CN111701012A - Il-12在术后抗肿瘤方面的应用 - Google Patents

Il-12在术后抗肿瘤方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出IL‑12在术后抗肿瘤方面的应用,其为IL‑12在制备用于手术切除恶性肿瘤后预防和/或抑制残余肿瘤和/或转移的微小肿瘤的生长的药物中的用途。本发明证实了在手术后给出IL‑12能够显著抑制残余肿瘤和/或转移的微小肿瘤的生长，提高术后无瘤率，解决术后残余肿瘤及微小转移肿瘤生长导致的肿瘤复发问题，即联合手术使用IL‑12抗肿瘤可有效抑制肿瘤复发。

Description

IL-12在术后抗肿瘤方面的应用
技术领域
本发明属于生物制药领域，涉及白介素-12的新用途，特别涉及用于手术切除恶性肿瘤后预防和/或抑制残余肿瘤和/或转移的微小肿瘤的生长的药物中的用途。
背景技术
手术仍然是多数实体瘤减少肿瘤负荷以获得根治的最有效途径，从癌症手术发展史来看，癌症最早多用局部切除，后来发现局部切除不够彻底，改为“根治术”。然而，转移是恶性肿瘤生物学行为的特征性表现，也是临床治疗失败的主要原因。据统计，60％以上恶性肿瘤患者于初次诊断时发现有转移。现代医学对晚期肿瘤术后复发、转移的治疗，仍是以再手术、放化疗为主。除单一孤立病灶可通过再手术切除或放疗外，对于广泛病灶，放、化疗虽在一定程度上能控制转移，但其缓解率低，加上患者免疫功能薄弱，骨髓抑制情况严重以及多药耐药现象的存在，根治性放、化疗难以进行，所以临床上尚无控制肿瘤术后复发转移的有效手段。
并且，目前多数针对恶性肿瘤术后复发、转移的临床试验如多药联合化疗、介入术等，往往对病人打击比较大，引发多种并发症，如骨髓抑制、胃肠道反应，常导致病人无法承受治疗或者因为副作用而中断治疗，甚至发生副作用导致的严重不良事件。
白介素-12(Interleukin-12，IL-12)为现有物质，国外有临床研究中使用大剂量IL-12(500ng/kg)长期连续给药(单次给药后暂停14天，从第15天起连续给5天，再暂停15天，从第36天起再连续给药5天，暂停15天，每3周为1个治疗周期)的方式单独直接抗肿瘤，这些肿瘤包括转移性肾癌、黑色素瘤、结肠癌、复发性卵巢癌、颈部和头部癌等，但这种治疗方式在实体瘤中的临床效果并不乐观，仅有少数患者达到部分或完全反应。
考虑IL-12单一治疗的有限临床获益，还有一些研究者将其定位在肿瘤免疫辅助治疗上，探索联合给药肿瘤治疗的可行性。现有技术尝试将IL-12在临床试验中与常规化疗药物同用直接用于抗肿瘤，疗效也同样有限。IL-12的强大免疫调节功能是将其用于肿瘤治疗的基础，但人体免疫系统的复杂性往往导致临床试验结果的不尽人意。探索如何有效发挥IL-12的免疫调节功能，对抗肿瘤的生长及扩散，一直是业界努力的方向。
发明内容
本发明为解决术后残余肿瘤及微小转移肿瘤的生长导致的肿瘤复发的问题，提供一种能够有效抑制癌细胞生长、提高机体免疫监视及免疫清除功能，降低术后复发、转移率的新的方式，创造性的提出将IL-12用于人手术后预防和/或抑制残余肿瘤或微小转移肿瘤的生长的新用途。
本发明试验发现，IL-12对手术后残余肿瘤有良好的抑制作用。与以往不同的是，只需低剂量(人体1-10ng/kg)即可达到良好的抑制残余肿瘤的生长的作用，具体而言，发明人利用手术后残余肿瘤的动物模型来模拟临床上存在的不能将肿瘤细胞完全清扫或存在已经转移的微小肿瘤病灶的情况，观察IL-12对残余肿瘤或已转移微小肿瘤的作用，本发明证实了在手术后给予IL-12能够显著抑制残余肿瘤和/或转移的微小肿瘤的生长，提高术后无瘤率，解决术后残余肿瘤及微小转移肿瘤生长导致的肿瘤复发问题。即联合手术使用IL-12抗肿瘤可有效抑制肿瘤复发。
因而，本发明提供一种白介素-12在制备用于人手术切除恶性肿瘤后预防和/或抑制残余肿瘤和/或转移的微小肿瘤的生长的药物中的用途。
本发明充分考虑到肿瘤病人在发现肿瘤后采取的第一个措施多为手术治疗，尤其对还没有发现可见的转移肿瘤的情况下。手术治疗一方面减少肿瘤负荷，治疗由于肿瘤的局部压迫导致的病理变化，减少肿瘤细胞扩散的机会，同时给进一步的治疗创造更有利的条件。但是，手术往往不能完全清除肿瘤细胞，而且，即便在疾病的早期，往往已经有肿瘤细胞转移到其它部位，无法被目前的检测手段发现。这些播散的微小肿瘤往往就是导致肿瘤复发的原因，现有技术手段均不能有效抑制肿瘤的术后复发。本发明创造性地于手术后使用IL-12抗肿瘤，可有效调动体内自身免疫，达到机体精准识别肿瘤复发细胞，并有效抑制其生长的目的，显著降低肿瘤患者术后复发概率，可有效抑制肿瘤复发。同时，本发明采用的剂量为以往临床试验剂量的1/50-1/500，避免了高剂量IL-12可能引发的免疫负反馈抑制的发生，有效对抗肿瘤的生长及扩散，解决临床问题。
本发明前述恶性肿瘤包括但不限于非小细胞肺癌、原发性肝癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、结肠癌、复发性卵巢癌、颈部和头部癌中的一种或多种。
作为前述用途的一具体实施方式，该药物的每次给药剂量为1-100ng/Kg，优选10-100ng/Kg，进一步优选25-100ng/Kg，更优选50-100ng/Kg。可以理解的是，本领域技术人员可根据具体情况每次给药2、3、4、5、5.2、5.4、5.5、5.6、5.8、6、6.5、7、7.5、8、9、12、15、18、20、26、28、30、32、35、37、40、45、46、52、54、55、56、58、59、60、65、70、75、80、85、90或95ng/Kg。
作为前述用途的一具体实施方式，该药物通过皮下给药。
作为前述用途的一具体实施方式，每隔24或48小时皮下注射50-100ng/Kg的白介素-12；或每隔24或48小时皮下注射50-100ng/Kg的白介素-12；或每隔24或48小时皮下注射50-100ng/Kg的白介素-12。
本发明中Kg或kg表示的是给药对象的体重。
本发明显著低的给药剂量和显著低的给药频率即可达到良好的治疗效果，给药剂量的降低使得单位重量的白介素-12可应用于更多的给药对象，在临床上的实施将显著降低患者治疗费用；同时，显著降低的给药频率将增加患者肿瘤治疗的依从性，另外，低的给药频率及低的给药剂量也可避免免疫系统的负反馈调节，降低肿瘤细胞的耐药性。
本发明所述的药物的剂型可为冻干制剂。
在前述冻干制剂的一具体实施方式中，所述冻干制剂中包括白介素-12、磷酸缓冲盐PB、NaCl、人血白蛋白、海藻糖及甘露醇。
在前述冻干制剂的一具体实施方式中，当所述冻干制剂复溶为浓度为1-10μg/ml的白介素-12水溶液时，所述磷酸缓冲盐PB能将该水溶液的pH保持为6.0-7.2。
在前述冻干制剂的一具体实施方式中，将所述冻干制剂复溶成浓度为1-10μg/ml的白介素-12水溶液时，NaCl的浓度使得水溶液的渗透压为260-320mOsm/Kg，NaCl的浓度为1-20mg/ml，优选为5-10mg/ml，更优选为9mg/ml。可以理解的是，本领域技术人员可根据实际操作情况还可将NaCl的浓度调整为2、3、4、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18或19mg/ml。
在前述冻干制剂的一具体实施方式中，当将所述冻干制剂复溶成浓度为1-10μg/ml的白介素-12水溶液时，所述冻干制剂中人血白蛋白的浓度为0.5-2.0mg/ml，优选为1.0-1.5mg/ml，更优选为1.0mg/ml。可以理解的是，本领域技术人员可根据实际操作情况还可将人血白蛋白的浓度调整为0.6、0.7、0.8、0.9、1.1、1.2、1.3、1.4、1.6、1.7、1.8或1.9mg/ml。
在前述冻干制剂的一具体实施方式中，当将所述冻干制剂复溶成浓度为1-10μg/ml的白介素-12水溶液时，所述冻干制剂中海藻糖的浓度为0.5-2.0mg/ml，优选为1.0-1.5mg/ml，更优选为1.0mg/ml。可以理解的是，本领域技术人员可根据实际操作情况还可将海藻糖的浓度调整为0.6、0.7、0.8、0.9、1.1、1.2、1.3、1.4、1.6、1.7、1.8或1.9mg/ml。
在前述冻干制剂的一具体实施方式中，当将所述冻干制剂复溶成浓度为1-10μg/ml的白介素-12水溶液时，所述冻干制剂中甘露醇的浓度为50-150mg/ml，优选为50-100mg/ml，更优选为70mg/ml。可以理解的是，本领域技术人员可根据实际操作情况还可将甘露醇的浓度调整为55、60、65、75、80、85、90、95、105、110、115、120、125、130、135、140或145mg/ml。
在前述冻干制剂的一具体实施方式中，当所述冻干制剂复溶为浓度为1-10μg/ml的白介素-12水溶液时，所述磷酸缓冲盐PB能将该水溶液的pH保持为6.0，NaCl的浓度为9mg/ml、人血白蛋白的浓度为1.0mg/ml、海藻糖的浓度为1.0mg/ml和甘露醇的浓度为70mg/ml。
综上可知，本发明提供了一种白介素-12的新用途，用于预防和/或治疗恶性肿瘤术后复发及微小转移肿瘤，其通过手术后给予白介素-12，能有效调动机体的免疫力，刺激天然免疫和后天免疫功能，达到抑制残余肿瘤及转移微小肿瘤病灶的生长，降低肿瘤转移/复发率，显著提高术后无瘤率，低剂量(人体1-10ng/kg)，低频率即可达到良好的抑制残余肿瘤的生长的作用。
附图说明
图1为本发明实施例1中IL-12对人A549非小细胞肺癌细胞小鼠皮下移植瘤模型体重影响图，图中“#”表示与阳性对照比较p＜0.05；“##”表与阳性对照比较p＜0.01；“###”表示与阳性对照比较p＜0.001。图中，给药3天时，25ng/kg·48h组与阳性对照组比较p＜0.01，100ng/kg·24h组与阳性对照组比较p＜0.01；给药5天时，与阳性对照组比较，50ng/kg·48h组p＜0.05；给药7天时，与阳性对照组比较，50ng/kg·48h组p＜0.001；给药9天时，与阳性对照组比较，25ng/kg·48h组p＜0.001，50ng/kg·48h组p＜0.05，100ng/kg·48h组p＜0.001，100ng/kg·24h组p＜0.05；给药11天时，与阳性对照组比较，25ng/kg·48h组p＜0.01；
图2为本发明实施例1中IL-12对人A549非小细胞肺癌细胞小鼠皮下移植瘤模型生长的抑制影响图；
图3为本发明实施例2中IL-12对H22肝癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型体重影响图，图中图中“#”表示与阳性对照比较p＜0.05；“##”表与阳性对照比较p＜0.01；“###”表示与阳性对照比较p＜0.001。图中，给药5天时，25ng/kg·48h组与阳性对照组比较p＜0.01，50ng/kg·48h组p＜0.01，100ng/kg·24h组p＜0.001；给药8天时，与阳性对照组比较，50ng/kg·48h组p＜0.05，100ng/kg·48h组p＜0.01；给药10天时，与阳性对照组比较，50ng/kg·48h组p＜0.05，100ng/kg·48h组p＜0.001；给药12天时，与阳性对照组比较，25ng/kg·48h组p＜0.001，50ng/kg·48h组p＜0.05，100ng/kg·24h组p＜0.05；给药17天时，与阳性对照组比较，50ng/kg·48h组p＜0.05；
图4为本发明实施例2中IL-12对H22肝癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型生长的抑制影响图；
图5为本发明实施例3中IL-12对BGC823细胞小鼠皮下移植瘤模型体重影响图，图中“#”表示与阳性对照比较p＜0.05；“##”表与阳性对照比较p＜0.01；“###”表示与阳性对照比较p＜0.001。图中，给药5天时，50ng/kg·48h组与阳性对照组比较p＜0.05；给药7天时，与阳性对照组比较，25ng/kg·48h组p＜0.01，50ng/kg·48h组p＜0.05；给药9天时，与阳性对照组比较，25ng/kg·48h组p＜0.05，50ng/kg·48h组p＜0.05，50ng/kg·48h组p＜0.01；给药11天时，与阳性对照组比较，25ng/kg·48h组p＜0.05，50ng/kg·48h组p＜0.05；给药13天时，与阳性对照组比较，50ng/kg·48h组p＜0.05；
图6为本发明实施例3中IL-12对BGC823细胞小鼠皮下移植瘤模型生长的抑制影响图；
图7为本发明实施例4中IL-12对MCF-7乳腺癌细胞小鼠皮下移植瘤模型体重影响图，图中图中“#”表示与阳性对照比较p＜0.05；“##”表与阳性对照比较p＜0.01；“###”表示与阳性对照比较p＜0.001。图中，给药3天时，25ng/kg·48h组与阳性对照组比较p＜0.01，50ng/kg·48h组p＜0.001，100ng/kg·24h组p＜0.05；给药5天时，与阳性对照组比较，25ng/kg·48h组p＜0.05，50ng/kg·48h组p＜0.001；给药8天时，与阳性对照组比较，25ng/kg·48h组p＜0.05，50ng/kg·48h组p＜0.01，100ng/kg·48h组p＜0.001，100ng/kg·24h组p＜0.01；给药10天时，与阳性对照组比较，50ng/kg·48h组p＜0.01，100ng/kg·24h组p＜0.01；给药12天时，与阳性对照组比较，50ng/kg·48h组p＜0.05；给药17天时，与阳性对照组比较，50ng/kg·48h组p＜0.05；
图8为本发明实施例4中IL-12对MCF-7乳腺癌细胞小鼠皮下移植瘤模型生长的抑制影响图；
图9为本发明实施例5中IL-12对膀胱癌BIU87细胞小鼠皮下移植瘤模型体重影响图，图中“#”表示与阳性对照比较p＜0.05；“##”表与阳性对照比较p＜0.01；“###”表示与阳性对照比较p＜0.001。图中，给药3天时，25ng/kg·48h组与阳性对照组比较p＜0.001；给药5天时，与阳性对照组比较，25ng/kg·48h组p＜0.01，50ng/kg·48h组p＜0.05；给药7天时，与阳性对照组比较，25ng/kg·48h组p＜0.05，50ng/kg·48h组p＜0.01，100ng/kg·48h组p＜0.001，100ng/kg·24h组p＜0.001；给药9天时，与阳性对照组比较，25ng/kg·48h组p＜0.01；给药13天时，与阳性对照组比较，50ng/kg·48h组p＜0.05；
图10为本发明实施例5中IL-12对膀胱癌BIU87细胞小鼠皮下移植瘤模型生长的抑制影响图；
图11为本发明实施例6中IL-12对B16F10黑色素瘤细胞小鼠皮下移植瘤模型体重影响图，图中图中“#”表示与阳性对照比较p＜0.05；“##”表与阳性对照比较p＜0.01；“###”表示与阳性对照比较p＜0.001。图中，给药3天时，25ng/kg·48h组与阳性对照组比较p＜0.001，50ng/kg·48h组p＜0.001；给药5天时，与阳性对照组比较，100ng/kg·24h组p＜0.01；给药15天时，与阳性对照组比较，25ng/kg·48h组p＜0.01，50ng/kg·24h组p＜0.05；给药17天时，与阳性对照组比较，25ng/kg·48h组p＜0.01；给药20天时，与阳性对照组比较，25ng/kg·48h组p＜0.01；给药22天时，与阳性对照组比较，25ng/kg·48h组p＜0.05；
图12为本发明实施例6中IL-12对B16F10黑色素瘤细胞小鼠皮下移植瘤模型生长的抑制影响图；
图13为本发明实施例7中IL-12对SW620结肠癌细胞小鼠皮下移植瘤模型体重影响图，图中“#”表示与阳性对照比较p＜0.05；“##”表与阳性对照比较p＜0.01；“###”表示与阳性对照比较p＜0.001。图中，给药3天时，25ng/kg·48h组与阳性对照组比较p＜0.05；给药5天时，与阳性对照组比较，25ng/kg·48h组p＜0.05，50ng/kg·48h组p＜0.001；给药7天时，与阳性对照组比较，25ng/kg·48h组p＜0.05，50ng/kg·48h组p＜0.05，100ng/kg·48h组p＜0.01；给药9天时，与阳性对照组比较，25ng/kg·48h组p＜0.05，50ng/kg·48h组p＜0.01，100ng/kg·48h组p＜0.001；给药11天时，与阳性对照组比较，25ng/kg·48h组p＜0.05，50ng/kg·48h组p＜0.01，100ng/kg·24h组p＜0.001；给药13天时，与阳性对照组比较，25ng/kg·48h组p＜0.05，50ng/kg·48h组p＜0.01；
图14为本发明实施例7中IL-12对SW620结肠癌细胞小鼠皮下移植瘤模型生长的抑制影响图；
图15为本发明实施例8中IL-12对SKOV3人卵巢癌细胞小鼠皮下移植瘤模型体重影响图，图中图中“#”表示与阳性对照比较p＜0.05；“##”表与阳性对照比较p＜0.01；“###”表示与阳性对照比较p＜0.001。图中，给药3天时，25ng/kg·48h组与阳性对照组比较p＜0.001，100ng/kg·48h组p＜0.001；给药5天时，与阳性对照组比较，25ng/kg·48h组与阳性对照组比较p＜0.05，50ng/kg·48h组与阳性对照组比较p＜0.05，100ng/kg·48h组与阳性对照组比较p＜0.01，100ng/kg·24h组p＜0.01；给药8天时，与阳性对照组比较，25ng/kg·48h组p＜0.05；给药10天时，与阳性对照组比较，25ng/kg·48h组p＜0.05，50ng/kg·48h组p＜0.01，100ng/kg·48h组p＜0.01；给药15天时，与阳性对照组比较，25ng/kg·48h组p＜0.05，50ng/kg·48h组p＜0.05，100ng/kg·24h组p＜0.05；给药17天时，与阳性对照组比较，25ng/kg·48h组p＜0.05，100ng/kg·48h组p＜0.05；
图16为本发明实施例8中IL-12对SKOV3人卵巢癌细胞小鼠皮下移植瘤模型生长的抑制影响图；
图17为本发明实施例9中IL-12对SCCⅦ小鼠头颈磷癌细胞小鼠皮下移植瘤模型体重影响图，图中“#”表示与阳性对照比较p＜0.05；“##”表与阳性对照比较p＜0.01；“###”表示与阳性对照比较p＜0.001。图中，给药3天时，25ng/kg·48h组与阳性对照组比较p＜0.05，50ng/kg·48h组与阳性对照组比较p＜0.01，100ng/kg·24h组与阳性对照组比较p＜0.001；给药7天时，与阳性对照组比较，25ng/kg·48h组p＜0.05，50ng/kg·48h组p＜0.05；给药9天时，与阳性对照组比较，25ng/kg·48h组p＜0.05，50ng/kg·48h组p＜0.05，100ng/kg·48h组p＜0.01，100ng/kg·24h组p＜0.01；给药11天时，与阳性对照组比较，25ng/kg·48h组p＜0.01；给药13天时，与阳性对照组比较，25ng/kg·48h组p＜0.01，50ng/kg·48h组p＜0.05；
图18为本发明实施例8中IL-12对SCCⅦ小鼠头颈磷癌细胞小鼠皮下移植瘤模型生长的抑制影响图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。下述实施例中，根据人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值进行了换算。
实施例1人A549非小细胞肺癌细胞
(1)术后残余肿瘤模型的建立
选择周龄为4-6周，体重18.0-22.0g的雌性Nu/Nu裸鼠55只。
细胞培养：将A549细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液中(补充青霉素、链霉素各100μl/ml)，置于37℃含5％CO2的细胞培养箱中，每1-2天换液一次。用0.25％胰酶消化传代，1000r/min离心5分钟后，弃上清液，加入新鲜培养基传代培养。
皮下移植瘤模型保种：将传代培养的肿瘤细胞，在无菌条件下将细胞消化成悬液，以氯化钠注射液冲洗后重悬成悬液，给予裸鼠右前肢腋部皮下接种保种。
皮下移植瘤残瘤模型：待传代保种裸鼠皮下肿瘤生长至体积约为1500-2000mm3时，无菌条件下取出瘤块，将瘤块切成约1.0×1.0mm大小的瘤块，给予裸鼠右前肢腋部皮下接种。
裸鼠皮下接种肿瘤后，待肿瘤生长至约200-300mm3体积时，将裸鼠麻醉后固定于小鼠手术台上。在肿瘤下方剪开直径约0.5cm的创口，暴露出部分肿瘤，对暴露的肿瘤进行摘除手术，切除部分瘤块，残余体积约为50mm3的肿瘤。然后用4/0号手术缝合针缝合皮肤。
(2)抑制残余肿瘤生长实验
选取步骤(1)中的模型小鼠，待术后皮下移植瘤体积达到50-100mm3时，按照肿瘤体积随机分组，皮下给药。阳性药尾静脉注射给药，一周2次。观察受试动物进食、饮水及活动情况，每2-3天测定动物体重及肿瘤体积，实验结束时颈部脱臼处死动物，并剥离肉眼可见肿瘤，称重。
第一组小鼠(空白对照组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，作为空白对照组，观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第二组小鼠(25ng/kg 48h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每隔一天皮下注射25ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为5ng/ml形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第三组小鼠(50ng/kg 48h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每隔一天皮下注射50ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为10ng/ml形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第四组小鼠(100ng/kg 48h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每隔一天皮下注射100ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为20ng/ml形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第五组小鼠(100ng/kg 24h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每天皮下注射100ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为20ng/ml的形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第六组小鼠(阳性对照组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，一周两次静脉注射10mg/kg的阳性对照药品长春新碱注射液(以浓度为2mg/ml的形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
(3)数据处理，实验结果及分析
数据用X±SD表示；肿瘤瘤重生长抑制率＝(对照组瘤重－给药组瘤重)/对照组瘤重×100％；
肿瘤体积＝1/2ab2(a＝肿瘤长径；b＝肿瘤短径)；
瘤重抑制率、体积抑制率、动物体重变化状况等，用EXCEL软件中t-检验程序进行组间统计学分析。所得结果如图1、图2、图3、表1、表2及表3所示：
表1.IL-12对人A549非小细胞肺癌细胞小鼠皮下移植瘤模型体重影响(g)
Figure BDA0002557852600000091
注：与模型对照比较p＜0.05,*；p＜0.01,**p＜0.001,***。(n)存活动物数量。
表2.IL-12对人A549非小细胞肺癌细胞小鼠皮下移植瘤模型生长的抑制影响
Figure BDA0002557852600000092
Figure BDA0002557852600000101
注：与模型对照组比较p＜0.05,*；p＜0.01,**p＜0.001,***。
从图1及表1可以看出阳性对照组给药第7天后出体重下降，而IL-12给药组试验期间体重没有明显下降。
从表2及图2可以看出与模型对照组比较，25ng/kg 48h组的瘤体积抑制率26.4％，瘤重抑制率21.9％；50ng/kg48h组的瘤体积抑制率35.4％，瘤重抑制率25.6％；100ng/kg48h组的瘤体积抑制率44.8％，瘤重抑制率32.4％；100ng/kg24h组的瘤体积抑制率55.6％，瘤重抑制率46.8％。阳性对照组的瘤体积抑制率59.9％，瘤重抑制率49.8％。各给药组对肿瘤生长均有抑制作用。
实施例2 H22肝癌细胞
(1)术后残余肿瘤模型的建立
选择周龄为4-6周，体重18.0-22.0g的雌性Nu/Nu裸鼠55只。
细胞培养：H22肝癌细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液中(补充青霉素、链霉素各100μl/ml)，置于37℃含5％CO2的细胞培养箱中，每1-2天换液一次。用0.25％胰酶消化传代，1000r/min离心5分钟后，弃上清液，加入新鲜培养基传代培养。
皮下移植瘤模型保种：将传代培养的肿瘤细胞，在无菌条件下将细胞消化成悬液，以氯化钠注射液冲洗后重悬成悬液，给予裸鼠右前肢腋部皮下接种保种。
皮下移植瘤残瘤模型：待传代保种裸鼠皮下肿瘤生长至体积约为1500-2000mm3时，无菌条件下取出瘤块，将瘤块切成约1.0×1.0mm大小的瘤块，给予裸鼠右前肢腋部皮下接种。
裸鼠皮下接种肿瘤后，待肿瘤生长至约200-300mm3体积时，将裸鼠麻醉后固定于小鼠手术台上。在肿瘤下方剪开直径约0.5cm的创口，暴露出部分肿瘤，对暴露的肿瘤进行摘除手术，切除部分瘤块，残余体积约为50mm3的肿瘤。然后用4/0号手术缝合针缝合皮肤。
(2)抑制残余肿瘤生长实验
选取实施例步骤(1)中的模型小鼠，待术后皮下移植瘤体积达到50-100mm3时，按照肿瘤体积随机分组，皮下给药。阳性药尾静脉注射给药，一周2次。观察受试动物进食、饮水及活动情况，每2-3天测定动物体重及肿瘤体积，实验结束时颈部脱臼处死动物，并剥离肉眼可见肿瘤，称重。
第一组小鼠(空白对照组)：随机挑选8只已建立残余肿瘤模型的小鼠，作为空白对照组，观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第二组小鼠(25ng/kg 48h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每隔一天皮下注射25ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为5ng/ml的形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第三组小鼠(50ng/kg 48h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每隔一天皮下注射50ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为10ng/ml的的形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第四组小鼠(100ng/kg 48h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每隔一天皮下注射100ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为20ng/ml的的形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第五组小鼠(100ng/kg 24h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每天皮下注射100ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为20ng/ml的的的形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第六组小鼠(阳性对照组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，一周两次静脉注射10mg/kg的阳性对照药品长春新碱注射液(以浓度为20mg/ml的的的形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
(3)数据处理，实验结果及分析
数据用X±SD表示；肿瘤瘤重生长抑制率＝(对照组瘤重－给药组瘤重)/对照组瘤重×100％；
肿瘤体积＝1/2ab2(a＝肿瘤长径；b＝肿瘤短径)；
瘤重抑制率、体积抑制率、动物体重变化状况等，用EXCEL软件中t-检验程序进行组间统计学分析。所得结果如图4、图5、图6、表4、表5及表6所示：
表3.IL-12对H22肝癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型体重影响(g)
Figure BDA0002557852600000111
Figure BDA0002557852600000121
注：与模型对照组比较p＜0.05,*；p＜0.01,**。(n)存活动物数量。
表4.IL-12对H22肝癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型生长的抑制影响
Figure BDA0002557852600000122
注：与模型对照组比较p＜0.05,*。
从图3及表3中可以看出阳性对照租给药第5天后出体重下降，在15天后体重逐渐恢复。受试药组和模型对照组体重没有明显下降。
从表4及图4中可以看出与模型对照组比较，25ng/kg48h组的瘤体积抑制率24.7％，瘤重抑制率35.6％；50ng/kg48h组的瘤体积抑制率30.5％，瘤重抑制率39.3％；100ng/kg 48h组的瘤体积抑制率44.5％，瘤重抑制率48.3％；100ng/kg 24h组的瘤体积抑制率53.7％，瘤重抑制率62.7％。阳性对照组的瘤体积抑制率55.1％，瘤重抑制率66.2％。各给药组对肿瘤生长均有抑制作用。
实施例3BGC823胃癌细胞
(1)术后残余肿瘤模型的建立
选择周龄为4-6周，体重18.0-22.0g的雌性Nu/Nu裸鼠55只。
细胞培养：BGC823细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液中(补充青霉素、链霉素各100μl/ml)，置于37℃含5％CO2的细胞培养箱中，每1-2天换液一次。用0.25％胰酶消化传代，1000r/min离心5分钟后，弃上清液，加入新鲜培养基传代培养。
皮下移植瘤模型保种：将传代培养的肿瘤细胞，在无菌条件下将细胞消化成悬液，以氯化钠注射液冲洗后重悬成悬液，给予裸鼠右前肢腋部皮下接种保种。
皮下移植瘤残瘤模型：待传代保种裸鼠皮下肿瘤生长至体积约为1500-2000mm3时，无菌条件下取出瘤块，将瘤块切成约1.0×1.0mm大小的瘤块，给予裸鼠右前肢腋部皮下接种。
裸鼠皮下接种肿瘤后，待肿瘤生长至约200-300mm3体积时，将裸鼠麻醉后固定于小鼠手术台上。在肿瘤下方剪开直径约0.5cm的创口，暴露出部分肿瘤，对暴露的肿瘤进行摘除手术，切除部分瘤块，残余体积约为50mm3的肿瘤。然后用4/0号手术缝合针缝合皮肤。
(2)抑制残余肿瘤生长实验
选取步骤(1)中的模型小鼠，待术后皮下移植瘤体积达到50-100mm3时，按照肿瘤体积随机分组，皮下给药。阳性药尾静脉注射给药，一周2次。观察受试动物进食、饮水及活动情况，每2-3天测定动物体重及肿瘤体积，实验结束时颈部脱臼处死动物，并剥离肉眼可见肿瘤，称重。
第一组小鼠(空白对照组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，作为空白对照组，观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第二组小鼠(25ng/kg 48h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每隔一天皮下注射25ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为5ng/ml形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第三组小鼠(50ng/kg 48h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每隔一天皮下注射50ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为10ng/ml形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第四组小鼠(100ng/kg 48h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每隔一天皮下注射100ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为20ng/ml形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第五组小鼠(100ng/kg 24h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每天皮下注射100ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为20ng/ml的形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第六组小鼠(阳性对照组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，一周两次静脉注射10mg/kg的阳性对照药品长春新碱注射液(以浓度为2mg/ml的形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
(3)数据处理，实验结果及分析
数据用X±SD表示；肿瘤瘤重生长抑制率＝(对照组瘤重－给药组瘤重)/对照组瘤重×100％；
肿瘤体积＝1/2ab2(a＝肿瘤长径；b＝肿瘤短径)；
瘤重抑制率、体积抑制率、动物体重变化状况等，用EXCEL软件中t-检验程序进行组间统计学分析。所得结果如图1、图2、图3、表1、表2及表3所示：
表5.IL-12对BGC823肺癌细胞小鼠皮下移植瘤模型体重影响(g)
Figure BDA0002557852600000141
注：与模型对照比较p＜0.05,*；p＜0.01,**p＜0.001,***。(n)存活动物数量。
表6.IL-12对BGC823肺癌细胞小鼠皮下移植瘤模型生长的抑制影响
Figure BDA0002557852600000151
注：与模型对照组比较p＜0.05,*；p＜0.01,**p＜0.001,***。
从图1、表1及表2可以看出阳性对照组给药第5天后出体重下降，12天后体重逐渐恢复，而IL-12给药组试验期间体重没有明显下降。
从表3、图2及图3可以看出与模型对照组比较，25ng/kg48h组的瘤体积抑制率10.8％，瘤重抑制率28.7％；50ng/kg48h组的瘤体积抑制率28.3％，瘤重抑制率50.0％；100ng/kg48h组的瘤体积抑制率41.6％，瘤重抑制率55.2％；100ng/kg 24h组的瘤体积抑制率51.5％，瘤重抑制率59.4％。阳性对照组的瘤体积抑制率60.5％，瘤重抑制率62.4％。各给药组对肿瘤生长均有抑制作用。
实施例4人MCF-7乳腺癌细胞
(1)术后残余肿瘤模型的建立
选择周龄为4-6周，体重18.0-22.0g的雌性Nu/Nu裸鼠55只。
细胞培养：将MCF-7乳腺癌细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液中(补充青霉素、链霉素各100μl/ml)，置于37℃含5％CO2的细胞培养箱中，每1-2天换液一次。用0.25％胰酶消化传代，1000r/min离心5分钟后，弃上清液，加入新鲜培养基传代培养。
皮下移植瘤模型保种：将传代培养的肿瘤细胞，在无菌条件下将细胞消化成悬液，以氯化钠注射液冲洗后重悬成悬液，给予裸鼠右前肢腋部皮下接种保种。
皮下移植瘤残瘤模型：待传代保种裸鼠皮下肿瘤生长至体积约为1500-2000mm3时，无菌条件下取出瘤块，将瘤块切成约1.0×1.0mm大小的瘤块，给予裸鼠右前肢腋部皮下接种。
裸鼠皮下接种肿瘤后，待肿瘤生长至约200-300mm3体积时，将裸鼠麻醉后固定于小鼠手术台上。在肿瘤下方剪开直径约0.5cm的创口，暴露出部分肿瘤，对暴露的肿瘤进行摘除手术，切除部分瘤块，残余体积约为50mm3的肿瘤。然后用4/0号手术缝合针缝合皮肤。
(2)抑制残余肿瘤生长实验
选取实施例步骤(1)中的模型小鼠，待术后皮下移植瘤体积达到50-100mm3时，按照肿瘤体积随机分组，皮下给药。阳性药尾静脉注射给药，一周2次。观察受试动物进食、饮水及活动情况，每2-3天测定动物体重及肿瘤体积，实验结束时颈部脱臼处死动物，并剥离肉眼可见肿瘤，称重。
第一组小鼠(空白对照组)：随机挑选8只已建立残余肿瘤模型的小鼠，作为空白对照组，观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第二组小鼠(25ng/kg 48h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每隔一天皮下注射25ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为5ng/ml的形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第三组小鼠(50ng/kg 48h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每隔一天皮下注射50ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为10ng/ml的的形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第四组小鼠(100ng/kg 48h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每隔一天皮下注射100ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为20ng/ml的的形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第五组小鼠(100ng/kg 24h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每天皮下注射100ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为20ng/ml的的的形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第六组小鼠(阳性对照组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，一周两次静脉注射10mg/kg的阳性对照药品长春新碱注射液(以浓度为20mg/ml的的的形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
(3)数据处理，实验结果及分析
数据用X±SD表示；肿瘤瘤重生长抑制率＝(对照组瘤重－给药组瘤重)/对照组瘤重×100％；
肿瘤体积＝1/2ab2(a＝肿瘤长径；b＝肿瘤短径)；
瘤重抑制率、体积抑制率、动物体重变化状况等，用EXCEL软件中t-检验程序进行组间统计学分析。所得结果如图4、图5、图6、表4、表5及表6所示：
表7.IL-12对MCF-7乳腺癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型体重影响(g)
Figure BDA0002557852600000171
注：与模型对照组比较p＜0.05,*；p＜0.01,**。(n)存活动物数量。
表8.IL-12对MCF-7乳腺癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型生长的抑制影响
Figure BDA0002557852600000172
Figure BDA0002557852600000181
注：与模型对照组比较p＜0.05,*。
从图7及表7中可以看出阳性对照租给药第3天后出体重下降，在8天后体重逐渐恢复。受试药组和模型对照组体重没有明显下降。
从表8及图8中可以看出与模型对照组比较，25ng/kg 48h组的瘤体积抑制率20.7％，瘤重抑制率50.0％；50ng/kg 48h组的瘤体积抑制率36.9％，瘤重抑制率52.1％；100ng/kg 48h组的瘤体积抑制率45.7％，瘤重抑制率55.8％；100ng/kg 24h组的瘤体积抑制率55.0％，瘤重抑制率63.9％。阳性对照组的瘤体积抑制率59.6％，瘤重抑制率69.4％。各给药组对肿瘤生长均有抑制作用。
实施例5膀胱癌BIU87细胞
(1)术后残余肿瘤模型的建立
选择周龄为4-6周，体重18.0-22.0g的雌性Nu/Nu裸鼠55只。
细胞培养：膀胱癌BIU87细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液中(补充青霉素、链霉素各100μl/ml)，置于37℃含5％CO2的细胞培养箱中，每1-2天换液一次。用0.25％胰酶消化传代，1000r/min离心5分钟后，弃上清液，加入新鲜培养基传代培养。
皮下移植瘤模型保种：将传代培养的肿瘤细胞，在无菌条件下将细胞消化成悬液，以氯化钠注射液冲洗后重悬成悬液，给予裸鼠右前肢腋部皮下接种保种。
皮下移植瘤残瘤模型：待传代保种裸鼠皮下肿瘤生长至体积约为1500-2000mm3时，无菌条件下取出瘤块，将瘤块切成约1.0×1.0mm大小的瘤块，给予裸鼠右前肢腋部皮下接种。
裸鼠皮下接种肿瘤后，待肿瘤生长至约200-300mm3体积时，将裸鼠麻醉后固定于小鼠手术台上。在肿瘤下方剪开直径约0.5cm的创口，暴露出部分肿瘤，对暴露的肿瘤进行摘除手术，切除部分瘤块，残余体积约为50mm3的肿瘤。然后用4/0号手术缝合针缝合皮肤。
(2)抑制残余肿瘤生长实验
选取步骤(1)中的模型小鼠，待术后皮下移植瘤体积达到50-100mm3时，按照肿瘤体积随机分组，皮下给药。阳性药尾静脉注射给药，一周2次。观察受试动物进食、饮水及活动情况，每2-3天测定动物体重及肿瘤体积，实验结束时颈部脱臼处死动物，并剥离肉眼可见肿瘤，称重。
第一组小鼠(空白对照组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，作为空白对照组，观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第二组小鼠(25ng/kg 48h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每隔一天皮下注射25ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为5ng/ml形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第三组小鼠(50ng/kg 48h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每隔一天皮下注射50ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为10ng/ml形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第四组小鼠(100ng/kg 48h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每隔一天皮下注射100ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为20ng/ml形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第五组小鼠(100ng/kg 24h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每天皮下注射100ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为20ng/ml的形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第六组小鼠(阳性对照组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，一周两次静脉注射10mg/kg的阳性对照药品长春新碱注射液(以浓度为2mg/ml的形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
(3)数据处理，实验结果及分析
数据用X±SD表示；肿瘤瘤重生长抑制率＝(对照组瘤重－给药组瘤重)/对照组瘤重×100％；
肿瘤体积＝1/2ab2(a＝肿瘤长径；b＝肿瘤短径)；
瘤重抑制率、体积抑制率、动物体重变化状况等，用EXCEL软件中t-检验程序进行组间统计学分析。所得结果如图1、图2、图3、表1、表2及表3所示：
表9.IL-12对膀胱癌BIU87细胞小鼠皮下移植瘤模型体重影响(g)
Figure BDA0002557852600000191
Figure BDA0002557852600000201
注：与模型对照比较p＜0.05,*；p＜0.01,**p＜0.001,***。(n)存活动物数量。
表10.IL-12对膀胱癌BIU87细胞小鼠皮下移植瘤模型生长的抑制影响
Figure BDA0002557852600000202
注：与模型对照组比较p＜0.05,*；p＜0.01,**p＜0.001,***。
从图9及表9可以看出阳性对照组给药第5天后出体重下降，12天后体重逐渐恢复，而IL-12给药组试验期间体重没有明显下降。
从表10及图10可以看出与模型对照组比较，25ng/kg 48h组的瘤体积抑制率15.4％，瘤重抑制率44.9％；50ng/kg 48h组的瘤体积抑制率29.8％，瘤重抑制率60.6％；100ng/kg 48h组的瘤体积抑制率44.3％，瘤重抑制率60.2％；100ng/kg 24h组的瘤体积抑制率66.7％，瘤重抑制率70.4％。阳性对照组的瘤体积抑制率69.7％，瘤重抑制率57.4％。各给药组对肿瘤生长均有抑制作用。
实施例6黑色素瘤B16F10细胞
(1)术后残余肿瘤模型的建立
选择周龄为4-6周，体重18.0-22.0g的雌性Nu/Nu裸鼠55只。
细胞培养：对B16F10黑色素瘤细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液中(补充青霉素、链霉素各100μl/ml)，置于37℃含5％CO2的细胞培养箱中，每1-2天换液一次。用0.25％胰酶消化传代，1000r/min离心5分钟后，弃上清液，加入新鲜培养基传代培养。
皮下移植瘤模型保种：将传代培养的肿瘤细胞，在无菌条件下将细胞消化成悬液，以氯化钠注射液冲洗后重悬成悬液，给予裸鼠右前肢腋部皮下接种保种。
皮下移植瘤残瘤模型：待传代保种裸鼠皮下肿瘤生长至体积约为1500-2000mm3时，无菌条件下取出瘤块，将瘤块切成约1.0×1.0mm大小的瘤块，给予裸鼠右前肢腋部皮下接种。
裸鼠皮下接种肿瘤后，待肿瘤生长至约200-300mm3体积时，将裸鼠麻醉后固定于小鼠手术台上。在肿瘤下方剪开直径约0.5cm的创口，暴露出部分肿瘤，对暴露的肿瘤进行摘除手术，切除部分瘤块，残余体积约为50mm3的肿瘤。然后用4/0号手术缝合针缝合皮肤。
(2)抑制残余肿瘤生长实验
选取实施例步骤(1)中的模型小鼠，待术后皮下移植瘤体积达到50-100mm3时，按照肿瘤体积随机分组，皮下给药。阳性药尾静脉注射给药，一周2次。观察受试动物进食、饮水及活动情况，每2-3天测定动物体重及肿瘤体积，实验结束时颈部脱臼处死动物，并剥离肉眼可见肿瘤，称重。
第一组小鼠(空白对照组)：随机挑选8只已建立残余肿瘤模型的小鼠，作为空白对照组，观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第二组小鼠(25ng/kg 48h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每隔一天皮下注射25ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为5ng/ml的形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第三组小鼠(50ng/kg 48h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每隔一天皮下注射50ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为10ng/ml的的形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第四组小鼠(100ng/kg 48h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每隔一天皮下注射100ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为20ng/ml的的形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第五组小鼠(100ng/kg 24h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每天皮下注射100ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为20ng/ml的的的形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第六组小鼠(阳性对照组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，一周两次静脉注射10mg/kg的阳性对照药品长春新碱注射液(以浓度为20mg/ml的的的形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
(3)数据处理，实验结果及分析
数据用X±SD表示；肿瘤瘤重生长抑制率＝(对照组瘤重－给药组瘤重)/对照组瘤重×100％；
肿瘤体积＝1/2ab2(a＝肿瘤长径；b＝肿瘤短径)；
瘤重抑制率、体积抑制率、动物体重变化状况等，用EXCEL软件中t-检验程序进行组间统计学分析。所得结果如图4、图5、图6、表4、表5及表6所示：
表11.IL-12对B16F10黑色素瘤细胞裸鼠皮下移植瘤模型体重影响(g)
Figure BDA0002557852600000221
注：与模型对照组比较p＜0.05,*；p＜0.01,**。(n)存活动物数量。
表12.IL-12对B16F10黑色素瘤细胞裸鼠皮下移植瘤模型生长的抑制影响
Figure BDA0002557852600000222
Figure BDA0002557852600000231
注：与模型对照组比较p＜0.05,*。
从图11及表11中可以看出阳性对照租给药第3天后出体重下降，8天后体重明逐渐恢复。受试药组和模型对照组体重没有明显下降。
从表12及图12中可以看出与模型对照组比较，25ng/kg 48h组的瘤体积抑制率35.1％，瘤重抑制率19.0％；50ng/kg 48h组的瘤体积抑制率45.1％，瘤重抑制率33.6％；100ng/kg 48h组的瘤体积抑制率46.5％，瘤重抑制率40.7％；100ng/kg 24h组的瘤体积抑制率67.6％，瘤重抑制率50.5％。阳性对照组的瘤体积抑制率67.8％，瘤重抑制率49.2％。各给药组对肿瘤生长均有抑制作用。
实施例7SW620结肠癌细胞
(1)术后残余肿瘤模型的建立
选择周龄为4-6周，体重18.0-22.0g的雌性Nu/Nu裸鼠55只。
细胞培养：SW620结肠癌细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液中(补充青霉素、链霉素各100μl/ml)，置于37℃含5％CO2的细胞培养箱中，每1-2天换液一次。用0.25％胰酶消化传代，1000r/min离心5分钟后，弃上清液，加入新鲜培养基传代培养。
皮下移植瘤模型保种：将传代培养的肿瘤细胞，在无菌条件下将细胞消化成悬液，以氯化钠注射液冲洗后重悬成悬液，给予裸鼠右前肢腋部皮下接种保种。
皮下移植瘤残瘤模型：待传代保种裸鼠皮下肿瘤生长至体积约为1500-2000mm3时，无菌条件下取出瘤块，将瘤块切成约1.0×1.0mm大小的瘤块，给予裸鼠右前肢腋部皮下接种。
裸鼠皮下接种肿瘤后，待肿瘤生长至约200-300mm3体积时，将裸鼠麻醉后固定于小鼠手术台上。在肿瘤下方剪开直径约0.5cm的创口，暴露出部分肿瘤，对暴露的肿瘤进行摘除手术，切除部分瘤块，残余体积约为50mm3的肿瘤。然后用4/0号手术缝合针缝合皮肤。
(2)抑制残余肿瘤生长实验
选取步骤(1)中的模型小鼠，待术后皮下移植瘤体积达到50-100mm3时，按照肿瘤体积随机分组，皮下给药。阳性药尾静脉注射给药，一周2次。观察受试动物进食、饮水及活动情况，每2-3天测定动物体重及肿瘤体积，实验结束时颈部脱臼处死动物，并剥离肉眼可见肿瘤，称重。
第一组小鼠(空白对照组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，作为空白对照组，观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第二组小鼠(25ng/kg 48h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每隔一天皮下注射25ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为5ng/ml形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第三组小鼠(50ng/kg 48h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每隔一天皮下注射50ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为10ng/ml形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第四组小鼠(100ng/kg 48h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每隔一天皮下注射100ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为20ng/ml形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第五组小鼠(100ng/kg 24h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每天皮下注射100ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为20ng/ml的形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第六组小鼠(阳性对照组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，一周两次静脉注射10mg/kg的阳性对照药品长春新碱注射液(以浓度为2mg/ml的形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
(3)数据处理，实验结果及分析
数据用X±SD表示；肿瘤瘤重生长抑制率＝(对照组瘤重－给药组瘤重)/对照组瘤重×100％；
肿瘤体积＝1/2ab2(a＝肿瘤长径；b＝肿瘤短径)；
瘤重抑制率、体积抑制率、动物体重变化状况等，用EXCEL软件中t-检验程序进行组间统计学分析。所得结果如图1、图2、图3、表1、表2及表3所示：
表13.IL-12对SW620结肠癌细胞小鼠皮下移植瘤模型体重影响(g)
Figure BDA0002557852600000241
Figure BDA0002557852600000251
注：与模型对照比较p＜0.05,*；p＜0.01,**p＜0.001,***。(n)存活动物数量。
表14.IL-12对SW620结肠癌细胞小鼠皮下移植瘤模型生长的抑制影响
Figure BDA0002557852600000252
注：与模型对照组比较p＜0.05,*；p＜0.01,**p＜0.001,***。
从图13及表13可以看出阳性对照组给药第5天后出体重下降，而IL-12给药组试验期间体重没有明显下降。
从表14及图14可以看出与模型对照组比较，25ng/kg 48h组的瘤体积抑制率62.2％，瘤重抑制率48.3％；50ng/kg 48h组的瘤体积抑制率25.8％，瘤重抑制率23.6％；100ng/kg 48h组的瘤体积抑制率34.4％，瘤重抑制率34.2％；100ng/kg24h组的瘤体积抑制率45.9％，瘤重抑制率38.9％。阳性对照组的瘤体积抑制率59.8％，瘤重抑制率47.0％。各给药组对肿瘤生长均有抑制作用。
实施例8 SKOV3人卵巢癌细胞
(1)术后残余肿瘤模型的建立
选择周龄为4-6周，体重18.0-22.0g的雌性Nu/Nu裸鼠55只。
细胞培养：将SKOV3人卵巢癌细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液中(补充青霉素、链霉素各100μl/ml)，置于37℃含5％CO2的细胞培养箱中，每1-2天换液一次。用0.25％胰酶消化传代，1000r/min离心5分钟后，弃上清液，加入新鲜培养基传代培养。
皮下移植瘤模型保种：将传代培养的肿瘤细胞，在无菌条件下将细胞消化成悬液，以氯化钠注射液冲洗后重悬成悬液，给予裸鼠右前肢腋部皮下接种保种。
皮下移植瘤残瘤模型：待传代保种裸鼠皮下肿瘤生长至体积约为1500-2000mm3时，无菌条件下取出瘤块，将瘤块切成约1.0×1.0mm大小的瘤块，给予裸鼠右前肢腋部皮下接种。
裸鼠皮下接种肿瘤后，待肿瘤生长至约200-300mm3体积时，将裸鼠麻醉后固定于小鼠手术台上。在肿瘤下方剪开直径约0.5cm的创口，暴露出部分肿瘤，对暴露的肿瘤进行摘除手术，切除部分瘤块，残余体积约为50mm3的肿瘤。然后用4/0号手术缝合针缝合皮肤。
(2)抑制残余肿瘤生长实验
选取实施例步骤(1)中的模型小鼠，待术后皮下移植瘤体积达到50-100mm3时，按照肿瘤体积随机分组，皮下给药。阳性药尾静脉注射给药，一周2次。观察受试动物进食、饮水及活动情况，每2-3天测定动物体重及肿瘤体积，实验结束时颈部脱臼处死动物，并剥离肉眼可见肿瘤，称重。
第一组小鼠(空白对照组)：随机挑选8只已建立残余肿瘤模型的小鼠，作为空白对照组，观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第二组小鼠(25ng/kg 48h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每隔一天皮下注射25ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为5ng/ml的形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第三组小鼠(50ng/kg 48h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每隔一天皮下注射50ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为10ng/ml的的形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第四组小鼠(100ng/kg 48h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每隔一天皮下注射100ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为20ng/ml的的形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第五组小鼠(100ng/kg 24h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每天皮下注射100ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为20ng/ml的的的形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第六组小鼠(阳性对照组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，一周两次静脉注射10mg/kg的阳性对照药品长春新碱注射液(以浓度为20mg/ml的的的形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
(3)数据处理，实验结果及分析
数据用X±SD表示；肿瘤瘤重生长抑制率＝(对照组瘤重－给药组瘤重)/对照组瘤重×100％；
肿瘤体积＝1/2ab2(a＝肿瘤长径；b＝肿瘤短径)；
瘤重抑制率、体积抑制率、动物体重变化状况等，用EXCEL软件中t-检验程序进行组间统计学分析。所得结果如图4、图5、图6、表4、表5及表6所示：
表15.IL-12SKOV3人卵巢癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型体重影响(g)
Figure BDA0002557852600000271
注：与模型对照组比较p＜0.05,*；p＜0.01,**。(n)存活动物数量。
表16.IL-12对SKOV3人卵巢癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型生长的抑制影响
Figure BDA0002557852600000272
Figure BDA0002557852600000281
注：与模型对照组比较p＜0.05,*。
从图15及表15中可以看出阳性对照租给药第5天后出体重下降，在10天后体重逐渐恢复。受试药组和模型对照组体重没有明显下降。
从表16及图16中可以看出与模型对照组比较，25ng/kg 48h组的瘤体积抑制率27.1％，瘤重抑制率28.3％；50ng/kg 48h组的瘤体积抑制率40.0％，瘤重抑制率41.2％；100ng/kg 48h组的瘤体积抑制率51.6％，瘤重抑制率47.6％；100ng/kg 24h组的瘤体积抑制率62.8％，瘤重抑制率60.5％。阳性对照组的瘤体积抑制率67.4％，瘤重抑制率62.8％。各给药组对肿瘤生长均有抑制作用。
实施例9SCCⅦ小鼠头颈磷癌
(1)术后残余肿瘤模型的建立
选择周龄为4-6周，体重18.0-22.0g的雌性Nu/Nu裸鼠55只。
细胞培养：SCCⅦ小鼠头颈磷癌细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液中(补充青霉素、链霉素各100μl/ml)，置于37℃含5％CO2的细胞培养箱中，每1-2天换液一次。用0.25％胰酶消化传代，1000r/min离心5分钟后，弃上清液，加入新鲜培养基传代培养。
皮下移植瘤模型保种：将传代培养的肿瘤细胞，在无菌条件下将细胞消化成悬液，以氯化钠注射液冲洗后重悬成悬液，给予裸鼠右前肢腋部皮下接种保种。
皮下移植瘤残瘤模型：待传代保种裸鼠皮下肿瘤生长至体积约为1500-2000mm3时，无菌条件下取出瘤块，将瘤块切成约1.0×1.0mm大小的瘤块，给予裸鼠右前肢腋部皮下接种。
裸鼠皮下接种肿瘤后，待肿瘤生长至约200-300mm3体积时，将裸鼠麻醉后固定于小鼠手术台上。在肿瘤下方剪开直径约0.5cm的创口，暴露出部分肿瘤，对暴露的肿瘤进行摘除手术，切除部分瘤块，残余体积约为50mm3的肿瘤。然后用4/0号手术缝合针缝合皮肤。
(2)抑制残余肿瘤生长实验
选取步骤(1)中的模型小鼠，待术后皮下移植瘤体积达到50-100mm3时，按照肿瘤体积随机分组，皮下给药。阳性药尾静脉注射给药，一周2次。观察受试动物进食、饮水及活动情况，每2-3天测定动物体重及肿瘤体积，实验结束时颈部脱臼处死动物，并剥离肉眼可见肿瘤，称重。
第一组小鼠(空白对照组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，作为空白对照组，观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第二组小鼠(25ng/kg 48h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每隔一天皮下注射25ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为5ng/ml形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第三组小鼠(50ng/kg 48h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每隔一天皮下注射50ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为10ng/ml形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第四组小鼠(100ng/kg 48h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每隔一天皮下注射100ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为20ng/ml形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第五组小鼠(100ng/kg24h组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，每天皮下注射100ng/kg的IL-12溶液剂(以浓度为20ng/ml的形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
第六组小鼠(阳性对照组)：随机挑选已建立残余肿瘤模型的小鼠，一周两次静脉注射10mg/kg的阳性对照药品长春新碱注射液(以浓度为2mg/ml的形式)。观察实验过程中肿瘤的变化、模型体重的变化。
(3)数据处理，实验结果及分析
数据用X±SD表示；肿瘤瘤重生长抑制率＝(对照组瘤重－给药组瘤重)/对照组瘤重×100％；
肿瘤体积＝1/2ab2(a＝肿瘤长径；b＝肿瘤短径)；
瘤重抑制率、体积抑制率、动物体重变化状况等，用EXCEL软件中t-检验程序进行组间统计学分析。所得结果如图1、图2、图3、表1、表2及表3所示：
表17.IL-12对SCCⅦ小鼠头颈磷癌细胞小鼠皮下移植瘤模型体重影响(g)
Figure BDA0002557852600000301
注：与模型对照比较p＜0.05,*；p＜0.01,**p＜0.001,***。(n)存活动物数量。
表18.IL-12对SCCⅦ小鼠头颈磷癌细胞小鼠皮下移植瘤模型生长的抑制影响
Figure BDA0002557852600000302
注：与模型对照组比较p＜0.05,*；p＜0.01,**p＜0.001,***。
从图17及表17可以看出阳性对照组给药第5天后出体重下降，12天后体重逐渐恢复，而IL-12给药组试验期间体重没有明显下降。
从表18及图18可以看出与模型对照组比较，25ng/kg 48h组的瘤体积抑制率25.7％，瘤重抑制率8.0％；50ng/kg 48h组的瘤体积抑制率35.1％，瘤重抑制率21.6％；100ng/kg 48h组的瘤体积抑制率39.3％，瘤重抑制率26.1％；100ng/kg 24h组的瘤体积抑制率59.3％，瘤重抑制率33.9％。阳性对照组的瘤体积抑制率62.5％，瘤重抑制率45.1％。各给药组对肿瘤生长均有抑制作用。

Claims (10)

1.白介素-12在制备用于人手术切除恶性肿瘤后预防和/或抑制残余肿瘤和/或转移的微小肿瘤的生长的药物中的用途；
优选地，所述恶性肿瘤包括非小细胞肺癌、原发性肝癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、结肠癌、复发性卵巢癌、颈部和头部癌中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，该药物的每次给药剂量为1-100ng/Kg，优选10-100ng/Kg，进一步优选25-100ng/Kg，更优选50-100ng/Kg。
3.根据权利要求1所述的用途，其中，该药物通过皮下给药。
4.根据权利要求1所述的用途，其中，每隔24或48小时皮下注射50-100ng/Kg的白介素-12；或每隔24或48小时皮下注射50-100ng/Kg的白介素-12；或每隔24或48小时皮下注射50-100ng/Kg的白介素-12。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的用途，其中，所述的药物的剂型为冻干制剂；所述冻干制剂中包括白介素-12、磷酸缓冲盐PB、NaCl、人血白蛋白、海藻糖及甘露醇；优选地，当所述冻干制剂复溶为浓度为1-10μg/ml的白介素-12水溶液时，所述磷酸缓冲盐PB能将该水溶液的pH保持为6.0-7.2。
6.根据权利要求5所述的用途，其中，将所述冻干制剂复溶成浓度为1-10μg/ml的白介素-12水溶液时，NaCl的浓度使得水溶液的渗透压为260-320mOsm/Kg，NaCl的浓度为1-20mg/ml，优选为5-10mg/ml，更优选为9mg/ml。
7.根据权利要求5所述的用途，其中，当将所述冻干制剂复溶成浓度为1-10μg/ml的白介素-12水溶液时，所述冻干制剂中人血白蛋白的浓度为0.5-2.0mg/ml，优选为1.0-1.5mg/ml，更优选为1.0mg/ml。
8.根据权利要求5所述的用途，其中，当将所述冻干制剂复溶成浓度为1-10μg/ml的白介素-12水溶液时，所述冻干制剂中海藻糖的浓度为0.5-2.0mg/ml，优选为1.0-1.5mg/ml，更优选为1.0mg/ml。
9.根据权利要求5所述的用途，其中，当将所述冻干制剂复溶成浓度为1-10μg/ml的白介素-12水溶液时，所述冻干制剂中甘露醇的浓度为50-150mg/ml，优选为50-100mg/ml，更优选为70mg/ml。
10.根据权利要求5所述的用途，其中，当所述冻干制剂复溶为浓度为1-10μg/ml的白介素-12水溶液时，所述磷酸缓冲盐PB能将该水溶液的pH保持为6.0，NaCl的浓度为9mg/ml、人血白蛋白的浓度为1.0mg/ml、海藻糖的浓度为1.0mg/ml和甘露醇的浓度为70mg/ml。
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