CN111700064A - 一种细胞冷冻辅助装置 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物材料冷冻技术领域，公开了一种细胞冷冻辅助装置。本发明包括贴合于载杆上端的容器皿，容器皿的中部设置有贯穿孔，贯穿孔的下端与载杆的生物材料装载部相对应；所述容器皿的上端设置有出液槽，容器皿的内部设置有排液腔，排液腔分别连通出液槽和贯穿孔。本发明便于细胞冷冻前对细胞的处理，便于快速精准的将细胞放入贯穿孔内，也便于后期细胞准确的落入载杆上，使包裹生物材料的冷冻液体积小而稳定，使得操作更加方便快捷，也不需要再移动细胞，节省了操作步骤；出液槽通过排液腔与贯穿孔相连，方便将各种玻璃化溶液吸走，同样可以使得用过的玻璃化溶液的处理更加轻松方便，效率也更高，整体保证了操作的稳定性、及时性和安全性。

Description

一种细胞冷冻辅助装置

技术领域

本发明属于生物材料冷冻技术领域，具体涉及一种细胞冷冻辅助装置。

背景技术

人和动物胚胎的玻璃化冷冻保存的技术是目前已经相对成熟的技术，其中“冷冻”是液体至固态的冷却，其可以包括结晶，“玻璃化”是液体至固态的冷却，但没有结晶。人和动物胚胎的玻璃化冷冻保存的步骤有，卵母细胞的收集和提取、其体外受精以及随后这样的受精卵和所得到的胚胎和/或后期胚泡，由冷冻保护液中处理后，在超低温环境保存。其中影响冷冻环节主要因素有，冷冻冻保护液的渗透冲击和中毒性休克，操作者的知识和技能，和操作工具，例如细胞的冷冻装载工具，也叫载杆，的性能的影响。好的载杆可以使细胞获得较高的冷冻，以及解冻的速度，和操作性。

市场上已有的载杆有空心管，或环/钩型设备，如Cryologic以商品名fibreplug或Cryoloop来销售，如WO00/21365中所限定的。更典型的如国际申请WO02/085110中所公开的其他工具“Cryotop”。Cryotop是一根握杆连接一片塑料的弹性条带。其中，将细胞置于条带上，然后直接投入液氮中。目前Cryotop是以较高的成活率，相对的易操作性成为主流技术。

市场上还有很多品牌的冷冻保护剂，原理都大同小异，目的都是为了抑制在细胞内生成冰晶，使得冷冻处理过程中的细胞损伤最小化。这些冷冻保护剂分为渗透和非渗透溶液。渗透性的实例是乙二醇(EG)、二甲基亚砜(DMSO)和甘油。渗透性冷冻保护剂是容易透过生物材料膜的小分子，与生物材料的水分子形成氢键，防止其冰结晶。非渗透性冷冻保护剂，例如双糖、海藻糖和蔗糖，通过从生物材料内抽提出游离水并且将胞内空间脱水来起作用。所产生的脱水作用使其可以与渗透性冷冻保护剂相辅相成，以提高冷冻保护剂在细胞内的相对浓度，而次防止细胞内形成冰晶。然而这些高浓度的冷冻保护剂的毒性可能是相当大的，细胞在冷冻保护剂预处理后，需要迅速投入液氮中，以实现冷冻。非常快的冷却速率使冷冻保护剂对生物材料的负面影响最小化，也使因给予希望的玻璃化导致的冰晶形成最小化。

玻璃化方法涉及将生物材料暴露于至少三种玻璃化溶液中。通常将玻璃化溶液加入多孔培养皿的连续孔中，其中将培养皿和溶液温热至预定温度，该温度根据所研究生物材料的需求来决定。

在典型的实验方案中，将生物材料物理地转移至第一个孔中的第一种溶液中(如ES平衡液)，然后使用细胞吸移装置将生物材料或细胞物理地移动通过所研究的溶液进行洗涤。在预定的时间段内在第二个孔的第二种溶液中(如VS玻璃化冷冻液)、第三个和第四个孔中重复洗涤过程，直至认为生物材料或细胞已经为冷冻保存作好准备。然后使用移液管或其他操作设备，用预定量的玻璃化溶液物理地吸出生物材料。然后将含有待玻璃化的生物材料或细胞的液滴吸移至玻璃化设备(如载杆Cryotop)上。然后将附着有液滴和生物材料的玻璃化设备物理地转移并且直接投入液氮中。一旦生物材料和携带流体玻璃化，就将玻璃化设备插入预冷保护套管或其他存储设备中，用于随后转移至液氮或液氮蒸汽中长期冷存储。

现有技术中所公开的其他工具“Cryotop”是连接一片塑料的弹性条带。其中，将样品置于条带上，然后直接投入液氮中。这个protocol是手工操作，目前以技术成熟和较高的细胞成活率成为生殖细胞玻璃化冷冻技术的标杆。

我现有的细胞冷冻过程基本上都是手工完成。人在手工作业时，可能发生精神紧张、手部颤抖、视线错觉、疲劳等问题，会出现丢胚胎或细胞等操作错误，从而无法保证操作的稳定性、及时性和安全性等。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种细胞冷冻辅助装置。

本发明所采用的技术方案为：

一种细胞冷冻辅助装置，包括载杆，还包括贴合于载杆上端的容器皿，容器皿的中部设置有贯穿孔，贯穿孔的下端与载杆的生物材料装载部相对应；所述容器皿的上端设置有出液槽，容器皿的内部设置有排液腔，排液腔分别连通出液槽和贯穿孔。

进一步优选的是，所述排液腔的一端连通出液槽的下部，排液腔的另一端环绕于贯穿孔的四周，且贯穿孔和排液腔之间均匀的分部有多个排液通道，每个排液通道均连通贯穿孔和排液腔。

更进一步优选的是，每个排液通道均与贯穿孔相切。

更进一步优选的是，所述容器皿包括位于排液腔上端的透明观察层，贯穿孔和出液槽均贯穿所述透明观察层。

更进一步优选的是，透明观察层所对应的贯穿孔上部为开口口径从上到下逐渐变小的漏斗形结构。

更进一步优选的是，所述容器皿还包括位于透明观察层下端的溶液处理层和位于溶液处理层下端的脱离层，载杆的上端与脱离层的下端相贴合；所述排液腔和所有排液通道均为设置于溶液处理层上端的凹槽；所述脱离层由弹性材料制成。

更进一步优选的是，溶液处理层所对应的贯穿孔中部为开口口径从上到下逐渐变小的漏斗形结构。

更进一步优选的是，所述容器皿上设置有若干个气孔，每个气孔的下端均对应的设置于载杆上。

更进一步优选的是，每个气孔与贯穿孔的中心轴之间的间距从上到下逐渐变小。

更进一步优选的是，脱离层的下端设置有位于贯穿孔外侧的环形气槽，每个气孔的下端均连通环形气槽。

本发明的有益效果为：

本发明便于细胞冷冻前对细胞的处理，增加容器皿，在容器品上设置贯穿孔，这样可以适当的扩大贯穿孔的大小，便于快速精准的将细胞放入贯穿孔内，也便于后期细胞准确的落入载杆上，使得操作更加方便快捷，也不需要再移动细胞，节省了操作步骤；出液槽通过排液腔与贯穿孔相连，方便将各种玻璃化溶液吸走，同样可以使得用过的玻璃化溶液的处理更加轻松方便，效率也更高，整体保证了操作的稳定性、及时性和安全性。

附图说明

图1是本发明容器皿的爆炸结构示意图；

图2是本发明容器皿的仰视时的三维结构示意图；

图3是本发明容器皿的剖视图；

图4是本发明的主视图。

图中：1-载杆；2-容器皿；201-透明观察层；202-溶液处理层；203-脱离层；3-贯穿孔；4-出液槽；5-排液腔；6-排液通道；7-气孔；8-环形气槽。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将结合附图和实施例或现有技术的描述对本发明作简单地介绍，显而易见地，下面关于附图结构的描述仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

以下将参照附图，通过实施例方式详细地描述本发明提供的技术方案。在此需要说明的是，对于这些实施例方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。

在一些例子中，由于一些实施方式属于现有或常规技术，因此并没有描述或没有详细的描述。

此外，本文中记载的技术特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，还可以在一个或多个实施例中以任意合适的方式组合。对于本领域的技术人员来说，易于理解与本文提供的实施例有关的方法的步骤或操作顺序还可以改变。附图和实施例中的任何顺序仅仅用于说明用途，并不暗示要求按照一定的顺序，除非明确说明要求按照某一顺序。

本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。而本申请所说“连接”、“联接”，在合理情况下(不构成自相矛盾的情况下)，均包括直接和间接连接(联接)。

本发明的一个目的是提供一种可以用于生物材料的显微操作和储存的容器皿，盖在CryoTop载杆上，在CryoTop载杆上形成微容器，细胞溶液处理完后，撤去容器皿，以省去细胞移动的步骤，包括但不限于这些材料的培养和冷冻保存。本发明的另一个目的是方便使用自动化控制洗涤实验方案次数和减少胚胎的操作，由此实现全部自动化。而本发明的生物材料可以是受精卵或卵母细胞。

实施例一：

如图1-4所示，本实施例提供一种细胞冷冻辅助装置，包括载杆1，还包括贴合于载杆1上端的容器皿2，容器皿2的中部设置有贯穿孔3，以便从贯穿孔放入细胞及玻璃化溶液，如ES溶液、VS溶液等培养基、冷冻保存介质、融化介质、玻璃化介质、受精介质或缓冲液等等，根据实际需求选择即可，贯穿孔3的下端与载杆1的生物材料装载部相对应，贯穿孔3下部主要是为了细胞的通过，所以贯穿孔3的下部尺寸根据细胞大小设计即可，贯穿孔3上部的尺寸和中部的尺寸不做具体的限制，方便细胞和玻璃化溶液通过即可；所述容器皿2的上端设置有出液槽4，出液槽4的上端会连接吸液装置，比如吸液泵，容器皿2的内部设置有排液腔5，排液腔5分别连通出液槽4的下端和贯穿孔3的中部。需要说明的是，在使用的过程中，会先把一种玻璃化溶液或带有细胞的玻璃化溶液从贯穿孔加入进去，当需要更换玻璃化溶液时，会在利用出液槽4通过排液腔5吸取贯穿孔3内的玻璃化溶液，然后再更换其他的玻璃化溶液，在细胞培养完成后，细胞从贯穿孔落入载杆1上，容器皿2脱离载杆，方便带有细胞的载杆进行细胞冷冻作业。需要进一步说明的是，容器皿2优选包括适于将开口密封的帽子或盖子，作为分开的盖子或整体连接的盖子。需要说明的是，在实际作业的过程中，为了加强载杆与容器皿之间的密封效果，可以利用镊子之类的物品来加强两者之间的贴合度，也或者用其他物品压紧亦可，避免载杆与容器皿之间有缝隙，使细胞留在载杆上，方便后续将载杆投入液氮中。

本发明便于细胞冷冻前对细胞的处理，增加容器皿2，在容器品上设置贯穿孔3，这样可以适当的扩大贯穿孔的大小，便于快速精准的将细胞放入贯穿孔内，也便于后期细胞准确的落入载杆上，使得操作更加方便快捷，也不需要再移动细胞，节省了操作步骤；出液槽4通过排液腔5与贯穿孔3相连，方便将各种玻璃化溶液吸走，同样可以使得用过的玻璃化溶液的处理更加轻松方便，省去细胞移动的步骤，效率也更高，整体保证了操作的稳定性、及时性和安全性。

实施例二：

本实施例是在实施例一基础上做出的进一步改进，本实施例与实施例一的具体区别是：

本实施例需要进一步说明的是，所述排液腔5的一端连通出液槽4的下部，使得排液腔5和出液槽4之间可以进行液体的流通，方便后期排液使用，排液腔5的另一端环绕于贯穿孔3的四周，且贯穿孔3和排液腔5之间均匀的分部有多个排液通道6，每个排液通道6均连通贯穿孔3和排液腔5。实际中，排液通道6的口径比较小，可以防止细胞通过排液通道6，也就可以将细胞限制在贯穿孔内，保证作业的稳定性。

需要更进一步说明的是，每个排液通道6均与贯穿孔3相切，这样会形成一个类似的漩涡状结构，可以适当的加速液体的流通，提高作业效率。

实施例三：

本实施例是在实施例二基础上做出的进一步改进，本实施例与实施例二的具体区别是：

本实施例需要进一步说明的是，所述容器皿2包括位于排液腔5上端的透明观察层201，贯穿孔3和出液槽4均贯穿所述透明观察层201。需要说明的是，透明观察层201可以但不仅仅限制于采用透明的医用材料形成，如PDMS或PMMA，便于显微镜观察。

实施例四：

本实施例是在实施例三基础上做出的进一步改进，本实施例与实施例三的具体区别是：

本实施例需要进一步说明的是，透明观察层201所对应的贯穿孔3上部为开口口径从上到下逐渐变小的漏斗形结构，开口大一点，方便细胞和玻璃化溶液快速的放入贯穿孔3内，使得作业更加轻松方便。

实施例五：

本实施例是在实施例四基础上做出的进一步改进，本实施例与实施例四的具体区别是：

本实施例需要进一步说明的是，所述容器皿2还包括位于透明观察层201下端的溶液处理层202和位于溶液处理层202下端的脱离层203，载杆1的上端与脱离层203的下端相贴合，具体的，载杆1的生物材料装载部是与脱离层203所对应的贯穿孔相对应的，保证细胞可以准确的落在载杆上；所述排液腔5和所有排液通道6均为设置于溶液处理层202上端的凹槽，然后经过透明观察层201的配合密封形成一个腔体，这样可以使得透过透明观察层201就可以观察到排液腔5和所有排液通道6的情况，使得观察更加清晰明了；所述脱离层203由弹性材料制成，如PDMS材料或PMMA材料，不做具体的限制，具有一定的弹性，可以加强容器皿的下端与载杆之间的紧密型，起到类似于O型圈的密封作用。

实施例六：

本实施例是在实施例五基础上做出的进一步改进，本实施例与实施例五的具体区别是：

本实施例需要进一步说明的是，溶液处理层202所对应的贯穿孔3中部为开口口径从上到下逐渐变小的漏斗形结构。需要说明的是，溶液处理层202所对应的贯穿孔3口径要相对较小，方便细胞落入其中，同时也不会太大，防止其内部有太多的玻璃化溶液，保证通过出液槽4出液的效率跟高。

实施例七：

本实施例是在实施例一至实施例中任一实施例基础上做出的进一步改进，本实施例与实施例五的具体区别是：

本实施例需要进一步说明的是，所述容器皿2上设置有若干个气孔7，每个气孔7的下端均对应的设置于载杆1上，方需要容器皿2脱离载杆，但是两者之间又有一定的吸力，使两者不好分离的，可以通过气孔7往里面充气，使得容器皿2轻松的脱离载杆。需要说明的是，气孔的设置形式不做具体限制，可以是垂直的一条孔，也可以倾斜的一条孔，或者是中心轴位置逐渐变化的阶梯孔也可以，不做具体的限制。进一步说明的是，当容器皿2包括从上到下依次设置的透明观察层201、溶液处理层202和脱离层203三层结构时，每个气孔均是贯穿三层结构的。

实施例八：

本实施例是在实施例七基础上做出的进一步改进，本实施例与实施例七的具体区别是：

本是实施例中需要进一步说明的是，每个气孔7与贯穿孔3的中心轴之间的间距从上到下逐渐变小，这样可以最大化的保证气孔的出口是设置在载杆上的，可以避免气孔出口位于载杆外的情况，保证气孔在需要时就可以起到其作用。需要进一步详细说明的是，每个气孔可以分成至少两段垂直气孔，而没两段相邻的垂直气孔之间可以通过长条孔相连，两个相邻的垂直气孔分别连通长条孔的两端，以此种方式来使得气孔7与贯穿孔3的中心轴之间的间距从上到下逐渐变小。

实施例九：

本实施例是在实施例七或实施例八基础上做出的进一步改进，本实施例与实施例七或实施例八的具体区别是：

本是实施例中需要进一步说明的是，脱离层203的下端设置有位于贯穿孔3外侧的环形气槽8，每个气孔7的下端均连通环形气槽8，这样可以加大气孔7的出口，只要是贯穿孔是对应的设置在载杆上的，就可有保证至少有一段环形气槽8是位于载杆上的，进而保证气孔可以起到其吹气，以使容器皿2达到脱离载杆的效果。

容器皿材料优选地选自能够被灭菌并且是生物惰性的材料，使得不会对生物材料造成污染。。

本发明可用于手动操作，也可用于自动化操作。在另一个方面中，本发明提供了一种装置，其是自动化的冷冻保存设备，包括用于一个或多个之前所述容器皿的构造，其中该装置进一步包括用玻璃化和/或其他处理溶液来冲洗捕获的生物材料的元件和将捕获的生物材料玻璃化的元件。

在另一个方面中，本发明提供了可用于一种半或自动化处理自动化微通道盖，其中该装置包括用预玻璃化或玻璃化处理溶液和射流来冲洗捕获的生物材料的元件，以制备用于玻璃化的捕获生物材料。

在另一个方面中，本发明提供了一种生物材料的冷冻保存方法，包括步骤：

将容器皿置于Cryotop上方，压紧，使Cryotop和容器皿形成一个小容器区域；

生物材料引入之前所述容器的一个小容器区域中，并用导入和排出一系列的从玻璃化溶液冲洗生物材料；

揭去容器皿，因为细胞区域足够小，以分配最少的最终玻璃化溶液，实现将容器和捕获的生物材料玻璃化。

这一系列的玻璃化溶液优选包括递增的选自乙二醇(EG)、二甲基亚砜(DMSO)、甘油、双糖、海藻糖和蔗糖的非渗透和渗透性冷冻保护剂，以增强所述生物材料沉到所述子贮器区域的底部，使得在玻璃化或冷冻之前，排出最大化和冲洗溶液停留最小化。

本发明不局限于上述可选实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是落入本发明权利要求界定范围内的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种细胞冷冻辅助装置，包括载杆(1)，其特征在于：还包括贴合于载杆(1)上端的容器皿(2)，容器皿(2)的中部设置有贯穿孔(3)，贯穿孔(3)的下端与载杆(1)的生物材料装载部相对应；所述容器皿(2)的上端设置有出液槽(4)，容器皿(2)的内部设置有排液腔(5)，排液腔(5)分别连通出液槽(4)和贯穿孔(3)。

2.根据权利要求1所述的一种细胞冷冻辅助装置，其特征在于：所述排液腔(5)的一端连通出液槽(4)的下部，排液腔(5)的另一端环绕于贯穿孔(3)的四周，且贯穿孔(3)和排液腔(5)之间均匀的分部有多个排液通道(6)，每个排液通道(6)均连通贯穿孔(3)和排液腔(5)。

3.根据权利要求2所述的一种细胞冷冻辅助装置，其特征在于：每个排液通道(6)均与贯穿孔(3)相切。

4.根据权利要求2或3所述的一种细胞冷冻辅助装置，其特征在于：所述容器皿(2)包括位于排液腔(5)上端的透明观察层(201)，贯穿孔(3)和出液槽(4)均贯穿所述透明观察层(201)。

5.根据权利要求4所述的一种细胞冷冻辅助装置，其特征在于：透明观察层(201)所对应的贯穿孔(3)上部为开口口径从上到下逐渐变小的漏斗形结构。

6.根据权利要求4所述的一种细胞冷冻辅助装置，其特征在于：所述容器皿(2)还包括位于透明观察层(201)下端的溶液处理层(202)和位于溶液处理层(202)下端的脱离层(203)，载杆(1)的上端与脱离层(203)的下端相贴合；所述排液腔(5)和所有排液通道(6)均为设置于溶液处理层(202)上端的凹槽；所述脱离层(203)由弹性材料制成。

7.根据权利要求6所述的一种细胞冷冻辅助装置，其特征在于：溶液处理层(202)所对应的贯穿孔(3)中部为开口口径从上到下逐渐变小的漏斗形结构。

8.根据权利要求6或7所述的一种细胞冷冻辅助装置，其特征在于：所述容器皿(2)上设置有若干个气孔(7)，每个气孔(7)的下端均对应的设置于载杆(1)上。

9.根据权利要求8所述的一种细胞冷冻辅助装置，其特征在于：每个气孔(7)与贯穿孔(3)的中心轴之间的间距从上到下逐渐变小。

10.根据权利要求8所述的一种细胞冷冻辅助装置，其特征在于：脱离层(203)的下端设置有位于贯穿孔(3)外侧的环形气槽(8)，每个气孔(7)的下端均连通环形气槽(8)。

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