CN111690684A - 一种组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，涉及一种组合物及其应用。本发明提供了一种组合物，所述组合物成分包括甘露醇、MgSO4、CaCl2和牛血清白蛋白；所述甘露醇、MgSO4、CaCl2和牛血清白蛋白的质量比为9～53：0.015～0.241：0.013～0.23：0.01～5。所述的组合物作为电融合液用于细胞融合，能够使得融合效率提高到100％，用于制备基因编辑小鼠，能够明显促进基因编辑小鼠的存活率。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种组合物及其应用。
背景技术
四倍体是指细胞中含有的染色体是最小染色体组数的四倍，即细胞中具有四个完整的染色体组的生物个体或者细胞。在自然条件下，哺乳动物四倍体胚胎的发生率极低而且普遍不能正常发育成为一个单独个体。
将一定数量的胚胎干细胞(ES)细胞和四倍体胚胎嵌合，在其嵌合体的发育过程中，ES细胞和四倍体胚胎不是随机分布的，即其四倍体胚胎部分仅参与卵黄囊内胚层和胎盘滋养层细胞(如绒毛膜外胚层、滋养层细胞等)等胚外组织的形成，而ES细胞则广泛的参与胚体、尿囊、羊膜、卵黄囊中胚层和绒毛膜中胚层部分的生成，而不参与生成卵黄囊内胚层和胎盘滋养层细胞谱系，即二者的发育潜能具有互补性，这种现象称之为四倍体互补技术。
由这项技术克隆出的动物个体，完全是由ES细胞发育而来，我们称之为ES动物。通过细胞核移植方法制备的克隆胚胎移植到代孕母体后胎儿的出生率极低，仅为1-2％，而通过四倍体补偿技术，即将ESC细胞系注射入囊胚期的四倍体胚胎载体中，可将胎儿的出生率提升至20-30％，显著提升了动物克隆的效率。近年来，国内外众多科学家都深入研究此项技术，并取得了很多创造性的研究成果。四倍体补偿技术所产生的动物模型有着非常普遍的应用，例如确定谱系特异性基因功能，分析胚外组织与胚胎组织的基因功能、识别细胞自发和非自发的基因功能、区分主要与次要缺陷、促进表型分析等。胚胎嵌合体的应用并不局限于早期胚胎发育的研究，也可应用于出生后胎儿发育，身体机能的研究。当嵌合体与分子工具结合使用时，这种分子工具可以在细胞中以时间和谱系特异性方式修饰遗传活性，为基因功能精确、深入和大规模分析提供便利。可以通过与条件性改变基因表达的方式来改变遗传活动(Nagy 2000)或调节基因功能。目前对于ES细胞的发育潜力的评价主要集中在研究细胞体外分化，以及反映细胞多能性分子标记的转录活性的分析。胚胎嵌合体的一个独特特征就是外来细胞可以嵌合入胚胎，细胞可以在胚胎发育过程中充分激发分化潜能。细胞受到全面细胞谱系的测试，这更能揭示多能性的真实程度。嵌合体是对于预测哺乳类动物多能性细胞体内评价最全面和最严格的重要工具。
发明内容
本发明提供一种动物的制备方法。
本发明提供一种电融合液。
本发明提供一种可以提高动物出生率的制备方法。
本发明提供一种动物四倍体补偿或互补方法(tetraploid embryocomplementation)。
一些实施例中，制备动物的方法中，使用了一种组合物，成分包括甘露醇、MgSO4、CaCl2和牛血清白蛋白；所述甘露醇、MgSO4、CaCl2和牛血清白蛋白的质量比为9～53：0.015～0.241：0.013～0.23：0.01～5。
一些实施例中，所述方法使用了一种组合物，所述组合物成分包括甘露醇、MgSO4、CaCl2和牛血清白蛋白；所述甘露醇、MgSO4、CaCl2和牛血清白蛋白的质量比为9～53：0.015～0.241：0.013～0.23：0.01～5。
一些实施例中，所述组合物中甘露醇、MgSO4、CaCl2和牛血清白蛋白的质量比为18～52：0.018～0.241：0.016～0.23：0.01-4。
一些实施例中，所述组合物中甘露醇、MgSO4、CaCl2和牛血清白蛋白的质量比为27～52：0.018～0.12：0.016～0.1：1～3.5。
一些实施例中，所述组合物包括以下成分：甘露醇0.05-0.29M、MgSO4 0.12-2mM、CaCl2 0.12-2mM、牛血清白蛋白0.01-5mg/mL。
一些实施例中，所述组合物包括以下成分：甘露醇0.1-0.28M、MgSO4 0.15-2mM、CaCl2 0.15-2mM、牛血清白蛋白0.01-4mg/mL。
一些实施例中，所述组合物包括以下成分：甘露醇0.15-0.28M、MgSO4 0.15-1mM、CaCl2 0.15-1mM、牛血清白蛋白1-3.5mg/mL。
一些实施例中，所述组合物包括以下成分：甘露醇0.18-0.28M、MgSO4 0.15-0.5mM、CaCl2 0.15-0.5mM、牛血清白蛋白2-3.5mg/mL。
一些实施例中，所述组合物包括以下成分：甘露醇0.2-0.28M、MgSO4 0.15-0.3mM、CaCl2 0.15-0.3mM、牛血清白蛋白2-3mg/mL。
一些实施例中，所述组合物包括以下成分：甘露醇0.27M、MgSO4 0.2mM、CaCl20.2mM、牛血清白蛋白3mg/mL。
一些实施例中，所述组合物可以作为母液，然后配制成所需浓度的工作液。
一些实施例中，所述组合物可以是工作液，可以无需配制，直接使用。
一些实施例中，本发明提供了所述组合物在制备基因编辑动物胚胎细胞或基因编辑动物中的应用。
一些实施例中，所述组合物用于制备动物四倍体胚胎。
一些实施例中，所述方法使用了一种电融合液，所述电融合液含有甘露醇、牛血清白蛋、Mg2+和Ca2+，所述电融合液具有提高了浓度的Mg2+和Ca2+；或者，所述电融合液Mg2+和Ca2 +的浓度分别为0.12-2mM、0.12-2mM。
一些实施例中，所述的电融合液体中的甘露醇、牛血清白蛋的浓度分别为0.05-0.29M、0.01-5mg/mL。
一些实施例中，所述的Mg2+和Ca2+分别来源于MgSO4和CaCl2。
一些实施例中，所述电融合液用于制备四倍体胚胎。
目前，四倍体的获得方法有生物法、化学法和物理法制备。通过显微操作将两个二倍体胚胎细胞核注射到1个1-细胞期胚胎细胞细胞质中对操作技术要求高，同时显微操作对胚胎损害较大；使用细胞松弛素B或秋水仙素抑制卵裂球细胞的分裂制备四倍体会对胚胎发育造成不良影响，甚至延迟阻滞胚胎发育；另外还可采用仙台病毒、聚乙二醇、直流电击等方法来进行细胞融合，仙台病毒存在致病性，聚乙二醇残存毒性，而电融合方法仅在短时间内发生可逆转的电穿孔，克服了化学试剂的毒害和病毒的致病性，是制作四倍体胚胎最常用和最高效的方法。但是现有的四倍体补偿技术还存在胚胎电融合效率达不到100％，制作小鼠的效率稳定性差，对来自纯系小鼠的胚胎干细胞效率低下的问题。而发明人在研究过程中，意外地发现使用本发明的改进的电融合液的融合效率可从80-90％提高到100％，具有极大地现实意义。
一些实施例中，本发明提供了一种制备动物的方法，所述方法包括将四倍体胚胎与胚胎干细胞聚合形成新的重构胚或嵌合体胚胎；所述的四倍体胚胎为处于2-细胞期的四倍体胚胎。
一些实施例中，所述胚胎干细胞指的是代数为p15代以内的胚胎干细胞。
一些实施例中，所述胚胎干细胞指的是代数为p12-p15代的胚胎干细胞。
一些实施例中，所述方法使用了四倍体补偿法或四倍体胚胎互补法(tetraploidembryo complementation)。
一些实施例中，所述方法包括以下步骤：(1)获得动物2-细胞胚胎；(2)将步骤(1)所述的2-细胞胚胎放入电融合液中，进行电融合，获得四倍体胚胎；(3)将步骤(2)中的四倍体胚胎放入培养基中培养；(4)将步骤(3)中发育到2-细胞期的四倍体胚胎与胚胎干细胞聚合，形成嵌合体胚胎；(5)将步骤(4)中的嵌合体胚胎植入假孕的动物子宫中，胚胎发育至足孕，从而获得动物。
一些实施例中，步骤(3)中的培养时间为8-24小时。
一些实施例中，步骤(3)中培养基为KSOM培养基。
一些实施例中，源自该接纳者胚胎的非人类动物可以是除人类之外的任何动物，如猪、大鼠、小鼠、仓鼠、兔、猪、牛、鹿、绵羊、山羊、小鸡、猫、马、狗、猩猩、猴。同时，用作被移植入接纳者的细胞原始来源的哺乳动物，可以是人类或除人类之外的哺乳动物，例如，株、大鼠、小鼠、牛、绵羊、山羊、马、狗、狒狒、黑猩猩、大猩猩、猩猩、猴、狨猴、和倭黑猩猩等。
一些实施例中，所述动物为哺乳动物。
一些实施例中，所述动物为非人类哺乳动物。
一些实施例中，所述动物选自猪、大鼠、小鼠、仓鼠、兔、猪、牛、鹿、绵羊、山羊、小鸡、猫、马、狗、猩猩、猴。
一些实施例中，所述动物选自鼠。一些实施例中，所述动物选自成鼠。一些实施例中，所述动物选自胎鼠。
现有技术表明，目前制备动物的技术难以满足实际应用的要求。例如，对于小鼠的制备中，早期研究发现小鼠四倍体胚胎不能正常发育，只能形成胎盘的滋养层和胚外内胚层(Tarkowski et al.,1977)，而胚胎干细胞可以形成整个胎儿本身，以及卵黄囊的中胚层，羊膜，尿囊，脐带等，但滋养层和卵黄囊内胚层的形成能力十分有限(Beddington etal.,1989)。四倍体补偿技术就是基于这种完美的互补关系而产生出来的，在最极端的情况下，使用最好质量的纯系遗传背景的胚胎干细胞，胎儿出生率最高可以达到15％，但这些小鼠在出生后不久全部死亡(Nagy et al.,1990)。
后来人们发现使用早期传代的F1遗传背景的胚胎干细胞得到的嵌合体胚胎可以足月发育并活到成年，但效率只有3.8％(Nagy et al.,1993)。后来有报道，基因打靶后的F1胚胎干细胞经过再克隆后存活率可以达到5-15％，但纯系胚胎干细胞制造小鼠的存活率仍然只有0-1.4％(Eggan et al.,2001)。2006年Guy S Eakin et al.发表了利用胚胎干细胞与二倍体或四倍体聚集产生小鼠的方法(Eakin and Hadjantonakis,2006)。以及其他方法文献(Gertsenstein,2015；Kang and Gao,2015；Li et al.,2015；Shinozawa et al.,2006；Tanaka et al.,2009；Wen et al.,2014；Yamaguchi et al.,2018；Zhao et al.,2009；Zhao et al.,2010)。2009年Michal J.Boland et al.利用四倍体补偿技术从小鼠诱导多能性干细胞中产生小鼠出生率在0-7％，大多为0％(Boland et al.,2009)，其中周琪在国际期刊NATURE上发表的出生率也仅在0-3％之间(Zhao et al.,2009)。尽管F1背景的胚胎干细胞通过大量细胞株筛选，技术改进，以及再克隆，通过四倍体补偿技术产生小鼠的效率得到提高，但F1不是理想的遗传背景，该技术也仍难以满足实际应用的要求，尤其是用纯系胚胎干细胞通过四倍体补偿技术直接生产转基因鼠仍然面临很大的困难。
一些实施例中，本发明提供了制备基因编辑动物的方法，使用了所述动物的制备方法。
一些实施例中，所述动物为基因人源化动物。
一些实施例中，所述动物为哺乳动物。
一些实施例中，所述动物为非人类哺乳动物。
一些实施例中，所述动物选自猪、大鼠、小鼠、仓鼠、兔、猪、牛、鹿、绵羊、山羊、小鸡、猫、马、狗、猩猩、猴。
一些实施例中，所述啮齿类动物为鼠。
一些实施例中，所述动物为成鼠。
一些实施例中，所述动物为胎鼠。
基因编辑小鼠的获得通常有以下几种：多能干细胞的囊胚注射；受精卵注射直接编辑；体细胞核移植；四倍体补偿技术等。其中多能干细胞囊胚注射需要获得生殖系传递的嵌合体小鼠再进行隔代繁殖获得纯合子小鼠，历时需要5个月以上；受精卵注射一般用于基因敲除编辑，基因编辑策略受限且技术操作难度大，后续还需对出生小鼠进行鉴定不一定能直接获得目标小鼠；体细胞核移植与四倍体补偿技术皆能直接获得纯合子基因编辑小鼠，但两种方法存活率都很低，在10％以下，一般在1％左右。而且体细胞核移操作难度大，显微注射对胚胎造成伤害较大，四倍体补偿法不会对胚胎造成直接伤害。对于直接获得基因编辑小鼠而言，四倍体补偿技术相对于体细胞核移植操作简便，效率高，获得基因编辑动物时间短，且在多能干细胞上进行基因编辑相对容易。
一些实施例中，提供了一种基因小鼠的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)获得小鼠2-细胞胚胎；(2)将步骤(1)所述的2-细胞胚胎放入电融合液中，进行电融合，获得四倍体胚胎；(3)将步骤(2)中的四倍体胚胎放入培养基中培养；(4)将步骤(3)中发育到2-细胞期的四倍体胚胎与胚胎干细胞聚合，形成嵌合体胚胎；(5)将步骤(4)中的嵌合体胚胎植入假孕的小鼠子宫中，胚胎发育至足孕，从而获得基因编辑小鼠。
一些实施例中，所述方法包括将将胚胎干细胞和四倍体胚胎聚合形成新的重构胚。其中，所述的胚胎干细胞可以为普通的胚胎干细胞，也可以为基因编辑的胚胎干细胞，例如人源化基因的动物胚胎干细胞等，具体不限。
一些实施例中，提供了一种动物嵌合体胚胎的制备方法，所述方法包括将四倍体胚胎与胚胎干细胞聚合形成新的重构胚或嵌合体胚胎；所述的四倍体胚胎为处于2-细胞期的四倍体胚胎。
一些实施例中，所述方法使用了四倍体补偿法或四倍体胚胎互补法。
一些实施例中，所述方法包括以下步骤：(1)获得动物2-细胞胚胎；(2)将步骤(1)所述的2-细胞胚胎放入电融合液中，进行电融合，获得四倍体胚胎；(3)将步骤(2)中的四倍体胚胎放入培养基中培养；(4)将步骤(3)中发育到2-细胞期的四倍体胚胎与胚胎干细胞聚合，形成嵌合体胚胎。
一些实施例中，步骤(3)中的培养时间为8-24小时。
一些实施例中，步骤(3)中培养基为KSOM培养基。
一些实施例中，所述动物为哺乳动物。
一些实施例中，所述动物为非人类哺乳动物。
一些实施例中，所述动物选自猪、大鼠、小鼠、仓鼠、兔、猪、牛、鹿、绵羊、山羊、小鸡、猫、马、狗、猩猩、猴。
一些实施例中，所述动物选自鼠。
一些实施例中，所述动物选自成鼠。
一些实施例中，所述动物选自胎鼠。
一些实施例中，所述方法包括将发育到2-细胞期的四倍体胚胎与胚胎干细胞聚合得到嵌合体胚胎。发明人又意外地发现，利用2-细胞期的四倍体胚胎与胚胎干细胞聚合，极大的改善了四倍体补偿技术制作小鼠的效率稳定性差，对来自纯系小鼠的胚胎干细胞效率低下的问题，小鼠出生率有了质的提升，接近正常胚胎移植，同时也克服了目前最先进基因编辑方法Cas9的局限性，可以从干细胞直接制造出胚胎和成年鼠进行表型研究，节省老鼠繁殖需要的大量的时间，人力和物力，彻底解决了四倍体补偿技术用来制作转基因小鼠的实用性问题，达到了商业化的水平。
一些实施例中，本发明提供了所述的方法制备得到的动物。
一些实施例中，所述动物为哺乳动物。
一些实施例中，所述动物为非人类哺乳动物。
一些实施例中，所述动物选自猪、大鼠、小鼠、仓鼠、兔、猪、牛、鹿、绵羊、山羊、小鸡、猫、马、狗、猩猩、猴。
一些实施例中，所述动物选自鼠。一些实施例中，所述动物选自成鼠。一些实施例中，所述动物选自胎鼠。一些实施例中，所述动物选自基因编辑动物。一些实施例中，所述动物选自基因人源化动物。一些实施例中，本发明提供了一种电融合液，含有甘露醇、牛血清白蛋、Mg2+和Ca2+，所述电融合液具有提高了浓度的Mg2+和Ca2+；或者，所述电融合液Mg2+和Ca2 +的浓度分别为0.12-2mM、0.12-2mM。
一些实施例中，所述的电融合液体中的甘露醇、牛血清白蛋的浓度分别为0.05-0.29M、0.01-5mg/mL。
一些实施例中，所述的Mg2+和Ca2+分别来源于MgSO4和CaCl2。
一些实施例中，所述制备动物的方法使用了所述的电融合液。
一些实施例中，本发明提供了一种基因编辑动物或其子孙的组织、体液、细胞、细胞核以及它们的破碎物或提取物，所述的动物是利用上述方法构建的。
一些实施例中，所述动物为哺乳动物。
一些实施例中，所述动物为非人类哺乳动物。
一些实施例中，所述动物选自猪、大鼠、小鼠、仓鼠、兔、猪、牛、鹿、绵羊、山羊、小鸡、猫、马、狗、猩猩、猴。
一些实施例中，所述动物选自鼠。
一些实施例中，所述动物选自成鼠。
一些实施例中，所述动物选自胎鼠。
附图说明
图1为实施例2制备小鼠的流程和结果图。
图2为试验例1制备小鼠的流程和结果图。
图3为显示小鼠出生率的结果图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
除非另有定义，本文中所使用的所有技术与科学术语的定义与本领域技术人员所熟悉的定义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法和材料皆可应用于本发明方法中，具体实施方式中描述了优选的方法和材料。
文中所用的“一”和“一种”指语法上不定冠词的释义,表示“一个”、“一种”或“多个”、“多种”(即“至少一个”、“至少一种”)。例如“一要素”指一种或种要素。
在本说明中,除非上下文另有要求，词语“包含”、“包括”将被理解为是指包括所述的步骤或要素或步骤和要素的集合，但并不排除任何其它的步骤或要素或步骤和要素的集合；即开放式限定。
本文中，关于“四倍体互补技术”与“四倍体胚胎补偿技术”或“四倍体互补方法”或“四倍体胚胎互补方法”可以等同，其指的是将一定数量的胚胎干细胞(ES)细胞和四倍体胚胎嵌合，在其嵌合体的发育过程中，ES细胞和四倍体胚胎不是随机分布的，即其四倍体胚胎部分仅参与卵黄囊内胚层和胎盘滋养层细胞(如绒毛膜外胚层、滋养层细胞等)等胚外组织的形成，而ES细胞则广泛的参与胚体、尿囊、羊膜、卵黄囊中胚层和绒毛膜中胚层部分的生成，而不参与生成卵黄囊内胚层和胎盘滋养层细胞谱系，即二者的发育潜能具有互补性，这种现象称之为四倍体互补技术。
在一些情况中，术语“胚胎”是指来源于出生前任意时间的动物受试者或来源于出生前任意时间的动物受试者体内的组织和细胞。
在一些情况中，“胚胎”被用于描述在受精后八周变成胎儿前移植入子宫后的受精卵母细胞。根据该定义，受精的卵母细胞在进行移植前通常被称为胚前期(pre-embryo)。然而，贯穿该专利申请，我们将使用更宽的术语胚胎定义，其包括胚前期阶段。因此其包括从卵母细胞受精到桑葚胚、胚泡期孵化和植入的所有发育阶段。
胚胎近似球形并且由一个或多个由明胶样外壳包围的细胞(卵裂球)组成，无细胞的基质被称为透明带。透明带执行多种功能，直到胚胎孵化为止，并且透明带是用于胚胎评价的好标志。该带是球状且半透明的，并且应当清晰地区别于细胞碎片。
哺乳动物着床前胚胎，直径约90～120微米，外面包有清晰可见的由糖蛋白组成的透明带。在受精卵的一侧，可见1-2个减数分裂时形成的极体。
在受精后23-43.5小时之间卵子经过第一次有丝分裂后形成的具有2个卵裂球的胚胎。2-细胞期胚胎的细胞近椭圆形，大小基本相等，经电击后2个卵裂球可以融合成一个4倍体细胞，进而发育成4倍体胚胎。受精卵一分为二形成2个卵裂球即2-细胞期，进一步地，2个卵裂球再一分为二形成4个，即4-细胞期；再一分为二为8个，即8-细胞期，经过5次分裂到32个细胞的时候，即形成了“桑椹胚。在4-细胞期，可以看到4个卵裂球呈交错排列。8-细胞期卵裂球排列分成上下两层，随着紧密连接的形成开始出现致密化。16-细胞期开始被称为桑葚胚，出现内细胞团与滋养层分化。受精后72小时胚胎发育到32-细胞期，卵裂球之间出现缝隙，增大后形成完整的囊胚腔，腔的一侧集中有一团细胞，此即为内细胞团。围绕囊胚腔四周的一层扁平细胞，称为滋养层。此时囊胚也称为胚泡。晚期胚泡膨胀并挤出透明带，即为孵化胚泡。
术语胚胎被用来表示以下的各个阶段——受精卵母细胞、受精卵(zygote)、2-细胞、4-细胞、8-细胞、16-细胞、桑葚胚、胚泡、扩张胚泡和孵化胚泡，以及位于其间的所有阶段(例如3-细胞或5-细胞)。
本文中使用的术语“嵌合体囊胚”或“嵌合体胚胎”指的是包含胚胎干细胞的处于嵌合体状态的囊胚或胚胎。该嵌合体囊胚或胚胎除了通过注射方法生产以外，还可使用例如所谓“聚集方法”生产，在该“聚集方法”中，令胚胎+胚胎、或胚胎+细胞在有盖培养皿中彼此紧密粘附，以生产嵌合体囊胚。再者，本公开中的接纳者囊胚或胚胎与待移植的细胞之间的关系可以是同种异体关系或异种异体关系。
提及供体细胞和/或宿主胚胎的术语“动物”包括哺乳动物、鱼和鸟。哺乳动物包括例如人、非人灵长类动物、啮齿类动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠)、家畜(例如牛物种，例如母牛、阉牛等；羊物种例如绵羊、山羊等；和猪物种，例如猪和公猪)。鸟包括例如鸡、火鸡、鸵鸟、鹅、鸭等。提及供体细胞和/或宿主胚胎的短语“非人哺乳动物”排除人。
在多个实施方案中，供体细胞和/或宿主胚胎不来自下述中的一种或多种：原鼠属物种(Akodon spp.)、林旅鼠属物种(Myopus spp.)、田鼠属物种(Microtus spp.)、鼹属物种(Talpa spp)。
在一个实施方案中，所述基因修饰动物是啮齿动物。在一个实施方案中，所述啮齿动物选自鼠总科。在一个实施方案中，所述基因修饰动物来自于选自以下各科的科：丽仓鼠科(Calomyscidae)(例如丽仓鼠)、仓鼠科(Cricetidae)(例如仓鼠、新世界鼠、田鼠)、鼠科(Muridae)(真鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠鼠)、马岛鼠科(Nesomy idae)(攀鼠、岩攀鼠、白尾鼠、马岛鼠)、刺山鼠科(Platacanthomyidae)(例如刺山鼠)和鼹形鼠科(Spalacidae)(例如醍鼠、竹鼠和酚鼠)；并且所述ADAM6直系同源物或同源物选自相同科内的不同种。在一个具体实施方案中，所述基因修饰啮齿动物选自真鼠(鼠科)，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自于选自沙鼠、刺毛鼠或冠鼠的种。在一个实施方案中，基因修饰小鼠是来自于鼠科的成员，并且ADAM6直系同源物或同源物是来自于鼠科的不同的种。在一个具体实施方案中，所述基因修饰啮齿动物是鼠科的小鼠，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自于鼠科的大鼠、沙鼠、刺毛。
用于由供体ES细胞和宿主胚胎制备非人动物例如小鼠的方法是本领域已知的。供体ES细胞就特定特征加以选择，所述特定特征增强细胞繁殖宿主胚胎的能力，且从而部分或大部分促成由供体ES细胞和宿主胚胎形成的动物。形成的动物可以是雄性或雌性，大部分基于ES细胞的基因型(例如XY或XX)。
一些实施例中，所述细胞为多潜能细胞、非多潜能细胞、哺乳动物细胞、人类细胞、非人类哺乳动物细胞、啮齿动物细胞、小鼠细胞、仓鼠细胞、非人类多潜能细胞、人类多潜能细胞、啮齿动物多潜能细胞或成纤维细胞或肺细胞。
在一些上述方法中，所述细胞为原代细胞或永生化细胞。在一些上述方法中,所述啮齿动物多潜能细胞为小鼠或大鼠胚胎干(ES)细胞。
在一些上述方法中，所述动物细胞或所述人类细胞为原代细胞或永生化细胞。
在一些上述方法中，所述动物细胞或所述人类细胞为多潜能细胞。在一些上述方法中，所述动物多潜能细胞为小鼠胚胎干(ES)细胞。在一些上述方法中，所述人类多潜能细胞为人类胚胎干(ES)细胞、人类成人干细胞、发育受限的人类祖细胞或人类诱导的多潜能干(iPS)细胞。
一些实施例中，本文中的某些实施例提供人源化基因编辑的细胞，尤其是还提供分离的人类和非人类全能或多潜能干细胞，尤其是小鼠胚胎干细胞，其能够在一种或多种体外连续基因修饰之后维持多潜能性且能够经由种系将所述靶向基因修饰传递到后代。
本文使用的术语“胚胎干细胞”或"ES细胞”包括在引入胚胎中后能够促进发育胚胎的任何组织的源自胚胎的全能或多潜能细胞。本文使用的术语“多潜能细胞”包括具有发育成多于一种类型的分化细胞的能力的未分化细胞。术语“非多潜能细胞”包括不是多潜能细胞的细胞。
本文使用的术语“给予”或“移植”是指通过使细胞至少部分定位于期望位点从而产生期望效果的方法或途径，将细胞放置于受试者中。
实施例1胚胎干细胞的来源
本文实施例中，小鼠胚胎干细胞的获得按照如下方法进行：
C57BL6/J小鼠胚胎干细胞从液氮冻存细胞库中复苏，特别使用代数为p15以内的小鼠胚胎干细胞，在6cm培养皿中培养生长3天。
以下实施例2-4和试验例1使用的是第12代的小鼠胚胎干细胞。
实施例2小鼠的制备方法(2-细胞期/提高了Mg2+和Ca2+浓度的电融合液组)
1、实施例2中使用的溶液配方分别如表1-表3所示。
表1电融合液配方(提高了Mg2+和Ca2+浓度的电融合液)
表2培养基配方
| 培养基 | KSOM(200mL) | M2(200mL) |
| EDTA(disodium 0.01mM) | 0.00076g | / |
| NaCl | 1.119g | 1.1068g |
| KCl | 0.037g | 0.070g |
| CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O | 1.71mM | 1.71mM |
| KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> | 0.0095g | 0.032g |
| MgSO<sub>4</sub> | 0.00482g | 0.0283g |
| NaHCO<sub>3</sub> | 0.420g | 0.070g |
| Na lactate | 0.280mL | 0.62mL |
| Na pyruvate | 0.0044g | 0.0073g |
| Glucose | 0.0072g | 0.1g |
| Pen/Strep/Glu | 1mL | 2mL |
| HEPES | / | 0.994g |
| EDTA(100mM) | / | 200μL |
| Gentamycin | / | 200μL |
| Phenol red(0.5％) | 20μL | 100μL |
| BSA | 0.2g | 0.8g |
| 水 | 加水至200mL | 加水至200mL |
表3酸性台氏液
2、小鼠的制备
(1)腹腔注射7.5单位PMSG到4-10周龄B6C3F1雌鼠，48小时后注射hCG并与CD1种公鼠合笼，次日早上检查雌鼠阴栓并将有阴栓的雌鼠挑出，记录雌鼠相应的受精时间。
(2)下一日将孕鼠进行颈椎脱臼法安乐死，70％酒精消毒小鼠腹部，用辅料镊子和眼科剪刀剪开腹部皮肤和肌肉层，打开腹腔。用镊子抓住一个子宫角的上部，用剪刀在靠近输卵管的膜上开一个小口，将输卵管和卵巢连接处剪断，将输卵管和附带的子宫移至35mm培养皿中，用镊子固定好输卵管伞口端，用装填好M2培养液(Hogan,1994)的冲洗针轻轻插入伞口，用0.1mL的M2培养液冲洗输卵管，用移卵管收集冲出的胚胎并用M2清洗3次，收集E1.5(受精后1.5天)的小鼠2-细胞胚胎。
(3)将收集到的小鼠2-细胞胚胎放入改进的电融合液(表1所述的配方)中，用Cellfusion CF-150/B电融合仪和250-微米电极间距的融合槽(BLS Ltd.,Budapest,Hungary)进行60伏50微秒直流电融合，从而获得四倍体胚胎，之后将融合的胚胎放入KSOM培养基(Summers et al.,2000)，于CO2培养箱中培养15小时。结果显示，改进的电融合液的融合效率达到100％。
(4)四倍体胚胎发育到2-细胞期，用酸性台氏液去掉透明带，与用0.25％胰酶消化后的小串胚胎干细胞(实施例1的胚胎干细胞)聚集，再培养24小时后形成嵌合体胚胎。
(5)最后，将嵌合体胚胎移入怀孕2.5天的假孕鼠子宫，17天后可获得足月发育的新生鼠。
由于四倍体胚胎只能有效形成胎盘等胚外组织，从四倍体胚胎与胚胎干细胞嵌合体胚胎获得的新生鼠完全来源于胚胎干细胞。
本实施例制备小鼠的流程和结果如图1所示。从图1可以看出，小鼠制备效率大大提高。进一步地，小鼠出生率的结果如图3所示，从图3可以看出，实施例2的方法制备的小鼠存活率达到33.3％(48/144)。
实施例3小鼠的制备方法(2-细胞期/传统融合液组)
其中KSOM培养基和M2培养液与实施例2相同。
1.腹腔注射7.5单位PMSG到4-10周龄B6C3F1雌鼠，48小时后注射hCG并与CD1种公鼠合笼，次日早上检查雌鼠阴栓并将有阴栓的雌鼠挑出，记录雌鼠相应的受精时间；
2.下一日将孕鼠进行颈椎脱臼法安乐死，70％酒精消毒小鼠腹部，用辅料镊子和眼科剪刀剪开腹部皮肤和肌肉层，打开腹腔。用镊子抓住一个子宫角的上部，用剪刀在靠近输卵管的膜上开一个小口，将输卵管和卵巢连接处剪断，将输卵管和附带的子宫移至35mm培养皿中，用镊子固定好输卵管伞口端，用装填好M2培养液(Hogan,1994)的冲洗针轻轻插入伞口，用0.1mL的M2培养液冲洗输卵管，用移卵管收集冲出的胚胎并用M2清洗3次，收集E1.5的小鼠2-细胞胚胎。
3.将收集到的小鼠2-细胞胚胎放入电融合液中(表4所示的配方)，用CellfusionCF-150/B电融合仪和250-微米电极间距的融合槽(BLS Ltd.,Budapest,Hungary)进行60伏50微秒直流电融合，从而获得四倍体胚胎，之后将融合的胚胎放入KSOM培养基(Summersetal.,2000)，于CO2培养箱中培养24小时。结果显示，融合效率为80-90％，电融合效率达不到100％。
4.四倍体胚胎发育到2-细胞期，用酸性台氏液去掉透明带，与用0.25％胰酶消化后的小串胚胎干细胞(实施例1的胚胎干细胞)聚集，再培养24小时后形成嵌合体胚胎，或者培养48小时到囊胚期，将胚胎胚胎干细胞通过显微操作注入囊胚腔中(Nagy et al.,1993)。
5.最后，将嵌合体胚胎移入怀孕2.5天的假孕鼠子宫，17天后可获得足月发育的新生鼠。由于四倍体胚胎只能有效形成胎盘等胚外组织，从四倍体胚胎与胚胎干细胞嵌合体胚胎获得的新生鼠完全来源于胚胎干细胞。
表4电融合液的配方(传统融合液)
本实施的小鼠出生率的结果如图3所示。从图3可以看出，小鼠的存活率为21.1％(32/152)。
实施例4小鼠的制备方法(4-细胞期/提高了Mg2+和Ca2+浓度的电融合液组)
其中KSOM培养基和M2培养液与实施例2相同。
1.腹腔注射7.5单位PMSG到4-10周龄B6C3F1雌鼠，48小时后注射hCG并与CD1种公鼠合笼，次日早上检查雌鼠阴栓并将有阴栓的雌鼠挑出，记录雌鼠相应的受精时间；
2.下一日将孕鼠进行颈椎脱臼法安乐死，70％酒精消毒小鼠腹部，用辅料镊子和眼科剪刀剪开腹部皮肤和肌肉层，打开腹腔。用镊子抓住一个子宫角的上部，用剪刀在靠近输卵管的膜上开一个小口，将输卵管和卵巢连接处剪断，将输卵管和附带的子宫移至35mm培养皿中，用镊子固定好输卵管伞口端，用装填好M2培养液(Hogan,1994)的冲洗针轻轻插入伞口，用0.1mL的M2培养液冲洗输卵管，用移卵管收集冲出的胚胎并用M2清洗3次，收集E1.5的小鼠2-细胞胚胎。
3.将收集到的小鼠2-细胞胚胎放入电融合液中(表5所示的配方)，用CellfusionCF-150/B电融合仪和250-微米电极间距的融合槽(BLS Ltd.,Budapest,Hungary)进行60V50微秒直流电融合，从而获得四倍体胚胎，之后将融合的胚胎放入KSOM培养基(Summerset al.,2000)，于CO2培养箱中培养24小时。结果显示，改进的电融合液的融合效率达到100％。
4.四倍体胚胎发育到4-细胞期，用酸性台氏液去掉透明带，与用0.25％胰酶消化后的小串胚胎干细胞(实施例1的胚胎干细胞)聚集，再培养24小时后形成嵌合体胚胎，或者培养48小时到囊胚期，将胚胎胚胎干细胞通过显微操作注入囊胚腔中(Nagy et al.,1993)。
5.最后，将嵌合体胚胎移入怀孕2.5天的假孕鼠子宫，17天后可获得足月发育的新生鼠。由于四倍体胚胎只能有效形成胎盘等胚外组织，从四倍体胚胎与胚胎干细胞嵌合体胚胎获得的新生鼠完全来源于胚胎干细胞。
表5电融合液配方(提高了Mg2+和Ca2+浓度的电融合液)
本实施的小鼠出生率的结果如图3所示。从图3可以看出，小鼠的存活率为7.5％(9/120)。
试验例1小鼠的制备方法(4细胞期/传统融合液组)
其中KSOM培养基和M2培养液与实施例2相同。
1.腹腔注射7.5单位PMSG到4-10周龄B6C3F1雌鼠，48小时后注射hCG并与CD1种公鼠合笼，次日早上检查雌鼠阴栓并将有阴栓的雌鼠挑出，记录雌鼠相应的受精时间；
2.下一日将孕鼠进行颈椎脱臼法安乐死，70％酒精消毒小鼠腹部，用辅料镊子和眼科剪刀剪开腹部皮肤和肌肉层，打开腹腔。用镊子抓住一个子宫角的上部，用剪刀在靠近输卵管的膜上开一个小口，将输卵管和卵巢连接处剪断，将输卵管和附带的子宫移至35mm培养皿中，用镊子固定好输卵管伞口端，用装填好M2培养液(Hogan,1994)的冲洗针轻轻插入伞口，用0.1ml的M2培养液冲洗输卵管，用移卵管收集冲出的胚胎并用M2清洗3次，收集E1.5的小鼠2-细胞胚胎。
3.将收集到的小鼠2-细胞胚胎放入电融合液(表6所示的配方)中，用CellfusionCF-150/B电融合仪和250-微米电极间距的融合槽(BLS Ltd.,Budapest,Hungary)进行60伏50微秒直流电融合，从而获得四倍体胚胎，之后将融合的胚胎放入KSOM培养基(Summers etal.,2000)，于CO2培养箱中培养24小时。电融合效率为80-90％。
4.四倍体胚胎发育到4-细胞期，用酸性台氏液去掉透明带，与用0.25％胰酶消化后的小串胚胎干细胞(实施例1的胚胎干细胞)聚集，再培养24小时后形成嵌合体胚胎，或者培养48小时到囊胚期，将胚胎胚胎干细胞通过显微操作注入囊胚腔中(Nagy et al.,1993)。
5.最后，将嵌合体胚胎移入怀孕2.5天的假孕鼠子宫，17天后可获得足月发育的新生鼠。由于四倍体胚胎只能有效形成胎盘等胚外组织，从四倍体胚胎与胚胎干细胞嵌合体胚胎获得的新生鼠完全来源于胚胎干细胞。
表6电融合液的配方(传统融合液)
本试验例1制备小鼠的过程和结果如图2所示。从图2可以看出，小鼠制备效率非常低。进一步地，小鼠出生率的结果如图3所示。从图3可以看出，小鼠的存活率仅为2.5％(4/163)。
Claims (10)
1.一种组合物，其特征在于，所述组合物成分包括甘露醇、MgSO4、CaCl2和牛血清白蛋白；所述甘露醇、MgSO4、CaCl2和牛血清白蛋白的质量比为9～53：0.015～0.241：0.013～0.23：0.01～5。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述甘露醇、MgSO4、CaCl2和牛血清白蛋白的质量比为18～52：0.018～0.241：0.016～0.23：0.01-4；
优选地，所述甘露醇、MgSO4、CaCl2和牛血清白蛋白的质量比为27～52：0.018～0.12：0.016～0.1：1～3.5；
或优选地，所述组合物包括以下成分：甘露醇0.05-0.29M、MgSO4 0.12-2mM、CaCl20.12-2mM、牛血清白蛋白0.01-5mg/mL；
更为优选地，所述组合物包括以下成分：甘露醇0.1-0.28M、MgSO4 0.15-2mM、CaCl20.15-2mM、牛血清白蛋白0.01-4mg/mL；
更为优选地，所述组合物包括以下成分：甘露醇0.15-0.28M、MgSO4 0.15-1mM、CaCl20.15-1mM、牛血清白蛋白1-3.5mg/mL；
更为优选地，所述组合物包括以下成分：甘露醇0.18-0.28M、MgSO4 0.15-0.5mM、CaCl20.15-0.5mM、牛血清白蛋白2-3.5mg/mL；
更进一步优选地，所述组合物包括以下成分：甘露醇0.2-0.28M、MgSO4 0.15-0.3mM、CaCl2 0.15-0.3mM、牛血清白蛋白2-3mg/mL。
或优选地，所述组合物为电融合液；
更为优选地，所述组合物用于制备动物；
更为优选地，所述动物为基因编辑动物胚胎细胞或基因编辑动物；
更为优选地，所述动物为基因人源化动物；
更为优选地，所述组合物用于制备动物四倍体胚胎；
更为优选地，所述动物为哺乳动物；
进一步优选地，所述哺乳动物为啮齿类动物；
进一步优选地，所述啮齿类动物为鼠。
3.权利要求1-2任一所述的组合物在制备动物胚胎细胞或动物中的应用；
优选地，所述胚胎细胞为基因编辑动物胚胎细胞；
或优选地，所述动物为基因编辑动物；
更为优选地，所述动物为基因人源化动物；
或优选地，所述组合物用于制备动物四倍体胚胎；
更为优选地，所述动物为哺乳动物；
进一步优选地，所述哺乳动物为啮齿类动物；
进一步优选地，所述啮齿类动物为鼠。
4.一种电融合液，含有甘露醇、牛血清白蛋、Mg2+和Ca2+，其特征在于，所述电融合液具有提高了浓度的Mg2+和Ca2+；或者，所述电融合液Mg2+和Ca2+的浓度分别为0.12-2mM、0.12-2mM；
优选地，所述的电融合液体中的甘露醇、牛血清白蛋的浓度分别为0.05-0.29M、0.01-5mg/mL；
更为优选地，所述的Mg2+和Ca2+分别来源于MgSO4和CaCl2。
5.一种制备动物的方法，其特征在于，使用了权利要求4所述的电融合液；
优选地，所述动物为基因编辑动物；
更为优选地，所述动物为基因人源化动物。
更为优选地，所述组合物用于制备动物四倍体胚胎；
更为优选地，所述动物为哺乳动物；
更为优选地，所述哺乳动物为啮齿类动物；
更为优选地，所述啮齿类动物为鼠；
更为优选地，所述动物为成鼠；
或更为优选地，所述动物为胎鼠。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法使用了四倍体补偿法或四倍体胚胎互补法；
优选地，所述方法包括将胚胎干细胞和四倍体胚胎聚合形成新的重构胚。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)获得小鼠2-细胞胚胎；
(2)将步骤(1)所述的2-细胞胚胎放入电融合液中，进行电融合，获得四倍体胚胎；
(3)将步骤(2)中的四倍体胚胎放入培养基中培养；
(4)将步骤(3)中四倍体胚胎与胚胎干细胞聚合，形成嵌合体胚胎；
(5)将步骤(4)中的嵌合体胚胎植入假孕的小鼠子宫中，胚胎发育至足孕，从而获得基因编辑小鼠；
优选地，步骤(3)中的培养时间为8-24小时；
或优选地，步骤(3)中培养基为KSOM培养基。
8.一种四倍体胚胎或嵌合体胚胎的制备方法，其特征在于，使用了权利要求1-2任一所述的组合物；
优选地，所述组合物作为电融合液；
更为优选地，所述组合物用于制备动物四倍体胚胎；
更为优选地，所述组合物用于制备嵌合体胚胎；
更为优选地，所述方法包括将四倍体胚胎与胚胎干细胞聚合得到嵌合体胚胎。
9.权利要求5-7任一所述的方法制备得到的鼠。
10.一种基因编辑鼠或其子孙的组织、体液、细胞、细胞核以及它们的破碎物或提取物，其特征在于，所述的鼠是利用权利要求5-7任一所述的方法构建的。
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2020
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