CN111701009A - 一种多肽类abc转运蛋白抑制剂xh-14c及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多肽类ABC转运蛋白抑制剂XH‑14C及其应用。SEQ ID NO.1所示的多肽XH‑14C和ABC转运蛋白底物化疗药物联合在制备治疗ABC转运蛋白介导的多药耐药的抗肿瘤药物中的应用。一种治疗ABC转运蛋白介导的多药耐药的抗肿瘤药物组合物，由SEQ ID NO.1所示的多肽XH‑14C和ABC转运蛋白底物化疗药物组成。本发明揭示了多肽可以抑制ABCB1的功能，与ABC转运蛋白底物化疗药物联用，可增加化疗药物在耐药肿瘤细胞中的浓度，从而抑制耐药肿瘤细胞的增殖。提示多肽类ABC转运蛋白抑制剂与ABC转运蛋白底物化疗药物联合用药在制备治疗ABC转运蛋白介导的多药耐药肿瘤药物中的应用具有广阔的前景。

Description

一种多肽类ABC转运蛋白抑制剂XH-14C及其应用
技术领域
本发明属于肿瘤治疗领域，具体涉及一种多肽类ABC转运蛋白抑制剂XH-14C及其应用。
背景技术
在肿瘤治疗中，多药耐药的产生是化疗失败和肿瘤复发的最主要因素。肿瘤多药耐药产生的分子机制较复杂，其中ATP结合盒转运蛋白超家族(ABC家族)在肿瘤组织中高表达是引起肿瘤多药耐药的主要原因。而ABCB1、ABCG2、ABCC1是ABC转运蛋白家族主要成员，其在多种肿瘤组织高表达，如ABCB1在人口腔表皮癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌等高表达，ABCG2在人口腔表皮癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌等高表达，ABCC1在肺癌、肝癌、肠癌、乳腺癌等高表达。ABCB1、ABCG2、ABCC1可以识别多种抗肿瘤化疗药物，利用ATP水解释放的能量，将化疗药物泵出肿瘤细胞外，使化疗药物在细胞内的浓度下降，进而导致化疗药物功效减弱甚至消失。因此，将ABC转运蛋白抑制剂与传统化疗药物联用，以降低ABC转运蛋白的表达或者抑制ABCB1的功能，从而增加化疗药物在耐药肿瘤细胞中的浓度，被认为是临床上克服ABC转运蛋白介导的多药耐药的有效策略。然而现有的ABC转运蛋白抑制剂由于选择性差、药物相互作用及安全性等问题，限制了其临床应用，因此，发现一种高效低毒、选择性强的新型ABC转运蛋白抑制剂一直是解决肿瘤耐药问题的研究热点。
多肽广泛存在于动植物组织中，其中有许多多肽在生物体内有特殊的功能，统称生物活性肽。近年来发现几乎所有生命科学的重大理论，如免疫防御、生殖控制、肿瘤病变、抗衰防老等都涉及有关的活性肽。研究较多的是抗菌肽(AMP)和抗肿瘤多肽(APC)。抗菌肽是指由多种生物如无脊椎动物、植物和动物等所分泌的，可以有效杀死细菌、真菌、病毒等外源性病原体的一类多肽分子，是生物体天然免疫系统的组成部分。抗肿瘤多肽是指一类对肿瘤细胞的生长和增殖具有抑制作用的多肽，且大多数的抗肿瘤多肽都来源于抗菌肽(AMP)。大多数抗菌肽和抗肿瘤多肽都有相似的结构特点，即一般由10-40个氨基酸构成，同时具有带正电的极性氨基酸和一定比例的非极性氨基酸，从而显示出两亲性。抗菌肽和抗肿瘤多肽的作用十分迅速，这也使得细胞不易产生耐药性。这一系列特点使多肽成为新药开发的研究热点。
肿瘤细胞膜的磷脂分布非对称性被破坏，磷脂酰乙醇胺(PE)与磷脂酰丝胺酸(PS)大量地出现在细胞膜的外层，多肽链中带正电荷的极性氨基酸与肿瘤细胞膜表层带负电荷的磷脂(PS)可借静电引力作用使多肽聚集于肿瘤细胞膜表面，聚集的多肽呈现α-螺旋结构，非极性的一侧疏水氨基酸借疏水作用可伸入细胞膜内层，从而进一步通过膜裂解和非膜裂解机制发挥抗肿瘤作用。而在以往的肿瘤耐药研究中，多肽是作为抗癌剂来发挥作用，虽然对肿瘤细胞有一定的选择性，但其在有效抑癌浓度下往往对正常细胞也有一定毒性，因而限制了其临床应用。
发明内容
本发明的目的在于提供ABC转运蛋白的抑制剂与ABC转运蛋白底物化疗药物联合用药在制备治疗ABC转运蛋白介导的多药耐药肿瘤药物中的应用。
为实现本发明目的，本发明公开以下技术方案：
SEQ ID NO.1所示的多肽XH-14C在制备治疗ABC转运蛋白介导的多药耐药的抗肿瘤药物中的应用；所述的ABC转运蛋白选自ABCB1、ABCC1或ABCG2。
作为本发明的一种优选，所述的ABC转运蛋白为ABCB1时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自紫杉烷类、长春花生物碱类，蒽环霉素类，表鬼臼毒素类，酪氨酸激酶抑制剂，或抗生素类抗肿瘤药；所述的ABC转运蛋白为ABCG2时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自核苷类似物、酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)、蒽环霉素类、表鬼臼毒素、喜树碱类、叶酸拮抗剂、黄酮类抗肿瘤药；所述的ABC转运蛋白为ABCC1时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自长春花生物碱类，蒽环霉素类，表鬼臼毒素类，酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药。
作为本发明的进一步优选，所述的ABC转运蛋白选自ABCB1时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自紫杉醇、多西紫杉醇、长春碱、长春新碱、阿霉素、柔红霉素、依托泊苷、替尼泊苷、伊马替尼、尼罗替尼、厄洛替尼、放线菌素D中的任意一种或多种；所述的ABC转运蛋白为ABCG2时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自夫拉平度、伊利替康及其代谢物SN-38、拓扑替康、替尼泊苷、依托泊苷、伊马替尼、吉非替尼、达努塞替、多柔吡星、柔红霉素、米托蒽醌、甲氨蝶呤和蒽环霉素中的任意一种或多种；所述的ABC转运蛋白为ABCC1时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自蒽环霉素、长春花生物碱、表鬼臼毒素、喜树碱、甲氨蝶呤、沙奎那韦、米托蒽醌和伊马替尼中的任意一种或多种。
作为本发明的一种优选，ABCB1介导的肿瘤优选肺癌、宫颈癌、人表皮样癌、卵巢癌、肝癌、肠癌、胃癌或胰腺癌；ABCC1介导的肿瘤优选肺癌、肝癌、肠癌、乳腺癌或食管癌；ABCG2介导的肿瘤优选乳腺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、非小细胞肺癌、卵巢癌或黑色素瘤。
SEQ ID NO.1所示的多肽XH-14C和ABC转运蛋白底物化疗药物联合在制备治疗ABC转运蛋白介导的多药耐药的抗肿瘤药物中的应用。
作为本发明的一种优选，所述的ABC转运蛋白选自ABCB1、ABCC1或ABCG2。
作为本发明的一种优选，ABCB1介导的肿瘤优选肺癌、宫颈癌、人表皮样癌、卵巢癌、肝癌、肠癌、胃癌或胰腺癌；ABCC1介导的肿瘤优选肺癌、肝癌、肠癌、乳腺癌或食管癌；ABCG2介导的肿瘤优选乳腺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、非小细胞肺癌、卵巢癌或黑色素瘤。
作为本发明的一种优选，所述的ABC转运蛋白为ABCB1时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自紫杉烷类、长春花生物碱类，蒽环霉素类，表鬼臼毒素类，酪氨酸激酶抑制剂，或抗生素类抗肿瘤药；所述的ABC转运蛋白为ABCG2时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自核苷类似物、酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)、蒽环霉素类、表鬼臼毒素、喜树碱类、叶酸拮抗剂、黄酮类抗肿瘤药；所述的ABC转运蛋白为ABCC1时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自长春花生物碱类，蒽环霉素类，表鬼臼毒素类，酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药。
作为本发明的进一步优选，所述的ABC转运蛋白选自ABCB1时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自紫杉醇、多西紫杉醇、长春碱、长春新碱、阿霉素、柔红霉素、依托泊苷、替尼泊苷、伊马替尼、尼罗替尼、厄洛替尼、放线菌素D中的任意一种或多种；所述的ABC转运蛋白为ABCG2时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自夫拉平度、伊利替康及其代谢物SN-38、拓扑替康、替尼泊苷、依托泊苷、伊马替尼、吉非替尼、达努塞替、多柔吡星、柔红霉素、米托蒽醌、甲氨蝶呤和蒽环霉素中的任意一种或多种；所述的ABC转运蛋白为ABCC1时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自蒽环霉素、长春花生物碱、表鬼臼毒素、喜树碱、甲氨蝶呤、沙奎那韦、米托蒽醌和伊马替尼中的任意一种或多种。
一种治疗ABC转运蛋白介导的多药耐药的抗肿瘤药物组合物，由SEQ ID NO.1所示的多肽XH-14C和ABC转运蛋白底物化疗药物组成。
作为本发明的优选，ABC转运蛋白选自ABCB1、ABCC1或ABCG2。
作为本发明的优选，所述的ABC转运蛋白为ABCB1时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自紫杉烷类、长春花生物碱类，蒽环霉素类，表鬼臼毒素类，酪氨酸激酶抑制剂，或抗生素类抗肿瘤药；所述的ABC转运蛋白为ABCG2时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自核苷类似物、酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)、蒽环霉素类、表鬼臼毒素、喜树碱类、叶酸拮抗剂、黄酮类抗肿瘤药；所述的ABC转运蛋白为ABCC1时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自长春花生物碱类，蒽环霉素类，表鬼臼毒素类，酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药。
作为本发明的进一步优选，所述的ABC转运蛋白选自ABCB1时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自紫杉醇、多西紫杉醇、长春碱、长春新碱、阿霉素、柔红霉素、依托泊苷、替尼泊苷、伊马替尼、尼罗替尼、厄洛替尼、放线菌素D中的任意一种或多种；所述的ABC转运蛋白为ABCG2时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自夫拉平度、伊利替康及其代谢物SN-38、拓扑替康、替尼泊苷、依托泊苷、伊马替尼、吉非替尼、达努塞替、多柔吡星、柔红霉素、米托蒽醌、甲氨蝶呤和蒽环霉素中的任意一种或多种；所述的ABC转运蛋白为ABCC1时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自蒽环霉素、长春花生物碱、表鬼臼毒素、喜树碱、甲氨蝶呤、沙奎那韦、米托蒽醌和伊马替尼中的任意一种或多种。
本发明的优点在于：本发明揭示了多肽HX-14C可以抑制ABC转运蛋白的功能，与ABC转运蛋白底物化疗药物联用，可增加化疗药物在耐药肿瘤细胞中的浓度，从而抑制耐药肿瘤细胞的增殖。提示多肽类ABC转运蛋白抑制剂与ABC转运蛋白底物化疗药物联合用药在制备治疗ABC转运蛋白介导的多药耐药肿瘤药物中的应用具有广阔的前景。
本发明将多肽应用于ABC转运蛋白介导的肿瘤多药耐药的逆转研究中，通过抑制ABC转运蛋白的功能，在无细胞毒浓度下发挥逆转耐药的作用，安全性更好，应用前景广阔。
附图说明
图1.Western blotting法检测ABCB1高表达细胞株中ABCB1的表达。(A)不同浓度多肽XH-14C孵育72小时后KB-C2细胞ABCB1蛋白的表达，未经任何处理的KB-3-1细胞作为ABCB1蛋白表达的阴性对照；以GAPDH为加载对照；(B)ABCB1表达与GAPDH表达的相对强度。
图2.Western blotting法检测ABCC1高表达细胞株中ABCC1的表达。(A)不同浓度多肽XH-14C孵育72小时后KB-CV60细胞ABCC1蛋白的表达，未经任何处理的KB-3-1细胞作为ABCC1蛋白表达的阴性对照；以GAPDH为加载对照；(B)ABCC1表达与GAPDH表达的相对强度。
图3.多肽XH-14C对KB-3-1和KB-C2细胞ABCB1表达及亚细胞定位的影响。
图4.多肽XH-14C对KB-3-1和KB-CV60细胞ABCC1表达及亚细胞定位的影响。图5.多肽XH-14C对KB-3-1和KB-C2细胞内[3H]-紫杉醇积累的影响.
图6.多肽XH-14C对KB-3-1和KB-C2细胞内紫杉醇外排的影响。
图7.多肽XH-14C对KB-3-1和KB-CV60细胞中[3H]-长春新碱的积累和外排活性。(A)肽XH-14C对KB-3-1和KB-CV60细胞内[3H]-长春新碱积累的影响；(B)肽XH-14C对KB-3-1和KB-CV60细胞内长春新碱外排的影响。
图8.多肽XH-14C对H460和H460/MX20细胞中[3H]-米托蒽醌积累的影响。
图9.多肽XH-14C对ABCB1转运体特异性ATP酶活性的影响。
图10.多肽XH-14C与ABCB1的分子对接。(A)多肽XH-14C与ABCB1结合的结构域和位置；(B)多肽XH-14C-ABCB1复合物表面的结构；(C)多肽XH-14C与ABCB1结合方式的预测。
图11.多肽XH-14C与ABCC1的分子对接。(A)多肽XH-14C与ABCC1结合的结构域和位置；(B)多肽XH-14C-ABCC1复合物表面的结构.
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
以下涉及的多肽均通过固相合成法合成，可委托商业公司合成，也可按照本领域已公开的技术进行自行合成。
实施例1多肽XH-14C对ABCB1转运蛋白高表达细胞株的影响
为了确定多肽XH-14C对ABC转运体的影响，测定了ABCB1过表达细胞KB-C2对多肽XH-14C的敏感性。采用改良MTT比色法测定不同细胞系中多肽的细胞毒性，按5000个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，培养过夜。以指定的浓度梯度加入多肽，孵育68h后，每孔加入20μL MTT溶液(4mg/mL)，再孵育4h，吸取培养基，加入100μL DMSO溶解甲醛晶体。用紫外/可见分光光度计在570nm处测定吸光度。结果如表1所示，多肽XH-14A(FFRKVLKLIRKI)、XH-14B(FFRKVLKLIRKIF)和XH-14C(FIKRIARLLRKIWR)对ABCB1过表达癌细胞(KB-C2)的细胞毒性试验IC50值分别为22.45μM、8.38μM和7.35μM。其亲代细胞(KB-3-1)的肽的IC50值分别为8.73μM、10.02μM和8.38μM。当在3μM的浓度下，多肽对癌细胞不会产生显著的细胞毒性，因此被选择用于进一步的逆转研究。
表1多肽的细胞毒作用
Figure BDA0002495327960000061
实施例2多肽XH-14C对ABCC1转运蛋白高表达细胞株的影响
为了确定多肽XH-14C对ABC转运体的影响，测定了ABCC1过表达细胞KB-CV60对多肽XH-14C的敏感性。采用改良MTT比色法测定不同细胞系中多肽的细胞毒性，按5000个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，培养过夜。以指定的浓度梯度加入多肽，孵育68h后，每孔加入20μL MTT溶液(4mg/mL)，再孵育4h，吸取培养基，加入100μL DMSO溶解甲醛晶体。用紫外/可见分光光度计在570nm处测定吸光度。结果如表2所示，多肽XH-14A(FFRKVLKLIRKI)、XH-14B(FFRKVLKLIRKIF)和XH-14C(FIKRIARLLRKIWR)对ABCC1过表达癌细胞(KB-CV60)的细胞毒性试验IC50值分别为14.71μM、8.54μM和10.12μM。其亲代细胞(KB-3-1)的肽的IC50值分别为7.18μM、7.82μM和8.37μM。当在3μM的浓度下，多肽对癌细胞不会产生显著的细胞毒性，因此被选择用于进一步的逆转研究。
表2多肽的细胞毒作用
Figure BDA0002495327960000071
实施例3多肽XH-14C对ABCG2转运蛋白高表达细胞株的影响
为了确定多肽XH-14C对ABC转运体的影响，测定了ABCG2过表达细胞H460/MX20对多肽XH-14C的敏感性。采用改良MTT比色法测定不同细胞系中多肽的细胞毒性，按5000个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，培养过夜。以指定的浓度梯度加入多肽，孵育68h后，每孔加入20μL MTT溶液(4mg/mL)，再孵育4h，吸取培养基，加入100μL DMSO溶解甲醛晶体。用紫外/可见分光光度计在570nm处测定吸光度。结果如表3所示，多肽XH-14A(FFRKVLKLIRKI)、XH-14B(FFRKVLKLIRKIF)和XH-14C(FIKRIARLLRKIWR)对ABCG2过表达癌细胞(H460/MX20)的细胞毒性试验IC50值分别为16.55μM、6.30μM和12.28μM。其亲代细胞(H460)的肽的IC50值分别为14.55μM、6.22μM和8.26μM。当在3μM的浓度下，多肽对癌细胞不会产生显著的细胞毒性，因此被选择用于进一步的逆转研究。
表3多肽的细胞毒作用
Figure BDA0002495327960000072
实施例4多肽XH-14C逆转ABCB1高表达细胞株耐药的研究
为了确定多肽XH-14C是否能够逆转ABCB1介导的多药耐药(MDR)，用药物诱导的耐药癌细胞系(KB-C2)和转染的ABCB1过表达细胞系(HEK293/ABCB1)(Shi Z,Tiwari A K,Shukla S,et al.Sildenafil Reverses ABCB1-and ABCG2-Mediated ChemotherapeuticDrug Resistance[J].Cancer Research,2011,71(8):3029-3041.)及其相应亲本细胞系(KB-3-1和HEK293/pcDNA3.1)进行细胞毒性试验。结果如表4和表5所示，与KB-3-1和HEK293/pcDNA3.1细胞系相比，多肽XH-14C显著降低了紫杉醇和阿霉素对过表达ABCB1的KB-C2和HEK293/ABCB1细胞系的IC50值。此外，与相应的亲本细胞(KB-3-1和HEK293/pcDNA3.1)相比，多肽XH-14C并没有影响顺铂(ABCB1的非底物)对过表达ABCB1的KB-C2和HEK293/ABCB1细胞系的IC50值(表5)。这些结果表明，多肽XH-14C可以逆转ABCB1介导的MDR。同等条件下多肽XH-14A和XH-14B没有XH-14C的逆转作用，尽管它们只有1～2个氨基酸的差别。
表4多肽对药物诱导的ABCB1过表达癌细胞株的逆转作用
Figure BDA0002495327960000081
1RF，耐药倍数，用药物诱导的ABCB1过表达癌细胞株KB-C2的IC50除
以药物敏感癌细胞株KB-3-1的IC50计算。
***，表示p＜0.001，与KB-C2对照组比较。
表5多肽对转染的ABCB1过表达癌细胞株的逆转作用
Figure BDA0002495327960000082
Figure BDA0002495327960000091
1RF，抗性倍数，用转染的ABCB1过表达细胞系HEK293/ABCB1的IC50除以转染的空载体细胞系HEK293/pcDNA3.1的IC50计算。***表示p＜0.001，与HEK293/ABCB1对照组比较
实施例5多肽XH-14C逆转ABCC1高表达细胞株耐药的研究
为了确定多肽XH-14C是否能够逆转ABCC1介导的多药耐药(MDR)，用药物诱导的耐药癌细胞系(KB-CV60)和转染的ABCC1过表达细胞系(HEK293/ABCC1)(Shi Z,Tiwari A K,Shukla S,et al.Sildenafil Reverses ABCB1-and ABCG2-Mediated ChemotherapeuticDrug Resistance[J].Cancer Research,2011,71(8):3029-3041.)及其相应亲本细胞系(KB-3-1和HEK293/pcDNA3.1)进行细胞毒性试验。结果如表6和表7所示，与KB-3-1和HEK293/pcDNA3.1细胞系相比，多肽XH-14C显著降低了长春新碱对过表达ABCC1的KB-CV60和HEK293/ABCC1细胞系的IC50值。此外，与相应的亲本细胞(KB-3-1和HEK293/pc DNA3.1)相比，多肽XH-14C并没有影响顺铂(ABCC1的非底物)对过表达ABCC1的KB-CV60和HEK293/ABCC1细胞系的IC50值(表7)。这些结果表明，多肽XH-14C可以逆转ABCC1介导的MDR。
表6多肽对药物诱导的ABCC1过表达癌细胞株的逆转作用
Figure BDA0002495327960000092
Figure BDA0002495327960000101
1RF，耐药倍数，用药物诱导的ABCC1过表达癌细胞株KB-CV60的IC50
除以药物敏感癌细胞株KB-3-1的IC50计算。
***，表示p＜0.001，与KB-CV60对照组比较。
表7多肽对转染的ABCC1过表达癌细胞株的逆转作用
Figure BDA0002495327960000102
1RF，抗性倍数，用转染的ABCC1过表达细胞系HEK293/ABCC1的IC50除以转染的空载体细胞系HEK293/pcDNA3.1的IC50计算。***表示p＜0.001，与HEK293/ABCC1对照组比较
实施例7多肽XH-14C逆转ABCG2高表达细胞株耐药的研究
为了确定多肽XH-14C是否能够逆转ABCG2介导的多药耐药(MDR)，用药物诱导的耐药癌细胞系(H460/MX20)和转染的ABCG2过表达细胞系(HEK293/ABCG2)及其相应亲本细胞系(H460和HEK293/pcDNA3.1)(Shi Z,Tiwari A K,Shukla S,et al.Sildenafil ReversesABCB1-and ABCG2-Mediated Chemotherapeutic Drug Resistance[J].Cancer Research,2011,71(8):3029-3041.)进行细胞毒性试验。结果如表8和表9所示，与H460和HEK293/pcDNA3.1细胞系相比，多肽XH-14C显著降低了米托蒽醌对过表达ABCG2的H460/MX20和HEK293/ABCG2细胞系的IC50值。此外，与相应的亲本细胞(H460和HEK293/pc DNA3.1)相比，多肽XH-14C并没有影响顺铂(ABCG2的非底物)对过表达ABCG2的H460/MX20和HEK293/ABCG2细胞系的IC50值(表9)。这些结果表明，多肽XH-14C可以逆转ABCG2介导的MDR。
表8多肽对药物诱导的ABCG2过表达癌细胞株的逆转作用
Figure BDA0002495327960000103
Figure BDA0002495327960000111
1RF，耐药倍数，用药物诱导的ABCG2过表达癌细胞株H460/MX20 IC50
除以药物敏感癌细胞株H460的IC50计算。
AAA***，表示p＜0.001，与H460/MX20对照组比较。
表9多肽对转染的ABCG2过表达癌细胞株的逆转作用
Figure BDA0002495327960000112
1RF，抗性倍数，用转染的ABCG2过表达细胞系HEK293/ABCG2的IC50除以转染的空载体细胞系HEK293/pcDNA3.1的IC50计算。***表示p＜0.001，与HEK293/ABCG2对照组比较
实施例8多肽XH-14C对ABCB1转运蛋白表达的影响
Western blotting分析考察多肽XH-14C是否影响ABCB1转运体的表达。在KB-C2和未经处理的KB-3-1中用0、1、3和6μM多肽XH-14C处理72h后，用裂解缓冲液(2.5％1M Tris、0.15％EDTA、1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、0.88％NaCl、1％Triton-X和蛋白酶抑制剂混合物)在冰上孵育细胞20min，4℃离心，收集上清液，利用基于双辛酸(BCA)的蛋白质测定法测定蛋白质浓度；用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质样品，并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；用5％的牛奶封闭2h后，在4℃下用一级抗体MDR(1:1000，检测ABCB1)孵育过夜。然后用TBST(Tris缓冲液，0.1％Tween 20)缓冲液冲洗膜，然后用二级HRP标记抗体(抗鼠抗体1:1000)孵育。用增强化学发光法检测信号，用软件定量蛋白质表达。如图1A和1B所示，不同浓度(0，1，3，6μM)的多肽XH-14C处理没有显著改变ABCB1蛋白(172kDa)在过表达KB-C2细胞系中的表达。
实施例9多肽XH-14C对ABCC1转运蛋白表达的影响
Western blotting分析考察多肽XH-14C是否影响ABCC1转运体的表达。在KB-CV60和未经处理的KB-3-1中用0、1、3和6μM多肽XH-14C处理72h后，用裂解缓冲液(2.5％1MTris、0.15％EDTA、1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、0.88％NaCl、1％Triton-X和蛋白酶抑制剂混合物)在冰上孵育细胞20min，4℃离心，收集上清液，利用基于双辛酸(BCA)的蛋白质测定法测定蛋白质浓度；用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质样品，并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；用5％的牛奶封闭2h后，在4℃下用一级抗体MDR(1:1000，检测ABCC1)孵育过夜。然后用TBST(Tris缓冲液，0.1％Tween 20)缓冲液冲洗膜，然后用二级HRP标记抗体(抗鼠抗体1:1000)孵育。用增强化学发光法检测信号，用软件定量蛋白质表达。如图2A和2B所示，不同浓度(0，1，3，6μM)的多肽XH-14C处理没有显著改变ABCC1蛋白(190kDa)在过表达KB-CV60细胞系中的表达。
实施例10多肽XH-14C对ABCB1表达水平及细胞定位的影响
为了进一步证实多肽是否改变了ABCB1蛋白的表达和细胞定位，在不同孵育时间处理细胞后进行免疫荧光染色。将KB-3-1和KB-C2细胞接种于24孔板中(1×104个细胞/孔)，37℃培养24小时，然后分别与3μM多肽XH-14C培养0、24、48和72h。然后用冷PBS溶液洗涤细胞2次；在4％甲醛中固定15min；用0.25％Triton X-100孵育15min；用BSA(6％PBS)孵育1h；再用单克隆抗体ABCB1(MDR，1:1000)4℃孵育过夜；用Alexa Fluor 488结合IgG二级抗体(抗ABCB1小鼠，1:1000)在黑暗中进一步孵育细胞1h；用DAPI溶液复染细胞核；用荧光显微镜观察。如图3所示，与亲本细胞KB-3-1相比，ABCB1在KB-C2细胞膜上显著表达，多肽XH-14C处理后KB-C2中ABCB1的荧光强度也没有变化，与Western blotting结果一致。另外，多肽XH-14C对KB-C2细胞膜上ABCB1的亚细胞分布也无明显影响。这些结果表明，多肽XH-14C逆转MDR并不是由于蛋白表达降低或蛋白位置改变引起的。
实施例11多肽XH-14C对ABCC1表达水平及细胞定位的影响
为了进一步证实多肽是否改变了ABCC1蛋白的表达和细胞定位，在不同孵育时间处理细胞后进行免疫荧光染色。将KB-3-1和KB-CV60细胞接种于24孔板中(1×104个细胞/孔)，37℃培养24小时，然后分别与3μM多肽XH-14C培养0、24、48和72h。然后用冷PBS溶液洗涤细胞2次；在4％甲醛中固定15min；用0.25％Triton X-100孵育15min；用BSA(6％PBS)孵育1h；再用单克隆抗体ABCC1(MDR，1:1000)4℃孵育过夜；用Alexa Fluor 488结合IgG二级抗体(抗ABCC1小鼠，1:1000)在黑暗中进一步孵育细胞1h；用DAPI溶液复染细胞核；用荧光显微镜观察。如图4所示，与亲本细胞KB-3-1相比，ABCC1在KB-CV60细胞膜上显著表达，多肽XH-14C处理后KB-CV60中ABCC1的荧光强度也没有变化，与Western blotting结果一致。另外，多肽XH-14C对KB-CV60细胞膜上ABCC1的亚细胞分布也无明显影响。这些结果表明，XH-14C肽逆转MDR并不是由于蛋白表达降低或蛋白位置改变引起的。
实施例12多肽XH-14C对[3H]-紫杉醇积聚和外排的影响
通过比较[3H]-紫杉醇在KB-3-1和KB-C2细胞中的浓度，确定多肽XH-14C对[3H]-紫杉醇在ABCB1过表达细胞中积聚和外排的影响。将KB-3-1和KB-C2细胞接种于24孔板(1×104个细胞/孔)中，37℃孵育24h，然后加或不加多肽和阳性逆转剂维拉帕米孵育72h，然后用含5μM[3H]-紫杉醇和多XH-14C或阳性逆转剂的培养基替代，培养2小时后，丢弃培养基，用冰冷的PBS洗涤细胞3次，裂解后转移到闪烁液中。对于外排分析，操作与累积分析类似。丢弃含有[3H]-紫杉醇的培养基后，用冰冷的PBS洗涤细胞，用含多肽XH-14C或阳性逆转剂的培养基培养。分别在30、60和120min取样，将细胞洗涤三次，裂解，然后转移到闪烁液中，用液体闪烁分析仪测量放射性。结果如图5所示，ABCB1高表达KB-C2细胞培养2小时后，细胞内[3H]紫杉醇含量约为其亲本KB-3-1细胞的100倍。与对照组相比，多肽XH-14C(3μM)组KB-C2细胞中[3H]-紫杉醇的积累明显增加，且多肽XH-14C(3μM)对[3H]-紫杉醇积累的影响与ABCB1抑制剂维拉帕米(3μM)相当。此外，我们还评估了多肽XH-14C对[3H]紫杉醇在ABCB1过度表达的KB-C2细胞中流出的影响，结果如图6所示。培养2小时后，KB-3-1细胞中的[3H]紫杉醇水平没有显著变化，抑制剂维拉帕米也没有改变KB-3-1细胞的流出功能。然而，未经抑制剂处理的KB-C2细胞内[3H]-紫杉醇水平显著下降约50％。说明多肽XH-14C(3μM)能有效抑制KB-C2细胞的外排功能。
实施例13多肽XH-14C对[3H]-长春新碱积聚和外排的影响
通过比较[3H]-长春新碱在KB-3-1和KB-CV60细胞中的浓度，确定多肽XH-14C对[3H]-长春新碱在ABCC1过表达细胞中积聚和外排的影响。将KB-3-1和KB-CV60细胞接种于24孔板(1×104个细胞/孔)中，37℃孵育24h，然后加或不加多肽和阳性逆转剂MK571孵育72h，然后用含5μM[3H]-长春新碱和多肽XH-14C或阳性逆转剂的培养基替代，培养2小时后，丢弃培养基，用冰冷的PBS洗涤细胞3次，裂解后转移到闪烁液中。对于外排分析，操作与累积分析类似。丢弃含有[3H]-长春新碱的培养基后，用冰冷的PBS洗涤细胞，用含多肽XH-14C或阳性逆转剂的培养基培养。分别在30、60和120min取样，将细胞洗涤三次，裂解，然后转移到闪烁液中，用液体闪烁分析仪测量放射性。结果如图7A所示，ABCC1高表达KB-CV60细胞培养2小时后，细胞内[3H]长春新碱含量约为其亲本KB-3-1细胞的7倍。与对照组相比，多肽XH-14C(3μM)组KB-CV60细胞中[3H]-长春新碱的积累明显增加。此外，我们还评估了多肽XH-14C对[3H]长春新碱在ABCC1过度表达的KB-CV60细胞中流出的影响，结果如图7B所示。培养2小时后，KB-3-1细胞中的[3H]长春新碱水平下降了25％，然而，未经抑制剂处理的KB-CV60细胞内[3H]-长春新碱水平显著下降约70％。经多肽XH-14C(3μM)处理的KB-CV60细胞内[3H]-长春新碱水平下降了55％，与抑制剂MK571作用相当。说明多肽XH-14C(3μM)能有效抑制KB-CV60细胞的外排功能。
实施例14多肽XH-14C对[3H]-米托蒽醌积聚的影响
通过比较[3H]-米托蒽醌在H460和H460/MX20细胞中的浓度，确定多肽XH-14C对[3H]-米托蒽醌在ABCG2过表达细胞中积聚和外排的影响。将H460和H460/MX20细胞接种于24孔板(1×104个细胞/孔)中，37℃孵育24h，然后加或不加多肽和阳性逆转剂FTC孵育72h，然后用含0.2μM[3H]-米托蒽醌和多肽XH-14C或阳性逆转剂的培养基替代，培养2小时后，丢弃培养基，用冰冷的PBS洗涤细胞3次，裂解后转移到闪烁液中，用液体闪烁分析仪测量放射性。结果如图8所示，ABCG2高表达H460/MX20细胞培养2小时后，细胞内[3H]米托蒽醌含量约为其亲本H460细胞的6倍。与对照组相比，多肽XH-14C(3μM)组H460/MX20细胞中[3H]-米托蒽醌的积累明显增加，且多肽XH-14C(3μM)对[3H]-米托蒽醌积累的影响与ABCG2抑制剂FTC(2.5μM)相当。说明多肽XH-14C(3μM)能有效抑制H460/MX20细胞的外排功能。
实施例15多肽XH-14C对ABCB1转运蛋白ATP酶活性的影响
测定了在不同浓度(0-40μM)多肽XH-14C存在下ABCB1介导的ATP的水解，以评估多肽XH-14C对ABCB1 ATP酶活性的影响。将购买的膜囊泡(10μg蛋白质)置于37℃的ATPase缓冲液中，加入或不加入0.3mM钒酸盐，孵育5min，加入缓冲液与0至40μM浓度的多肽XH-14C在37℃孵育3min，添加总体积为0.1mL的5mM Mg-ATP来启动ATP酶反应。37℃孵育20min后，通过向反应混合物中添加100μL5％SDS溶液停止反应；通过用分光光度计在800nm处测定释放出的无机磷(IP)量来计算其ATP酶活性。结果如图9所示，多肽XH-14C以浓度依赖的方式刺激ABCB1的ATP酶活性，最大刺激量为基础活性的2.3倍。并且获得50％刺激所需的多肽XH-14C浓度为0.65μM，远低于细胞毒性浓度。这些结果表明，多肽XH-14C可能在药物-底物结合位点相互作用，从而影响ABCB1的ATPase活性。
实施例16多肽XH-14C-ABCB1结合的分子对接分析
为了深入了解潜在的结合模式并使多肽XH-14C的观察效果合理化，我们进行了分子对接研究。利用Sybyl/Sketch模块(Tripos公司)对多肽XH-14C进行了描述，并应用Powell方法对其进行了优化，将收敛参数设置为0.05kcal/
Figure BDA0002495327960000152
并用Gasteiger-Hsckel方法进行了分配。从RCSB蛋白数据库(PDB-ID:4M2T)获得ABCB1的晶体结构；并利用配体模式，将多肽XH-14C连接到ABCB1的活性位点；用Tripos力场和Pullman电荷去除配体，加氢并最小化；其他参数保持默认值。结果如图10所示，多肽XH-14C与ABCB1的活性位点(底物结合位点)紧密结合。该肽与ABCB1中的S305和S989残基形成氢键，可能对提高多肽XH-14C与ABCB1的结合亲和力起重要作用。
实施例17多肽XH-14C-ABCC1结合的分子对接分析
为了深入了解潜在的结合模式并使多肽XH-14C的观察效果合理化，我们进行了分子对接研究。利用Sybyl/Sketch模块(Tripos公司)对多肽XH-14C进行了描述，并应用Powell方法对其进行了优化，将收敛参数设置为0.05kcal/
Figure BDA0002495327960000151
并用Gasteiger-Hsckel方法进行了分配。从RCSB蛋白数据库(PDB-ID:4M2T)获得ABCC1的晶体结构；并利用配体模式，将多肽XH-14C连接到ABCC1的活性位点；用Tripos力场和Pullman电荷去除配体，加氢并最小化；其他参数保持默认值。结果如图11所示，多肽与ABCC1的NBD区域紧密结合。该肽能够与S685和G683形成氢键。
序列表
<110> 湖南科技学院
<120> 一种多肽类ABC转运蛋白抑制剂XH-14C及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Phe Ile Lys Arg Ile Ala Arg Leu Leu Arg Lys Ile Trp Arg
1 5 10

Claims (10)

1.SEQ ID NO.1所示的多肽XH-14C在制备治疗ABC转运蛋白介导的多药耐药的抗肿瘤药物中的应用；所述的ABC转运蛋白选自ABCB1、ABCC1或ABCG2。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的ABC转运蛋白为ABCB1时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自紫杉烷类、长春花生物碱类，蒽环霉素类，表鬼臼毒素类，酪氨酸激酶抑制剂，或抗生素类抗肿瘤药；所述的ABC转运蛋白为ABCG2时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自核苷类似物、酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)、蒽环霉素类、表鬼臼毒素、喜树碱类、叶酸拮抗剂、黄酮类抗肿瘤药；所述的ABC转运蛋白为ABCC1时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自长春花生物碱类，蒽环霉素类，表鬼臼毒素类，酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的ABC转运蛋白选自ABCB1时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自紫杉醇、多西紫杉醇、长春碱、长春新碱、阿霉素、柔红霉素、依托泊苷、替尼泊苷、伊马替尼、尼罗替尼、厄洛替尼、放线菌素D中的任意一种或多种；所述的ABC转运蛋白为ABCG2时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自夫拉平度、伊利替康及其代谢物SN-38、拓扑替康、替尼泊苷、依托泊苷、伊马替尼、吉非替尼、达努塞替、多柔吡星、柔红霉素、米托蒽醌、甲氨蝶呤和蒽环霉素中的任意一种或多种；所述的ABC转运蛋白为ABCC1时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自蒽环霉素、长春花生物碱、表鬼臼毒素、喜树碱、甲氨蝶呤、沙奎那韦、米托蒽醌和伊马替尼中的任意一种或多种。
4.SEQ ID NO.1所示的多肽XH-14C和ABC转运蛋白底物化疗药物联合在制备治疗ABC转运蛋白介导的多药耐药的抗肿瘤药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的ABC转运蛋白选自ABCB1、ABCC1或ABCG2。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于ABCB1介导的肿瘤优选肺癌、宫颈癌、人表皮样癌、卵巢癌、肝癌、肠癌、胃癌或胰腺癌；ABCC1介导的肿瘤优选肺癌、肝癌、肠癌、乳腺癌或食管癌；ABCG2介导的肿瘤优选乳腺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、非小细胞肺癌、卵巢癌或黑色素瘤。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的ABC转运蛋白为ABCB1时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自紫杉烷类、长春花生物碱类，蒽环霉素类，表鬼臼毒素类，酪氨酸激酶抑制剂，或抗生素类抗肿瘤药；所述的ABC转运蛋白为ABCG2时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自核苷类似物、酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)、蒽环霉素类、表鬼臼毒素、喜树碱类、叶酸拮抗剂、黄酮类抗肿瘤药；所述的ABC转运蛋白为ABCC1时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自长春花生物碱类，蒽环霉素类，表鬼臼毒素类，酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的ABC转运蛋白选自ABCB1时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自紫杉醇、多西紫杉醇、长春碱、长春新碱、阿霉素、柔红霉素、依托泊苷、替尼泊苷、伊马替尼、尼罗替尼、厄洛替尼、放线菌素D中的任意一种或多种；所述的ABC转运蛋白为ABCG2时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自夫拉平度、伊利替康及其代谢物SN-38、拓扑替康、替尼泊苷、依托泊苷、伊马替尼、吉非替尼、达努塞替、多柔吡星、柔红霉素、米托蒽醌、甲氨蝶呤和蒽环霉素中的任意一种或多种；所述的ABC转运蛋白为ABCC1时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自蒽环霉素、长春花生物碱、表鬼臼毒素、喜树碱、甲氨蝶呤、沙奎那韦、米托蒽醌和伊马替尼中的任意一种或多种。
9.一种治疗ABCB1介导的多药耐药的抗肿瘤药物组合物，其特征在于由SEQ ID NO.1所示的多肽XH-14C和ABC转运蛋白底物化疗药物组成。
10.根据权利要求7所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于ABC转运蛋白选自ABCB1、ABCC1或ABCG2；所述的ABC转运蛋白为ABCB1时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自紫杉烷类、长春花生物碱类，蒽环霉素类，表鬼臼毒素类，酪氨酸激酶抑制剂，或抗生素类抗肿瘤药；所述的ABC转运蛋白为ABCG2时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自核苷类似物、酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)、蒽环霉素类、表鬼臼毒素、喜树碱类、叶酸拮抗剂、黄酮类抗肿瘤药；所述的ABC转运蛋白为ABCC1时，所述的ABC转运蛋白底物化疗药物选自长春花生物碱类，蒽环霉素类，表鬼臼毒素类，酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药。
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