CN111705155A - Est-ssr标记鉴定换锦花和中国石蒜杂交种方法和引物 - Google Patents

Est-ssr标记鉴定换锦花和中国石蒜杂交种方法和引物 Download PDF

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CN111705155A CN202010667183.8A CN202010667183A CN111705155A CN 111705155 A CN111705155 A CN 111705155A CN 202010667183 A CN202010667183 A CN 202010667183A CN 111705155 A CN111705155 A CN 111705155A
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Abstract

本申请公开了一种利用EST‑SSR标记鉴定换锦花和中国石蒜杂交种的方法，本申请还公开了基于换锦花转录组序列的EST‑SSR核心引物组以及EST‑SSR标记在换锦花和中国石蒜杂交种鉴定中的应用。利用EST‑SSR核心引物建立快速鉴定换锦花和中国石蒜杂交种F1的真实性的EST‑SSR技术体系，为石蒜属种间杂交提供验证方法，缩短石蒜属杂交品种选育的周期。

Description

EST-SSR标记鉴定换锦花和中国石蒜杂交种方法和引物
技术领域
本申请涉及EST-SSR标记鉴定换锦花和中国石蒜杂交种方法和引物。
背景技术
石蒜属植物花色丰富，花型优美，杂交育种一直石蒜属植的遗传育种的重要手段。一般情况下，石蒜属杂交种F1代从种子播种到开花需要5～6年的时间，生长周期长，因而在生长的早期不能正确检测石蒜属植物的杂交种F1真实性。目前由于石蒜属植物生长周期长使田间性状调查等形态学鉴定方法影响杂交鉴定和后续育种工作效率。而对亲本与杂种的RAPD标记、ISSR标记和AFLP标记等方面的研究仅仅对现在的杂交种进行可能的亲本的确定。而对于杂交种真实性的早期鉴定未见报道。随着现代生物科技的迅速发展，基于转录组测序所开发的EST-SSR标记具有在基因组中分布广泛、多态性高、共显性、检测程序简单等优点，被广泛应用于番茄、茄子、花生、马铃薯、美洲黑杨、西瓜、大豆等杂交种真实性和纯度鉴定及指纹图谱标记等，因而对比田间性状调查鉴定而言，SSR种间杂种鉴定技术具有能够克服田间鉴定所需周期长、成本高、不便捷的优点，极具可靠性，为后续工作提供技术支撑和决策依据，减少假杂种造成经济损失和育种失误，因而可以更加广泛地应用于生产销售中。
本申请以石蒜属植物换锦花和中国石蒜两个种为亲本所区的种间杂交种F1为材料，采用本研究EST-SSR标记筛选特征谱带，建立快速鉴定换锦花和中国石蒜杂交种F1的真实性的EST-SSR技术体系，为石蒜属种间杂交提供验证方法，缩短石蒜属杂交品种选育的周期。
发明内容
基于此，本申请的目的之一在于提供一种利用EST-SSR标记鉴定换锦花和中国石蒜杂交种的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样品基因组的DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，基于换锦花转录组序列的EST-SSR核心引物组进行PCR扩增，得到不同长度的扩展产物；所述EST-SSR核心引物组包括下述3对引物中的至少2对，每对引物由上游引物和下游引物组成，每对引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，其中编号为奇数的核苷酸序列为上游引物，编号为偶数的核苷酸序列为下游引物；
(3)对步骤(2)所得不同长度的扩增产物进行测序分型。
在一个实施方案中，上述步骤(2)所述的EST-SSR核心引物组包括上述的3对引物。
在一个实施方案中，上述步骤(1)所述的基于换锦花转录组序列的EST-SSR核心引物组由以下方法筛选得到：基于换锦花转录组的序列，筛选EST序列，搜索EST序列中的SSR位点，针对SSR位点设计、合成目标引物，对所合成的目标引物进行PCR扩增、再对扩增产物通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析，筛选得到权利要求1所述的换锦花EST-SSR分子标记的引物组。
在一个实施方案中，上述SSR位点的搜索限制条件为单核苷酸最少重复次数为10次，2～3核苷酸最少重复次数为6次，4～6核苷酸最少重复次数为5次。
在一个实施方案中，上述PCR扩增的最佳体系反应体系(10.0μl)为：Taq 1.0U，MgCl2 1.0mmol·L-1，dNTPs 0.2mmol·L-1，引物0.8μmol·L-1，DNA 40ng。
本申请的目的之二在于提供一种基于换锦花转录组序列的EST-SSR核心引物组，其所述核心引物组包括下述3对引物中的至少2对，每对引物由上游引物和下游引物组成，每对引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQID NO.5和SEQ ID NO.6，其中编号为奇数的核苷酸序列为上游引物，编号为偶数的核苷酸序列为下游引物。
在一个实施方案中，所述的EST-SSR核心引物组包括上述的3对引物。
本申请的目的之三在于提供EST-SSR标记在换锦花和中国石蒜杂交种鉴定中的应用，商述EST-SSR标记为基于换锦花转录组序列的EST-SSR核心引物组中的至少2对。
本申请的发明人通过已测序的换锦花转录组信息，进一步构建了换锦花的EST序列，进而通过海量的工作开发并筛选出3对种间及石蒜属植物间多态性的EST-SSR核心引物，利用EST-SSR核心引物建立快速鉴定换锦花和中国石蒜杂交种F1的真实性的EST-SSR技术体系，为石蒜属种间杂交提供验证方法，缩短石蒜属杂交品种选育的周期。
附图说明
图1为换锦花EST-SSR核心引物组109、220、46在中国石蒜和换锦花中的扩增；
图2为换锦花EST-SSR核心引物对109在换锦花为父本和以中国石蒜为母本的杂交种中的扩增；
图3为换锦花EST-SSR核心引物对220在以换锦花为母本和以中国石蒜为父本的杂交种中的扩增；
图4为换锦花EST-SSR核心引物对46在以换锦花为母本和以中国石蒜为父本的杂交种中的扩增；
图5为换锦花EST-SSR核心引物对46在换锦花为父本和以中国石蒜为母本的杂交种中的扩增。
具体实施方式
以下对本申请的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本申请，并不用于限制本申请。
实施例1用于说明换锦花EST-SSR标记开发
1材料与方法：
1.1植物材料
2017年3月于浙江农林大学遗传学科石蒜属植物种质资源圃试验材料30份换锦花(浙江农林大学和江苏宜兴各15份)叶片。
1.2换锦花转录组EST-SSR序列特征分析及SSR引物设计
采用CTAB法提取材料基因组DNA，换锦花转录组信息来自于课题组前期用换锦花进行转录测序拼接后的53 362条Unigene，利用perl脚本MISA对Unigene中的SSR位点进行分析。参数设置为：SSR重复单元包括1～6核苷酸，其中单核苷酸最少重复次数为10次，2～3核苷酸最少重复次数为6次，4～6核苷酸最少重复次数为5次。
利用MISA得出的SSR位点信息，结合Primer 3.0批量设计SSR引物，主要参数为：扩增片段长度80～300bp，引物长度18～28nt，退火温度为50～60℃，GC含量40％～60％，每个SSR位点设计3对引物。
随机选取278对SSR引物(南京金斯瑞生物公司)用于引物的通用性和多态性筛选。
1.3换锦花EST-SSR体系优化和引物筛选
采用五因素四水平(L16-4-5)正交试验，对Taq DNA聚合酶，MgCl2，dNTPs，EST-SSR引物和DNA进行换锦花EST-SSR体系进行优化。PCR反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30S，退火温度30S，72℃延伸30S，循环35次；72℃延伸10min；16℃保温30min。
表1换锦花EST-SSR体系设计表
Figure BDA0002580786290000031
Figure BDA0002580786290000041
1.4非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳反应体系的优化
SSR-PCR扩增产物采用10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测。具体操作步骤如下：
(1)处理胶板：取玻璃板，用清水洗干净，放置将其自然晾干备用。用无水乙醇将平玻璃和粘条玻璃两面分别拭擦，然后将其自然晾干。
(2)将晾干后的玻璃用塑料封条固定，再用1％的液体琼脂糖凝胶将底部和侧边封住，并且用金属夹子夹住固定，防止PAGE胶流出。
(3)10％PAGE胶的配制：30％丙烯酰胺和TEMED购买于上海生工。其中30％丙烯酰胺放置于4℃冰箱，TEMED放于阴暗处。
5×TBE配置方法：54gTris，27.5g硼酸，20ml 0.5mol/L EDTA调节pH至8.0放在4℃冰箱保存备用。
10％APS的配制：10g过硫酸铵，90g灭过菌的ddH2O摇匀放在4℃冰箱保存备用。
10％PAGE胶制备：两板的量为18.2ml，将烧杯用无菌水润洗后加入18.2ml无菌ddH2O，再分别加入13.4ml 30％丙烯酰胺，8ml 5×TBE，400μL 10％APS，40μL TEMED，快速充分摇匀，迅速倒入两个玻璃板之间，倒的时候要尽量匀速，注意流量，防止气泡产生，然后将洗干净的梳子插入玻璃板之间，将玻璃板上方流出的胶擦干净。放平静置0.5小时以上可以跑电泳。
(4)电泳：将金属固定夹和塑料封条拿掉，放入电泳槽内，所用电泳仪为北京六一DYCZ-30C型双板夹芯式垂直注塑电泳仪。确定拧紧以后，在其中间倒入0.5×TBE缓冲液，液面高出胶面上方1～2cm，两端倒一半。将加样梳小心拔掉，防止产生气泡，检查点样孔是否完整，小心吹赶走气泡，160V电压，预电泳15min，停止电泳，取扩增产物0.6μL与0.2μL 6×Loading buffer混合，0.8μL 500bp marker，电泳约90min，当迁移至胶板下边缘时，结束电泳。取清水于水盒中，将胶板倒扣在水中，反复拿出放入，直到胶完整脱落于水中。
(5)固定：固定液配置，使用无水乙醇100mL，冰醋酸5mL加双蒸水定容至1L。放在摇床固定5～10min后清水冲洗。
(6)银染：染色液配置，硝酸银2g加双蒸水定容至1L，摇床染色3min后清水冲洗。
(7)显色：显色液配置，氢氧化钠30g加双蒸水定容至1L加甲醛13.6mL，置于摇床显色约3min至条带全部出现为止。
(8)定影：将显色后的胶放置在适量的10％乙酸之中约1min，用清水冲洗干净残留的乙酸后置于X线胶片观察灯上进行拍照以及条带分析。
1.5引物筛选和有效性分析
利用最佳SSR-PCR体系对随机选择278对引物进行筛选。首先用1个换锦花材料筛选条带清晰和重复性好的引物；再用7个不同石蒜种群植物进行复筛；最后用形态差异较明显的30个材料筛选条带清晰，具多态性的引物，用于换锦花种质资源的遗传多样性研究。
SSR-PCR扩增产物采用10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测，电压200V，电泳90min后银染显色。显色后将胶片置于X线胶片观察灯上进行观察拍照。
1.6数据统计与分析
采用人工读带的方法进行数据统计，稳定清晰可重复的条带记做1，相同位置不清楚或者无条带则记为0，构建矩阵，再用NTSYS2.10软件，UPGMA法绘制聚类图。
2.结果与分析
2.1换锦花EST-SSR数据分析
换锦花EST-SSR转录组数据重复类型丰富，从单核苷酸至六核苷酸都有不同的重复基元。53 362条Unigene中8 333条中，共检测到9 918个SSR位点，其中1 330条Unigene包括1个以上的SSR位点。具有SSR的Unigene大部分只有1个SSR位点，而包括3个及以上SSR位点的Unigene极少。SSR重复单元主要为1～3个碱基，其中单碱基重复最多，占SSR总数61.08％，三碱基和二碱基的频率为23.22％和14.23％，4碱基及以上重复单元相对较少，转录组中的SSR分布密度约为268个/Mb。碱基重复次数丰富，为5～23次。其中重复次数最多的在5～10之间，有5 882个，约占59.3％；11～20次之间的有3 835个，约占38.67％；大于20次的最少，有201个，约为2.03％。
表2换锦花EST-SSR的类型、数量和频率分布
Figure BDA0002580786290000061
2.2换锦花EST-SSR的特征
换锦花转录组SSR位点中，数量较多的是单核苷酸、三核苷酸和二核苷酸，其中单核苷酸最多的是A/T(97.23％)；二核苷酸最多的为AG/CT(68.25％)；三核苷酸最多的为AAG/CTT(30.01％)；四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸含量较少，分布比较为弥散。
表3换锦花EST-SSR不同基元频率分布表
Figure BDA0002580786290000062
2.3换锦花EST-SSR反应体系优化结果
采用正交设计试验方法对引物1的EST-SSR反应体系进行优化，结果表明第11组中无条带扩增，第2、3、9、10组合杂带较少，目的片段清晰，效果较好。重复试验发现组合9的重复性最好，因此确定EST-PCR的最佳体系反应体系(10.0μl)为：Taq 1.0U，MgCl2 1.0mmol·L-1，dNTPs 0.2mmol·L-1，引物0.8μmol·L-1，DNA 40ng。
2.4换锦花EST-SSR引物的筛选
利用MISA得出的SSR位点信息，结合Primer5.0批量设计SSR引物，从中挑选278对进行引物的有效性和多态性筛选。
从278对引物中筛选出185对能够清晰稳定扩增出条带的引物，有效性引物约为66.55％；再用石蒜属7个种复筛得到的59对有效引物用于30份浙江和江苏地区的换锦花。
实施例2用于说明换锦花EST-SSR标记在换锦花和中国石蒜杂交种鉴定中的应用
1材料和方法
1.1植物材料
亲本换锦花和中国石蒜各7份，换锦花和中国石蒜正反交杂交F1代2年生幼苗共113份材料，均种植于浙江农林大学遗传学科石蒜属植物种质资源圃。试验所用换锦花EST-SSR引物于南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
1.2基因组DNA提取和EST-SSR扩增
换锦花、中国石蒜及其杂交种F1代幼苗叶片基因组DNA用CTAB法，对经检测在石蒜属植物中通用的实施例1所描述的59对SSR引物在分别在父母本(中国石蒜和换锦花)种内一致、且种间具有多态性、且具有特异、单一且重复性好的条带的引物进行筛选，所得引物用于杂交种鉴定。
EST-SSR PCR扩增体系参照前面正交分析优化的最佳反应体系(10.0μl)：包括Taq1.0U，MgCl2 1.0mmol·L-1，dNTPs 0.2mmol·L-1，引物0.8μmol·L-1，DNA 40ng。PCR扩增反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30S，退火温度30S，72℃延伸30S，循环35次；72℃延伸10min；16℃保温30min。
SSR-PCR扩增产物采用10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测，电压200V，电泳90min后银染显色。显色后将胶片置于X线胶片观察灯上进行观察拍照。
1.3 F1杂种鉴定
对于共显性标记SSR分子标记，对杂种F1代PCR扩增产物中，通过比较亲本与杂种PCR扩增条带，杂种F1具有父母本互补型或有父本型扩增带型的样品鉴定为真杂种，反之仅有母本型条带鉴定为假杂种。
杂交率(％)＝杂交成功样本数/样本总数×100％
2结果与分析
2.1亲本间特征型SSR引物的筛选
利用59对在石蒜属通用的SSR引物对亲本中国石蒜和换锦花各7个单株进行种内一致性和种间多态性分析，筛选出3对多态性好的引物(见图1)，其中引物109仅有换锦花有特征条带，因而可以作为以换锦花为父本的杂交种鉴定；引物220仅在中国石蒜中检测到特征条带，可以作为以中国石蒜为父本的杂交种鉴定；而引物46在中国石蒜和换锦花中均检测到有单一、互补、重复性好的特征性条带，可以用于中国石蒜和换锦花的所有正反杂交的杂交种的鉴定。
表4可用于杂交种鉴定的引物
Figure BDA0002580786290000081
2.2杂交种F1的鉴定
用筛选出的3对引物(109、220、46)对中国石蒜和换锦花杂交种进行鉴定，引物109对63个以换锦花为父本的杂交种F1及亲本作谱带特征性分析，PCR扩增产物大小为150-200bp，除了4、9、17、18、48号样品外(见图2)，其余均鉴定出有父本特征条带，可以初步判断该引物对杂交种F1的检出率为92.06％。
引物220对46个以中国石蒜为父本的杂交种F1及亲本进行特征带分析，其拉增产物大小为200-300bp，其中样品22无扩增条带，11和132样品仅检测到母本的特征条带(见图3)，被认为是假杂种，因而可以认为该引物对杂交种F1的杂交率为检定为93.48％。
引物46对换锦花和中国石蒜正反交的杂交种F1特征谱带的检测，发现在46个换锦花(♀)×中国石蒜(♂)杂交种F1中，样品22和25则无扩增条带，11、18、19和32仅检测到母本的特异性条带(见图4)，可以认为是假杂种，其他40个样品均存在父母本的特征条带，可以认为是真杂种，因杂交种检出率为86.96％。在67个以换锦花(♂)为父本和以中国石蒜(♀)为母本的杂交种中，除样品16无扩增条带外，其余98.5％的样品均检测到父母本的特征条带(见图5)，判定为真杂种。
为进一步分析中国石蒜和换锦花杂交种F1的真实性，将3对引物相结合对杂交种F1进行PCR扩增，引物46+引物109对63个H(♂)×Z(♀)检测的杂交率为90.48％；引物46+引物220对46个H(♀)×Z(♂)检测的杂交率为86.96％。可以说明利用多对引物结合对杂交种F1的真实性检测更为准确。
表9杂交率统计表
Figure BDA0002580786290000091
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 浙江农林大学
<120> EST-SSR标记鉴定换锦花和中国石蒜杂交种方法和引物
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggcgcaga agaccctatc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgaggatgac atggacggag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgttccatct gccttgcact 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tatgaaccag tcgtgccgtc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgtagaaacg ggtgcatgct 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cggtaagctc accaacaggt 20

Claims (8)

1.一种利用EST-SSR标记鉴定换锦花和中国石蒜杂交种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测样品基因组的DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，基于换锦花转录组序列的EST-SSR核心引物组进行PCR扩增，得到不同长度的扩展产物；所述EST-SSR核心引物组包括下述3对引物中的至少2对，每对引物由上游引物和下游引物组成，每对引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，其中编号为奇数的核苷酸序列为上游引物，编号为偶数的核苷酸序列为下游引物；
(3)对步骤(2)所得不同长度的扩增产物进行测序分型。
2.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的EST-SSR核心引物组包括权利要求1所述的3对引物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的基于换锦花转录组序列的EST-SSR核心引物组由以下方法筛选得到：基于换锦花转录组的序列，筛选EST序列，搜索EST序列中的SSR位点，针对SSR位点设计、合成目标引物，对所合成的目标引物进行PCR扩增、再对扩增产物通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析，筛选得到权利要求1所述的换锦花EST-SSR分子标记的引物组。
4.根据权利要求3所述的分子标记，其特征在于，所述SSR位点的搜索限制条件为单核苷酸最少重复次数为10次，2～3核苷酸最少重复次数为6次，4～6核苷酸最少重复次数为5次。
5.根据权利要求3所述的分子标记，其特征在于，所述PCR扩增的最佳体系反应体系(10.0μl)为：Taq 1.0U，MgCl2 1.0mmol·L-1，dNTPs 0.2mmol·L-1，引物0.8μmol·L-1，DNA40ng。
6.一种基于换锦花转录组序列的EST-SSR核心引物组，其特征在于，所述核心引物组包括下述3对引物中的至少2对，每对引物由上游引物和下游引物组成，每对引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6，其中编号为奇数的核苷酸序列为上游引物，编号为偶数的核苷酸序列为下游引物。
7.根据权利要求2所述的EST-SSR核心引物组，其特征在于，所述的EST-SSR核心引物组包括权利要求6所述的3对引物。
8.EST-SSR标记在换锦花和中国石蒜杂交种鉴定中的应用，其特征在于，所述EST-SSR标记为基于换锦花转录组序列的EST-SSR核心引物组中的至少2对。
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