CN111704856B - 一种γ-聚谷氨酸-聚阳离子复合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种γ‑聚谷氨酸‑聚阳离子复合物及其制备方法与应用，它是由带负电荷的小分子量γ‑聚谷氨酸和带正电荷的聚阳离子化合物通过电荷间相互作用形成的聚氨基酸复合物；所述γ‑聚谷氨酸通过微生物发酵法获得，分子量范围为5000～10000道尔顿，优选5000道尔顿；所述聚阳离子化合物为聚赖氨酸、羧甲基壳聚糖、壳聚糖季铵盐、聚赖氨酸盐酸盐中的任意一种。将该复合物作为医疗器械表面抗污涂层，能够稳定黏附在医疗器械表面，作用时间长，且有效隔绝微生物在器械表面的生长，抑制微生物在表面上的粘附。

Description

一种γ-聚谷氨酸-聚阳离子复合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于抗菌技术领域，具体涉及一种γ-聚谷氨酸-聚阳离子复合物及其制备方法与应用。

背景技术

手术中的医疗器械污染常常导致医疗器械失效和降低使用寿命。不可控的医疗器械污染危险大大提高了手术过程中潜在的风险和手术成本。植入性医疗器械，譬如医用导尿管，静脉导管等也因为具有被污染的风险而在使用过程中备受限制。研究发现，医疗器械容易被细菌在其表面粘附形成生物膜，被污染的医疗器械是导致细菌感染和耐药性形成的关键原因。目前，针对生物膜形成的机制，常见的医疗器械抗污手段是通过化学接枝的方法，将一些抗污化合物诸如银离子，抗菌剂接枝在医疗器械表面产生主动杀菌效果，但是这种涂层制备方法步骤繁琐，生物可持续性不高，且主动性杀菌手段会造成死亡的微生物大量堆积在器械表面，从而造成抑菌失效。近年来，抗细菌粘附表面构建策略不断发展，在湿润环境下，亲水性高分子由于能减弱微生物的黏附作用从而减少细菌的粘附数量，有效避免细菌定殖。然而，单一构建的亲水性涂层存在功能较为单一，持久性抗菌效果较差等缺点。

公开号为CN 105268015 B的发明公开了一种抗菌性水凝胶复合材料及其制备方法，其提供的抗菌性创伤修复材料是一种由壳聚糖和γ-聚谷氨酸以1/0.5-2的质量比通过静电相互作用而形成的水凝胶，并在水凝胶上以PVP为分散剂原位合成负载了纳米银；该创伤修复材料在成胶过程中有乙酸的添加，影响生物相容性，后续纯化过程较为繁琐，且形成的凝胶锚定性差，难以稳定黏附在医疗器械表面，实际应用存在弊端。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种具备有效抗菌能力，且生物相容高、不溶于水的γ-聚谷氨酸-聚阳离子复合物，并将其作为医疗器材表面的抗污涂层。

本发明进一步解决的技术问题是提供该γ-聚谷氨酸-聚阳离子复合物的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：

一种γ-聚谷氨酸-聚阳离子复合物，它是由带负电荷的小分子量γ-聚谷氨酸和带正电荷的聚阳离子化合物通过电荷间相互作用形成的聚氨基酸复合物；

所述γ-聚谷氨酸通过生物发酵法获得，分子量范围为5000～10000道尔顿，优选5000道尔顿；

所述聚阳离子化合物为聚赖氨酸、羧甲基壳聚糖、壳聚糖季铵盐、聚赖氨酸盐酸盐中的任意一种。

其中，本发明中所述聚谷氨酸为分子量范围在5000～10000道尔顿的聚谷氨酸，又称之为小分子聚谷氨酸。由于聚谷氨酸通常分子量范围较大，所具有的的长直链高分子结构在与相应化学基团反应时极易发生缠绕交联从而形成凝胶，而本发明中所使用的小分子聚谷氨酸由于分子量＜10000道尔顿，在与阳离子反应中由于链长较短，因此易发生沉积作用，形成沉淀，另一方面，较小分子量的聚谷氨酸相较于其他分子量的聚谷氨酸有更优异的保湿保水力，小分子量γ-聚谷氨酸侧链丰富亲水性基团能更有效减少微生物黏附作用，侧链游离羧基具有的的强亲水性能够降低细菌和表面之间的粘附作用起到超润滑抗污的作用。聚阳离子化合物解离的阳离子基团能够起到主动杀菌的效果，通过这种抗菌-亲水协同功能，能够有效地降低医疗器械表面微生物的定殖和粘附，降低医疗器械使用成本，改善目前医疗卫生领域微生物带来的医疗污染等问题。

聚氨基酸是氨基酸分子间互以氨基和羧基缩合而成的聚合物，是一类可以由微生物代谢产生的一类天然高分子化合物，天然存在的聚氨基酸包括两种，γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和聚赖氨酸(ε-PL)。由于聚氨基酸来源于天然，因此生物相容高，一些聚氨基酸由于其结构不同还具有不同的特点，譬如聚赖氨酸由于其侧链上含有丰富的阳离子基团，可以起到极强的抑菌作用，γ-聚谷氨酸含有的丰富的羧基，使其具有极强的保水能力，且来源天然，细胞亲和性高。

壳聚糖是一种天然阳离子多糖，具有天然的抗菌功能，然而水溶性较差，且只溶于弱酸溶液中，羧甲基壳聚糖和壳聚糖季铵盐是一类由壳聚糖衍生而来的化合物，其分子量在2000～6000道尔顿左右，相较于壳聚糖，羧甲基壳聚糖和壳聚糖季铵盐能溶于水且分子量更小。

具体地，所述γ-聚谷氨酸与聚阳离子化合物的质量比为1:1～1:3，优选1:1～1:2。

具体地，所述聚赖氨酸、聚赖氨酸盐酸盐的分子量为2500～4500道尔顿，优选2500道尔顿；

所述羧甲基壳聚糖、壳聚糖季铵盐的分子量为2000～5000道尔顿，优选2000道尔顿。

本发明进一步提供上述γ-聚谷氨酸-聚阳离子复合物的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)将带正电荷的聚阳离子化合物溶于水中，得到聚阳离子溶液；同时，将γ-聚谷氨酸溶于水中，得到聚阴离子溶液；

(2)将步骤(1)得到的聚阳离子溶液和聚阴离子溶液混合搅拌，得到γ-聚谷氨酸-聚阳离子复合物沉淀；

(3)将步骤(2)得到的γ-聚谷氨酸-聚阳离子复合物沉淀进行离心分离，水洗后真空干燥，即得。

步骤(1)中，所述聚阳离子溶液中聚阳离子化合物的浓度为20～180g/L；所述聚阴离子溶液中γ-聚谷氨酸的质量浓度为20～60g/L。

所述聚阳离子溶液和聚阴离子溶液混合的温度控制在0～60℃之间；混合搅拌的搅拌速率控制在80～120rpm/min，时间为30s～5min。

本发明进一步要求保护上述γ-聚谷氨酸-聚阳离子复合物作为医疗器械表面抗污涂层的应用。

具体地，将上述γ-聚谷氨酸-聚阳离子复合物溶解于有机溶剂后，均匀涂覆于医疗器械表面，然后经真空干燥，即可在医疗器械表面形成抗污涂层。

优选地，所述有机溶剂为乙醇或乙酸乙酯，γ-聚谷氨酸-聚阳离子复合物以0.5～2wt％的浓度溶解于有机溶剂中；所述医疗器械的表面材质为聚酯、聚乙烯、硅橡胶、铁或铁的合金。

优选地，所述真空干燥的温度为40℃，真空度低于101Kpa，干燥时间为10～20h。

有益效果：

(1)本发明通过离子间络合作用制备了一种新型的聚氨基酸抗污复合物，在以往研究的基础上，通过在医用器材表面涂覆以小分子量γ-聚谷氨酸和聚阳离子化合物为原料的抗污复合物，该复合物黏附在医疗器械表面后性质稳定，作用时间长。能够有效隔绝微生物在器械表面的生长，抑制微生物在表面上的粘附作用，对于大肠杆菌灭菌率≥99.1％，对金黄色葡萄球菌灭菌率≥97％。聚合物涂层在涂覆到基质表面以后具有良好的锚定性，在PBS7.4缓冲液中浸泡10天后涂层仍然无脱落和溶胀现象且仍保持完整的抗污抑菌效果，该聚氨基酸抗污复合物涂层能够有效解决手术中伤口感染的问题，并延长医疗器械使用寿命。

(2)本发明制备过程简单，制备条件简单易行，所用溶剂组织无刺激性，形成的抗污复合物生物相容性高，产物能够满足工业化规模生产的需要，在抗污以及医疗器械领域具有较大的应用前景。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1是实施例1制备的γ-PGA-ε-PL抗污涂层扫描电镜图。

图2是实施例2制备的γ-PGA-羧甲基壳聚糖抗污涂层扫描电镜图。

图3是实施例3制备的γ-PGA-壳聚糖季铵盐抗污涂层扫描电镜图。

图4是本发明制备的3种γ-PGA-聚阳离抗污复合物涂层生物相容性评价结果。

图5为对比例制备的白色半透明凝胶状固体实物照片。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。

实施例1

(1)将γ-PGA粉末(分子量为5000道尔顿)溶于水中，得到浓度为20g/L的聚阴离子溶液；将ε-PL粉末(分子量为2500道尔顿)溶于水中，得到浓度为40g/L的聚阳离子溶液。

(2)按照γ-PGA与ε-PL的质量比为1:2将聚阴离子溶液和聚阳离子溶液混合搅拌，常温混合搅拌的搅拌速率控制在80rpm/min，时间为2min，通过旋转式真空水泵抽滤，得到白色不溶性γ-PGA-ε-PL复合物沉淀。

(3)将步骤(2)得到的γ-PGA-ε-PL复合物沉淀进行离心分离，水洗后真空干燥，得到γ-PGA-ε-PL复合物粉末。

(4)将γ-PGA-ε-PL复合物粉末溶于乙醇溶液中，配成质量浓度为1wt％的溶液，然后涂抹至商业化医用聚乙烯植入物表面，随后对医用聚乙烯进行真空干燥处理，真空干燥温度为40℃，真空度低于101Kpa，时间为15h，得到均匀涂覆抗污涂层的医用聚乙烯植入物。

实施例2

(1)将γ-PGA粉末(分子量为5000道尔顿)溶于水中，得到浓度为20g/L的聚阴离子溶液；将羧甲基壳聚糖粉末(分子量为2500道尔顿)溶于水中，得到浓度为40g/L的聚阳离子溶液。

(2)按照γ-PGA与羧甲基壳聚糖的质量比为1:2将聚阴离子溶液和聚阳离子溶液混合搅拌，常温混合搅拌的搅拌速率控制在80rpm/min，时间为2min，通过旋转式真空水泵抽滤，得到白色不溶性γ-PGA-羧甲基壳聚糖复合物沉淀。

(3)将步骤(2)得到的γ-PGA-羧甲基壳聚糖复合物沉淀进行离心分离，水洗后真空干燥，得到γ-PGA-羧甲基壳聚糖复合物粉末。

(4)将γ-PGA-羧甲基壳聚糖复合物粉末溶于乙醇溶液中，配成质量浓度为1wt％的溶液，然后涂覆至商业化医用聚乙烯植入物表面，随后对医用聚乙烯植入物表面进行真空干燥处理，真空干燥温度为40℃，真空度低于101Kpa，时间为15h，得到均匀涂覆抗污涂层的医用聚乙烯植入物表面。

实施例3

(1)将γ-PGA粉末(分子量为5000道尔顿)溶于水中，得到浓度为20g/L的聚阴离子溶液；将壳聚糖季铵盐粉末(分子量为2500道尔顿)溶于水中，得到浓度为40g/L的聚阳离子溶液。

(2)按照γ-PGA与壳聚糖季铵盐的质量比为1:2将聚阴离子溶液和聚阳离子溶液混合搅拌，常温混合搅拌的搅拌速率控制在80rpm/min，时间为2min，通过旋转式真空水泵抽滤，得到白色不溶性γ-PGA-壳聚糖季铵盐复合物沉淀。

(3)将步骤(2)得到的γ-PGA-壳聚糖季铵盐复合物沉淀进行离心分离，水洗后真空干燥，得到γ-PGA-壳聚糖季铵盐复合物粉末。

(4)将γ-PGA-壳聚糖季铵盐复合物粉末溶于乙醇溶液中，配成质量浓度为1wt％的溶液，然后涂覆至商业化医用聚乙烯植入物表面，随后对医用聚乙烯植入物表面进行真空干燥处理，真空干燥温度为40℃，真空度低于101Kpa，时间为15h，得到均匀涂覆抗污涂层的医用聚乙烯植入物表面。

实施例4

分别剪取实施例1～3制备均匀涂覆抗污涂层的静脉硅橡胶导管，获得扫描电镜照片，结果如图1～3所示。其中，图1为实施例1制备的γ-PGA-ε-PL抗污涂层微观形貌，图2为实施例2制备的γ-PGA-羧甲基壳聚糖抗污涂层微观形貌，图3为实施例3制备的γ-PGA-壳聚糖季铵盐抗污涂层微观形貌。从图中可知，实施例1～3均能形成稳定的具有抗污功能的抗污涂层。相较于实施例1，实施例2中制得的抗污复合物涂层呈现大的较为稀松的涂层分布，实施例3中的抗污复合物涂层斑块最小且分布不够均匀，实施例1中的抗污涂层斑块均匀致密。由此可见，三者中实施例1条件下制得的γ-PGA-ε-PL抗污复合物涂层分布最为均匀，形成的复合物斑块相对较大且粘附牢固。

实施例5

将上述实施例1～3制得的抗污涂层分别按照下述实验过程进行生物相容性评价。

(1)γ-PGA-聚阳离子抗污复合物涂层的准备：首先将各实施例中涂覆抗污涂层的静脉硅橡胶导管剪成直径为1cm的圆形并在超净工作台上紫外线照射2h，然后用无菌PBS冲洗3遍，将抗污涂层材料浸泡在DMEM细胞培养液中过夜备用。

(2)细胞在材料上的增殖情况(MTT实验)：将L929细胞按1×106每孔接种于12孔培养板中，在其中6孔中细胞液加入抗污涂层材料，另外6孔为空白对照组(Control)。分别在培养1d、3d、5d时加入100μL MTT试剂并在37℃下孵育4h，然后加入150μL DMSO溶解甲瓒沉淀，通过酶标仪测定培养液在570nm和630nm波长下的吸收值，计算细胞增值率，计算公式为：

实验每组进行6个平行实验，取平均值减小系统误差。

实验结果如图4所示，实施例1～3细胞存活率均超过85％，在实施例1中细胞存活率超过90％。实验表明实施例1～3制得的抗污材料均具有良好的生物相容性。

实施例6

将上述实施例1～3制得的抗污涂层分别进行动态接触条件下的抗菌性评价(参照测试标准ASTM E2149-2013a)，结果见表1。

表1

	实施例1	实施例2	实施例3	空白对照
					大肠杆菌	99.1％	97.2％	97.1％	0
金黄色葡萄球菌	99.5％	97.8％	98.4％	0

从表1可以看出，各实施例制备的γ-PGA-ε-PL抗污复合物涂层、γ-PGA-羧甲基壳聚糖抗污复合物涂层、γ-PGA-壳聚糖季铵盐抗污复合物涂层处理的硅橡胶导管内部表面微生物粘附率远低于空白对照组，可以有效降低病原微生物的粘附和生长，具有优秀的抗污效果。

将上述实施例1～3制得的抗污涂层分别在PBS中浸泡10天后，进行动态接触条件下的抗菌性评价(参照测试标准ASTM E2149-2013a)，结果见表2。

表2

	实施例1	实施例2	实施例3	空白对照
					大肠杆菌	98.1％	96.7％	96.7％	0
金黄色葡萄球菌	98.2％	96.9％	96.5％	0

从表2可以看出，各实施例制备的γ-PGA-ε-PL抗污复合物涂层、γ-PGA-羧甲基壳聚糖抗污复合物涂层、γ-PGA-壳聚糖季铵盐抗污复合物涂层在浸泡十天后仍能保持较好的抗污杀菌作用，其完好率仍保持在96.5％以上。

对比例

(1)将γ-PGA粉末(分子量为：6×10⁵道尔顿)溶于水中，得到浓度为20g/L的聚阴离子溶液；将壳聚糖粉末(分子量为3×10⁵道尔顿，平均脱乙酰化程度≥85％)溶于乙酸水溶液中，得到浓度为40g/L的聚阳离子溶液。

(2)按照γ-PGA与ε-PL的质量比为1:2将聚阴离子溶液和聚阳离子溶液均匀混合后静置20min，得到半透明块状水凝胶。

实验结果如图5所示，分子量为6×10⁵道尔顿的γ-PGA和分子量为3×10⁵道尔顿的壳聚糖粉末在混合后迅速形成白色半透明凝胶状固体，并未形成复合物沉淀，且形成的固体不溶于水，难以再固定至固体医疗器械表面。

本发明提供了一种γ-聚谷氨酸-聚阳离子复合物及其制备方法与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (7)

1.一种γ-聚谷氨酸-聚阳离子复合物，其特征在于，它是由带负电荷的小分子量γ-聚谷氨酸和带正电荷的聚阳离子化合物通过电荷间相互作用形成的聚氨基酸复合物；

所述γ-聚谷氨酸的分子量范围为5000～10000道尔顿；

所述聚阳离子化合物为聚赖氨酸、羧甲基壳聚糖、壳聚糖季铵盐、聚赖氨酸盐酸盐中的任意一种；

所述γ-聚谷氨酸与聚阳离子化合物的质量比为1:1～1:3；

所述γ-聚谷氨酸-聚阳离子复合物通过如下步骤制备得到：

（1）将带正电荷的聚阳离子化合物溶于水中，得到聚阳离子溶液；同时，将γ-聚谷氨酸溶于水中，得到聚阴离子溶液；

（2）将步骤（1）得到的聚阳离子溶液和聚阴离子溶液混合搅拌，得到γ-聚谷氨酸-聚阳离子复合物沉淀；

（3）将步骤（2）得到的γ-聚谷氨酸-聚阳离子复合物沉淀进行离心分离，水洗后真空干燥，即得；

将γ-聚谷氨酸-聚阳离子复合物溶解于有机溶剂后，均匀涂覆于医疗器械表面，然后经真空干燥，在医疗器械表面形成抗污涂层；

所述聚赖氨酸、聚赖氨酸盐酸盐的分子量为2500～4500道尔顿；

所述羧甲基壳聚糖、壳聚糖季铵盐的分子量为2000~5000道尔顿。

2.根据权利要求1所述γ-聚谷氨酸-聚阳离子复合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述聚阳离子溶液中聚阳离子化合物的浓度为20~180 g/L；所述聚阴离子溶液中γ-聚谷氨酸的质量浓度为20~60 g/L。

3.根据权利要求1所述γ-聚谷氨酸-聚阳离子复合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述聚阳离子溶液和聚阴离子溶液混合的温度控制在0~60℃之间；混合搅拌的搅拌速率控制在80~120 rpm，时间为30 s~5 min。

4.权利要求1所述的γ-聚谷氨酸-聚阳离子复合物作为医疗器械表面抗污涂层的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将γ-聚谷氨酸-聚阳离子复合物溶解于有机溶剂后，均匀涂覆于医疗器械表面，然后经真空干燥，在医疗器械表面形成抗污涂层。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述有机溶剂为乙醇或乙酸乙酯，γ-聚谷氨酸-聚阳离子复合物以0.5~2wt%的浓度溶解于有机溶剂中；所述医疗器械的表面材质为聚酯、聚乙烯、硅橡胶、铁或铁的合金。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述真空干燥的温度为40℃，真空度低于101KP a，干燥时间为10~20h。

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