当放大ZnO@Al2O3表面结构后，可观察到氧化铝颗粒表面覆载着长度400-500nm的针状物。
如图2所示，为ZnO@Al2O3复合材料的EDS能谱元素分析图。从图中可以看出，合成材料的主要组成元素为O、Al及Zn，元素占比分别为71.02％、26.94％和2.05％。图中显示，O和Al分布最为广泛，分布位置基本一致，而Zn元素色块最小，而且分布范围局限于O和Al 元素分布色块，表明氧化锌完全负载于氧化铝表面之上。根据元素占比可以算出，ZnO负载量为10wt％。
图3是ZnO@Al2O3颗粒在波数500-4000cm-1范围内的FTIR特征光谱图。使用IRAffinity- 1S型Fourier Transfrom Infrared Spectrophotometer对复合材料进行红外光谱分析，已测定官能团变化。测试波数范围为400cm-1-4000cm-1，扫面次数为32次，用干燥的光谱纯溴化钾作窗片材料与样品压片后上机扫描。
在波数3051.39-3610.74cm-1范围内出现一个较宽的特征峰，主要原因是活性氢处于高度缔合状态，根据合成材料和步骤推知为结合在氧化锌和氧化铝表面的羟基及结晶水的相互影响形成的特征峰。此外，波数1000–2000cm-1范围内的特征峰是鉴定物质的官能团和指纹区。在波数1072.42cm-1、1365.60cm-1和1631.78cm-1处的特征峰符合氧化铝特征吸收峰；在波数1419.61cm-1和1697.36cm-1符合氧化锌颗粒由于表面羟基或桥联羟基的伸缩和弯曲振动吸收形成的两个特征峰。因此，综合FTIR光谱图和EDS元素分析结果可以确定该合成材料是由氧化锌负载于氧化铝表面的复合材料，同时含有丰富的羟基官能团，主要原因是水热合成过程中部分吸附于金属氧化物表面的水分子解离生成吸附羟基。
使用Autosorb iQ Station型全自动比表面积和孔径分布分析仪测定样品的BET比表面积和BJH孔体积和孔径分布。主要操作参数为：分析气体为高纯氮气N2，孔径测定范围为2 -200nm，比表面积分析范围≥0.01m2/g，软件自动绘制N2脱附等温线。
在高、低压时曲线远比中压时陡峭，在0-1.0Pa压力范围内呈现典型的Ⅱ型吸附等温线，在0.1Pa压力左右达到单层吸附结果，表明合成ZnO@Al2O3是大孔径固体颗粒。通过N2的等温吸附-脱附曲线计算出ZnO@Al2O3颗粒比表面积为248.271m2/g。同时，由BJH模型计算得到平均孔径为6.896nm，低于200nm孔径的总孔容为1.575cc/g。
如图4是Al2O3和ZnO@Al2O3的固体紫外可见漫反射光谱。使用紫外-可见分光光度计测定材料的紫外可将漫反射光谱，波长范围为200-800nm。
Al2O3在紫外可见波段不存在明显的吸收峰，因此无吸收边缘，并不产生电子跃迁。在Al2O3上负载ZnO得到ZnO@Al2O3后，在紫外波长258nm处有显著吸收峰，可得吸收边缘是390 nm，根据Eg＝hc/λ计算可得带隙宽度为3.18eV，说明ZnO@Al2O3在波长390nm以下均具有较好的光吸收性能，在波长258nm时达到最好的光吸收性能，而在大于390nm的波段下光吸收性能很弱。因此，ZnO@Al2O3在全紫外波段照射下都能发挥作用，同时，在灭菌效果最佳的UVC波段内有最好的光吸收性能。
实施例2 ZnO@Al2O3颗粒用于灭菌
实验菌株：采用携带RP4质粒的大肠杆菌(RP4-E.coli)为灭菌对象。RP4质粒上编码有包括tetA、aphA和blaTEM-1在内的三种ARGs，使得E.coli分别对10mg/L四环素、50mg/L硫酸卡那霉素和100mg/L氨苄西林产生抗性。
取0.1mL从-80℃冷藏解冻后的甘油菌液，接种到100mL含有三种抗生素的选择性LB 液体培养基中，在37℃下，200rpm振荡培养。所述LB液体培养基中的营养物质为10g/LNaCl、10g/L胰蛋白胨和5g/L酵母提取物；LB液体培养基的选择性针对10mg/L四环素、50mg/L硫酸卡那霉素和100mg/L氨苄西林。培养12h后达到生长稳定期，细菌数量基本不发生变化，因此取培养12h后的菌液作为实验对象。
实验装置：镀铁箱体内设置一个磁力搅拌器，三个并联紫外灯管以及三个并联可见光灯管，每个所述紫外灯管和可见光灯管均为8W。镀铁箱体顶部安装散热风扇，所述灯管启动时，风扇转动进行散热。
实验过程：取10mL所述菌液，在4℃、10000rpm下离心10min，然后倾倒上清液，得到活体菌沉淀。将离心后的菌体用100mL PBS缓冲液重悬浮于300mL石英烧杯中，轻微振荡混匀后分别加入5mg、10mg、和20mg ZnO@Al2O3，加入搅拌子，置于磁力搅拌器上，搅拌混匀1min后，打开紫外灯。将整个实验装置置于恒温培养箱中，分别在15、25和37℃下，紫外照射0、1、2、3、5、10和15min时移取0.1mL菌液，用PBS缓冲液10倍梯度稀释，并将稀释液接种到含有所述三种抗生素的选择性LB固体培养基，过夜培养并计数 (CFU/mL)。所述LB固体培养基的营养物质为15g/L琼脂粉、10g/L NaCl、10g/L胰蛋白胨和5g/L酵母提取物。LB固体培养基的选择性为：10mg/L四环素、50mg/L硫酸卡那霉素和100mg/L氨苄西林。
对照实验为不添加ZnO@Al2O3的紫外灭菌实验和添加ZnO@Al2O3但是在暗条件下进行杀菌实验，其他条件与上述操作保持一致。其中，暗条件下的取样时间为反应后0、10、30、60、 90、120、180和240min。
灭菌实验的影响因素包括：ZnO@Al2O3剂量分别为10、50、100和200mg/L；灭菌温度分别为10、25和37℃。
如图5所示，ZnO@Al2O3颗粒在暗条件和可见光照射下对抗生素抗性细菌没有灭菌效果。从图5中可以看出，使用紫外灯能在较短时间内有效降低细菌存活数量，单纯UV照射就能使三种初始浓度为108CFU/mL细菌的存活数量在5min内达到100CFU/mL的检测线以下。当向 UV灭菌体系加入ZnO@Al2O3后，细菌存活数量达到检测线的时间被明显缩短，从5min降到3 min，但不同ZnO@Al2O3剂量下灭菌效率没有显著变化。
分析在UV照射下的灭菌效果以及ZnO@Al2O3剂量和灭菌温度对灭菌效果的影响。其中，图5(a)表示当pH＝7.0,温度＝25℃，ZnO@Al2O3剂量为0、50、100和200mg/L时细菌存活数量随灭菌时间的变化。图5(b)表示当pH＝7.0,[ZnO@Al2O3]＝50mg/L，灭菌温度为10、25 和37℃时细菌存活数量随灭菌时间的变化。
当改变温度时，单纯UV灭菌效率并没有被改变，在三种不同温度下细菌存活数量达到检测线的时间均为5min。而不同温度对UV-ZnO@Al2O3体系灭菌效率有较明显的影响。10℃时达到检测线以下的时间与单纯UV时相同。温度分别升至25℃和37℃时，所述达到检测线以下的时间从5min减少至3min。因此，升高一定温度有助于ZnO@Al2O3在UV照射下的灭菌效果。这是由于升高温度促进了氧化锌光催化生成ROSs的反应，高温下相同时间内会生成更多作用于灭菌的ROSs。
UV-ZnO@Al2O3体系能有效降低三种抗生素抗性细菌的存活数量，尤其对具有多种抗生素抗性细菌的灭菌效果显著，而且高温提高了灭菌效率。
实施例3UV-ZnO@Al2O3抑制抗生素抗性细菌的可见光复活修复
实验装置与实施例2相同。
将UV照射后的无活菌体系，包括单独UV照射和UV-ZnO@Al2O3体系，置于所述实验装置内，同样将整个装置置于恒温培养箱中，在25℃下，打开可见光照射(VL)按钮。在VL照射0、5、10、20、40、60、120、180和240min后，分别取0.1mL菌液，用PBS缓冲液10 倍梯度稀释，并接种到选择性LB固体培养基上，过夜培养并计数(CFU/mL)。所述LB固体培养基的选择性为：10mg/L四环素、50mg/L硫酸卡那霉素和100mg/L氨苄西林。
本实施例针对不同灭菌体系的菌液进行光修复实验，以对比得出能有效避免光修复的灭菌体系。
图6(a)、图6(b)和图6(c)分别表示灭菌温度为10、25和37℃下，不同ZnO@Al2O3剂量对RP4-E.coli进行灭菌15min后暴露于可见光下，细菌存活数量随可见光照射时间的变化。其中灭菌的pH为7.0，光复活的pH为7.0，光复活温度为25℃。
空白实验是单纯UV灭菌后置于暗处并测定灭菌后细菌存活数量随时间变化。其中对RP4- E.coli进行灭菌15min后不同细菌数量均低于检测线。空白实验在12h内都没有检测到可以在固体选择性培养基上繁殖的活RP4-E.coli，而灭菌后暴露于可见光的实验组都在12h 内检测到了活RP4-E.coli。
1.灭菌温度和ZnO@Al2O3剂量对抑制抗生素抗性细菌的可见光复活修复的影响
在所有实验温度下，可见光照10min后即可以在单纯UV灭菌体系中检测到检测线以上数量的RP4-E.coli。而UV-ZnO@Al2O3体系，第一次检测到RP4-E.coli的时间均长于10min。
以10℃下可见光修复为例，在同一温度下，UV-50mg/L ZnO@Al2O3灭菌体系中在可见光暴露30min后才第一次检测到102.52CFU/mL的检测线以上数量的RP4-E.coli，随着加入ZnO@Al2O3剂量的增加，该时间从30min分别增长到60和120min，此时100、200mg/L ZnO@Al2O3体系出现的细菌数量分别为102.66和102.39CFU/mL。25℃和37℃下可见光修复曲线趋势相同。
由图6可知，在所有上述实验温度下，单纯使用UV灭菌后第一次检测到细菌数量达到检测线以上的时间是相同的。UV-ZnO@Al2O3的体系中第一次检测到细菌数量达到检测线以上的时间与温度和ZnO@Al2O3剂量成正比。温度影响了光复活过程中第一次检测到细菌数量达到检测线以上的时间。当温度升高时，同一UV-ZnO@Al2O3灭菌体系灭菌后第一次细菌检测时间延长。因此，加入ZnO@Al2O3进行灭菌后，RP4-E.coli暴露于可见光下一定时间不会引起细菌数量的恢复。
同一灭菌温度下，光复活过程最大细菌数量与ZnO@Al2O3剂量成反比。
对比不同灭菌温度下，不同ZnO@Al2O3剂量体系灭菌后的最大光复活细菌数量与不加 ZnO@Al2O3时最大光复活细菌数量，可以看出，加入ZnO@Al2O3抑制了UV灭菌后RP4-E.coli由于光复活修复引起的细菌数量回升，且抑制效果随ZnO@Al2O3剂量的增大和温度的升高显著增强。而且ZnO@Al2O3剂量和温度对抑制效果的影响程度差别很大。
灭菌温度对应于10、25和37℃的情况下，ZnO@Al2O3剂量从50增加到200mg/L时，抑制效果分别提升了7.41、5.50和3.32倍。ZnO@Al2O3剂量对应于50、100和200mg/L的情况下，温度从10℃升至37℃时，抑制效果增强了19.06、18.21和11.57倍。相比于ZnO@Al2O3剂量，温度对细菌光修复抑制效果更明显。
综合分析单纯UV与UV-ZnO@Al2O3灭菌后细菌光复活结果，加入ZnO@Al2O3显著抑制了RP4- E.coli在暴露于可见光后的数量恢复。UV-ZnO@Al2O3体系中的细菌开始光复活的时间晚于单纯UV灭菌体系，而且在UV-ZnO@Al2O3灭菌后在一定时间下通过光复活机制而恢复正常细胞功能的RP4-E.coli数量远远低于单纯UV灭菌体系。所述的正常细胞功能包括复制繁殖和抗生素抗性。这主要是由于在UV-ZnO@Al2O3体系中的RP4-E.coli除受UV照射损伤外，还可能受到ROSs和二价锌离子等杀菌物质的作用。
2.UV灭菌时间对抑制抗生素抗性细菌的可见光复活修复的影响
在UV照射15min检测不到活细菌后，继续UV照射30、60、120和240min。各个灭菌体系在不同UV时间照射后的暴露于可见光720min的细菌存活数量如图7所示。同时计算了除15min外，其他所有UV时间下细菌数量占15min时的百分比，以确定延长UV抑制光复活过程的效果。
从图7可以看出，增加UV照射时间均显著降低了单纯UV照射和UV-ZnO@Al2O3体系灭菌后RP4-E.coli通过光复活机制引起的数量回升现象，而且UV照射时间与细菌光复活数量成反比。增加UV照射时间对不同ZnO@Al2O3剂量灭菌体系细菌光复活数量的影响有显著差别。对比不同灭菌体系中，UV-ZnO@Al2O3体系灭菌后光复活细菌数量远低于单纯UV照射体系。特别是在UV-ZnO@Al2O3体系中，只需UV照射15或30min就远低于单纯UV灭菌体系的最低光复活细菌数量。
此外，增加UV照射时间对单纯UV灭菌和UV-ZnO@Al2O3灭菌体系抑制光复活效果的提高差别很大，总体来说是更能增强UV-ZnO@Al2O3灭菌体系抑制细菌光复活的效果。
通过不同灭菌体系在不同UV照射时间，经过相同的光复活过程后的数据可以得出，UV照射时间与所有灭菌体系的光复活细菌数量成反比，即增加UV照射时间均提高了不同体系抑制细菌光复活的效果。同时可以看出，虽然增加UV照射时间后，单纯UV照射体系和UV-ZnO@Al2O3体系的灭菌效果都被提高了，但是UV-ZnO@Al2O3体系的灭菌效果提升更明显，且提升效果与 ZnO@Al2O3剂量呈正相关关系。这主要是因为对于单纯UV灭菌体系来说，增加UV照射时间只是增强了对DNA的紫外破坏，从结果来看较长的UV时间确实能抑制细菌光复活恢复，但是效果有限。而对于UV-ZnO@Al2O3体系来说，长时间的UV照射不仅增强了UV对DNA的破坏效果，还加强了氧化锌在UV激发下生成ROSs、释放二价锌离子等杀菌过程。因此，UV-ZnO@Al2O3灭菌体系是一个复杂的，互补的灭菌体系，一方面UV能在数分钟内快速杀菌，另一方面加入的 ZnO@Al2O3能显著降低UV灭菌后细菌暴露于可见光时的光复活修复风险。
现有技术表明，细菌被UV照射死亡后，一定时间内接受400nm左右VL照射会重新恢复活力，主要原因是VL激活的光复活酶能分解因UV照射而形成的嘧啶二聚体，这种光修复过程会对UV灭菌效果造成严重影响。加入ZnO@Al2O3后，如本实施例所示，虽然对灭菌效果的提高并不显著，但是极大地抑制了在UV灭菌后暴露于可见光下的细菌数量的回升。
实施例4自由基对细菌的破坏
结合实施例2的UV-ZnO@Al2O3灭菌和实施例3光复活修复的结果可以看出，在UV-ZnO@Al2O3体系中存在除UV灭菌外的灭菌机制外，还包括氧化锌通过光催化过程产生ROSs对细菌造成氧胁迫损伤。
1.鉴定自由基种类
ZnO在UV激发下会生成自由基，并对细菌细胞结构造成损伤。使用EPR检测UV-ZnO@Al2O3内生成的自由基种类。将100mg的ZnO@Al2O3加入装有200mL超纯水的烧杯中，超声30min 分散ZnO@Al2O3，移取100μL分散后溶液，加入10mg/L的DMPO溶液，用毛细管吸取溶液，加入到石英核磁管中，用紫外照射15min后，放入电子顺磁共振仪进行测定。
EPR操作参数为中心磁场3500.00G；扫场宽度为150.00G；扫场时间为30.00s；微波功率为3.99mW；调制幅度为1.000G；转换时间为40.0ms；微波频率是9.8752GHz。
图8是室温下，以DMPO为捕获剂的UV-ZnO@Al2O3灭菌体系的EPR谱图，表示UV-ZnO@Al2O3体系生成ROSs的情况。图中以▲、●、■和▼标识的四个峰，且峰强比为▲：●：■：▼＝1： 2：2：1，是典型的DMPO-OH谱线，表明在该体系中确实生成了·OH。
2.自由基对细胞膜通透性的破坏
胞外β-半乳糖苷酶活性变化可以表征细胞膜通透性，即胞外β-半乳糖苷酶活性越高，说明细胞膜通透性越大，膜结构破坏越严重。因此通过测定菌液β-半乳糖苷酶活性变化来判断自由基对细胞膜通透性的破坏程度。
实验组共六个，分别为UV-50mg/L ZnO@Al2O3、UV-100mg/L ZnO@Al2O3和UV-200mg/L ZnO@Al2O3及对应加入水杨酸做羟基自由基捕获剂的三个自由基淬灭组；对照组包括三个，分别为暗条件、暗条件-200mg/L ZnO@Al2O3和UV。其余实验条件和实验步骤与实施例2相同。
在灭菌反应0、15、30、60、120和240min时分别取50μL菌液于1.5mL离心管中，使用200μL改良PBS缓冲液稀释。10000rpm离心5min后，移取50μL上清液加入到96 孔板中，然后加入110μL改良PBS缓冲液，37℃恒温培养5min后，加入50μL的4g/L邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)作为β-半乳糖苷酶反应物，37℃培养6h至反应液变为亮黄色后，加入90μL 1MNa2CO3终止反应，然后用微孔板分光光度计在405nm波长下测定吸光度(OD405 nm)。其中，所述改良PBS缓冲液的组成为：标准PBS缓冲液、0.001M的 MgSO4和0.05M的β-巯基乙醇
图9表示的是以RP4-E.coli为研究对象，不同剂量的UV-ZnO@Al2O3灭菌体系自由基对不同灭菌实验中细菌细胞膜通透性的作用。其中图9(a)和9(b)分别表示有自由基和没有自由基淬灭剂条件下胞外β-半乳糖苷酶活性随UV照射时间的变化。对照实验为暗处理、单纯 UV照射和单纯200mg/L ZnO@Al2O3灭菌实验。
在不添加自由基淬灭剂时，对照实验组，即暗处理、单纯UV照射和单纯200mg/L的ZnO@Al2O3实验中检测到的β-半乳糖苷酶活性随时间基本没有变化。在UV-ZnO@Al2O3实验组中，0min时β-半乳糖苷酶活性与对照组相似，吸光度均在0.083左右，但随时间增大呈S 型上升趋势，即活性随时间增加先逐渐升高后基本保持不变。
在不经过UV和ROSs淬灭剂处理时，同样可以在离心后的悬液中检测到一定程度的β-半乳糖苷酶活性，说明在细胞未被破坏时，离心后的悬浮液中也有少量的RP4-E.coli细胞，而且这个活性值随时间是基本不变的。因此，将所述β-半乳糖苷酶活性数值是本实验的背景值。所述β-半乳糖苷酶活性数值背景值在0.080-0.083。
同时，对照组β-半乳糖苷酶活性随时间没有显著变化，表明没有其他的β-半乳糖苷酶被释放到溶液中，即细胞结构基本保持完整，说明单纯ZnO@Al2O3和单纯UV照射并不会破坏 RP4-E.coli细菌细胞膜。与此相比，β-半乳糖苷酶活性在UV-ZnO@Al2O3实验组从背景值逐渐增大，到120min时达到最大值，且最大值与ZnO@Al2O3剂量为正相关关系，说明UV-ZnO@Al2O3实验组确实破坏了RP4-E.coli细胞膜结构，增大了通透性，导致大量β-半乳糖苷酶从胞内被释放到胞外。
并且，由图9(b)所示，对照实验证实单独UV照射和ZnO@Al2O3并不会破坏RP4-E.coli 细胞膜结构，但在加入自由基淬灭剂后，实验组β-半乳糖苷酶活性也没有随时间增加而产生显著改变，说明氧化锌在UV照射下发生光催化过程生成的·OH破坏了细胞膜结构。
此外，在所有UV-ZnO@Al2O3实验组中β-半乳糖苷酶活性并不是随灭菌时间一直增大的，而是在120min后达到最大，这个符合“地毯模型”原理。
首先，氧化锌在UV催化下生成具有强氧化性的·OH，使RP4-E.coli细胞膜结构受损，导致通透性增大，生成能使β-半乳糖苷酶透过的孔穴，这个过程随着·OH的持续生成而不断反复进行，所以检测到β-半乳糖苷酶活性逐渐增大。但RP4-E.coli是革兰氏阴性菌，细胞膜外侧表面在中性水环境中呈阴性，当具有阳电荷的离子在细胞膜破损外表面不断积累时，便通过静电作用充当粘合剂的作用将破损的细胞膜表面重新聚合在一起，因此在120min后β-半乳糖苷酶活性基本不变。在UV-ZnO@Al2O3实验组中阳离子除缓冲液中的Na+和K+外，还检测到了Zn离子浓度。检测Zn离子浓度随灭菌时间变化结果列于图10。其中灭菌温度为 25℃，灭菌pH＝7.0，目标细菌RP4-E.coli。
在无UV照射时，在水溶液中检测不到Zn离子浓度；而在UV照射下，Zn浓度变化与β-半乳糖苷酶活性变化基本相同。Zn浓度与β-半乳糖苷酶活性的相似变化说明Zn离子是发挥所述粘合作用的主要阳离子。当灭菌时间进行到120min时，积累到一定浓度的Zn离子使受损的细胞膜在静电作用下重新聚合，因此β-半乳糖苷酶活性并没有进一步增大，但是聚合的细胞膜并不会重新具备正常的选择透过功能。
实施例5 UV-ZnO@Al2O3使ARGs和MGEs失活
实施例2-4对细菌的存活情况进行了说明，但是当ARGs游离到环境中，通过水平转移被其他细菌获取并转化时，会使该细菌重新获得抗生素抗性，因此抗生素抗性细菌的死亡并不能代表抗生素抗性的完全去除，需要检测灭菌前后ARGs的丰度变化以确定抗生素抗性是否被有效去除。此外，若能够促进ARGs的转移扩散的可转移的遗传因子(MobileGenetic Elements，MGEs)丰度减少，也能降低ARGs传播的风险。
本实施例使用qPCR技术测定基因相对丰度。由于灭菌前后内参基因丰度发生了显著变化，因此本实施例中基因的相对丰度是指实验组相比对照组的比例。
所述比例通过下述公式得出：
Y＝X×(1+Ev)Ct (1)
lgX＝logY-Ct×lg(1+Ev) (2)
lgX1-lgX2＝-Ct1×lg(1+Ev)+Ct2×lg(1+Ev) (3)
Figure RE-GDA0002631127550000131
Figure RE-GDA0002631127550000132
其中Y为扩增物数量，X为起始模板数量，Eυ为扩增效率，CT为扩增循环数。公式(1)和公式(2)是PCR实时检测定量的原理。当起始模板数量X1和X2分别经过n1和n2次扩增循环达到相同荧光阈值，即相同的Y值时，lgX1和lgX2的差值得到公式(3)，并经过简并计算得到公式(4)和公式(5)。公式(5)说明了X1与X2的比例可以通过两者的CT值得到。
每个扩增效率Eυ理想情况下是100％，但由于引物准确性和反应条件适宜性的差别使得扩增效率往往不等于100％，因此需要通过拟合标准曲线得到每种目的基因在各自引物下的扩增效率，从而得到不同处理后各个目的基因丰度的变化。
使用Ezupk柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取E.coli的DNA，并用作qPCR模板。具体抽提步骤按照试剂盒内的说明书进行。目标基因包括RP4携带的三种ARGs和两种MGEs：tetA、aphA和blaTEM-1、traF和korA。
上述基因引物信息见序列表，并用于qPCR实验。其中，MEGs基因选自traF和korA，对应的引物分别为traF-F和traF-R，以及korA-F和korA-R。
ARGs基因选自aphA、blaTEM和tetA。对应的引物分别为aphA-F和aphA-R，blaTEM-1- F和blaTEM-1-R，以及tetA-F和tetA-R。
qPCR反应体系组分包括1μL DNA模板、0.5μL 10μM引物1、0.5μL 10μM引物2和 10μL PCR混合试剂，并用超纯水补足至20μL。qPCR反应程序为95℃预变性3min，94℃变性25s，55℃退火25s，72℃延伸50s，40个循环；最后72℃延伸5min。每个孔测定三次，计算平均Ct。
表1不同灭菌体系中5种目标基因相对丰度随灭菌时间的变化及光复活240min后相对丰度的以10为底的负对数
Figure RE-GDA0002631127550000141
对不同灭菌体系中5种目标基因相对丰度随灭菌时间的变化，以及光复活240min后的相对丰度进行统计，根据式(1)-(5)计算发现结果均小于1，且数值间相差很大。因此对结果做以10为底的对数处理，并取对数结果的正值，如表1所示，即表中数值越大，实际倍数越小。
实验时，灭菌温度25℃，灭菌pH＝7.0，光复活温度25℃，光复活pH＝7.0，灭菌时间为15、30、60、120和240min，目标细菌RP4-E.coli。
从表1中可知，单纯UV体系灭菌与UV-ZnO@Al2O3体系分别灭菌15、30、60、120和240min后traF、korA、tetA、blaTEM、aphA丰度相比，UV-ZnO@Al2O3体系灭菌后基因丰度有更大程度的降低。
对比同一灭菌体系不同灭菌时间前后MEGs基因丰度和ARGs基因丰度值，以及单纯UV照射和UV-ZnO@Al2O3灭菌体系各个基因灭菌后丰度变化可知：
1.所有灭菌体系的基因丰度都与灭菌时间成反比。
2.相同灭菌时间下，对于一种基因型来说，在UV体系的丰度变化倍数高于UV-ZnO@Al2O3体系1到2个数量级，因此UV-ZnO@Al2O3灭菌体系对ARGs和MEGs的灭活效果更加显著。
3.灭菌过程降低基因丰度的程度与基因类型有关。灭菌后两种MEGs丰度与灭菌前相比有比较明显降低，但是三种ARGs丰度降低的程度更加明显，也就是表现出抑制倍数更低，在热图中色块更偏红色。这个现象出现的原因可能是不同功能基因在质粒上的位置不同导致的，也有可能是ARGs类型基因在高浓度抗生素环境中才会有较高的表达，而MEGs在正常状态下就有比较高的表达量。UV-ZnO@Al2O3体系能有效灭活ARGs，降低其在水体中的丰度能，而且能极大程度地减弱抗生素抗性污染的持续性和扩散性。
对比表1中灭菌后和光复活后两部分数据可知，光复活后ARGs和MEGs丰度的增加，说明光复活修复确实使失活的部分基因重新获得表达能力。但不同灭菌条件和基因类型的基因丰度增加情况差异很大。
比较光复活后各个基因型丰度变化，与灭菌后丰度变化不同，光复活程度与基因类型没有相关性，但是与灭菌时间，即UV照射时间，和ZnO@Al2O3剂量有明显相关。灭菌时间越长，光复活后基因丰度相比与灭菌前丰度的倍数就越低。但灭菌时间在不同灭菌体系所表现出来的对光复活基因丰度的影响不同。
1.在单纯UV照射体系虽然基因丰度与灭菌时间成反比，但是变化并不大，最大倍数和最小倍数之间相差约1个数量级。但是在UV-ZnO@Al2O3体系，最大倍数通常高于最小倍数2 到3个数量级，说明在UV-ZnO@Al2O3的灭菌体系中，增加UV灭菌时间能显著抑制基因丰度在光复活后的上升。
2.相同UV照射时间下，ZnO@Al2O3剂量越大的灭菌体系光复活后基因丰度越低。出现这个差异的主要原因是在UV灭菌体系中，对核酸造成破坏的只有UV，而有ZnO@Al2O3的体系中，除了UV会使核酸失活外，氧化锌通过光催化过程生成的ROSs也会对核酸造成损伤，而且这部分的核酸损伤无法通过光复活修复机制重新获得活性。
基于上述实施例，UV-ZnO@Al2O3在细胞和基因水平上治理抗生素抗性的机理为：UV- ZnO@Al2O3体系能快速高效去除水体中的ARBs和ARGs，并且有效避免了光复活修复问题。UV- ZnO@Al2O3体系去除抗生素抗性污染的机理模型示意图如图11所示的。
首先，如过程①所示，UV能直接破坏ARBs细胞内的核酸，包括核区和质粒DNA，改变核酸活性，造成ARBs的生长性或再生性细胞死亡，这个过程是UV-ZnO@Al2O3体系能在3分钟内使ARBs存活数量降到检测线以下的最重要原因。但是灭菌后，当暴露于可见光下时也可能通过光复活修复机制而重新获得正常的DNA功能。此外，过程②表示UV照射到ZnO@Al2O3上，能激发针状氧化锌的电子从价带跃迁到导带，在价带上留下一个相对稳定的，具有氧化性的空穴，从而产生电子-空穴对。详细过程如过程③所示：电子跃迁后留下空穴，空穴氧化水分子得到·OH，溶解氧分子获得电子变成O2 ·-。产生·OH等ROSs的同时，氧化锌颗粒通过过程④溶解出锌离子。
无UV时在溶液中基本检测不到锌离子。图中过程⑤表示的是当具有强氧化性的ROSs及空穴与ARBs细胞膜接触后，破坏磷脂双分子层等结构，细胞膜通透性增大，导致β-半乳糖苷酶从胞内流失到胞外，同时也使胞外ROSs进入胞内。虽然ROSs在细胞膜上造成的损伤导致通透性增大，但随后在锌离子介导下会是破损的磷脂双分子聚合在一起。具体过程为，随着ROSs持续生成并在ARBs细胞膜表面不断积累(a)，破坏磷脂双分子层结构，形成能通过β-半乳糖苷酶的孔穴(b)，此时锌离子浓度还较低，当细胞膜破损处积累了足够量的锌离子时，由于ARBs(RP4-E.coli)表面带负电荷，因此会与锌离子通过静电作用聚合在一起形成胶束，重新堵塞了孔穴(c)。另一方面，过程⑥表示进入了胞内的ROSs会对质粒等核酸造成氧化损伤，这部分损伤是无法通过光复活过程而被修复的，这也是UV-ZnO@Al2O3体系能有效解决UV灭菌后细菌数量回升问题的原因。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 吉林大学
<120> 一种负载型纳米氧化锌及其制备和应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> traF-F(Escherichia coli)
<400> 1
aagtgttcag ggtgcttctg c 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> traF-R(Escherichia coli)
<400> 2
gtcgccttaa ccgtggtgtt 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> korA-F(Escherichia coli)
<400> 3
tcgggcaagt tcttgtcc 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> korA-R(Escherichia coli)
<400> 4
gcagcagacc atcgagata 19
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> aphA-F(Escherichia coli)
<400> 5
cgacggtaga gcaaaggt 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> aphA-R(Escherichia coli)
<400> 6
agcggacagc atcagtaa 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> blaTEM-1-F(Escherichia coli)
<400> 7
ccaatgctta atcagtgagg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> blaTEM-1-R(Escherichia coli)
<400> 8
atgagtattc aacatttccg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> tetA-F(Escherichia coli)
<400> 9
gctacatcct gcttgccttc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> tetA-R(Escherichia coli)
<400> 10
catagatcgc cgtgaagagg 20

Claims (10)

1.一种负载型纳米氧化锌，其特征在于：载体为氧化铝，其中ZnO占总质量的9％-11％；ZnO@Al2O3颗粒的粒径为3-5μm，所述ZnO@Al2O3颗粒的表面为长度400-500nm的针状氧化锌。
2.制备如权利要求1所述的负载型纳米氧化锌的方法，其特征在于：利用大孔径有机模板制备Al2O3颗粒后，以Zn(NO3)2·6H2O和无水Na2C2O4为原料合成ZnO的前体物质；将所述Al2O3模板和ZnO前体高温水热，即得所述负载型纳米氧化锌。
3.根据权利要求2所述的负载型纳米氧化锌的制备方法，其特征在于：具体步骤为，
S1.制备模板：将14-17g环氧树脂、16-20g聚乙二醇在加热条件下强烈搅拌，待全部融化后迅速加入3-5g二乙烯三胺，并迅速倒入模具中，在65-75℃下固化反应2-4h，生成具有大孔径的有机固体模板，并在常温下干燥22-26h，将所述模板裁剪成块状颗粒；
S2.模板法制备Al2O3颗粒：将4.5-5.8g Al(NO3)3溶解于100mL去离子水后，并缓慢滴加到100mL的壳聚糖的乙酸溶液中，加入5g步骤S1所得模板颗粒；搅拌混合物一定时间后，一边搅拌一边逐滴滴加氨水，至pH为8-9；
将所得溶液加热老化，随后真空抽滤，收集滤膜上的白色固体颗粒，用去离子水清洗，高温干燥；将干燥后的颗粒用500℃煅烧，研磨煅烧后的产物，即得到以大孔径有机固体为模板的Al2O3颗粒；
S3.合成ZnO的前体物质：取研磨过的3.2-3.8g Zn(NO3)2·6H2O和研磨过的1.2-1.8g无水Na2C2O4混合，将所述混合物研磨成为粘稠物后继续研磨10min；使用去离子水溶解所述粘稠物后离心5min，反复清洗粘稠物直至离心上清液电导率低于20μS/cm，然后使用无水乙醇离心洗去多余的水分；将下层沉淀物高温干燥一定时间，研磨后即得ZnO前体物质ZnC2O4·2H2O；
S4.水热法合成ZnO@Al2O3：取0.4-0.6g粉末状Al2O3和0.1-0.2g ZnC2O4·2H2O至水热反应釜中，并加入去离子水，混合均匀后在180-220℃下反应5-7h；反应结束后对反应产物进行清洗、干燥和研磨，即得ZnO@Al2O3复合材料。
4.根据权利要求2所述的负载型纳米氧化锌的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述聚乙二醇选自聚乙二醇1000和聚乙二醇2000中的至少一种。
5.将权利要求1所述的负载型纳米氧化锌用于杀灭细菌。
6.根据权利要求5所述的负载型纳米氧化锌的应用，其特征在于：所述细菌为携带抗生素抗性基因的细菌。
7.将权利要求1所述的负载型纳米氧化锌用于灭活抗生素抗性基因；进一步地，所述抗生素抗性基因包括tetA、aphA和blaTEM-1。
8.根据权利要求7所述的负载型纳米氧化锌的应用，其特征在于：所述抗生素抗性基因包括移动遗传相关基因，进一步地，所述移动遗传相关基因包括traF和korA。
9.根据权利要求5或7任一所述的负载型纳米氧化锌的应用，其特征在于：以紫外照射下的ZnO@Al2O3为治理抗生素抗性污染的体系，灭菌温度5-40℃；紫外照射时间3-240min，ZnO@Al2O3剂量为10-250mg/L。
10.根据权利要求9所述的负载型纳米氧化锌的应用，其特征在于：以PBS溶液作为灭菌体系的细菌分散剂。
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