CN111700912B - 一种适用于角膜缘干细胞缺乏症的滴眼液及制备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种适用于角膜缘干细胞缺乏症的滴眼液及制备方法，所述滴眼液包括如下组分：人脂肪干细胞外泌体1‑40mg/L，辅料：玻璃酸钠0.5‑2g/L、维生素B6 0.5‑3g/L、苯扎氯铵0.05‑0.3g/L、余量为医用生理盐水，pH为6.5‑7.5；本发明涉及的滴眼液用于治疗角膜缘干细胞缺乏症的效果显著。

Description

一种适用于角膜缘干细胞缺乏症的滴眼液及制备
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种适用于角膜缘干细胞缺乏症的滴眼液及制备方法。
背景技术
角膜缘干细胞是一群位于角膜缘基底部Vogt栅栏处的干细胞，角膜缘干细胞不断增殖和分化，维持角膜上皮的稳定与更新。眼表化学损伤或热烧伤、干眼、长时间佩戴角膜接触镜(隐形眼镜)等因素均可造成角膜缘干细胞数量和功能失代偿，导致角膜缘干细胞缺乏。角膜缘干细胞缺乏症使角膜上皮失去再生和修复的能力，引起角膜上皮结膜化、新生血管长入、角膜基质瘢痕化甚至造成角膜自溶及溃疡。角膜缘干细胞缺乏症在我国等发展中国家是常见的致盲性眼病，且多为青壮年劳动人群，给患者家庭和社会造成严重的经济和精神负担。
针对角膜缘干细胞缺乏症的治疗，目前常用的是自体/异体角膜缘移植、有异体角膜缘干细胞移植、体外培养的口腔粘膜细胞移植、羊膜移植等。这些方法虽然在临床上取得一定疗效，但仍存在很多问题，比如角膜缘移植排斥反应，角膜缘干细胞体外扩增困难易分化，口腔粘膜细胞移植生物学效应较差，羊膜移植无法修复角膜上皮等。
中国专利文献CN109449770A(申请号：201810188801.3)公开了一种间充质干细胞外泌体滴眼液及其制备方法和应用，公开了一种间充质干细胞外泌体滴眼液，其pH为5.2-6.0，渗透压为0.24-0.360smol/kg，每1000mL包括1.5-2.5g牛磺酸、0.12-0.16g天然冰片、1.5-2.5mL药用乙醇、间充质干细胞外泌体8-12mg、适量甘油和适量磷酸氢二钠，溶剂为医用生理盐水；所述间充质干细胞外泌体的来源包括脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和胎盘间充质干细胞；所述间充质干细胞传代至少3次后，种植于培养瓶中，待细胞融合度达到75-85％时更换为无血清培养基，继续培养至少3d后收集培养基，再通过外泌体提取试剂盒获得干细胞外泌体悬液；该发明说明了所述滴眼液具有保健功能可以缓解视疲劳，还能降低眼压、消除眼部充血，对近视、远视、老花眼、青光眼、白内障、年龄相关性黄斑病变等眼部疾病有一定的防治作用。
中国专利文献CN108743620A(申请号：201810643146.6)公开了生物活性材料促进干细胞来源外泌体治疗角膜损伤，该发明是使用干细胞分泌的外泌体通过物理混合与生物活性材料水凝胶结合，将外泌体释放至周围组织中，调控其释放速度和释放方式；所述水凝胶为生物活性材料水凝胶滴眼液，所述水凝胶即具有生物材料的物理和化学性能，也具有干细胞分泌的生物活性，所述的生物材料可以是壳聚糖、透明质酸、羧甲基纤维素钠等可用于眼部给药的材料；所述外泌体为干细胞来源的外泌体，所述干细胞包括脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、尿液来源干细胞、内皮祖细胞或心脏干细胞等；该发明说明了所述水凝胶滴眼液可以有效增强外泌体在损伤部位的滞留率，同时提高外泌体内蛋白质及microRNA等有效成分的稳定性，并可以将外泌体缓释到损伤部位，进一步提高外泌体的治疗效果，促进损伤组织结构和功能的恢复。
目前，关于利用干细胞培养基中提取的外泌体成分适用于角膜损伤修复、缓解视觉疲劳有少量报道，但是，利用人脂肪干细胞外泌体制备适用于角膜缘干细胞缺乏尤其是有效预防继发角膜新生血管和角膜上皮结膜化的滴眼液，未见相关报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种适用于角膜缘干细胞缺乏症的滴眼液及制备方法。
本发明涉及的滴眼液适用于多种因素导致的角膜缘干细胞缺乏证。
本发明的技术方案
人脂肪干细胞外泌体作为药效成分，在制备治疗角膜缘干细胞缺乏症药物中的应用。
一种治疗角膜缘干细胞缺乏症的药物，所述药物含有人脂肪干细胞外泌体。
一种组合物作为药效成分，在制备治疗角膜缘干细胞缺乏症药物中的应用，所述组合物的组分包括如下：人脂肪干细胞外泌体，辅料：玻璃酸钠、维生素B6、苯扎氯铵和医用生理盐水。
根据本发明优选的，组合物的组分包括如下：人脂肪干细胞外泌体1-40mg/L，辅料：玻璃酸钠0.5-2g/L、维生素B6 0.5-3g/L和苯扎氯铵0.05-0.3g/L。
根据本发明优选的，组合物的组分包括如下：含有人脂肪干细胞外泌体20mg/L，辅料：玻璃酸钠2g/L、维生素B6 3g/L和苯扎氯铵0.3g/L和医用生理盐水。
一种治疗角膜缘干细胞缺乏症的药物，所述药物含有人脂肪干细胞外泌体，辅料：玻璃酸钠、维生素B6、苯扎氯铵和医用生理盐水。
根据本发明优选的，所述药物含有人脂肪干细胞外泌体1-40mg/L，辅料：玻璃酸钠0.5-2g/L、维生素B6 0.5-3g/L和苯扎氯铵0.05-0.3g/L和医用生理盐水。
进一步优选的，所述药物含有人脂肪干细胞外泌体20mg/L，辅料：玻璃酸钠2g/L、维生素B6 3g/L和苯扎氯铵0.3g/L和医用生理盐水。
一种适用于角膜缘干细胞缺乏症的滴眼液，包括如下组分：人脂肪干细胞外泌体1-40mg/L，辅料：玻璃酸钠0.5-2g/L、维生素B6 0.5-3g/L、苯扎氯铵0.05-0.3g/L、余量为医用生理盐水，pH为6.5-7.5。
所述滴眼液的渗透压为310-315mOSm/L。
根据本发明优选的，所述滴眼液，包括如下组分：人脂肪干细胞外泌体20mg/L，辅料：玻璃酸钠2g/L、维生素B6 3g/L、苯扎氯铵0.3g/L、余量为医用生理盐水，pH为6.5-7.5。
根据本发明优选的，上述医用生理盐水为注射用生理盐水。
上述适用于角膜缘干细胞缺乏症的滴眼液的制备方法，包括如下步骤：
(1)选取3-5代人脂肪干细胞，利用干细胞培养基将细胞培养至70％-80％融合后，更换为干细胞无血清培养基，将干细胞继续培养36h-48h，收集培养上清液，提取人脂肪干细胞外泌体，重悬所述外泌体，制得人脂肪干细胞外泌体溶液；
(2)将步骤(1)中制备的人脂肪干细胞外泌体溶液，按照上述滴眼液的外泌体组分浓度与其它组分混合均匀，调整pH为6.5-7.5，制得所述滴眼液。
根本发明优选的，步骤(1)中利用超速梯度离心法提取外泌体，具体离心力选择依次为300×g，20min，留取上清液；10000×g，30min，留取上清液；100000×g,1h，除去上清液，留取沉淀为人脂肪干细胞外泌体。
进一步优选的，步骤(1)中利用HBSS重悬人脂肪干细胞外泌体。
根据本发明优选的，步骤(1)中通过BCA法测定重悬外泌体的蛋白含量，即为人脂肪干细胞外泌体的浓度，调整外泌体的使用浓度，制得人脂肪干细胞外泌体溶液。
根据本发明优选的，步骤(2)中按上述滴眼液的组分，将玻璃酸钠溶解到医用生理盐水中，再依次溶解相应浓度的维生素B6，苯扎氯铵，调整pH为6.5-7.5，然后添加相应浓度的步骤(1)制备的人脂肪干细胞外泌体溶液，混合均匀制得所述滴眼液。
根据本发明优选的，步骤(2)中利用HCl和/或NaOH调整pH为6.5-7.5。
根据本发明优选的，步骤(2)中的滴眼液，包括如下组分：人脂肪干细胞外泌体20mg/L，辅料：玻璃酸钠2g/L、维生素B6 3g/L、苯扎氯铵0.3g/L、余量为医用生理盐水，pH为6.5-7.5。
根据本发明优选的，步骤(2)中滴眼液的组分中，医用生理盐水为注射用生理盐水。
所述滴眼液在适用于眼部化学损伤、热烫伤或其他原因导致的角膜缘干细胞缺乏症中的应用。
本发明技术方案的有益效果
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明涉及的滴眼液适用于角膜缘干细胞缺乏尤其是有效预防继发角膜新生血管和角膜上皮结膜化的症状，应用效果显著。
2、与干细胞移植，羊膜移植，口腔粘膜细胞移植等相比，本发明涉及的干细胞外泌体滴眼液具有制作简便、操作简单、技术难度低等优势。
3、本发明涉及的干细胞外泌体滴眼液含有多种活性物质，具有良好的稳定性和生物活性，且具有缓释的效果，利于安全有效的眼部局部治疗。
4、本发明涉及的滴眼液具有携带方便、费用较低，减轻使用者的经济负担。
附图说明
图1为小鼠角膜缘干细胞缺乏症动物模型经实施例1-3与对比例1-3制备的滴眼液治疗28天后的小鼠眼球裂隙灯照片及临床评分统计图；
其中：A为裂隙灯照片；B为角膜临床评分统计图；
图2为小鼠角膜缘干细胞缺乏症动物模型经实施例-3与对比例-3制备的滴眼液治疗28天后，小鼠角膜铺片行新生血管标记物CD31免疫荧光染色图及角膜新生血管面积统计图；
其中：A为角膜新生血管的CD31免疫荧光染色照片；B为角膜的新生血管面积统计图；
图3为小鼠角膜缘干细胞缺乏症动物模型经实施例-3与对比例-3制备的滴眼液治疗28天后，小鼠角膜做冰冻切片，行角膜缘干细胞标记物△Np63免疫荧光染色照片，行细胞核染色剂DAPI荧光染色照片，以及将所述两种荧光染色照片利用Merge的方式进行处理的照片；
图4为小鼠角膜缘干细胞缺乏症动物模型经实施例-3与对比例-3制备的滴眼液治疗28天后，小鼠角膜做冰冻切片，行角结膜杯状细胞标记物MUC-5AC免疫荧光染色的照片，行细胞核染色剂DAPI荧光染色的照片，以及将所述两种荧光染色的照片利用Merge的方式进行处理的照片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但保护范围不限于此。
实施例中未注明具体条件的内容，按照常规条件进行；所用试剂或仪器未注明生成厂商的，均为普通市售产品。
主要材料的来源
人脂肪干细胞：分离自健康成人女性(20-30岁)吸脂手术所得脂肪；也可购买现有市售人脂肪干细胞；
玻璃酸钠：购自Sigma公司；
维生素B6：购自Sigma公司；
苯扎氯氨：购自Sigma公司；
MEM脂肪干细胞基础培养基：购自Thermofisher公司；
干细胞培养基：购自赛业(广州)生物科技有限公司；
HBSS：购自Thermofisher公司；
人胎盘干细胞：分离自健康足月产胎儿胎盘；也可购买现有市售人胎盘干细胞。
人脐带干细胞：分离自健康足月产胎儿脐带；也可购买现有市售人脐带干细胞。
实施例1
一种适用于角膜缘干细胞缺乏症的滴眼液，包括如下组分：
人脂肪干细胞外泌体1mg/L，辅料：玻璃酸钠0.5g/L、维生素B6 1g/L、苯扎氯铵0.05g/L，余量为注射用生理盐水，pH为7.0。
上述滴眼液的制备方法，包括如下步骤：
(1)人脂肪干细胞外泌体的制备：选取第3代人脂肪干细胞，利用干细胞培养基，于体积浓度为5％CO2的37℃恒温细胞培养箱中培养，将细胞培养至80％融合后，更换为MEM干细胞基础培养基培养48h，于体积浓度为5％CO2的37℃恒温细胞培养箱中培养，收集培养上清液，超速梯度离心法提取外泌体，离心力选择依次为300×g，20min，留取上清液；10000×g，30min，留取上清液；100000×g，1h，除去上清液，留取沉淀为人脂肪干细胞外泌体，利用HBSS重悬所述外泌体，利用BCA试剂盒测定重悬外泌体的蛋白含量，即为人脂肪干细胞外泌体的浓度，调整外泌体的使用浓度，制得人脂肪干细胞外泌体溶液。
(2)按上述滴眼液中的组分组成将玻璃酸钠溶解到注射用生理盐水中，依次溶解维生素B6，苯扎氯铵，利用HCl和NaOH调整PH为7.0，然后添加相应量的步骤(1)制备的外泌体溶液，使最终溶液中外泌体的浓度为1mg/L，制得上述滴眼液。
上述制得的滴眼液渗透压为312mOSm/L。
实施例2
一种适用于角膜缘干细胞缺乏症的滴眼液，包括如下组分：
人脂肪干细胞外泌体10mg/L，辅料：玻璃酸钠1g/L、维生素B6 2g/L、苯扎氯铵0.1g/L、余量为注射用生理盐水，pH为7.0。
上述滴眼液的制备方法，包括如下步骤：
(1)人脂肪干细胞外泌体的制备：选取3代人脂肪干细胞，利用干细胞培养基，于体积浓度为5％CO2的37℃恒温细胞培养箱中培养，将细胞培养至80％融合后，更换为MEM干细胞基础培养基培养48h，于体积浓度为5％CO2的37℃恒温细胞培养箱中培养，收集培养上清液，超速梯度离心法提取外泌体，离心力选择依次为300×g，20min，留取上清液；10000×g，30min，留取上清液；100000×g，1h，除去上清液，留取沉淀为人脂肪干细胞外泌体，利用HBSS重悬所述外泌体，利用BCA试剂盒测定重悬外泌体的蛋白含量，即为人脂肪干细胞外泌体的浓度，调整外泌体的使用浓度，制得人脂肪干细胞外泌体溶液。
(2)按上述滴眼液中组分组成将玻璃酸钠溶解到注射用生理盐水中，再依次溶解维生素B6，苯扎氯铵，利用HCl和NaOH调整PH为7.0，然后添加相应量的步骤(1)制备的外泌体溶液，使最终溶液中外泌体的浓度为10mg/L，制得上述滴眼液。
上述制得的滴眼液渗透压为312mOSm/L。
实施例3
一种适用于角膜缘干细胞缺乏症的滴眼液，包括如下组分：
人脂肪干细胞外泌体20mg/L，辅料：玻璃酸钠2g/L、维生素B6 3g/L、苯扎氯铵0.3g/L，余量为注射用生理盐水
上述滴眼液的制备方法，包括如下步骤：
(1)人脂肪干细胞外泌体的制备：选取4代人脂肪干细胞，利用干细胞培养基，于体积浓度为5％CO2的37℃恒温细胞培养箱中培养，将细胞培养至80％融合后，更换为MEM干细胞基础培养基培养48h，于体积浓度为5％CO2的37℃恒温细胞培养箱中培养，收集培养上清液，超速梯度离心法提取外泌体，离心力选择依次为300×g，20min，留取上清液；10000×g，30min，留取上清液；100000×g，1h，除去上清液，留取沉淀为人脂肪干细胞外泌体，利用HBSS重悬所述外泌体，利用BCA试剂盒测定重悬外泌体的蛋白含量，即为人脂肪干细胞外泌体的浓度，调整外泌体的使用浓度，制得人脂肪干细胞外泌体溶液。
(2)按上述滴眼液中组分组成将玻璃酸钠溶解到注射用生理盐水中，再依次溶解维生素B6，苯扎氯铵，利用HCl和NaOH调整PH为7.0，然后添加相应量的步骤(1)制备的外泌体溶液，使最终溶液中外泌体的浓度为20mg/L，制得上述滴眼液。
上述制得的滴眼液渗透压为312mOSm/L。
对比例1
与实施例1的滴眼液不同之处在于，滴眼液组分中的人脂肪干细胞外泌体用MEM脂肪干细胞基础培养基代替，其它均相同。
对比例2
与实施例2的滴眼液不同之处在于，滴眼液组分中的人脂肪干细胞外泌体用人胎盘干细胞外泌体代替，在滴眼液中的浓度也为10mg/L，所述人胎盘干细胞外泌体的制备方法与人脂肪干细胞外泌体的制备方法相同，其它均相同。
对比例3
与实施例3的滴眼液不同之处在于，滴眼液组分中的人脂肪干细胞外泌体用人脐带干细胞外泌体代替，在滴眼液中的浓度也为20mg/L，所述人脐带干细胞外泌体的制备方法与人脂肪干细胞外泌体的制备方法相同，其它均相同。
效果例
参照文献Reconstruction of chemically burned rat corneal surface bybone marrow-derived human mesenchymal stem cells.Stem Cells.2006Feb；24(2):315-21.利用滤纸环法构建小鼠角膜缘干细胞缺乏症模型，小鼠建模后，分别利用上述滴眼液每天点眼4次，点眼时间为(8：00AM；11:00AM；14:00PM；17:00PM)，5ul/眼/次，治疗时间28天，经实施例1-3与对比例1-3制备的滴眼液治疗后，对小鼠眼球裂隙灯拍照，分析小鼠角膜临床评分，利用CD31抗体行小鼠角膜新生血管染色，利用角膜缘干细胞标记物△Np63抗体染色，行角结膜杯状细胞标记物MUC-5AC免疫荧光染色，行细胞核染色剂DAPI荧光染色，小鼠角膜缘干细胞缺乏症相关检测指标明显好转，实验结果如图1、图2、图3和图4所示：
图1为小鼠角膜缘干细胞缺乏症动物模型经实施例1-3与对比例1-3制备的滴眼液治疗28天后的小鼠眼球裂隙灯照片及临床评分统计图。A代表裂隙灯照片，照片中显示对比例1-3中，小鼠角膜呈现不同程度的浑浊，且伴有新生血管长入，与对比例1-3相比，实施例1-3中小鼠角膜浑浊度均有减轻；B代表角膜临床评分统计，结果显示，与对比例1-3相比，实施例1-3中小鼠角膜临床评分显著改善。所用角膜临床评分统计，参照经典文献中的评分系统，参考文献Mesenchymal Stromal Cells Inhibit Inflammatory Lymphangiogenesisin the Cornea by Suppressing Macrophage in a TSG-6-Dependent Manner.Mol Ther26,162-172,doi:10.1016/j.ymthe.2017.09.026(2018).)。
通过图1可以得出相比较于对比例1-3组的滴眼液，实施例1-3组的滴眼液，均有治疗效果，而且以实施-3组的治疗效果最好。
图2为小鼠角膜缘干细胞缺乏症动物模型经实施例-3与对比例-3制备的滴眼液治疗28天后，取实施例-3和对比例-3制备的滴眼液治疗的小鼠角膜铺片，行CD31角膜新生血管染色。图中：A为角膜新生血管的CD31免疫荧光染色照片；结果显示，对比例-3中小鼠角膜中有大量新生血管长入，而实施例-3中小鼠角膜新生血管长入显著减少；B为角膜的新生血管面积统计图；结果显示，与对比例-3相比，实施例-3小鼠角膜新生血管面积显著降低；统计方法参照文献：Effects of mesenchymal stem/stromal cells on cultures ofcorneal epithelial progenitor cells with ethanol injury.Invest Ophthalmol VisSci 55,7628-7635,doi:10.1167/iovs.14-15424(2014).)。
角膜新生血管是角膜缘干细胞缺乏的重要指标，由图2可以得出，与对比例-3制备的滴眼液治疗组相比，实施例-3制备的滴眼液治疗组小鼠角膜新生血管显著降低。
图3为小鼠角膜缘干细胞缺乏症动物模型经实施例-3与对比例-3制备的滴眼液治疗28天后，取实施例-3和对比例-3制备的滴眼液治疗小鼠的角膜做冰冻切片，行角膜缘干细胞标记物△Np63和细胞核染色剂DAPI的免疫荧光染色。图中为△Np63免疫荧光染色的照片，DAPI荧光染色的照片，以及将所述两种荧光染色的照片利用Merge的方式进行处理的照片。△Np63是角膜缘干细胞标记物，△Np63阳性细胞下降或缺失是角膜缘干细胞缺乏的重要标志，参照文献Therapeutic Effect of Human Adipose Tissue-Derived MesenchymalStem Cells in Experimental Corneal Failure Due to Limbal Stem Cell NicheDamage.Stem Cells 35,2160-2174,doi:10.1002/stem.2672(2017))。
由图3可以得出，对比例-3制备的滴眼液治疗小鼠的角膜缘干细胞基本消失，而与对比例-3相比，实施例-3制备的滴眼液治疗组小鼠的角膜缘干细胞数量显著增多。
图4为小鼠角膜缘干细胞缺乏症动物模型经实施例-3与对比例-3制备的滴眼液治疗28天后，取实施例-3和对比例-3制备的滴眼液治疗小鼠的角膜做冰冻切片，行角结膜杯状细胞标记物MUC-5AC和细胞核染色剂DAPI免疫荧光染色。图中为MUC-5AC免疫荧光染色的照片，DAPI荧光染色的照片，以及将所述两种荧光染色的照片利用Merge的方式进行处理的照片。MUC-5AC是结膜杯状细胞标记物，角结膜杯状细胞浸润是角膜缘干细胞缺乏症的重要标志，参照文献A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem CellDeficiency in Mouse.J Vis Exp,doi:10.3791/54658(2016))。
由图4可以得出，对比例-3制备的滴眼液治疗小鼠的角膜中有结膜杯状细胞浸润，而与对比例-3相比，实施例-3制备的滴眼液治疗组小鼠的角膜完整，未见结膜杯状细胞。
结果分析
上述结果证明，小鼠角膜缘干细胞缺乏症建模后，给与干细胞基础培养基+辅料(对比例-1)，人胎盘干细胞外泌体+辅料(对比例-2)，人脐带干细胞外泌体+辅料(对比例-3)，即对比例1-3制备的滴眼液点眼治疗均出现严重的角膜缘干细胞缺乏症。具体表现为：小鼠角膜严重混浊，新生血管侵入角膜，角膜缘干细胞显著消失，且结膜杯状细胞侵入角膜。而给予本发明涉及的含有人脂肪干细胞外泌体的滴眼液(实施例1,2,3)治疗后，均有明显的治疗效果，说明本发明涉及的滴眼液的成分组成具有一定的特异性，可有效治疗角膜缘干细胞缺乏症。
以上所述仅是本发明的具体实施方式的描述，应当指出，本发明并不局限于上述特定的实施方式，任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，依据本发明的技术实质所做的任何简单修改和润饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (13)

1.一种组合物作为药效成分，在制备治疗角膜缘干细胞缺乏症滴眼液中的应用，其特征在于，组合物由如下组分组成：人脂肪干细胞外泌体1-40mg/L，辅料：玻璃酸钠0.5-2g/L、维生素B6 0.5-3g/L和苯扎氯铵0.05-0.3g/L和医用生理盐水。
2.如权利要求1所述应用，其特征在于，组合物由如下组分组成：含有人脂肪干细胞外泌体20mg/L，辅料：玻璃酸钠2g/L、维生素B6 3g/L和苯扎氯铵0.3g/L和医用生理盐水。
3.一种适用于角膜缘干细胞缺乏症的滴眼液，其特征在于，由如下组分组成：人脂肪干细胞外泌体1-40mg/L，辅料：玻璃酸钠0.5-2g/L、维生素B6 0.5-3g/L、苯扎氯铵0.05-0.3g/L、余量为医用生理盐水，pH为6.5-7.5。
4.如权利要求3所述滴眼液，其特征在于，由如下组分组成：人脂肪干细胞外泌体20mg/L，辅料：玻璃酸钠2g/L、维生素B6 3g/L、苯扎氯铵0.3g/L、余量为医用生理盐水，pH为6.5-7.5。
5.如权利要求3所述滴眼液，其特征在于，医用生理盐水为注射用生理盐水。
6.权利要求3所述滴眼液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）选取3-5代人脂肪干细胞，利用干细胞培养基将细胞培养至70%-80%融合后，更换为干细胞无血清培养基，将干细胞继续培养36h-48h，收集培养上清液，提取人脂肪干细胞外泌体，重悬所述外泌体，制得人脂肪干细胞外泌体溶液；
（2）将步骤（1）中制备的人脂肪干细胞外泌体溶液，按照权利要求1所述滴眼液的外泌体组分浓度与其它组分混合均匀，调整pH为6.5-7.5，制得所述滴眼液。
7.如权利要求6所述滴眼液的制备方法，其特征在于，步骤（1）中利用超速梯度离心法提取外泌体，具体离心力选择依次为300×g，20min，留取上清液；10000×g，30min，留取上清液；100000×g, 1h，除去上清液，留取沉淀为人脂肪干细胞外泌体。
8.如权利要求6所述滴眼液的制备方法，其特征在于，步骤（1）中利用HBSS重悬人脂肪干细胞外泌体。
9.如权利要求6所述滴眼液的制备方法，其特征在于，步骤（1）中通过BCA法测定重悬外泌体的蛋白含量，即为人脂肪干细胞外泌体的浓度，调整外泌体的使用浓度，制得人脂肪干细胞外泌体溶液。
10.如权利要求6所述滴眼液的制备方法，其特征在于，步骤（2）中按权利要求1所述滴眼液的组分，将玻璃酸钠溶解到医用生理盐水中，再依次溶解相应浓度的维生素B6，苯扎氯铵，调整pH为6.5-7.5，然后添加相应浓度的步骤（1）制备的人脂肪干细胞外泌体溶液，混合均匀制得所述滴眼液。
11.如权利要求6所述滴眼液的制备方法，其特征在于，步骤（2）中利用HCl和/或NaOH调整pH为6.5-7.5。
12.如权利要求6所述滴眼液的制备方法，其特征在于，步骤（2）中滴眼液的组分中，医用生理盐水为注射用生理盐水。
13.如权利要求6所述滴眼液的制备方法，其特征在于，步骤（2）中的滴眼液，由如下组分组成：人脂肪干细胞外泌体20mg/L，辅料：玻璃酸钠2g/L、维生素B6 3g/L、苯扎氯铵0.3g/L、余量为医用生理盐水，pH为6.5-7.5。
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