CN111693415B - 一种基于催化发夹组装-动态光散射技术的端粒酶活性检测方法 - Google Patents
一种基于催化发夹组装-动态光散射技术的端粒酶活性检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111693415B CN111693415B CN202010580953.5A CN202010580953A CN111693415B CN 111693415 B CN111693415 B CN 111693415B CN 202010580953 A CN202010580953 A CN 202010580953A CN 111693415 B CN111693415 B CN 111693415B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- telomerase
- light scattering
- dynamic light
- aunps
- telomerase activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 title claims abstract description 121
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 59
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 49
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims abstract description 20
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims abstract description 20
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims abstract description 20
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 61
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 42
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 41
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 37
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 37
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 37
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 31
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 26
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 20
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 18
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 claims description 10
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 10
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 10
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 10
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 8
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 6
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 5
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 230000032683 aging Effects 0.000 claims description 5
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 5
- HQUQLFOMPYWACS-UHFFFAOYSA-N tris(2-chloroethyl) phosphate Chemical compound ClCCOP(=O)(OCCCl)OCCCl HQUQLFOMPYWACS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 150000002343 gold Chemical class 0.000 claims description 4
- 101001128634 Homo sapiens NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 beta subcomplex subunit 2, mitochondrial Proteins 0.000 claims description 2
- 102100032194 NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 beta subcomplex subunit 2, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 abstract description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 92
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 15
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 13
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 5
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 4
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 4
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 4
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 2
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 101000958041 Homo sapiens Musculin Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 208000029162 bladder disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000840 electrochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 102000046949 human MSC Human genes 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000026533 urinary bladder disease Diseases 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/02—Investigating particle size or size distribution
- G01N15/0205—Investigating particle size or size distribution by optical means
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/02—Investigating particle size or size distribution
- G01N15/0205—Investigating particle size or size distribution by optical means
- G01N15/0211—Investigating a scatter or diffraction pattern
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/02—Investigating particle size or size distribution
- G01N15/0205—Investigating particle size or size distribution by optical means
- G01N15/0211—Investigating a scatter or diffraction pattern
- G01N2015/0222—Investigating a scatter or diffraction pattern from dynamic light scattering, e.g. photon correlation spectroscopy
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于催化发夹组装‑动态光散射技术的端粒酶活性检测方法，包括如下步骤：提取待测样品中的端粒酶，催化发夹组装产物获得和动态光散射检测得到信号，实现对端粒酶活性的高灵敏检测。本发明提供的端粒酶活性检测方法操作简单，成本低，所需样品少且特异性好，利用该方法能够检测多种癌症患者尿液中的端粒酶活性，尤其在膀胱癌的无创诊断方面具有潜在的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于催化发夹组装-动态光散射技术的端粒酶活性检测方法。
背景技术
端粒是真核生物染色体末端的一种特殊结构，能够防止染色体DNA的降解、末端融合、非正常重组等。在正常体细胞中，端粒长度随着细胞的周期分裂递减，最终导致细胞无法继续分裂，使细胞寿命受到限制，防止细胞过度分裂。端粒酶是一种核糖核蛋白酶，能以自身RNA为模板，在染色体末端延伸TTAGGG重复序列以维持端粒长度。研究表明，端粒酶活性在大多数正常体细胞中被抑制，但在85-90％的肿瘤细胞中被高度激活，如乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌等。因此，端粒酶被认为是癌症早期诊断的潜在生物标志物，端粒酶活性的有效检测对生物医学研究具有重要的意义。
目前，基于聚合酶链反应(PCR)的端粒重复序列扩增法(TRAP)是检测端粒酶活性的常用方法。然而，该方法存在操作复杂，费用昂贵以及易受诸多因素的干扰而产生假阳性结果等问题。近年来，人们又开发了一些无需PCR反应的端粒酶活性检测方法，例如等温核酸扩增法，比色法、荧光分析法、电化学分析法和化学发光法等。尽管这些方法可以避免PCR反应的缺点，但也存在一些不足，如程序复杂、灵敏度低和特异性差等。因此，开发一种灵敏度高、选择性好、可操作性强的端粒酶活性检测方法是癌症早期诊断中急需解决的问题。
催化发夹组装(catalytic hairpin assembly，CHA)，作为一种新型的无酶级联扩增策略备受关注。其原理主要是在目标物的作用下，引发链诱导发夹探针进行组装，然后被置换出来引发下一轮反应，起到类似催化剂的作用，从而实现目标物检测信号的放大。动态光散射技术(Dynamic Light Scattering，DLS)是一种常用光学测量技术，可以用来测定直径在0.5nm～6μm之间颗粒大小，由于它的高灵敏度，已成为一种重要的分析工具。DLS技术被广泛应用于疾病相关的生物分子和金属离子的检测。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种基于催化发夹组装-动态光散射技术的端粒酶活性检测方法，通过测定催化发夹组装产物的动态光散射信号，实现对端粒酶活性的高灵敏检测，具有灵敏度高、选择性好、特异性好和可操作性强的有益效果，能够有效检测待测样品中端粒酶的活性。
本发明的上述发明目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种基于催化发夹组装-动态光散射技术的端粒酶活性检测方法，包括以下步骤：
S1、端粒酶提取：利用CHAPS法提取待测样品中的端粒酶，得到待测端粒酶提取物；
S2、催化发夹组装产物获得：将待测端粒酶提取物与端粒酶引物在延伸反应缓冲液进行延伸反应，得到延伸产物，然后在延伸产物加入金纳米粒子探针，在温度为25-40℃进行催化发夹组装反应，得到催化发夹组装产物；
S3、动态光散射检测：催化发夹组装产物通过动态光散射测量粒径大小得到动态光散射信号。
优选的，所述步骤S2中的端粒酶引物序列为：5`-AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3`；所述延伸产物序列为：5`-AAT CCG TCG AGC AGA GTT AGGG TTA GGG-3`。
优选的，所述步骤S2中的金纳米粒子探针混合物包括发夹探针H1修饰的金纳米粒子(AuNPs-H1探针)和发夹探针H2修饰的金纳米粒子(AuNPs-H2探针)。
优选的，所述发夹探针H1的序列为5`-SH-(CH2)6-CCC TAA CCC TAA CTC TGC CTAGGG TAC TGC AGA GTT AGGG-3`；所述发夹探针H2的序列为5`-SH-(CH2)6-CTC TGC AGT ACCCTA GGC AGA GTT AGG GTA CTG-3`。
优选的，所述步骤S2中的金纳米粒子探针的制备方法包括以下步骤：
A、分别在发夹探针H1和发夹探针H2中添加磷酸三(2-氯乙基)酯，置于25-30℃下处理0.5-3h后得到产物H1`、H2`，分别加入金纳米粒子溶液并室温孵育12-18h得到产物AuNPs-H1`和AuNPs-H2`；
B、在上述产物AuNPs-H1`和AuNPs-H2`中分别加入终浓度为0.1M的氯化钠溶液，进行盐老化处理25-50h后，在4℃条件下以13800rpm的转速离心15-30分钟，弃上清后，加入PBS缓冲液洗涤2-4次得到油状沉淀物，分别加入PBS缓冲液(pH＝7.0-7.4，0.1M NaCl)溶解即得探针AuNPs-H1和AuNPs-H2。
优选的，所述步骤A中产物H1`、H2`与金纳米粒子的摩尔比为100-200:1。
优选的，所述步骤S2中的金纳米粒子探针的摩尔浓度为2-6nM。
优选的，所述步骤S2中延伸反应的温度为25-40℃，反应时间为0.5-3h。
优选的，根据权利要求1所述的端粒酶活性检测方法，其特征在于，所述步骤S3中的动态光散射测量的温度为25-30℃，散射角为90-120°，红色激光波长为610-650nm，激光功率为3-6mW。
优选的，所述待测样品选自膀胱癌细胞，人乳腺癌细胞或人宫颈癌细胞，所述膀胱癌细胞，人乳腺癌细胞或人宫颈癌细胞的细胞浓度的检测下限是3个细胞/μL。
本发明提供的一种基于催化发夹组装-动态光散射技术的端粒酶活性检测方法的原理如图1：当没有端粒酶或端粒酶失活时，其端粒酶引物无法延伸，不能引发CHA反应，金纳米粒子探针保持分散状态。而当活性端粒酶存在时，其引物的延伸产物会诱导AuNPs-H1和AuNPs-H2探针发生组装，形成大量的AuNPs-H1/H2纳米结构，伴随着金纳米粒子发生聚集，其粒径也随之增大，进而通过测定动态光散射信号(粒径大小)的变化，实现端粒酶活性的定量检测。
本发明具有如下优点和有益技术效果：
1)本发明的方法是当待测样品中有活性端粒酶时，端粒酶引物会发生端粒酶延伸反应，其延伸反应产物可以诱导发夹探针H1和H2发生催化发夹组装反应，使金纳米粒子探针发生组装，形成交联的金纳米粒子聚集体，通过测定催化发夹组装产物的DLS信号，实现对端粒酶活性的高灵敏检测。
2)本发明的端粒酶活性检测方法避免了PCR反应过程，大大简化了端粒酶活性检测步骤，同时提高了检测结果的可靠性。
3)本发明利用端粒酶对其引物的特异性识别进行延伸反应来提高其特异性。
4)本发明的方法具有操作简单，灵敏度高，成本低，所需样品少且特异性好等优点，而且该方法适用于检测尿液中的端粒酶活性，尤其对膀胱癌患者尿液样品具有特异性响应，检测结果与临床一致，为膀胱癌的无创诊断提供了新的技术支持。
附图说明
图1为本发明一种基于催化发夹组装-动态光散射技术的端粒酶活性检测方法原理图。
图2a和图2b分别显示的是本发明采用动态光散射技术分析不同样品(无端粒酶活性和有端粒酶活性)的粒径大小分布图。
图3为本发明检测不同浓度端粒酶提取物，膀胱癌细胞数与粒径大小的线性关系图。
具体实施方式
以下对本发明作进一步详细说明。
本实验中以膀胱癌细胞(5637细胞)，人乳腺癌细胞(MCF-7细胞)，人宫颈癌细胞(HeLa细胞)等细胞作为待测细胞，购买于上海歌凡生物科技有限公司，利用本发明的方法进行端粒酶活性检测实验。
实施例1
以膀胱癌细胞(5637细胞)为待测细胞，利用本发明的方法进行端粒酶活性定量检测实验，具体包括如下步骤：
1)制备金纳米粒子：采用经典的柠檬酸钠还原法，具体的是将2mL 38.8mM新鲜配制的柠檬酸钠溶液，迅速加到20mL煮沸的1mM氯金酸溶液中，剧烈搅拌下加热回流至溶液变成酒红色，并在搅拌下自然冷却至室温，用0.22μm的微孔滤膜过滤即得金纳米粒子溶液，保存于4℃备用。
2)制备金纳米粒子探针，包括以下步骤：
A、分别在发夹探针H1和发夹探针H2中添加磷酸三(2-氯乙基)酯，置于25℃下处理1.5h后得到产物H1`、H2`，然后分别以产物H1`、H2`与上述金纳米粒子溶液的摩尔比为200：1混合，在室温下孵育16h得到产物AuNPs-H1`和AuNPs-H2`；
B、在上述产物AuNPs-H1`和AuNPs-H2`中分别加入终浓度为0.1M的氯化钠溶液，进行盐老化处理44h后，在4℃条件下以13800rpm的转速离心30分钟，弃上清后，加入PBS缓冲液洗涤3次得到油状沉淀物，分别加入PBS缓冲液(pH＝7.4，0.1M NaCl)溶解即得金纳米粒子探针AuNPs-H1和AuNPs-H2。
3)待测样品的检测，包括以下步骤：
S1、端粒酶的提取：首先利用CHAPS法提取细胞的端粒酶，将5637细胞在其指数生长期用胰蛋白酶提取收集，将细胞分散在1.5mL EP管中，在1000rpm下离心5min，并用冰冷的PBS洗涤两次，再将细胞分散于适量的1×CHAPS裂解缓冲液中，最终浓度为5000个细胞/μL，然后在冰上孵育30分钟后，将裂解液在4℃条件下以12000g的转速离心20分钟，将上清液转移分装，即得端粒酶提取物，保存于-80℃备用；
S2、催化发夹组装产物获得：取端粒酶提取物1μL与端粒酶延伸反应缓冲液5μL(含有40nM端粒酶引物、1mM dNTPs、1mM MgCl2、0.2mg/mL BSA和0.4U/mL RNase抑制剂)在37℃下孵育1h以进行端粒酶延伸反应，然后在95℃下加热10分钟以终止延伸反应得到端粒酶延伸产物，再将端粒酶延伸产物与预先制备的摩尔浓度均为4nM的AuNPs-H1和AuNPs-H2探针混合，在37℃下孵育3h以进行CHA反应；
S3、动态光散射检测：在温度为25℃，散射角为90°，红色激光波长为633nm，激光功率为4mW的条件下测定端粒酶的活性。
结果：对应于5637细胞的产物中检测到金纳米粒子的水合粒径显著增大，而对应于正常细胞和和空白对照组的产物中粒径大小未发生明显变化。这是因为5637细胞有端粒酶活性表达，而正常细胞不表达端粒酶活性。这一实施例表明，本发明提出的基于催化发夹组装-动态光散射技术的方法能够实现5637细胞端粒酶活性检测。
实施例2
以人乳腺癌细胞(MCF-7细胞)为待测细胞，利用本发明的方法进行端粒酶活性定量检测实验，具体包括如下步骤：
1)制备金纳米粒子：采用经典的柠檬酸钠还原法，具体的是将2mL 38.8mM新鲜配制的柠檬酸钠溶液，迅速加到20mL煮沸的1mM氯金酸溶液中，剧烈搅拌下加热回流至溶液变成酒红色，并在搅拌下自然冷却至室温，用0.22μm的微孔滤膜过滤即得金纳米粒子溶液，保存于4℃备用。
2)制备金纳米粒子探针，包括以下步骤：
A、分别在发夹探针H1和发夹探针H2中添加磷酸三(2-氯乙基)酯，置于30℃下处理1h后得到产物H1`、H2`，然后分别以产物H1`、H2`与上述金纳米粒子溶液的摩尔比为100：1混合，在室温孵育12h得到产物AuNPs-H1`和AuNPs-H2`；
B、在上述产物AuNPs-H1`和AuNPs-H2`中分别加入终浓度为0.1M的氯化钠溶液，进行盐老化处理25h后，在4℃条件下以13800rpm的转速离心30分钟，弃上清后，加入PBS缓冲液洗涤3次得到油状沉淀物，分别加入PBS缓冲液(pH＝7.0，0.1M NaCl)溶解即得金纳米粒子探针AuNPs-H1和AuNPs-H2。
3)待测样品的检测，包括以下步骤：
S1、端粒酶的提取：首先利用CHAPS法提取细胞的端粒酶，将MCF-7细胞在其指数生长期用胰蛋白酶提取收集，将细胞分散在1.5mL EP管中，在1000rpm下离心5min，并用冰冷的PBS洗涤两次，再将细胞分散于适量的1×CHAPS裂解缓冲液中，最终浓度为5000个细胞/μL，然后在冰上孵育30分钟后，将裂解液在4℃条件下以12000g的转速离心20分钟，将上清液转移分装，即得端粒酶提取物，保存于-80℃备用；
S2、催化发夹组装产物获得：取端粒酶提取物1μL与端粒酶延伸反应缓冲液5μL(含有40nM端粒酶引物、1mM dNTPs、1mM MgCl2、0.2mg/mL BSA和0.4U/mL RNase抑制剂)在30℃下孵育1h以进行端粒酶延伸反应，然后在95℃下加热10分钟以终止延伸反应得到端粒酶延伸产物，再将端粒酶延伸产物与预先制备的摩尔浓度均为2nM的AuNPs-H1和AuNPs-H2探针混合，在40℃下孵育2.5h以进行CHA反应；
S3、动态光散射检测：在温度为30℃，散射角为90°，红色激光波长为610nm，激光功率为3mW的条件下测定端粒酶的活性。
结果：在MCF-7细胞的产物中检测到金纳米粒子的水合粒径显著增大，而正常细胞和空白对照组的产物中粒径大小未发生明显变化，这是因为MCF-7细胞有端粒酶活性表达，而正常细胞不表达端粒酶活性，表明本发明提出的基于催化发夹组装-动态光散射技术的方法能够实现MCF-7细胞端粒酶活性检测。
实施例3
以人宫颈癌细胞(HeLa细胞)为待测细胞，利用本发明的方法进行端粒酶活性定量检测实验，具体包括如下步骤：
1)制备金纳米粒子：采用经典的柠檬酸钠还原法，具体的是将2mL 38.8mM新鲜配制的柠檬酸钠溶液，迅速加到20mL煮沸的1mM氯金酸溶液中，剧烈搅拌下加热回流至溶液变成酒红色，并在搅拌下自然冷却至室温，用0.22μm的微孔滤膜过滤即得金纳米粒子溶液，保存于4℃备用。
2)制备金纳米粒子探针，包括以下步骤：
A、分别在发夹探针H1和发夹探针H2中添加磷酸三(2-氯乙基)酯，置于30℃下处理1h后得到产物H1`、H2`，然后分别以产物H1`、H2`与上述金纳米粒子溶液的摩尔比为150：1混合，在室温孵育18h得到产物AuNPs-H1`和AuNPs-H2`；
B、在上述产物AuNPs-H1`和AuNPs-H2`中分别加入终浓度为0.1M的氯化钠溶液，进行盐老化处理50h后，在4℃条件下以13800rpm的转速离心30分钟，弃上清后，加入PBS缓冲液洗涤3次得到油状沉淀物，分别加入PBS缓冲液(pH＝7.2，0.1M NaCl)溶解即得金纳米粒子探针AuNPs-H1和AuNPs-H2。
3)待测样品的检测，包括以下步骤：
S1、端粒酶的提取：首先利用CHAPS法提取细胞的端粒酶，将HeLa细胞细胞在其指数生长期用胰蛋白酶提取收集，将细胞分散在1.5mL EP管中，在1000rpm下离心5min，并用冰冷的PBS洗涤两次，再将细胞分散于适量的1×CHAPS裂解缓冲液中，最终浓度为5000个细胞/μL，然后在冰上孵育30分钟后，将裂解液在4℃条件下以12000g的转速离心20分钟，将上清液转移分装，即得端粒酶提取物，保存于-80℃备用；
S2、催化发夹组装产物获得：取端粒酶提取物1μL与端粒酶延伸反应缓冲液5μL(含有40nM端粒酶引物、1mM dNTPs、1mM MgCl2、0.2mg/mL BSA和0.4U/mL RNase抑制剂)在30℃下孵育1h以进行端粒酶延伸反应，然后在95℃下加热10分钟以终止延伸反应得到端粒酶延伸产物，再将端粒酶延伸产物与预先制备的摩尔浓度均为6nM的AuNPs-H1和AuNPs-H2探针混合，在25℃下孵育3.5h以进行CHA反应；
S3、动态光散射检测：在温度为30℃，散射角为90°，红色激光波长为650nm，激光功率为6mW的条件下测定端粒酶的活性。
结果：在Hela细胞的产物中检测到金纳米粒子的水合粒径显著增大，而正常细胞和和空白对照组的产物中粒径大小未发生明显变化，这是因为Hela细胞有端粒酶活性表达，而正常细胞不表达端粒酶活性，表明本发明提出的基于催化发夹组装-动态光散射技术的方法能够实现Hela细胞端粒酶活性检测。
实施例4
以膀胱癌细胞(5637细胞)为待测细胞，利用本发明实施例1的方法进行端粒酶活性定量检测实验，具体包括如下步骤：
按照实施例1中的步骤1)和步骤2)制备金纳米粒子和金纳米粒子探针，并按照实施例1中的所述步骤3)CHAPS法提取5637细胞中的端粒酶，并将端粒酶提取物用RNA酶抑制剂处理过的CHAPS裂解液稀释至对应5000个细胞/μL，2000个细胞/μL，1000个细胞/μL，500个细胞/μL，200个细胞/μL，100个细胞/μL，50个细胞/μL，20个细胞/μL，10个细胞/μL，3个细胞/μL，取不同浓度的端粒酶提取物，并设置空白对照组(空白对照组中端粒酶提取物用纯CHAPS裂解液代替)分别与端粒酶延伸反应缓冲液反应(含有40nM端粒酶引物、1mM dNTPs、1mM MgCl2、0.2mg/mL BSA和0.4U/mL RNase抑制剂)，在37℃下孵育1h以进行端粒酶延伸反应，然后在95℃下加热10分钟以终止延伸反应得到端粒酶延伸产物，再将端粒酶延伸产物与预先制备的AuNPs-H1和AuNPs-H2探针混合，在37℃下孵育3h以进行CHA反应得到催化发夹组装产物，检测其DLS信号，检测条件为：温度为25℃，散射角为90°，红色激光波长为633nm，激光功率为4mW，测定端粒酶的活性。
结果：如图3所示，随着端粒酶提取物浓度的增加，测定的金纳米粒子的水合粒径逐渐增大，表明该方法可用于膀胱癌细胞中端粒酶活性的检测，其线性回归方程为D＝40.71+0.35N，R2＝0.996，其中D表示粒径，N表示细胞数。本实施例中发现即使是3个细胞/μL的端粒酶活性也能被检测到，实现了超高灵敏度的端粒酶活性检测，因此，该实施例中本方法的检测灵敏度为3个细胞/μL。在实际应用中，尤其是样品的浓度低以及样品量少时，可以通过本方法进行精确定量检测，采用这种方式能大大提高样品检测速度，利于实现高通量的生物分析。
临床应用效果试验例
尿液中端粒酶的提取：收集新鲜尿样，在4℃条件下以850g的转速离心10分钟，用PBS洗涤两次。然后在4℃条件下以2300g的转速离心5分钟，将沉淀重新分散于适量的1×CHAPS裂解缓冲液中，并在冰上孵育30分钟。最后，混合物在4℃条件下以12000g的转速离心20分钟。将上清液转移分装，保存于-80℃备用，并采用实施例1方法检测尿液中的端粒酶活性，结果如表1。
表1临床应用效果
| 临床样本<sup>a</sup> | 粒径(nm) | 检测结果 | 临床样本<sup>a</sup> | 粒径(nm) | 检测结果 |
| 正常人1 | 43.3±1.8 | 阴性 | 前列腺癌患者2 | 54.9±2.4 | 阴性 |
| 正常人2 | 45.8±1.4 | 阴性 | 前列腺癌患者3 | 55.9±2.2 | 阴性 |
| 正常人3 | 46.9±1.7 | 阴性 | 肝癌患者1 | 51.2±2.8 | 阴性 |
| 膀胱癌患者1 | 193.7±4.2 | 阳性 | 肝癌患者2 | 48.3±2.1 | 阴性 |
| 膀胱癌患者2 | 229.1±4.3 | 阳性 | 肝癌患者3 | 47.6±1.6 | 阴性 |
| 膀胱癌患者3 | 178.6±3.9 | 阳性 | 肺癌患者1 | 50.4±1.9 | 阴性 |
| 膀胱癌患者4 | 243.4±3.4 | 阳性 | 肺癌患者2 | 52.5±2.1 | 阴性 |
| 乳腺癌患者1 | 48.2±2.3 | 阴性 | 肺癌患者3 | 46.1±1.7 | 阴性 |
| 乳腺癌患者2 | 50.2±1.9 | 阴性 | 胃癌患者1 | 53.4±2.0 | 阴性 |
| 乳腺癌患者3 | 54.0±2.5 | 阴性 | 胃癌患者2 | 55.1±2.4 | 阴性 |
| 前列腺癌患者1 | 56.1±2.4 | 阴性 | 胃癌患者3 | 53.6±2.9 | 阴性 |
a临床样本由中山大学肿瘤医院提供
由上表可知，乳腺癌，前列腺癌，肝癌，肺癌和胃癌细胞没有进入尿液，而膀胱癌患者能够通过其尿液中端粒酶活性水平来诊断是否患癌，因此，该方法可用于膀胱癌的非侵入性诊断，本发明方法可以区分膀胱癌患者与正常人以及其他的癌症患者，有望在临床上用于膀胱癌的诊断和筛查。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (7)
1.一种非疾病诊断目的的基于催化发夹组装-动态光散射技术的端粒酶活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、端粒酶提取：利用CHAPS法提取待测样品中的端粒酶，得到待测端粒酶提取物；
S2、催化发夹组装产物获得：将待测端粒酶提取物与端粒酶引物在延伸反应缓冲液中进行延伸反应，得到延伸产物，然后在延伸产物中加入摩尔浓度为2-6nM的金纳米粒子探针，在温度为25-40℃进行催化发夹组装反应，得到催化发夹组装产物；
S3、动态光散射检测：催化发夹组装产物通过动态光散射检测得到信号；
所述步骤S2中的金纳米粒子探针包括发夹探针H1修饰的金纳米粒子AuNPs-H1探针和发夹探针H2修饰的金纳米粒子AuNPs-H2探针；
所述发夹探针H1的序列为5`-SH-(CH2)6-CCC TAA CCC TAA CTC TGC CTA GGG TAC TGCAGA GTT AGGG-3`；所述发夹探针H2的序列为5`-SH-(CH2)6-CTC TGC AGT ACC CTA GGC AGAGTT AGG GTA CTG-3`。
2.根据权利要求1所述的非疾病诊断目的的基于催化发夹组装-动态光散射技术的端粒酶活性检测方法，其特征在于，所述步骤S2中的端粒酶引物序列为：5`-AAT CCG TCG AGCAGA GTT-3`；所述延伸产物序列为：5`-AAT CCG TCG AGC AGA GTT AGGG TTA GGG-3`。
3.根据权利要求1所述的非疾病诊断目的的基于催化发夹组装-动态光散射技术的端粒酶活性检测方法，其特征在于，所述步骤S2中的金纳米粒子探针的制备方法包括以下步骤：
A、分别在发夹探针H1和发夹探针H2中添加磷酸三（2-氯乙基）酯，置于25-30℃下处理0.5-3 h后得到产物H1`、H2`，分别加入金纳米粒子溶液并室温孵育12-18h得到产物AuNPs-H1`和AuNPs-H2`；
B、在上述产物AuNPs-H1`和AuNPs-H2`中分别加入终浓度为0.1 M的氯化钠溶液，进行盐老化处理25-50 h后，在4℃条件下以13800 rpm的转速离心15-30分钟，弃上清后，加入PBS缓冲液洗涤2-4次得到油状沉淀物，分别加入PBS缓冲液，pH = 7.0-7.4，0.1M NaCl溶解即得金纳米粒子探针AuNPs-H1和AuNPs-H2。
4.根据权利要求3所述的非疾病诊断目的的基于催化发夹组装-动态光散射技术的端粒酶活性检测方法，其特征在于，所述步骤A中产物H1`、H2`与金纳米粒子的摩尔比为100-200:1。
5.根据权利要求1所述的非疾病诊断目的的基于催化发夹组装-动态光散射技术的端粒酶活性检测方法，其特征在于，所述步骤S2中延伸反应的温度为25-40℃，反应时间为0.5-3h。
6.根据权利要求1所述的非疾病诊断目的的基于催化发夹组装-动态光散射技术的端粒酶活性检测方法，其特征在于，所述步骤S3中的动态光散射检测的温度为25-30℃，散射角为90-120°，红色激光波长为610-650nm，激光功率为3-6mW。
7.根据权利要求1所述的非疾病诊断目的的基于催化发夹组装-动态光散射技术的端粒酶活性检测方法，其特征在于，所述待测样品选自膀胱癌细胞，人乳腺癌细胞或人宫颈癌细胞，所述膀胱癌细胞，人乳腺癌细胞或人宫颈癌细胞的细胞浓度的检测下限是3个细胞/μL。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010580953.5A CN111693415B (zh) | 2020-06-23 | 2020-06-23 | 一种基于催化发夹组装-动态光散射技术的端粒酶活性检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010580953.5A CN111693415B (zh) | 2020-06-23 | 2020-06-23 | 一种基于催化发夹组装-动态光散射技术的端粒酶活性检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111693415A CN111693415A (zh) | 2020-09-22 |
| CN111693415B true CN111693415B (zh) | 2022-11-29 |
Family
ID=72483493
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010580953.5A Active CN111693415B (zh) | 2020-06-23 | 2020-06-23 | 一种基于催化发夹组装-动态光散射技术的端粒酶活性检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111693415B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101978254A (zh) * | 2008-01-03 | 2011-02-16 | 中央佛罗里达大学研究基金会有限公司 | 使用金属纳米粒子探针和动态光散射的分析物检测 |
| CN109182456A (zh) * | 2018-09-18 | 2019-01-11 | 中山大学 | 基于杂交链式反应和动态光散射检测尿液中端粒酶活性的方法 |
| CN109797200A (zh) * | 2019-02-13 | 2019-05-24 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 比率型端粒酶活性定量检测方法 |
-
2020
- 2020-06-23 CN CN202010580953.5A patent/CN111693415B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101978254A (zh) * | 2008-01-03 | 2011-02-16 | 中央佛罗里达大学研究基金会有限公司 | 使用金属纳米粒子探针和动态光散射的分析物检测 |
| CN109182456A (zh) * | 2018-09-18 | 2019-01-11 | 中山大学 | 基于杂交链式反应和动态光散射检测尿液中端粒酶活性的方法 |
| CN109797200A (zh) * | 2019-02-13 | 2019-05-24 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 比率型端粒酶活性定量检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 《Sensitive Multicolor Visual Detection of Telomerase Activity Based on Catalytic Hairpin Assembly and Etching of Au nanorods》;Danni Wang et al.;《Biosensors and Bioelectronics》;20180919;第122卷;摘要，第2.1节-第3.1节、第4节及方案图1 * |
| 《基于金纳米粒子的催化发夹DNA组装检测microRNA》;成永强 等;《河北大学学报(自然科学版)》;20180325;第38卷(第2期);第148页第1段，第1.1节-第2.1节及图1 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111693415A (zh) | 2020-09-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109182456B (zh) | 基于杂交链式反应和动态光散射检测尿液中端粒酶活性的方法 | |
| Zhao et al. | MXene-MoS2 heterostructure collaborated with catalyzed hairpin assembly for label-free electrochemical detection of microRNA-21 | |
| CN112662776B (zh) | 检测环状rna和/或所述环状rna表达量的制剂在制备结直肠癌辅助诊断试剂中的应用 | |
| CN113388668A (zh) | 基于DNA纳米线的局域催化发夹自组装技术检测外泌体miRNA的方法 | |
| Borum et al. | Hybridizing clinical translatability with enzyme-free DNA signal amplifiers: recent advances in nucleic acid detection and imaging | |
| Chan et al. | Direct and sensitive detection of circulating miRNA in human serum by ligase-mediated amplification | |
| CN112626209A (zh) | 用于卵巢癌诊断的miRNA标志物、其应用及诊断试剂盒 | |
| Chang et al. | ctDNA detection based on DNA clutch probes and strand exchange mechanism | |
| Huang et al. | Dual signal amplification for microRNA-21 detection based on duplex-specific nuclease and invertase | |
| CN104089936A (zh) | 基于生物传感器对荧光标记的mcf肿瘤标志物检测 | |
| CN114088783B (zh) | 一种生物传感器及其制备方法和应用、检测ctDNA的电化学系统 | |
| Esmaeilzadeh et al. | Recent advances on the electrochemical and optical biosensing strategies for monitoring microRNA-21: a review | |
| Tong et al. | Ratiometric fluorescent detection of exosomal piRNA-823 based on Au NCs/UiO-66-NH2 and target-triggered rolling circle amplification | |
| CN111235228A (zh) | 基于聚合酶链式反应和动态光散射检测血液中癌症标志物ca125的方法 | |
| Wang et al. | Tracing cellular interaction of circRNA-miRNA axis with Cu metal-organic framework supported DNA cascade assembly | |
| CN109402225B (zh) | 一种检测外泌体中miRNA-1246的纳米金核酸探针及其制备方法和应用 | |
| CN104480201B (zh) | 基于类石墨相碳化氮纳米材料的荧光传感器的制备方法 | |
| CN111693415B (zh) | 一种基于催化发夹组装-动态光散射技术的端粒酶活性检测方法 | |
| Radfar et al. | A novel signal amplification tag to develop rapid and sensitive aptamer-based biosensors | |
| Ghanbari et al. | A rapid and simple method for simultaneous determination of three breast cancer related microRNAs based on magnetic nanoparticles modified with S9. 6 antibody | |
| Peng et al. | A fluorescent signal “removal” sensor via duplex-specific nuclease-aided cleavage for miRNA detection in flow cytometry | |
| CN117004719A (zh) | 一种活细胞内多靶标级联实时动态检测方法及应用 | |
| CN116144770B (zh) | 基于DNA walker及支链杂交链式反应检测乳腺癌循环肿瘤核酸的探针组及方法 | |
| CN116479089A (zh) | 一种纳米核酸探针及其制备方法和应用 | |
| CN113186254B (zh) | 用于ctDNA检测的生物传感器及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |